CN101092445A

CN101092445A - 用离子液体结晶蛋白质的方法

Info

Publication number: CN101092445A
Application number: CN 200710072352
Authority: CN
Inventors: 张密林; 徐晓冬; 李欣欣; 丹媛媛; 景晓燕
Original assignee: Harbin Engineering University
Current assignee: Harbin Engineering University
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2027-06-13
Also published as: CN101092445B

Abstract

本发明提供的一种用离子液体结晶蛋白质的方法。用离子液体－水混合溶液从蛋白质溶液中结晶蛋白质，所述的离子液体－水混合溶液是由重量比为离子液体1～85％与沉淀剂1～25％加缓冲溶液配制而成的pH值为4.0～11.0的混合液。采用本发明的蛋白质结晶方法进行蛋白质结晶，可以使工艺条件变得宽泛，而且在不同条件下可获得不同形貌的蛋白质单晶，所培养的蛋白质晶体衍射强度高，重复性好，提高了结晶过程的可操作性。

Description

用离子液体结晶蛋白质的方法

(一)技术领域

本发明涉及的是一种蛋白质结晶的新方法，特别是涉及一种将离子液体用于蛋白质结晶的新方法。

(二)背景技术

近年来，由于生物活性物质在医学、药学、化学、农业和工业方面的广泛应用，因此通过X射线晶体学揭示生物大分子结构与功能之间关系而显得尤为重要。以晶体形式存在的生物大分子是比较稳定的，而X射线衍射是确定晶体分子三维空间结构最可靠的方法。具体了解生物大分子结构对于新药设计、蛋白质工程以及改变分子结构或构象等方面都具有十分重要的意义。但是从总体方面来说，生物大分子的晶体培养仍然是摸索性和经验性的，在某种程度上还要靠机遇。晶体培养已成为当前阻碍提高晶体结构分析速度的关键性问题。

专利申请号为97192855.X的专利申请文件中公开了一种从蛋白质溶液结晶蛋白质的方法，该方法包括：(a)用包含硫原子的盐处理蛋白质溶液，所说的硫原子具有低于6的氧化态；(b)以结晶形式回收蛋白质。本发明的特点在于将离子液体用于蛋白质的结晶。近年来，离子液体已经被广泛应用于生物领域。例如：由于其电化学稳定性高，具有较高的电导率和较宽的电化学窗口，人们已成功的利用离子液体来分离纯化蛋白质。并且有研究表明，某些蛋白质在离子液体中的活性和稳定性大大提高。一些蛋白质在水中的溶解度较小，很难得到符合X射线的晶体，而离子液体对很多无机和有机物质都表现出良好的溶解能力，这就为这类蛋白质的结晶提供了可能。此外，离子液体的结构具有更大的可设计性，即可通过修饰或调变阴阳离子的结构或种类来调控离子液体的物理化学性质，以满足特定的应用需求。由于离子液体的低挥发性，使蛋白质分子缓慢的从溶液中析出而结晶，避免了多晶的生成。而且所培养的蛋白质晶体与不加离子液体比较衍射强度高，重复性好。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种将离子液体用于蛋白质结晶并使其处于一种可控状态的用离子液体结晶蛋白质的方法。

本发明的目的是这样实现的：用离子液体-水混合溶液从蛋白质溶液中结晶蛋白质，所述的离子液体-水混合溶液是由重量比为离子液体1～85％与沉淀剂1～25％加缓冲溶液配制而成的pH值为4.0～11.0的混合液。

所述的离子液体为咪唑类离子液体、硝基乙胺类离子液体、胍类离子液体、季铵类离子液体、季鏻类离子液体或吡啶类离子液体中的一种，其重量比含量优选5～50％。

所述的沉淀剂是氯化钠、氯化镁、硫酸钠、醋酸铵、柠檬酸铵、硝酸铵、硫酸铵、硫酸钙、硫酸镁、硝酸钾、硼酸钾、磷酸钾、酒石酸钾、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、碘化钠、硝酸钠、磷酸钠、氯化锂或硫酸锂中的一种，其重量比浓度优选3～6％。

