CN102675412B

CN102675412B - 一种制备蛋白质晶体的方法

Info

Publication number: CN102675412B
Application number: CN201110063339.2A
Authority: CN
Inventors: 李林; 杨聚平; 周建军; 杨富
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: CN102675412A

Abstract

本发明提供了一种制备蛋白质晶体的方法。该方法包括如下步骤：将底液、所述蛋白质的水溶液和高分子添加剂水溶液进行混合得到结晶液；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中进行培养即得所述蛋白质晶体；所述底液由沉淀剂和pH值缓冲液组成。利用上述方法进行蛋白质晶体生长，在不同条件下可以得到不同形貌的晶体，成功调控了蛋白质晶体的形貌。并且结晶条件明显放宽，单晶衍射强度高，结果重复性好。

Description

一种制备蛋白质晶体的方法

技术领域

本发明涉及一种制备蛋白质晶体的方法，属于蛋白质结晶领域。

背景技术

蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。

最近，为了更好的调控晶体的形貌和得到完善程度较高的蛋白质晶体，改善和优化蛋白质晶体生长的方法得到了科研工作者的广泛关注。专利公开号为CN 1707252A的专利申请文件中公开了一种采用改善结晶基底的方法，即采用一种硅烷化的云母作为蛋白质结晶的基底，以达到放宽结晶生长条件，控制蛋白质晶体生长过程中的晶核数量的目的。又如专利公开号为CN 101092445A的专利申请文件中公开了采用离子液体结晶蛋白质的方法。该方法也可以使结晶工艺条件宽泛，提高晶体衍射强度。以上方法在一定程度上提高了蛋白质晶体的质量，然而，操作步骤比较繁杂，对试剂的要求也较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备蛋白质晶体的方法。

本发明提供了一种制备蛋白质晶体的方法，包括如下步骤：将底液、所述蛋白质的水溶液和高分子添加剂水溶液进行混合得到结晶液；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中进行培养即得所述蛋白质晶体；所述底液由沉淀剂和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂为使所述蛋白质从水溶液中沉淀出来的中性盐。

上述的方法中，所述蛋白质可为水溶性蛋白质，具体可为溶菌酶或甜味蛋白。

上述的方法中，所述沉淀剂可为NaCl或KCl；所述pH值缓冲液可为醋酸钠缓冲溶液或柠檬酸钠缓冲溶液；所述底液的pH值可为3.0-6.0，如5.0或5.4。

上述的方法中，所述底液中所述沉淀剂的质量百分含量可为2.0％-15％，具体可为6.5％；所述底液中所述pH值缓冲液的摩尔浓度可为0.01M-0.5M，具体可为0.1M。

上述的方法中，所述蛋白质的水溶液中所述蛋白质的质量体积浓度(mg/ml)可为5-100，具体可为30；所述高分子添加剂水溶液中所述高分子添加剂的质量百分含量可为0.001％-10％，具体可为0.002％-7.2％、0.002％、0.004％、0.008％、0.012％、0.016％、0.02％、0.06％、1.0％、1.8％、2.4％、300％、3.2％、3.6％或7.2％。

上述的方法中，所述高分子添加剂可为水溶性高分子聚电解质和表面活性剂型嵌段共聚物中至少一种；所述水溶性高分子聚电解质的数均分子量可为10000-5000000，具体可为58000-100000；所述表面活性剂型嵌段共聚物的数均分子量可为5000-100000，具体可为15000-100000。

上述的方法中，所述水溶性高分子聚电解质可为聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚-4-乙烯基吡啶、聚-2-乙烯基吡啶和聚丙烯酰胺中至少一种；所述表面活性剂型嵌段共聚物可为氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段共聚物和氧化乙烯/氧化丙烯/氧化乙烯三嵌段共聚物中至少一种。

上述的方法中，所述结晶液中，所述底液、所述蛋白质的水溶液和所述高分子添加剂水溶液的体积份数比可为(0.5-4)∶(0.5-4)∶(0.5-3)，具体可为2∶2∶1。

上述的调控方法中，所述培养的温度可为4℃-25℃，具体可为5℃或20℃；所述培养的时间可为1天-5天，具体可为3天。

利用本发明提供的上述方法进行调控蛋白质晶体的生长，在不同条件下可以得到不同形貌的蛋白质晶体，成功的制备了蛋白质晶体；并且结晶条件明显放宽，单晶衍射强度高，结果重复性好。

附图说明

图1为本发明实施例1和对比例1得到的溶菌酶晶体的偏光显微镜照片，其中，图(a)为对比例1中未添加任何高分子添加剂时得到的溶菌酶晶体的偏光显微镜照片，图(b)-图(f)分别为聚乙烯吡咯烷酮水溶液中聚乙烯吡咯烷酮的质量百分含量为1.8％、2.4％、3.2％、3.6％和7.2％时得到的溶菌酶晶体的偏光显微镜照片。

图2为本发明实施例2得到的溶菌酶晶体的不同侧面的偏光显微镜照片，其中，图(a)为(110)晶面朝上，图(b)为(101)晶面朝上。

图3为本发明实施例3得到的溶菌酶晶体的偏光显微镜照片，其中，图(a)-图(c)分别为氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段聚合物(两嵌段的质量比为1∶1)水溶液中氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段聚合物的质量百分含量为0.016％、0.06％和0.2％。

