JP4180060B2 - シゾンを選択的に培養する培地 - Google Patents

Description

この発明は、シゾン（Cyanidioschyzon merolae）を選択的に培養するための培地に関する。

シゾンは、温泉に生息する単細胞の藻の一種であり、約２０億年前に出現した真核生物の起源に最も近く位置する生物である。シゾンは、１つの細胞に核とミトコンドリアや葉緑体など真核生物に共通するオルガネラを最小単位で含んでいる単純な構造である。
このように、シゾンは、現在地球上に存在する全ての生物の生命の基になる物質を含んでいるとともに、構造が単純であるため、実験や解析がやりやすいという特徴を持っている。また、シゾンは、細胞壁を持っていないため、細胞内物質を取り出しやすいという生化学的な解析に有利であるとともに、本願の発明者らによってゲノム解読も完了しているので、その情報を基盤に応用的な研究に利用することも可能である。

つまり、シゾンは、真核細胞の基本原理の謎に迫るための実験材料として最適である。そこで、実験材料としてのシゾンを効率良く培養する必要性が生じる。
なお、シゾンは、pH１．５、温度４５℃という極限環境に棲息するので、培養するためには強酸性の環境が必要である。このような強酸性の培地として、アレン培地を用いることがある。
上記アレン培地とは、強酸性の液体培地であり、その組成は、図８の表５に示すとおりである。なお、上記表５中のＰ４metalの組成を、図９の表６に示している。

シゾンの場合、pH１．５、温度４５℃という極限環境に棲息するが、このような環境でも棲息可能な、シゾン以外の藻類やカビなどもあり、自然界においてはそれらが一緒に棲息している場合がほとんどである。そのため、アレン培地を利用してシゾンを培養する場合に、同じ生息環境にいる藻類やカビの混入が起こる可能性がある。培養中に、上記のような他の生物の混入を許したのでは、研究対象として必要なシゾンのみを取り出すことが困難になる。
そこで、この発明の目的は、他の生物の混入を防止して、シゾンのみを選択的に培養することが可能な培地を提供することである。

第１の発明の培地は、シゾンが増殖可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含んだ点に特徴を有する。
第２の発明は、上記第１の発明を前提とし、アクチン重合阻害剤がサイトカラシンである点に特徴を有する。
第３の発明は、上記第１または第２の発明を前提とし、クエン酸を添加した点に特徴を有する。
第４の発明は、上記第１〜第３の発明を前提とし、ゲル状を維持するための支持体を用いてプレート状にした点に特徴を有する。

第１〜第４の発明の培地によれば、アクチンタンパク質の収縮リングを利用して分裂増殖する全ての生物の増殖を阻止することができる。従って、シゾンの培養時に、シゾン以外の藻類やカビの増殖を阻止でき、シゾンだけを培養することができる。その結果、実験材料として必要なシゾンを効率的に培養し、採取することができるようになる。

第３の発明によれば、シゾンを選択的に培養するだけでなく、その増殖率を高め、より効率良くシゾンを増殖させることができる。
第４の発明によれば、プレート培地が得られるので、液体培養ではできない、生成した藻類のコロニーを個別に分離して採取することが可能になる。

この発明の発明者らは、シゾンのゲノム解読に成功し、その結果、シゾンの細胞分裂がアクチンタンパク質を利用していないことを突き止めた。具体的には、シゾンがどのような方法で細胞分裂を行っているのかは明らかになっていないが、アクチンタンパク質を利用しない別の方法で細胞分裂を行っていると考えられる。
これに対し、他の、ほとんど全ての真核細胞は、アクチンタンパク質からなる収縮リング（アクチンリング）を利用して細胞分裂を行うことがわかっている。

そこで、培地にアクチン重合阻害剤を含めば、アクチンタンパク質の合成が阻害され、アクチンリングを利用して細胞分裂を行う生物は、増殖ができなくなり、その結果、棲息できなくなるはずである。
一方、シゾンは、細胞分裂、すなわち増殖にアクチンリングを利用しないので、アクチン重合阻害剤によって増殖が抑制されることがない。
つまり、アクチン重合阻害剤を含むとともに、シゾンの増殖が可能な強酸性である、この発明の培地を用いれば、シゾンとともに混入した他の藻類やカビなどは、棲息できなくなる。その結果、この培地では、シゾンだけが選択的に培養されることになる。

次に、この発明の培地の第１実施例として、アクチン重合阻害剤を含んだ強酸性のプレート培地について説明する。なお、強酸性とは、ｐＨが約３．０以下であり、紅藻のシアニジウム属が棲息可能なｐＨである。
まず、この発明のプレート培地の、大まかな作成手順を図１に示す。