所述缓冲溶液pH值优选4.4～10.5。

采用本发明的蛋白质结晶新方法，将浓度为10～300mg/mL的蛋白质溶液添加至离子液体-水混合溶液中，进行蛋白质结晶。

采用本发明的蛋白质结晶新方法进行蛋白质结晶，可以在0℃～50℃条件下获得蛋白质晶体。

采用本发明的蛋白质结晶新方法进行蛋白质结晶，可以使工艺条件变得宽泛，而且在不同条件下可获得不同形貌的蛋白质单晶，所培养的蛋白质晶体衍射强度高，重复性好，提高了结晶过程的可操作性。

采用本发明的蛋白质结晶新方法，可以获得动物蛋白质晶体，如蛋清溶菌酶；也可以获得植物蛋白质晶体，如索马甜蛋白。

采用本发明的蛋白质结晶新方法，既可以从配制的蛋白质溶液中获得蛋白质单晶，也可以直接从蛋白质粗原料中结晶蛋白质。

(四)附图说明

图1为比较例中不加离子液体时，以氯化钠为沉淀剂，浓度4％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.5时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图2为本发明中以氯化钠为沉淀剂，浓度3％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.4，四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液体积比为1∶6时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图3为本发明中以氯化钠为沉淀剂，浓度3％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液体积比为1∶6时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图4为本发明中以氯化钠为沉淀剂，浓度3％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液体积比为5∶9时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图5为本发明中以硫酸钠为沉淀剂，浓度4％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液体积比为5∶9时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图6为本发明中以氯化镁为沉淀剂，浓度6％(重量)，采用悬滴结晶法，醋酸-醋酸钠缓冲体系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液体积比为5∶9时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图7、8为本发明中以氯化钠为沉淀剂，浓度5％(重量)，采用批量结晶法，氢氧化钠缓冲体系下，pH值9.0～10.5，加入1～50μl四氟硼酸丁基甲基咪唑时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图9、10为本发明中以氯化钠为沉淀剂，浓度5％(重量)，采用批量结晶法，氢氧化钠缓冲体系下，pH值9.0～10.5，加入5～100mg氯丁基甲基咪唑时所得蛋清溶菌酶晶体图。

图11为本发明中以鸡蛋清为原料，以氯化钠为沉淀剂，浓度5％(重量)，采用批量结晶法，氢氧化钠缓冲体系下，pH值9.0～10.5，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得蛋清溶菌酶晶体图。

图12为本发明中以酒石酸钾钠为沉淀剂，浓度8％(重量)，采用悬滴结晶法，N-(2-乙酰氨基)-亚氨二乙基缓冲体系下，pH值6.5～7.0，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得索马甜蛋白质晶体图。

(五)具体实施方式

下面举例对本发明做更详细地描述：

比较例1：为了更清楚地反映本发明的效果，先进行一个比较例1，在不加离子液体的情况下，酸性体系中，通常得到多晶或孪晶；在碱性条件下，我们很难获得可以用于X射线衍射的单晶体。按常规方法，在pH值4.5，氯化钠浓度4％(重量)，室温的条件下，培养出溶菌酶球晶如图1所示。

实施例1：配制浓度为10～50mg/mL的溶菌酶溶液，调节醋酸-醋酸钠缓冲体系pH值至4.4。以氯化钠为沉淀剂，浓度为3％(重量)。采用悬滴结晶法，悬滴中包括5μl溶菌酶溶液，2μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和12μl缓冲溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液比例与悬滴一致，氯化钠浓度为15％(重量)，于室温下培育，得块状晶体如图2所示。

实施例2：除了将实施例1中醋酸-醋酸钠缓冲体系pH值变更为4.6外，其它均按相同步骤配制悬滴与池液，在相同条件下培育，所得晶体与图1相比为长块状晶体如图3所示。

实施例3：除了将实施例2中悬滴所包含四氟硼酸丁基甲基咪唑和缓冲溶液体积分别变更为5μl和9μl外，其它均按相同步骤配制悬滴与池液，在相同条件下培育，实验所得棒状晶体如图4所示。

