JPH04506154A - 細胞培養培地及びその作成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 細胞培養培地及びその作成法 本発明は、微生物、植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む原核及び真核細胞のため の新規の増殖培地に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は任意 に安定同位体で標識化した藻類の加水分解産物を含んで成るこのような増殖培地 に関する。

今日、安定同位体で標識化した化合物には多（の医学的及び研究的用途が存在す る。例えば、構造決定領域及び代謝経路解明の領域では、重水素、＋４０又は１ ５Ｎ標識高分子が重要な役割を演する。安定同位体による標識化は組換え蛋白質 の構造決定〔例えばトルヒア（Ｔｏｒｃｈｉａ。

Ｄ、Ａ、）らのＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１１０巻、２３２０ペー ジ、１９８８参照〕及び連鎖法菌種及びプセウドモナス種のような微生物からの 多糖の構造及び代謝の決定〔ウエツセルズ（Ｗｅｓｓｅｌｓ、Ｍ、Ｒ，）らのＪ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２巻、８２６２ページ、１９８７及びクニレ ル（Ｋｎｉｒｅｌ、　Ｙ、Ａ、）らのＢｕｒ、　Ｊ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

１００巻：１８９ページ、１９８７）に利用されている。安定同位体標識化は抗 生物質の構造及び生合成の決定に〔例えば、ブトクー（Ｂｅｕｔ　ｌｅｒ、　Ｊ 、　Ａ、　）らのＪ、　Ｎａｔ　１．　Ｐｒｏｃ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、５１巻、５６２ページ、１９８８３及び標識トレーサー、例えばアミノ 酸の生合成〔ウオルカー（Ｗａ　１ｋｅｒ、　Ｔ、　Ｅ、　）及びロンドン（Ｒ ，Ｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ）のＡｐｐｌ、Ｅｎｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５３巻、 ９２ページ、１９８７３にも用いられた。

種々の微生物によってつくられる化合物及び高分子を標識するために用いられる 実用的かつ便利な方法は、問題の安定同位体で標識化した栄養を一つ以上含む増 殖培地で微生物を培養することである。例えば、市販されているｐｅｒｄｅｕｔ ｅｒａｔｅｄブドウ糖は、ｐｅｒｄｅｕｔｅｒａｔｅａ、　Ｅ、　ｃｏｌｉ。

の作成のためにはすぐれた基質である。しかしながら、ｐｅｒｄｅｕｔｅｒａｔ ｅｄブドウ糖は高価であるため、安い市販の大規模細胞培養培地のためにそれを 使用することはできない。そのため、所望の微生物、植物細胞及び哺乳動物細胞 の増殖を支持することのできるその他の標識物質が探索されてきた。

本発明の一つの焦点は、藻類ベースの増殖培地に向けられている。“藻類”及び “藻類ベース”という用語はここでは、特に記さない限り、“ｍｉｃｒｏａｌｇ ａｅ”を指す。

藻類ベースの増殖培地は、細菌にとって、急速増殖を支えるすぐれた栄養源であ ることがわかった。藻類は光合成的に、細胞材料のための唯一の炭素源としてＣ ０２を、水素源としてＨｔＯを取り込んで生長する。数種類の藻類、例えばＣｈ ｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏ ｓａ及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｏｂｌｉｑｕｕｓは、無機塩と、炭素源とし てのＣＯ２を含む９９．９％Ｄ２０（ここでは純り、Ｏと定義される）中で生長 することがわかった。これらの条件下では、重水素は藻類のすべての水素を置換 する。例えば、テラカー（Ｔａｅｃｋｅｒ、　Ｒ，Ｇ、　）らのＢｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｑ、　１３巻、７７９ページ（１９７１）参照。藻類は炭 素源として９９．９％１″ＣＯ□を用いるか〔ベーレンス（Ｂｅｈｒｅｎｓ　） ら、応用藻類学雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ） ］　、窒素源として、ＮａＮ０＊又はＫＮＯ，の代わりにそれぞれＮａ”Ｎｏ、 又はに１５ＮＯ３を用いることによっても生長する。藻類は蛋白質及び炭水化物 に富むから、このような条件下で生長した藻類は細胞内の相当する成分として” Ｈ，”Ｃ又はＩ５Ｎを一様に取り込む。例えば、クレスピ（Ｃｒｅｓｐｉ　Ｈ， Ｌ、）らの、自然（Ｎａｔｕｒｅ）　１８４巻、　７２９ページ（１９５９）参 照。