つまり、この発明のプレート培地を作製するためには、基礎培養体（液体）と、支持体溶液と、サイトカラシン溶液とを、それぞれ作製し、これらを別々に加熱滅菌処理する。そして、加熱滅菌処理を行った各溶液を混合するが、混合する前にそれぞれ別々に、所定温度まで冷ますようにする。そして、上記混合液をシャーレなどの型に流し込んでさらに冷やし固める。
なお、培地作成の作業は全てクリーンベンチを用いた無菌作業である。

上記基礎培養体は、図２の表１に示すように、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（硫酸アンモニウム）と、ＫＨ₂ＰＯ₄（リン酸水素二カリウム）と、ＭｇＳＯ₄（硫酸マグネシウム）と、ＣａＣｌ₂／２Ｈ₂Ｏ（塩化カルシウム）と、Ｐ４metalとからなる。
上記成分のうち、Ｐ４metal以外、すなわち、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（硫酸アンモニウム）と、ＫＨ₂ＰＯ₄（リン酸水素二カリウム）と、ＭｇＳＯ₄（硫酸マグネシウム）と、ＣａＣｌ₂／２Ｈ₂Ｏ（塩化カルシウム）とを、それぞれ５．２４（ｇ）、１．０８（ｇ）、１．００（ｇ）、０．２８（ｇ）を１（ｌ）の水に溶解し、それにＨ_２ＳＯ₄（硫酸）を添加して溶液のｐＨを１．５に調整する。この溶液を１２１℃で２０分間の加熱加圧滅菌処理をする。

また、図９の表６に示すＰ４metal成分を１（ｌ）の水に溶解し、Ｐ４metal溶液を作成し、これを、１２１℃で２０分間の加熱加圧滅菌処理をし、８（ｍｌ）を、上記（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄などを含み加熱加圧処理を行った溶液に混合すると、滅菌処理した基礎培養体が完成する。
上記支持体溶液は、ゲランガム溶液であり、水１（ｌ）にゲランガム１０（ｇ）を溶解して作製する。

さらに、上記各溶液とは別に、この発明のアクチン重合阻害剤としてのサイトカラシンを水に溶解し、サイトカラシン溶液を作製する。
そして、上記ゲランガム溶液と、サイトカラシン溶液とを別々に、１２１℃で２０分間の加熱加圧滅菌処理を行う。その後、あら熱を取り、上記基礎培養体、ゲランガム溶液、サイトカラシン溶液のそれぞれが、７０℃位になったところで、基礎培養体とゲランガム溶液とを１：１で混合し、サイトカラシン溶液を、溶液１（ｌ）に対して、サイトカラシン量が１０〜１５（ｍｇ）だけ混合し、培地用溶液を作製する。

次に、この培地用溶液を２０（ｍｌ）、シャーレに流し込む。シャーレを放置し、冷やし固めたものが、この発明のシゾンを選択的に培養する培地である。
また、実際に、シゾンを培養する際には、シャーレ内の上記プレート培地上にシゾンを含んだ溶液を滴下し、インキュベータ内で、４２℃〜４５℃、湿度約７０％、光量５０００（ｌｘ）を維持する。インキュベータ内で、上記シャーレには蓋を被せるとともに、その周囲をテープで密閉し、乾燥を防ぐようにする。

上記実施例のプレート培地には、培地用溶液に対して１０〜１５（ｍｇ／ｌ）濃度のサイトカラシンが含まれている。このように培地にサイトカラシンを含ませたのは、シゾン以外の生物の増殖を抑制し、シゾンを選択的に培養するためである。サイトカラシンによってカビやその他の藻類の増殖が抑制されることを実験１によって確認した。
（実験１）
上記した第１実施例のプレート培地と同様にして、培地１（ｌ）に対してサイトカラシンを８（ｍｇ）、１０（ｍｇ）含んだ培地と、サイトカラシンを含まない培地（コントロール）とを作成し、各培地でシゾンを培養した。
上記３つの培地は、インキュベータ内で、４２℃〜４５℃、湿度約７０％、光量５０００（ｌｘ）という、全て同じ培養条件下においた。そして、培養開始から１週間後にカビの発生状体を顕微鏡観察し、その結果を図３の表２に示す。

