CN107099846B - 一种预布微、纳米级籽晶蛋白质结晶板的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预布微、纳米级籽晶蛋白质结晶板的制备方法，首先获得蛋白质晶体并利用交联方式制得微、纳米级交联蛋白质籽晶储存液，其次将粘合剂均匀涂布于蛋白结晶板的结晶孔中，在粘合剂上散布微、纳米级交联蛋白质晶体，最后置于恒温干燥箱中干燥处理，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的新型结晶板。本发明能够在保证结晶条件筛选的优势的同时，彻底解决籽晶稳定性、使用方便性等问题。

Description

一种预布微、纳米级籽晶蛋白质结晶板的制备方法

技术领域

本发明涉及一种结晶板的制备方法，特别是通过稳定的微、纳米级交联蛋白质籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

背景技术

解析蛋白质晶体结构对了解蛋白质在生命体中的功能具有重要的作用。利用X-射线晶体衍射技术解析蛋白质三维结构的瓶颈是获得高质量的蛋白质晶体。蛋白质结晶有两个关键步骤，一是获得较多的蛋白质结晶筛选条件，二是获得较高质量的能用于X-射线衍射的蛋白质晶体。现在已经有多种可提高蛋白质结晶条件筛选数的方法，例如添加籽晶，控制温度，采用不同的结晶板等。文献1：“Hou H,Wang B,Hu S Y,et al.A comparativestudy on the quality of protein crystals obtained using the cross-diffusionmicrobatch and sitting-drop vapor diffusion methods[J].Crystengcomm,2015,17(29):5365-5371.”报道基于交互扩散的蛋白结晶板可显著提高蛋白质结晶成功率；文献2：“D'Arcy A,Villard F,Marsh M.An automated microseed matrix-screening methodfor protein crystallization[J].Acta Crystallographica,2007,63(4):550–554.”报道，添加蛋白质晶体作为蛋白质结晶的籽晶，可以使蛋白质结晶条件筛选数提高2.5～65倍。然而，尽管该技术效果很好，但仍然存在如下问题：1)该技术直接使用蛋白质晶体作为籽晶，但是由于蛋白质晶体非常脆弱、也不稳定，不能在常规实验室条件下长期储存或储存成本昂贵；2)该技术需要在每次结晶实验前，将籽晶添加到结晶板中，增加了实验者的人力与时间成本。由于这些原因，该技术在推广应用方面受到了明显的限制。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种在结晶板上预布交联微、纳米级蛋白质晶体作为籽晶的途径，能够在保证结晶条件筛选的优势的同时，彻底解决籽晶稳定性、使用方便性等问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

第一步，配制溶解蛋白质所需的缓冲液；称取蛋白质溶解于蛋白质缓冲液中制得蛋白质溶液；吸取蛋白质溶液和沉淀剂溶液均匀混合滴入蛋白结晶板的结晶孔中；密封蛋白结晶板，并将结晶板置于4-20℃环境中结晶；

第二步，把蛋白质晶体从蛋白结晶板的结晶孔中转移到交联剂中进行交联；交联实验体系放置于4-16℃环境中，反应过程不断搅拌，12-24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步，配置体积比为0.1～2％的醋酸溶液作为高分子聚合物壳聚糖、聚乙烯醇的溶剂；称取高分子聚合物，加入到醋酸溶液中，40-60℃下搅拌5-24小时，配制成质量体积比为0.1～1％的高分子聚合物粘合剂；

第四步，用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于40-80℃加热烘干；将0.1～1％的高分子聚合物粘合剂均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1～0.5μm厚度均匀的透明高分子聚合物粘合膜；将蛋白结晶板放置在超净台中风干1～10分钟；

第五步，在每个结晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布微、纳米级交联籽晶的悬浮液；将蛋白结晶板恒温干燥，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

本发明的有益效果是：

本发明所采用的交联蛋白质晶体作为籽晶为微、纳米级，微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶为蛋白质分子提供晶格匹配，能够促进蛋白质分子形成有序的分子团簇，降低形核壁垒，伴随着晶格的外延生长，进而形成晶核。添加微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶使晶体的形核生长过程处于结晶体系溶液浓度较低的状态，能够避免蛋白质结晶体系达到较高的浓度形核后蛋白质晶体依然在高浓度下生长。这种方法在增加结晶筛选条件数的基础上，同时也能提高蛋白质晶体的衍射质量。