有機栄養生物を培養し、安定同位体で標識するための藻類ベース増殖培地の開発 に関する文献中最初の報告は、ブレイク（Ｂｌａｋｅ）ら（Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、 　Ｓｃｉ、　５０巻、　４２５ページ（１９６１）　）によるものである。重水 素−藻類ベース増殖培地を作るための彼らの一般的方法は、重水素化藻類を酸化 重水素と共にスラリーにし、それからそのスラリーを沸騰酸化重水素に加えて藻 類の細胞壁をこわし、細胞成分を放出させることを含む。その溶液を冷やし、遠 心分離し、残渣をメタノールと石油エーテルの混液で抽出し、色素及び脂質を除 去する。不溶性部分を乾燥し、それからＩＮ塩化重水素と共に２４時間還流する ことにより加水分解する。溶液を濾過し、残渣を捨て、加水分解産物を炭酸銀で 処理して塩化物を除く。その溶液を遠心分離し、上澄液をイオン交換カラムを通 す。カラムを洗い、非イオン性フラクション、主としてグルコース及びマンノー スを除く。その後、主としてアミノ酸から成るイオンフラクションを、ｌＮＨＣ ｌを溶出することによりカラムから除去する。

この方法を用いて得られた加水分解産物は種々の有機物を培養及び標識化するの に有用であることがわかったとはいえ、より一層の改善がめられた。市販製品の 製造にはこの方法は用いられていなかった、そこで藻類ベース増殖培地を使用し たいと思う研究者は自分で、購入した原料から培地を作らなければならなかった 。ブレイクらが開発した方法も、費用がかかり、時間を浪費し、種々の実験室的 実施法によって、−貫しない結果が得られる、という欠点をもっていた。その上 、この方法によって作られた培地上で種々の微生物の細胞を培養しようという試 みは不満足に終わることが多かった；細胞増殖が限られていたからである。よっ て、研究者が直接植え付けることができる特徴づけられた標識藻類ベース増殖培 地を使用することができれば、非常に好都合である。

本発明の目的は、種々の細胞を培養し、標識するために研究者が直接使用できる 標識化藻類ベース増殖培地と、それら細胞がつくる化合物及び高分子を提供する ことである。

本発明のもう一つの目的は、効率的細胞増殖を支持できる藻類ベースの増殖培地 を作ることである。

本発明のその他の目的は、下記の本発明の詳細を読むことによって明らかになる 。

細胞培養のための基質をつくるために有用な加水分解産物の製法は、 （ａ）　藻類の水性スラリーを形成し、（ｂｌ　上記藻類の細胞壁をこわし、 （Ｃ）上記藻類に、酸濃度的２ないし約３Ｍとなるように十分の酸を加え、それ から上記の藻類中の蛋白質を部分的に加水分解し、 （ｄ）　生成した加水分解産物の酸溶性フラクションから酸不溶性フラクション を除去し、 （ｅ）　溶性フラクションから、そのフラクションのｐＨが少な（とも約１．０ になるまで酸を除去し、（ｆｌ　加水分解産物を塩基で滴定して加水分解産物中 に残っている酸を塩に変え、ｐＨを約６．５ないし約７．０の範囲に調節する ことから成る。

加水分解産物を水又はり、０と混合し、滅菌濾過し、付加的塩及び緩衝液を所望 のように加えて、細胞培養を支持するために所望のすべての栄養を含む基質をつ （る。

本発明の方法によって作られる加水分解産物は細菌、真菌、酵母及び植物及び哺 乳動物細胞の増殖培地として適している。

本発明の一実施態様において、藻類は少なくとも一種類の安定同位体で標識化さ れる。そのような標識化藻類を基にした培地で増殖した細胞は標識を組み込む。

このような細胞によってつくられる高分子又は化合物は標識を組み込むはずであ る。

本発明の方法にしたがって、細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動 物細胞を含めた広範囲の細胞の増殖のための基質として使用される藻類ベースの 増殖培地かつ（られる。本発明の一実施態様においては、増殖培地をつくるよう に処理された藻類が安定同位体で標識化される。