实施例4：除了将实施例3中沉淀剂变更为硫酸钠，浓度变为4％(重量)，pH值调至4.5外，其它均按相同步骤配制悬滴与池液，在相同条件下培育，得块状晶体如图5所示。

实施例5：除将了实施例4中沉淀剂变更为氯化镁，浓度变为6％(重量)外，其它均按相同步骤配制悬滴与池液，在相同条件下培育，得小块晶体如图6所示。

实施例6：配制浓度为10～50mg/mL的溶菌酶溶液，调节氢氧化钠缓冲体系pH值至9.0～10.5。以氯化钠为沉淀剂，浓度为5％(重量)。采用批量结晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～50μl，于4℃下培育12h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶结晶。而且3天后结晶生成通过肉眼和实体显微镜都可确认并可进行X射线衍射分析。得十二面晶体，晶体尺寸为100～500μm，如图7、8所示。

实施例7：除了将实施例6中加入小瓶中的四氟硼酸丁基甲基咪唑替换为5～100mg氯丁基甲基咪唑以外，其它都按照同样的步骤制备溶菌酶结晶溶液。将其密封并于4℃下培育24h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶结晶。而且5天后结晶生成通过肉眼和实体显微镜都可确认并可进行X射线衍射分析。得双锥体和块状晶体，晶体尺寸为30～200μm其晶体形貌如图9、10所示。

实施例8：取一定量蛋清，用2体积水将其溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节体系pH值至9.0～10.5。以氯化钠为沉淀剂，浓度5％(重量)。采用批量结晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～30μl，于4℃下温育24h，在蛋清溶液中析出溶菌酶结晶。得大量微晶，晶体尺寸为5～100μm，如图11所示。

实施例9：配制浓度为20～30mg/mL的索马甜蛋白溶液，调节N-(2-乙酰氨基)-亚氨二乙基体系下缓冲体系pH值至6.5～7.0。以酒石酸钾钠为沉淀剂，浓度为8％(重量)。采用悬滴结晶法，悬滴中包括5μl索马甜蛋白溶液，1～6μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和适量缓冲溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑与缓冲溶液比例与悬滴一致，酒石酸钾钠浓度为20％(重量)，于室温下培育，得八面双锥晶体如图12所示。

Claims

1、一种用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：用离子液体一水混合溶液从蛋白质溶液中结晶蛋白质，所述的离子液体一水混合溶液是由重量比为离子液体1～85％与沉淀剂1～25％加缓冲溶液配制而成的pH值为4.0～11.0的混合液。

2、根据权利要求1所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所述的离子液体为咪唑类离子液体、硝基乙胺类离子液体、胍类离子液体、季铵类离子液体、季鏻类离子液体或吡啶类离子液体中的一种。

3、根据权利要求2用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所述的离子液体的重量比含量优选5～50％。

4、根据权利要求1所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所述的沉淀剂是氯化钠、氯化镁、硫酸钠、醋酸铵、柠檬酸铵、硝酸铵、硫酸铵、硫酸钙、硫酸镁、硝酸钾、硼酸钾、磷酸钾、酒石酸钾、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、碘化钠、硝酸钠、磷酸钠、氯化锂或硫酸锂中的一种。

5、根据权利要求4所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所述的沉淀剂的重量比浓度优选3～6％。

6、根据权利要求1所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：pH值优选4.4～10.5。

7、根据权利要求1所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所述的蛋白质溶液是配制的蛋白质溶液或者是蛋白质的粗原料。

8、根据权利要求7所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：所用蛋白质是植物蛋白或者是动物蛋白。

9、根据权利要求1-8任何一项所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：将浓度为10～300mg/mL的蛋白质溶液添加至离子液体一水混合溶液中。

10、根据权利要求1-8任何一项所述的用离子液体结晶蛋白质的方法，其特征是：结晶温度为0℃～50℃。