本发明所采用的交联蛋白质晶体籽晶可稳定存在于常温环境并且可以适应pH等外界条件的变化。未经过交联处理的蛋白质晶体非常脆弱，很容易被氧化，不能承受大范围pH值的变动，而且只能储存于4℃温度条件下。经过交联的蛋白质晶体作为籽晶彻底解决了稳定性问题。

本发明所采用高分子聚合物粘合膜可将籽晶牢固黏附于蛋白质结晶板上。

本发明所采用高分子聚合物粘合膜对晶核形成具有促进作用。高分子聚合物粘合膜可以帮助吸附并聚集蛋白质分子，为结晶体系由最初均一的蛋白质分子状态向无序的类液滴分子团簇状态过渡提供帮助，有利于蛋白质晶体形核。

本发明为提高蛋白质结晶条件筛选数提供一种有效且省时的方法。直接使用蛋白质晶体作为籽晶需要在每次结晶实验前将籽晶添加到结晶板中，增加了实验者的人力与时间成本。由于这些原因，该技术在推广应用方面受到了明显的限制。而预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶的结晶板提前将微、纳米级交联蛋白质晶体布到结晶板上，解决了方便性问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，本发明包括但不仅限于下述实施例。

本发明提供一种预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板的制备方法，这种微、纳米级交联蛋白质籽晶可于室温稳定储存并且牢固黏附于结晶板上，可有效提高蛋白质结晶条件筛选的成功率，同时，在研究中，直接使用结晶板，可减少散布籽晶的流程，大幅减少研究者的时间和操作成本，能够取代现有实验室常用的结晶板，实现更高效的蛋白质结晶条件筛选和优化。

本发明所采用的方案：首先获得蛋白质晶体并利用交联方式制得微、纳米级交联蛋白质籽晶储存液，其次将粘合剂均匀涂布于蛋白结晶板的结晶孔中，在粘合剂上散布微、纳米级交联蛋白质晶体，最后置于恒温干燥箱中干燥处理，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。具体步骤如下：

第一步：获得蛋白质晶体。a)配制溶解蛋白质所需的缓冲液。b)称取蛋白质溶解于配制好的蛋白质缓冲液中制得蛋白质溶液。c)用机械手吸取蛋白质溶液和沉淀剂溶液均匀混合滴入蛋白结晶板的结晶孔中。d)密封蛋白结晶板，并将结晶板放入4-20℃控温箱中结晶；

第二步：利用交联方式制得交联微、纳米级籽晶。把蛋白质晶体用移液器从蛋白结晶板的结晶孔中转移到交联剂中进行交联。交联实验体系放置于4-16℃环境中，反应过程用转子不断的进行搅拌，12-24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步：制取高分子聚合物粘合剂。a)配置体积比为0.1-2％的醋酸溶液作为高分子聚合物壳聚糖、聚乙烯醇的溶剂。b)称取高分子聚合物，加入到0.1-2％的醋酸溶液中，40-60℃下用转子搅拌5-24小时，配制成质量体积比为0.1-1％的高分子聚合物粘合剂；

第四步：将粘合剂涂布于蛋白结晶板中。a)用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于40-80℃烘箱中加热烘干。b)用机械手将0.1-1％的高分子聚合物粘合剂均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1-0.5μm厚度均匀的透明高分子聚合物粘合膜。c)将涂布好0.1-1％的高分子聚合物粘合剂的蛋白结晶板放置在超净台中风干1-10分钟，以促进高分子聚合物粘合膜中水分及醋酸的挥发；

第五步：将交联籽晶散布于蛋白结晶板结晶孔的粘合剂上，干燥后即可获得蛋白质结晶板。a)用机械手在每个结晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布上微、纳米级交联籽晶的悬浮液。b)将散布好籽晶的蛋白结晶板置入恒温干燥箱中干燥处理，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

本发明的实施例主要包括以下两个方面：1.制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板；2.利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行蛋白质结晶条件筛选实验。