本発明の増殖培地をつくるために、藻類は従来の方法にしたがって培養される。

好都合なことに、藻類は、撹拌培地全体に光りを一様に分布して供給することが できるフォトバイオリアクターに培養できる。藻類の種々様々の種類を用いて本 発明の増殖培地をつくることができる。適した藻類としては、Ｃｈｌｏｒｅｌｌ ａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、　ＮａｖｉｃｕｉａＳｐｉｒｕｌｉｎａ及びＣｈｌａｍ ｙｄｏｍｏｎａｓ種がある。

一つ以上の安定同位体で標識した藻類を用いることが所望である場合、藻類の増 殖培地は、所望同位体の無機源を元素の単独源として含む。藻類に挿入され得る 安定同位体には、２　）１　、１２０．１５　Ｎ及び１７０がある。上で論じた ように、これら安定同位体の一つ以上で藻類を標識することは当業者には公知で ある。

上記のように、藻類増殖のための好都合な炭素源は、Ｃ０２である。培養中に− その間に炭素が代謝される一培養培地のｐＨは上がる。培地のｐＨは約７．８に 保たれるのが所望である。ｐＨが約８．０に達したとき、十分量の付加的ＣＯ２ を培地中をぶくぶ（通し、ｐＨを再び約７．８に戻す。

光合成は酸素（Ｏｌ）を発生する；それは定期的に、好都合にはｐＨが８．０に 達する時に（すなわちＣＯ！添加の直前）除去されるのが好適である。藻類がフ ォトバイオリアクター中で増殖する場合、フォトバイオリアクターはソレノイド バルブの使用によって開けられ、０．は排気流中に除去される。所望ならば、そ の排気流を２ＭＫＤＨ溶液を通過させて、共存するかも知れないＣＯｌを捕らえ ることができる。ＣＯｔの炭素が標識されている場合４　には、この段階が所望 である。

ひとたび藻類が所望密度まで培養された場合、従来の方法によってそれらを収穫 する。細胞壁崩壊が収穫プロセスの一部としておきなかった場合には、それら細 胞の水性スラリーを処理して細胞壁を溶解する。溶解が従来の方法、例えば（こ れに制限されるものではない）スラリーを沸騰水に加え、それから遠心分離して 液体を除去するか、超音波処理及びフランスプレスを含めた機械的破壊によるか 、又は熟練せる当業者には公知のその他の方法による。機械的破壊が好適である 。

生成した細胞破片を、その後酸で処理して藻類の蛋白質フラクションを部分的に 加水分解する。蛋白質が実質上すべてのアミノ酸にまで完全に加水分解しないよ うに加水分解条件を選ぶ。加水分解は、生成加水分解産物が小ポリペプチド並び に遊離アミノ酸を含むような条件下で行われる。生成加水分解産物の約３５重量 ％、より好適には約４０ないし５０重量％が小ボリペプチドー一般的には約２〜 １０アミノ酸から成るポリペプチド−であることが好都合である。理論によって 縛られたくはないが、小ペプチド類を含む増殖培地は、単一のアミノ酸を含む匹 敵培地よりより多くの細胞を支えるようにみえる；若干のペプチドは遊離アミノ 酸よりも容易に細胞に吸収されるようにみえる。

このような部分的加水分解は、例えばおだやかな酸加水分解を用いて実現できる 。これは、藻類の水性スラリーに酸を加えてスラリーの最終的酸濃度を約２ない し３Ｍ、より好適には約２．５Ｍとし、酸性になったスラリーを撹拌して加水分 解を開始させ、それから沸騰するまで加熱して反応効率を高めることから成る。

好適な酸は１（ＣＩであるか、硫酸及びトリフルオロ酢酸を含むその他の酸も使 用できる。概して、約２−４時間の加熱及び還流が蛋白質を所望程度加水分解す るには十分であることがわかった。