表２に示すように、サイトカラシンを含まない培地（コントロール）と、サイトカラシンが８（ｍｇ／ｌ）の培地は、どちらもカビの発生が見られた。特に、サイトカラシンを含有しないコントロールでは、カビの量が多く、シゾンは死滅しているように見えた。
なお、この実験によって確認されたカビは、高温、強酸性の環境下で棲息可能なカビである。
一方、サイトカラシンを１０（ｍｇ／ｌ）含有した培地では、カビの発生は全く見られず、シゾンのコロニーが生成されていた。また、カビ以外の、高温、強酸性の環境下で棲息可能な生物、例えば、シゾン以外の、紅藻のシアニジウム属の棲息もなかった。
このように、サイトカラシンにより、シゾン以外の生物の発生を抑制して、シゾンを選択的に培養することができた。

次に、クエン酸を含有した第２実施例の培地について説明する。
クエン酸を含有したこの第２実施例の培地は、図４に示すように、基礎培養体、サイトカラシン溶液、支持体溶液を、上記第１実施例の培地と同様に作成するとともに、さらに、２０（％）のクエン酸溶液を作製する。
そして、クエン酸溶液も、１２１℃で２０分間の加熱滅菌処理を行い、加熱滅菌処理を済ませた他の溶液と一緒に混合して、培地用溶液を作成する。そして、この培地用溶液をシャーレに流しこんで冷やし固め、プレート培地を作製する。
なお、４種の溶液を混合する際には、予め、あら熱をとり、５０℃くらいにしておく。また、クエン酸溶液以外の３種の溶液の混合比は、上記第１実施例と同じであり、これら３種の混合液１（ｌ）に対して、上記クエン酸溶液を混合する。ただし、クエン酸溶液の混合量は、培地に対するクエン酸濃度に応じて調整する。

また、上記培地用溶液を作製する過程で、基礎培養体と、支持体溶液と、クエン酸溶液とを別々に加熱滅菌した後、あら熱を取ってから混合したのは、支持体溶液に含まれるゲランガムが酸に弱いためである。もしも、ゲランガム溶液と基礎培養体とを混合してから、加熱滅菌処理を行うと、その後、温度を下げてもゲル状にならず、プレート培地を作成することができないことを確認している。このことは、加熱滅菌処理時のような高温で、かつ、強酸性の環境におかれると、ゲランガムの構造が破壊されてしまうためと予想される。

上記のようにして作成したクエン酸を含有したプレート培地を用いて、シゾンの増殖状態を確認する実験２を行った。
（実験２）
上記した作成手順に従って、クエン酸濃度を０．０５（％）、０．１（％）、１．０（％）、２．０（％）、５．０（％）にした培地と、クエン酸を含まない培地（コントロール）とを作成し、各培地で、紅藻のシアニジウム属としてシゾンを培養した。この際、各培地に植えつけるシゾンの細胞密度は、２．７×１０６（匹／ｍｌ）とした。
なお、培地に植えつける細胞密度が１．０×１０６（匹／ｍｌ）以上の場合、１．０×１０６（匹／ｍｌ）未満の場合と比べて、増殖率が高いことを確認している。
シゾンの培養の際、上記６つの培地は、インキュベータ内で、４２℃〜４５℃、湿度約７０％、光量５０００（ｌｘ）という、全て同じ培養条件下においた。そして、培養開始から１週間後にカビの発生状体を顕微鏡観察し、その結果を図５の表３に示す。
この実験２で用いるコントロールは、上記第１実施例の培地と同じ、サイトカラシンを含んだ培地である。

図５の表３および図６の写真に示すように、クエン酸を含んだ培地は、２ヶ月後の時点で、クエン酸を含まない培地（コントロール）と比べてシゾンの増殖率が上がっていることがわかった。この実験２の結果からは、クエン酸濃度が２．０（％）の培地で、最もシゾンの増殖率が高いことがわかるが、他の濃度、すなわち、０．０５（％）、０．１（％）および１．０（％）でも、コントロールとの差は明らかであった。一方、５．０（％）の濃度になると生育阻害をもたらした。
また、詳細は省略するが、クエン酸の替わりに酢酸を含んだ培地についても実験を行ったが、酢酸の場合、コントロールとの差はなかった。

上記のように、クエン酸を含むことによってシゾンの増殖率が高まる理由は、以下のように推測できる。
シゾンなどの光合成は、細胞内の葉緑体で行われ、太陽エネルギーを使って、ＣＯ_２（二酸化炭素）と水から、デンプンを合成して酸素を放出する。合成したデンプンは、ミトコンドリア内のＴＣＡ（トリカルボン酸）回路で酸素を使って分解され、エネルギー源（ＡＴＰ）となる。このエネルギー源が豊富ならば、生物の生育が早まり、その結果増殖率も高まると考えられる。