制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板主要包括以下五个步骤：

第一步：获得蛋白质晶体；

第二步：利用交联方式制得交联微、纳米级籽晶；

第三步：制备高分子聚合物粘合剂；

第四步：将粘合剂涂布于蛋白结晶板中；

第五步：将交联籽晶散布于蛋白结晶板结晶孔的粘合剂上，干燥后即可获得蛋白质结晶板。

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行蛋白质结晶条件筛选实验：

第一步：用蛋白质结晶条件筛选试剂盒进行蛋白质结晶条件筛选实验，将蛋白质与沉淀剂按一定比例混合，加入结晶板的结晶孔中，密封结晶板，将结晶板放于20摄氏度控温箱中结晶；

第二步：统计蛋白质结晶条件筛选数并观察蛋白质晶体形貌。

实例1

检测预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板提升了蛋白酶K蛋白质的结晶条件筛选数。

检测一种预布微、纳米级籽晶提高蛋白酶K蛋白质的结晶成功率的结晶板的具体方案主要包括以下两个方面：1.制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板；2.利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行蛋白酶K蛋白质结晶条件筛选实验。

制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板主要包括以下五个步骤：

第一步：获得溶菌酶蛋白质晶体。a)配制溶菌酶蛋白质缓冲液：浓度为0.1M，pH为4.6的醋酸钠缓冲液。b)购买于日本Seikagaku公司的溶菌酶蛋白质不再作进一步的纯化等处理直接溶入缓冲液中配成终浓度为20mg/ml的蛋白质溶液。c)用机械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl浓度为60mg/ml的氯化钠溶液混合均匀后滴入蛋白结晶板的结晶孔中。d)用胶带密封蛋白结晶板，并将蛋白结晶板放入4℃控温箱中结晶；

第二步：利用戊二醛作为交联剂制得交联微、纳米级籽晶。把溶菌酶晶体用移液器从结晶板的结晶孔中转移到温度为4℃的5％的戊二醛溶液中进行交联。交联实验体系放置于4℃环境中，反应过程用转子不断的进行搅拌，24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步：制取0.1％的高分子聚合物壳聚糖粘合剂。a)配置体积比为1％的醋酸溶液作为壳聚糖的溶剂。b)称取壳聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用转子搅拌过夜，配制成质量体积比为0.1％的壳聚糖溶液；

第四步：将粘合剂涂布于蛋白结晶板中。a)用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于60℃烘箱中加热烘干。b)用机械手系统将0.1％的壳聚糖溶液均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1μm厚度均匀的透明壳聚糖膜。c)将涂布好的0.1％的壳聚糖溶液的蛋白结晶板放置在超净台中风干3分钟，以促进壳聚糖膜中水分及醋酸的挥发；

第五步：将交联微、纳米籽晶散布于蛋白结晶板结晶孔的粘合剂上，干燥后即可获得蛋白质结晶板。a)用机械手系统在每个结晶孔的壳聚糖膜上散布微、纳米级交联籽晶悬浮液。b)将散布好籽晶的蛋白结晶板置入60℃的恒温干燥箱中干燥处理，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行蛋白酶K蛋白质的结晶条件筛选实验：

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板检测蛋白酶K蛋白质结晶条件筛选数提升情况主要有三个步骤。第一步：制备蛋白酶K(美国Sigma公司No.P6556)溶液，将蛋白酶K溶入pH为3，0.5M HEPES-Na缓冲溶液中配成终浓度为16mg/ml蛋白质溶液。第二步：利用IndexTM结晶条件筛选试剂盒进行结晶条件筛选实验。利用机械手将蛋白质溶液与沉淀剂按照1：1比例混合，在每个结晶孔中加入2μl的混合溶液，密封结晶板，置于20摄氏度控温箱中结晶7天。实验组采用预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板，对照组采用普通的蛋白结晶板。第三步：在显微镜下统计对照组与实验组蛋白酶K蛋白质结晶条件筛选数，并观察晶体形貌。

观察发现，预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板中晶体形貌优于普通的蛋白结晶板；此外相对于对照组，实验组的结晶条件筛选数有大幅度提升，结晶条件筛选成功率提高1.6倍。