加水分解反応が完了したとき、酸に不溶の藻類フラクションを溶性フラクション から分離し、捨てる。不溶性フラクションは主として脂質と色素を含む。加水分 解産物の溶性フラクションは主として砂糖、アミノ酸、及び部分的に加水分解さ れた蛋白質（すなわちペプチド）を含む。

それから酸を溶性フラクションから除去する。第一段階として、そのフラクショ ンを真空下で加熱し、酸の多くを蒸発することが好都合である。この操作は、も し必要ならば、最低的１．０のｐＨが得られるまで１回以上繰り返すことができ る。

それからその加水分解産物を、加水分解産物のｐＨが約４−９の範囲、より好適 には約６．５ないし７の範囲に上昇するまで塩基で滴定する。加水分解反応に用 いる酸がＨＣｌであった場合、選択される塩基はＮａＯＨであることが都合がよ い；塩基を添加すると酸を中和して塩化ナトリウム−最終的加水分解産物中の所 望成分−を形成する。

使用できるその他の塩基としてはＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨｚ）　、及びＢａＣＯ５が ある。酸溶性加水分解産物は清澄になる。

中和された加水分解産物は濃縮される。これは、凍結乾燥、回転蒸発又はオヴン 乾燥を含めた従来の方法によって実現する。生成産物は吸湿性粒状固体である。

本発明の方法によってつ（られた固体培地は約３５％ないし約５０％の小ペプチ ド、約２２％ないし約３０％のアミノ酸、約５％ないし約１５％の総還元糖及び 砂糖（それぞれ主としてアルドヘキソース及び痕跡量のケトヘキソース）及び約 ７％ないし約１５％の水から成ることができる。それらは約４０％ないし約４５ ％のペプチド、約２４％ないし約２８％のアミノ酸、約５％ないし約１５％の還 元糖及び約７％ないし約１５％の水から成ることがより好適である。

最終的組成物を作るために、加水分解産物を水に加え、遠心分離して不溶性物質 を除き、滅菌し、生成培地が約０．２５％ないし約１０％の加水分解産物、より 好適には約１．０％の加水分解産物を含むようにする。付加的塩及び緩衝液を所 望のように加えて、細胞増殖を維持するために所望のすべての栄養を含む最終的 産物を得ることができる。

例えば、増殖培地ｌリットルは、普通は、約２．５ないし約ｔｏｏｇ、より好適 には約１３ｇの藻類加水分解産物、約１、５ないし約２．０　ｇ、より好適には 約ｉ、　８　ｇのニリン酸カリウム、及び約１．０ないし約１．　ｓ　ｇ、より 好適には約１．４ｇのリン酸カリウムを含む。加水分解産物を遠心分離して不溶 性物質を除去し、滅菌濾過する。

一般的には約０．２ないし１．２　ｇの範囲の硫酸マグネシウム、一般的には０ ．８−１．２　ｇの範囲の塩化アンモニウム及び一般的にはＩ　Ｍ　ＣａＣ１ｔ 　ｏ、　１ｍｌを含めたその他の塩も培地１リツトルに加えることができる。一 般的量を加えることができる付加的塩としては硫酸鉄、及びマンガン、モリブデ ン、コバルト、銅及び亜鉛の無機塩がある。

所望ならば補充的炭水化物を最終的組成物に加えることができる。このような炭 水化物としては、例えば、グルコース、グリセロール、フルクトース又はその他 の一般的に使用できる炭素源がある。炭水化物は安定同位体で標識化され、無菌 濃縮溶液の形で加水分解産物に加えられる。増殖培地として使用する前に加水分 解産物に炭水化物を補充することは、付加的エネルギー源を提供し、より大きい 細胞密度を得るか、所望生成物を最大にするために望ましいかも知れない。

細胞及び哺乳動物細胞の増殖を支えるための基質として用いられる。

本発明の加水分解産物を用いてつくった培地は、細胞の速やかな効率的増殖を支 えることがわかった。その加水分解産物を形成するための基礎として用いられる 藻類が、一つ以上の安定同位体で標識化される場合、それが生産する細胞及び化 合物又は高分子はその標識を組み込む。

