CN114853882B - 一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，首先利用结晶剂和与水互不相容的液体形成“油包水”的乳液；然后以“油包水”的乳液作为结晶液滴生长蛋白质晶体，从而得到尺寸均匀的纳米级蛋白质晶体；最后利用戊二醛对纳米级蛋白质晶体进行交联，得到可以在空气中稳定存在且尺寸均匀的蛋白质纳米级晶体。本发明的优势在于：1)可以通过控制乳液颗粒的大小，制备特定尺寸需求的蛋白质晶体；2)可以制备纳米尺度的蛋白质晶体；3)可以实现大规模蛋白质晶体纳米颗粒的生产制备。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质结晶方法领域，涉及一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法。
背景技术
蛋白质晶体内部和表面具有丰富的三维多孔结构，不仅生物相容性好，而且本身也具备离子转运、酶促反应和电子转运等一些特定的功能。因此在蛋白质纯化、结构解析、催化转化、生物传感、药物递送等领域具有广泛的应用前景。在生物材料领域应用的前提是制备大小合适、尺寸均一、性能稳定的蛋白质微晶。
蛋白质结晶方法主要有，1)批量结晶法：将蛋白质结晶液滴孵育在与水不相容的油相中，体系相对稳定，得到的晶体也不易溶解，但晶体尺寸难以控制。2)气相扩散结晶：蛋白质结晶液滴中的水分子通过气相扩散逃逸离开结晶液滴使其达到局域过饱和度而实现结构起伏形成晶核进而生长为晶体。3)液相扩散结晶法：将蛋白质结晶液滴和池液一起封在毛细管中，结晶液滴中的水分子通过水相扩散至池液中，使蛋白质液滴达到过饱和度从而长出晶体。4)透析结晶法：利用透析袋将大分子蛋白质液滴与小分子结晶剂分隔开，两侧具有浓度差，结晶剂中的小分子通过半透膜进入大分子蛋白质液滴中，而大分子蛋白质不能通过透析袋，使蛋白质液滴达到过饱和度进而形成蛋白质晶体。但已有技术主要存在的问题有：1)晶体尺寸难以控制，尺寸分布不均一；
2)晶体尺寸难以达到纳米尺度；3)晶体的规模制备存在困难，难以在实际应用中推广。
本发明通过在乳液中生长蛋白质晶体，可以按需规模制备出尺寸均匀的纳米级交联蛋白质晶体。其有益效果是：1)蛋白质晶体的尺寸可控；2)蛋白质晶体的尺寸可以达到纳米级；3)可以实现大规模的蛋白质晶体的生产制备。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，解决的技术问题是：1)晶体尺寸难以控制，尺寸分布不均一；2)晶体尺寸难以达到纳米尺度；3)晶体的规模制备存在困难，难以在实际应用中推广。
技术方案
一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：将与水不互溶的溶剂和蛋白质结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液；所述的与水不互溶的溶剂与结晶剂溶液的体积比为3～6:1；
步骤2：将蛋白质溶液与步骤1制备的结晶剂乳浊液混匀，形成蛋白质结晶乳浊液；所述的蛋白质溶液与结晶剂乳液的体积比为1:10～15；
步骤3：搅拌蛋白质结晶乳浊液实现纳米尺度蛋白质晶体的生长；
步骤4：离心收集蛋白质晶体并使用结晶剂溶液重悬蛋白质晶体获得蛋白质晶体悬浊液；
步骤5：将蛋白质晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联蛋白质晶体；
步骤6：用去离子水清洗蛋白质晶体，冷冻干燥后获得最终的交联蛋白质晶体。
所述蛋白质结晶剂溶液包括重量比为20％～25％的聚乙二醇溶液和3％～6％的NaCl溶液。
所述与水不互溶的溶剂包括液体石蜡或玉米油。
所述蛋白质溶液包括：血红蛋白溶液、溶菌酶溶液、卵清蛋白溶液、β-乳球蛋白溶液。
所述步骤3的蛋白质晶体生长时间为8～24h。
所述戊二醛溶液浓度为2％～6％。
所述步骤5的戊二醛交联时间为0.5～2h。
有益效果
本发明提出的一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，首先利用结晶剂和与水互不相容的液体形成“油包水”的乳液；然后以“油包水”的乳液作为结晶液滴生长蛋白质晶体，从而得到尺寸均匀的纳米级蛋白质晶体；最后利用戊二醛对纳米级蛋白质晶体进行交联，得到可以在空气中稳定存在且尺寸均匀的蛋白质纳米级晶体。本发明的优势在于：1)可以通过控制乳液颗粒的大小，制备特定尺寸需求的蛋白质晶体；
2)可以制备纳米尺度的蛋白质晶体；3)可以实现大规模蛋白质晶体纳米颗粒的生产制备。
本发明提供的制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其有益效果是：
1)本发明通过控制乳液的大小，制备特定尺寸需求的蛋白质晶体；
2)本发明制备的蛋白质晶体，可以在复杂环境中稳定存在；
3)本发明提供的蛋白质制备方法可以实现大规模的蛋白质晶体的生产制备。
附图说明
图1为纳米级交联血红蛋白晶体透射电镜形貌图，晶体尺寸约为500nm。
图2为纳米级交联血红蛋白晶体元素分析，蛋白质晶体的主要元素有C、N、O。
图3为纳米级交联血红蛋白晶体电子衍射图，表明得到的蛋白质晶体为单晶。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
本发明涉及一种制备尺寸均匀的交联蛋白质晶体的方法，其技术方案是按照以下步骤进行的：
步骤一、将与水不互溶的溶剂和蛋白质结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
可选地，与水不互溶的溶剂包括液体石蜡、玉米油。
可选地，蛋白质结晶剂包括20％～25％(重量比)的聚乙二醇溶液，3％～6％(重量比)的NaCl溶液。
步骤二、将蛋白质溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成蛋白质结晶乳浊液。
可选地，蛋白质溶液包括血红蛋白溶液、溶菌酶溶液、卵清蛋白溶液、β-乳球蛋白溶液。
可选地，混匀方式包括搅拌、超声。
步骤三、搅拌蛋白质结晶乳浊液实现纳米尺度蛋白质晶体的生长。
可选地，晶体生长时间为4～24h。
步骤四、离心收集蛋白质晶体并使用结晶剂溶液重悬蛋白质晶体获得蛋白质晶体悬浊液。
可选地，离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将蛋白质晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联蛋白质晶体。
可选地，戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
可选地，戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗蛋白质晶体，冷冻干燥后获得最终的交联蛋白质晶体。
本发明的原理是通过控制结晶乳浊液的大小从而控制蛋白质晶体的尺寸。
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步的说明。
实施例1玉米油乳液制备纳米级血红蛋白晶体
步骤一、将玉米油和血红蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的血红蛋白结晶剂配方为：20％聚乙二醇，0.2M丁二酸，pH 7.0。
所述的玉米油和血红蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将血红蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成血红蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌血红蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度血红蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集血红蛋白晶体并使用血红蛋白结晶剂溶液重悬血红蛋白晶体获得血红蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃；