实例2

检测预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板提升了过氧化氢酶蛋白质的结晶条件筛选数。

检测一种预布微、纳米级籽晶提高过氧化氢酶蛋白质结晶成功率的结晶板的具体方案主要包括以下两个方面：1.制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板；2.利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行过氧化氢酶蛋白质结晶条件筛选实验。

制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板主要包括以下五个步骤：

第一步：获得溶菌酶蛋白质晶体。a)配制溶菌酶蛋白质缓冲液：浓度为0.1M，pH为4.6的醋酸钠缓冲液。b)购买于日本Seikagaku公司的溶菌酶蛋白质不再作进一步的纯化等处理直接溶入缓冲液中配成终浓度为20mg/ml的蛋白质溶液。c)用机械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl浓度为60mg/ml的氯化钠溶液混合均匀后滴入蛋白结晶板的结晶孔中。d)用胶带密封蛋白结晶板，并将蛋白结晶板放入4℃控温箱中结晶；

第二步：利用戊二醛作为交联剂制得交联微、纳米级籽晶。把溶菌酶晶体用移液器从结晶板的结晶孔中转移到温度为4℃的5％的戊二醛溶液中进行交联。交联实验体系放置于4℃环境中，反应过程用转子不断的进行搅拌，24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步：制取0.1％的高分子聚合物壳聚糖粘合剂。a)配置体积比为1％的醋酸溶液作为壳聚糖的溶剂。b)称取壳聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用转子搅拌过夜，配制成质量体积比为0.1％的壳聚糖溶液；

第四步：将粘合剂涂布于蛋白结晶板中。a)用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于60℃烘箱中加热烘干。b)用机械手系统将0.1％的壳聚糖溶液均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1μm厚度均匀的透明壳聚糖膜。c)将涂布好的0.1％的壳聚糖溶液的蛋白结晶板放置在超净台中风干3分钟，以促进壳聚糖膜中水分及醋酸的挥发；

第五步：将交联微、纳米籽晶散布于蛋白结晶板结晶孔的粘合剂上，干燥后即可获得蛋白质结晶板。a)用机械手系统在每个结晶孔的壳聚糖膜上散布微、纳米级交联籽晶悬浮液。b)将散布好籽晶的蛋白结晶板置入60℃的恒温干燥箱中干燥处理，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行过氧化氢酶蛋白质的结晶条件筛选实验：

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板检测过氧化氢酶蛋白质结晶条件筛选数提升情况主要有三个步骤：第一步：制备过氧化氢酶(美国Sigma公司No.C40)溶液，将过氧化氢酶蛋白质溶入pH为3，0.5M HEPES-Na缓冲溶液中配成终浓度为10mg/ml蛋白质溶液。第二步：利用IndexTM结晶条件筛选试剂盒进行结晶条件筛选实验。利用机械手将蛋白质溶液与沉淀剂按照1：1比例混合，在每个结晶孔中加入2μl相应的混合溶液，密封结晶板，置于20摄氏度控温箱中结晶7天。实验组采用预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板，对照组采用普通蛋白结晶板。第三步：在显微镜下统计对照组与实验组过氧化氢酶蛋白质结晶条件筛选数，并观察晶体形貌。

观察发现，预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板中晶体形貌优于普通蛋白结晶板；相比于对照组，实验组的结晶条件筛选数有大幅度提升，结晶条件筛选成功率提高2.5倍。

实例3

检测预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板提升了葡萄糖异构酶蛋白质的结晶条件筛选数。

检测一种预布微、纳米级籽晶提高葡萄糖异构酶蛋白质结晶成功率结晶板的具体方案主要包括以下两个方面：1.制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板；2.利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行葡萄糖异构酶蛋白质结晶条件筛选数实验。

制备预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板主要包括以下五个步骤：

第一步：获得溶菌酶蛋白质晶体。a)配制溶菌酶蛋白质缓冲液：浓度为0.1M，pH为4.6的醋酸钠缓冲液。b)购买于日本Seikagaku公司的溶菌酶蛋白质不再作进一步的纯化等处理直接溶入缓冲液中配成终浓度为20mg/ml的蛋白质溶液。c)用机械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl浓度为60mg/ml的氯化钠溶液混合均匀后滴入蛋白结晶板的结晶孔中。d)用胶带密封蛋白结晶板，并将蛋白结晶板放入4℃控温箱中结晶；