本発明は、説明の目的にのみ提供され、制限する意図のない下記の実施例によっ てさらによ（説明される。

好適実施例 藻類の培養 市販のＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　（英国藻類及び原生動物培養コ レクション、ＣＣＡＰ　Ｎｏ、２１１８　）を、０．１　ｇ／ｌ、Ｋ、ＨＰＯ４ ，０，０７５ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ，、０，５ｇ／ｌ　ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ， ０，０６２ｇ／ｌ　Ｃａ（ＮＯ３）２　−４　［２０，３，０ｇ／ｌ　ＫＮＯ３ ，１０ｍｇ／ｌ　Ｆｅ５０．　・７Ｈ２０，８，０ｍｇ／ｌ　ＥＤＴＡ二ナトリ ウム、２．８６ｍｇ／Ｉ　ＨｓＢＯｓ　、１．８１ｍｇ／ｌ　ＭＬＩＣＩ！　” 　４）＋２０．０．２２ｍｇ／ｌ　Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ２０，０，３９ｍｇ／ｌ　 ＮａＭｏＯ４・２ＨｚＯ１０，０８ｍｇ／Ｉ　ＣｕＳＯ４−５Ｈ２０及び０．０ ５ｍｇ／１ｃｏ（ＮＯｘ）ｚ　・６　ＨｚＯから成るミネラル塩培地で増殖させ る。使用容器は１３０リットル入りフォトバイオリアクターである。この藻類の 増殖のための最適温度は３２−３５℃である。ｐＨは二酸化炭素の添加により７ ．０に維持される。培養物は連続気流によって混合される。

Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓは１日に４回倍加する最大速度で増殖す る。窒素源がな（なった時点で培養物を収穫する。使用ＫＮＯ３１ｇあたり約２ ｇの乾燥生物量が得られる。培養物を収穫する：藻類生物量を約１０−１５％固 体（Ｗ／Ｗ）になるように水に懸濁させる。それから細胞を機械的に破壊する。

実　施　例　２ 標識藻類の培養 同位体で標識化した増殖培地をつくるための安定同位体で標識したＣｈｌｏｒｅ ｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓの培養を、下記のことを除いて実施例１と同様に行っ た。

１５Ｎ標識藻類のためには、ＫＮＯ２の代わりに標識ＫＮＯ３を用いる： 重水素藻類のためには、水の代わりに０．０を用い、混合のためにぶくぶく通し た空気を分子篩で乾燥される；目Ｃ標識藻類のためには、ｐＨを８，０と８．５ との間に維持し、”ｃ　ｃｏ□の代わりに１３Ｃ−富化ＣＯ２を用いる。

実施例３ 凍結乾燥生物量から酸加水分解産物の製法実施例１の方法によってつ、くられた Ｃ、　ｖｕｌｇａｒｉｓから得られた乾燥、崩壊した生物量５ｇを丸底フラスコ に入れる。この生物量に２．５　Ｍ　ＨＣｌ　５０ｍ１を加える。混合物を室温 （２５℃）で−晩撹拌する。藻類スラリーを加熱して沸騰させ（撹拌しながら） 、２時間還流させる。その後そのスラリーを遠心分離し、酸不溶性フラクション を捨てる。酸によって溶解する生物量のパーセンテージは約６９％である。酸の 多（を回転蒸発器によって蒸発させる。スラリーを水に再懸濁させ、付加的蒸発 によって残りの酸を除去する。循環中に除去される酸の量は、ＨＣＩ、Ｈ，０共 沸混合物によって制限される。この操作を４回繰り返し、酸の９０％以上が除去 される。その後スラリーは水に再懸濁される。ｐＨは約１．２である。４　Ｍ　 ＮａＯＨを加水分解産物に加えて最終的ｐＨが６．８になるようにする。