图4为本发明实施例4得到的溶菌酶晶体的偏光显微镜照片，其中，图(a)-图(e)分别为氧化乙烯/氧化丙烯/氧化乙烯三嵌段聚合物(三嵌段聚合度分别为106、70、106)水溶液中氧化乙烯/氧化丙烯/氧化乙烯三嵌段聚合物的质量百分含量为0.002％、0.004％、0.008％

图5为本发明实施例5和对比例2得到的甜味蛋白晶体的偏光显微镜照片，其中，图(a)为对比例2中未添加任何高分子添加剂时得到的甜味蛋白晶体的偏光显微镜照片，图(b)为本发明实施例5得到的甜味蛋白晶体的偏光显微镜照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述溶菌酶和甜味蛋白均购自Sigma公司。

实施例1、溶菌酶晶体的制备

(1)首先配制质量百分含量为20％的NaCl储存液、0.6M NaOAc缓冲溶液(pH为4.5)储存液和30mg/ml的溶菌酶水溶液储存液。

(2)由步骤(1)配制的NaCl储存液和NaOAc缓冲溶液配制600μL底液，其pH为5.0，其中，NaCl的质量百分含量为6.5％，NaOAc的摩尔浓度为0.1M，

(3)结晶液的配制：由步骤(2)配制的2μL底液、2μL 30mg/ml的溶菌酶水溶液和1μL质量百分含量分别为1.8％、2.4％、3.2％、3.6％和7.2％，数均分子量为58,000的聚乙烯吡咯烷酮水溶液组成；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于24孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，至于20℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图1(b)-图1(f)所示，由图可知，所得晶体为短棱柱状或八面体形貌。

对比例1、溶菌酶晶体的制备

制备过程与实施例1相同，不同之处在于：该对比例中的结晶液没有添加任何高分子添加剂。所得晶体的偏光显微镜照片如图1(a)所示。

实施例2、溶菌酶晶体的制备

制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将实施例1中结晶液中的1μL聚乙烯吡咯烷酮水溶液变为1μL质量百分含量为1.0％的聚丙烯酸(数均分子量为100,000)水溶液。所得溶菌酶晶体为相邻四个(101)面凹陷的形貌，如图2所示。

实施例3、溶菌酶晶体的制备

制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将实施例1中结晶液中的1μL聚乙烯吡咯烷酮水溶液分别变为1μL质量百分含量分别为0.016％、0.06％和0.2％的氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段聚合物水溶液，其中，该氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段聚合物的数均分子量为100,000(两嵌段的质量比为1∶1)。所得溶菌酶晶体为长棱柱状或棒状形貌，如图3所示。

实施例4、溶菌酶晶体的制备

制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将实施例1中结晶液中的1μL聚乙烯吡咯烷酮水溶液分别变为1μL质量百分含量分别为0.002％、0.004％、0.008％、0.012％和0.02％的氧化乙烯/氧化丙烯/氧化乙烯三嵌段聚合物(三嵌段聚合度分别为106、70、106，数均分子量为15,000)水溶液。所得溶菌酶晶体为长棱柱状或棒状形貌，如图4所示。

实施例5、甜味蛋白晶体的制备

(1)首先配制质量百分含量为20％的KCl储存液、0.6M柠檬酸钠缓冲溶液(pH为4.8)储存液和30mg/ml的甜味蛋白水溶液储存液。

(2)由步骤(1)配制的KCl储存液和柠檬酸钠缓冲溶液配制600μL底液，其pH为5.4，其中，KCl的质量百分含量为6.5％，柠檬酸钠的摩尔浓度为0.1M，

(3)结晶液的配制：由步骤(2)配制的2μL底液、2μL 30mg/ml的甜味蛋白水水溶液和1μL质量百分含量为3.0％，数均分子量为58,000的聚乙烯吡咯烷酮水溶液组成；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于24孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，至于5℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图5(b)所示，所得晶体为棒状形貌。

对比例2、甜味蛋白晶体的制备

制备过程同实施例5，不同之处在于：该对比例中的结晶液没有添加任何高分子添加剂。所得晶体的偏光显微镜照片如图5(a)所示。

Claims

1.一种制备蛋白质晶体的方法，包括如下步骤：将底液、所述蛋白质的水溶液和高分子添加剂水溶液进行混合得到结晶液；采用悬滴法将所述结晶液置于培养箱中进行培养即得所述蛋白质晶体；所述底液由沉淀剂和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂为使所述蛋白质从水溶液中沉淀出来的中性盐；

所述高分子添加剂为表面活性剂型嵌段共聚物；所述表面活性剂型嵌段共聚物的数均分子量为5000-100000；

所述蛋白质为溶菌酶或甜味蛋白；

所述表面活性剂型嵌段共聚物为氧化乙烯/氧化丙烯两嵌段共聚物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述沉淀剂为NaCl或KCl；所述pH值缓冲液为醋酸钠缓冲溶液或柠檬酸钠缓冲溶液；所述底液的pH值为3.0-6.0。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述底液中所述沉淀剂的质量百分含量为2.0％-15％；所述底液中所述pH值缓冲液的摩尔浓度为0.01M-0.5M。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的水溶液中所述蛋白质的质量体积浓度mg/ml为5-100；所述高分子添加剂水溶液中所述高分子添加剂的质量百分含量为0.001％-10％。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述结晶液中，所述底液、所述蛋白质的水溶液和所述高分子添加剂水溶液的体积份数比为(0.5-4)：(0.5-4)：(0.5-3)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为4℃-25℃；所述培养的时间为1天-5天。