第二步：利用戊二醛作为交联剂制得交联微、纳米级籽晶。把溶菌酶晶体用移液器从结晶板的结晶孔中转移到温度为4℃的5％的戊二醛溶液中进行交联。交联实验体系放置于4℃环境中，反应过程用转子不断的进行搅拌，24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步：制取0.1％的高分子聚合物壳聚糖粘合剂。a)配置体积比为1％的醋酸溶液作为壳聚糖的溶剂。b)称取壳聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用转子搅拌过夜，配制成质量体积比为0.1％的壳聚糖溶液；

第四步：将粘合剂涂布于蛋白结晶板中。a)用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于60℃烘箱中加热烘干。b)用机械手系统将0.1％的壳聚糖溶液均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1μm厚度均匀的透明壳聚糖膜。c)将涂布好的0.1％的壳聚糖溶液的蛋白结晶板放置在超净台中风干3分钟，以促进壳聚糖膜中水分及醋酸的挥发；

第五步：将交联微、纳米籽晶散布于蛋白结晶板结晶孔的粘合剂上，干燥后即可获得蛋白质结晶板。a)用机械手系统在每个结晶孔的壳聚糖膜上散布微、纳米级交联籽晶悬浮液。b)将散布好籽晶的蛋白结晶板置入60℃的恒温干燥箱中干燥处理，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即可获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板进行葡萄糖异构酶蛋白质的结晶条件筛选数实验：

利用预布微、纳米级籽晶的结晶板检测葡萄糖异构酶蛋白质结晶条件筛选数提升情况主要有三个步骤：第一步：制备葡萄糖异构酶(美国Hampton Research公司No.HR7)溶液，将葡萄糖异构酶蛋白质溶入pH为3，0.5M HEPES-Na缓冲溶液中配成终浓度为18mg/ml的蛋白质溶液。第二步：利用IndexTM结晶条件筛选试剂盒进行结晶条件筛选实验。利用机械手将蛋白质溶液与沉淀剂按照1：1比例混合，在每个结晶孔中加入2μl相应的混合溶液，密封结晶板，置于20摄氏度控温箱中结晶7天。实验组采用预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板，对照组采用普通蛋白结晶板。第三步：在显微镜下统计对照组与实验组葡萄糖异构酶蛋白质结晶条件筛选数，并观察晶体形貌。

观察发现，预布微、纳米级籽晶提高蛋白质结晶成功率的结晶板中晶体形貌优于普通蛋白质结晶板；相比于对照组，实验组结晶条件筛选数有大幅度提升，成功率提高4.5倍。

Claims (1)

1.一种预布微、纳米级籽晶蛋白质结晶板的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

第一步，配制溶解蛋白质所需的缓冲液；称取蛋白质溶解于蛋白质缓冲液中制得蛋白质溶液；吸取蛋白质溶液和沉淀剂溶液均匀混合滴入蛋白结晶板的结晶孔中；密封蛋白结晶板，并将结晶板置于4-20℃环境中结晶；

第二步，把蛋白质晶体从蛋白结晶板的结晶孔中转移到交联剂中进行交联；交联实验体系放置于4-16℃环境中，反应过程不断搅拌，12-24小时后制得微、纳米级籽晶储存液；

第三步，配制 体积比为0.1～2％的醋酸溶液作为高分子聚合物壳聚糖、聚乙烯醇的溶剂；称取高分子聚合物，加入到醋酸溶液中，40-60℃下搅拌5-24小时，配制成质量体积比为0.1～1％的高分子聚合物粘合剂；

第四步，用去离子水洗涤蛋白结晶板三次，并置于40-80℃加热烘干；将0.1～1％的高分子聚合物粘合剂均匀的涂布于蛋白结晶板上，形成一层0.1～0.5μm厚度均匀的透明高分子聚合物粘合膜；将蛋白结晶板放置在超净台中风干1～10分钟；

第五步，在每个结晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布微、纳米级交联籽晶的悬浮液；将蛋白结晶板恒温干燥，直至蛋白结晶板上溶液完全干燥，即获得预布微、纳米级交联蛋白质晶体作为籽晶、用于提高蛋白质结晶成功率的结晶板。