一方、細胞に取り込まれたＣＯ_２は、葉緑体内でクエン酸、オキザロ酢酸、リンゴ酸などの合成にかかわる多数の酵素の連鎖からなるカルビン回路を経てデンプンを合成する。
また、ミトコンドリア内の細胞内呼吸では、糖分がピルビン酸に分解され、ピルビン酸はミトコンドリア内にあるＴＣＡ（トリカルボン酸）回路に入り、エネルギー源（ＡＴＰ）を合成し、その過程でＣＯ_２を放出する。
そこで、上記カルビン回路やＴＣＡ回路を早く回転させることによって、代謝活性が上がり、その結果としてシゾンの増殖率を高めることができると考えられる。

そのために、上記ＴＣＡ回路の中間物質であるクエン酸を培地に添加すると、このクエン酸が細胞内に取り込まれ、ＴＣＡ回路がよりスムーズに回転させられると考えられる。

また、カルビン回路やＴＣＡ回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であれば、クエン酸以外であっても、増殖率を高める効果を期待できるが、カルビン回路やＴＣＡ回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であっても、細胞内に取り込まれなければ、上記のような効果は得られない。つまり、クエン酸は、細胞内に取り込まれやすい物質と考えられる。
なお、クエン酸以外の物質についても、増殖率を高める効果がないか確認するために、実験３を行い、その結果を図７の表４に示す。

（実験３）
上記した第２実施例の培地の作製方法に従って、クエン酸の代わりに、図７の表４に示すアミノ酸、核酸、糖、その他の各物質を用いて、それぞれプレート培地を作製した。具体的には、クエン酸溶液の代わりに、各物質の水溶液を作成し、その水溶液を加熱滅菌後、それぞれ加熱滅菌後の、上記基礎培養体およびゲランガム溶液に混合して冷やし固めた。
そして、それぞれの培地に、シゾンを植え付け、４２℃〜４５℃、湿度７０％を保ち、光量なども同一条件で培養した。

実験結果は、図７に示すように、いずれの物質も、図５の表３に示すコントロールと比べて増殖率を高める効果は無かった。しかも、尿素と、ＮａＣｌを添加した培地では、コントロールよりも増殖率が下がり、２週間後には死滅してしまった。

以上のように、クエン酸を含んだプレート培地は、シゾンの増殖率を高めることがわかった。また、詳細は省略するが、支持体であるゲランガムを含まない液体培地であっても、クエン酸を含むことによって、上記実施例と同様に、増殖率が高くなることをシゾンで確認済みである。
ただし、プレート培養なら、例えば、生育状態の異なる突然変異体を採取することが可能であるが、液体培養では、個々の細胞を区別することは、ほとんど不可能である。

なお、上記第１，第２実施例で説明した培地の組成は、一例であり、この発明の培地はこれに限定されるものではない。要するに、シゾンが生息可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含有していれば、他の生物の混入を阻止してシゾンを選択的に培養することができる。
特に、基礎培養体には、硫酸とアンモニウムを含むことが好ましい。硫酸によって、硫酸環境に生息するシゾンにとって好ましい環境を作ることができる。また、アンモニウムは、光合成を行う際の窒素源となるからである。

また、支持体としてゲランガム濃度は、上記実施例では、培地全体に対して約０．５％にしているが、プレート培地とするためには、０．４〜０．６（％）くらいが好ましい。ゲランガム濃度が高すぎると、プレートが硬くなってしまい、培地が硬すぎると紅藻の生育が悪いという結果が出ている。一方で、ゲランガム濃度が低すぎた場合、生育には問題がない。しかし、ゲランガム濃度が低すぎて、培地が液体状になってしまうと、特定の細胞を採取できるという、プレート培地のメリットは得られなくなる。

第１実施例の培地の作成手順を示した図である。 基礎培養体の組成の一例を示した表である。 実験１の結果を示した表である。 第２実施例の培地の作成手順を示した図である。 実験２の結果を示した表である。 実験２の結果を示した写真である。 実験３の結果を示した表である。 アレン培地の組成を示した表である。 アレン培地に用いるＰ４metalの組成を示した表である。

Claims (4)

1. シゾンが増殖可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含んだことを特徴とするシゾンを選択的に培養する培地。
2. 上記アクチン重合阻害剤がサイトカラシンである請求項１に記載のシゾンを選択的に培養する培地。
3. クエン酸を添加した請求項１または２に記載のシゾンを選択的に培養する培地。
4. ゲル状を維持するための支持体を用いてプレート状にした請求項１〜３のいずれか１に記載のシゾンを選択的に培養する培地。

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