所述的通过透射电镜对纳米级血红蛋白晶体进行表征，其形貌如图1所示；利用EDS对晶体进行元素分析，结果如图2所示，主要元素为C、N、O、P属于蛋白质特征元素；利用电子衍射对晶格进行分析，衍射花样如图3所示，经过对晶格的测量可知该图为血红蛋白晶体的衍射花样。
步骤五、将血红蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联血红蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗血红蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联血红蛋白晶体。
实施例2液体石蜡乳液制备纳米级血红蛋白晶体
步骤一、将液体石蜡和血红蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的血红蛋白结晶剂配方为：20％聚乙二醇，0.2M丁二酸，pH 7.0。
所述的液体石蜡和血红蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将血红蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成血红蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌血红蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度血红蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集血红蛋白晶体并使用血红蛋白结晶剂溶液重悬血红蛋白晶体获得血红蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将血红蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联血红蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗血红蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联血红蛋白晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对血红蛋白晶体进行表征。
实施例3玉米油乳液制备纳米级溶菌酶晶体
步骤一、将玉米油和溶菌酶结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的溶菌酶结晶剂配方为：3％～6％NaCl；
所述的玉米油和溶菌酶结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将溶菌酶溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成溶菌酶结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌溶菌酶结晶乳浊液实现纳米尺度溶菌酶晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集溶菌酶晶体并使用溶菌酶结晶剂溶液重悬溶菌酶晶体获得溶菌酶晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将溶菌酶晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联溶菌酶晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗溶菌酶晶体，冷冻干燥后获得最终的交联溶菌酶晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对溶菌酶晶体进行表征。
实施例4液体石蜡乳液制备纳米级溶菌酶晶体
步骤一、将液体石蜡和溶菌酶结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的溶菌酶结晶剂配方为：3％～6％NaCl。
所述的液体石蜡和溶菌酶结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将溶菌酶溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成溶菌酶结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌溶菌酶结晶乳浊液实现纳米尺度溶菌酶晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集溶菌酶晶体并使用溶菌酶结晶剂溶液重悬溶菌酶晶体获得溶菌酶晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将溶菌酶晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联溶菌酶晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗溶菌酶晶体，冷冻干燥后获得最终的交联溶菌酶晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对溶菌酶晶体进行表征。
实施例5玉米油乳液制备纳米级卵清蛋白晶体
步骤一、将玉米油和卵清蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的卵清蛋白结晶剂配方为：3％～6％NaCl。
所述的玉米油和卵清蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将卵清蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成卵清蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌卵清蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度卵清蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集卵清蛋白晶体并使用卵清蛋白结晶剂溶液重悬卵清蛋白晶体获得卵清蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将卵清蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联卵清蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗卵清蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联卵清蛋白晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对卵清蛋白晶体进行表征。
实施例6液体石蜡乳液制备纳米级卵清蛋白晶体
步骤一、将液体石蜡和卵清蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的卵清蛋白结晶剂配方为：3％～6％NaCl。
所述的液体石蜡和卵清蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将卵清蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成卵清蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌卵清蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度卵清蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集卵清蛋白晶体并使用卵清蛋白结晶剂溶液重悬卵清蛋白晶体获得卵清蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将卵清蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联卵清蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗卵清蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联卵清蛋白晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对卵清蛋白晶体进行表征。
实施例7玉米油乳液制备纳米级β-乳球蛋白晶体
步骤一、将玉米油和β-乳球蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的β-乳球蛋白结晶剂配方为：20％～30％聚乙二醇。
所述的玉米油和β-乳球蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将β-乳球蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成β-乳球蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌β-乳球蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度β-乳球蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集β-乳球蛋白晶体并使用β-乳球蛋白结晶剂溶液重悬β-乳球蛋白晶体获得β-乳球蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将β-乳球蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联β-乳球蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗β-乳球蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联β-乳球蛋白晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对β-乳球蛋白晶体进行表征。
实施例8液体石蜡乳液制备纳米级β-乳球蛋白晶体
步骤一、将液体石蜡和β-乳球蛋白结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液。
所述的β-乳球蛋白结晶剂配方为：20％～30％聚乙二醇。
所述的液体石蜡和β-乳球蛋白结晶剂的比例为5:1(体积比)。
步骤二、将β-乳球蛋白溶液与结晶剂乳浊液混匀，形成β-乳球蛋白结晶乳浊液。
所述的混匀方式为搅拌。
步骤三、搅拌β-乳球蛋白结晶乳浊液实现纳米尺度β-乳球蛋白晶体的生长。
所述的晶体生长时间为4～8h。
步骤四、离心收集β-乳球蛋白晶体并使用β-乳球蛋白结晶剂溶液重悬β-乳球蛋白晶体获得β-乳球蛋白晶体悬浊液。
所述的离心转速为12000r/min，离心时间为10min，离心温度为4～20℃。
步骤五、将β-乳球蛋白晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联β-乳球蛋白晶体。
所述的戊二醛的浓度为2％～6％(体积比)。
所述的戊二醛交联时间为0.5～2h。
步骤六、用去离子水清洗β-乳球蛋白晶体，冷冻干燥后获得最终的交联β-乳球蛋白晶体。
所述的利用透射电子显微镜、X射线能谱、X射线衍射对β-乳球蛋白晶体进行表征。
Claims (4)
1.一种制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：将与水不互溶的溶剂和蛋白质结晶剂溶液搅拌混匀，制备出结晶剂乳浊液；所述的与水不互溶的溶剂与结晶剂溶液的体积比为3～6:1；
步骤2：将蛋白质溶液与步骤1制备的结晶剂乳浊液混匀，形成蛋白质结晶乳浊液；所述的蛋白质溶液与结晶剂乳液的体积比为1:10～15；
步骤3：搅拌蛋白质结晶乳浊液实现纳米尺度蛋白质晶体的生长；
步骤4：离心收集蛋白质晶体并使用结晶剂溶液重悬蛋白质晶体获得蛋白质晶体悬浊液；
步骤5：将蛋白质晶体悬浊液与戊二醛溶液混合，获得交联蛋白质晶体；
步骤6：用去离子水清洗蛋白质晶体，冷冻干燥后获得最终的交联蛋白质晶体；
所述蛋白质结晶剂溶液包括重量比为20％～25％的聚乙二醇溶液和3％～6％的NaCl溶液；
所述与水不互溶的溶剂包括液体石蜡或玉米油；
所述蛋白质溶液包括：血红蛋白溶液、溶菌酶溶液、卵清蛋白溶液、β-乳球蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其特征在于：所述步骤3的蛋白质晶体生长时间为8～24h。
3.根据权利要求1所述制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其特征在于：所述戊二醛溶液浓度为2％～6％。
4.根据权利要求1所述制备尺寸均匀的蛋白质纳米晶体的方法，其特征在于：所述步骤5的戊二醛交联时间为0.5～2h。
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| CN101092445A (zh) * | 2007-06-13 | 2007-12-26 | 哈尔滨工程大学 | 用离子液体结晶蛋白质的方法 |
| CN105462945A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-06 | 西北工业大学 | 可在空气中稳定存在的微纳尺度蛋白质晶体的制备方法 |
| CN109701029A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-03 | 南京大学 | 蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体及其制备方法 |
-
2022
- 2022-04-02 CN CN202210368292.9A patent/CN114853882B/zh active Active
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| CN109701029A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-03 | 南京大学 | 蛋白质介导的纳米晶体自组装聚集体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Preparation of hemoglobin crystals of desired size;Xiao-Qian Jin et al;《Acta Cryst.》;第第77卷卷;第1页 * |
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