加えた塩基の量から、生成した塩化ナトリウム量を計算する。それから加水分解 産物を凍結乾燥し、秤量する。

計算した基量を重量から引く：この最終的重量（基量を引いたもの）を用いて酸 加水分解産物の無塩（５ａｌｔ（ｒｅｅ）水溶液をつくる。

実施例４ １％酸加水分解産物溶液からの培地の生成実施例３のようにしてつくった１％加 水分解産物１ｇに、１．８　ｇ　ＫＪＰＯｎ、３．２　ｇ　ＫＨ２ＰＯ４及び１ ．０　ｇＮＨａＣＩを加える。それから加水分解産物を遠心分離する。上澄液に １．０　ｇ　Ｍｇ５Ｏａと０．１　ｍｌ　ｌ　Ｍ　ＣａＣ１ｔを加える。

培地をその後滅菌濾過し、使用するばかりにする。

実施例５ 藻類ベース増殖培地を用いた場合とＬ−ブロスを用いの接種原（レダーバーブ（ Ｊ、　Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ）ら、ライスコンシン大学）をつくるために、Ｅ、ｃ ｏｌｉ　ｌループ（Ｉｏｏｐｆｕｌンをとり、増殖培地１５ｍ１に接種した。こ の接種原を一晩３７℃で振とうした。フラスコを下記のように設定した：フラス コ番号　増殖培地　培地中の栄養の％３　藻類ベース加水分解産物　１％ ３　藻類ベース加水分解産物　２％ ３　藻類ベース加水分解産物　３％ ３　Ｌ−ブロス　３％ 各フラスコは培地１５ｍ１を含む。藻類ベース培地は先行実施例にしたがってつ （られた；Ｌ−ブロスはｌｏｇ／ｌ　）リプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、ｌｏｇ ／Ｉ　ＮａＣ１からつくられた。

接種原０．０２ｍ１を各フラスコに加えた。全サンプルは３回づつ行われた。フ ラスコを３７℃で振とうし、２．４．６．１２．２４時間目に１ｍｌサンプルを 無菌的に採取した。光学密度を分光光度計で波長５５０で読み取った。光学密度 ｌ＝　２　Ｘ　１０”細胞／ｍｌという関係を用いて細胞数を計算した。最後の 採取時点に、Ｅ、ｃｏｌｆを遠心分離し、凍結乾燥し、乾燥生物量の重量を記録 した。１％、２％、及び３％藻類加水分解産物を用いた場合の乾燥重量を、匹敵 するし一ブロス栄養の場合と合わせて図１に示す。

１、５％栄養を含むし一ブロスをつくり、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞をこの培地で上記の ように増殖させる。増殖培地（１，０％栄養）及びＬ−ブロス（１，５％栄養） におけるＢ、ｃｏｌｉの増殖動態を図２及び図３に示す。図かられかるように、 増殖２４時間後には藻類ベース培地は１．０％栄養で、１．５％栄養のし一ブロ スよりもより多い細胞／ｍｌの増殖を支安定同位体標識増殖培地及びＬ−ブロス におけるＥ、ｃｏｌｉの増殖動態 同位体標識培地（実施例２における標識藻類生物量及び実施例３及び４における 増殖培地の製法を用いて得られた）を用いる増殖動態測定法は実施例５と同様で ある。

細胞数／ｍｌ及び乾燥重量は同様である。重水素化Ｅ、ｃｏｌｉは増殖速度に対 する顕著な同位体効果を示す。増殖速度はその未標識部分のそれの２ないし５分 の−である。

図の簡単な説明 図１は本発明の藻類ベース増殖培地の数種類の濃度の各々において及びそれらに 相当する濃度のし一ブロスにおいて増殖したＥ、ｃｏｌｉ細胞の収量を示すグラ フである。

（１）収量対％栄養　（２）振とうフラスコ中のＥ、　ｃｏｌｉ（３）　ｇ／　 Ｉ細胞　（４）％栄養　（５）セルトン−Ｕ（６）Ｌ−ブロス 図２は１．５％Ｌ−ブロスにおけるＥ、ｃｏｌｉ細胞の増殖を示すグラフである 。

（１）Ｌ−ブｏ　ス（２）Ｅ、　ｃｏｌｉ増殖曲線　（３）細胞／ｍ１（４）時 間　（５）増殖曲線 図３は１．０％藻類ベース増殖培地におけるＢ、ｃｏｌｉ細胞の増殖を示すグラ フである。

（１）セルトン−Ｕ　（２）Ｅ、ｃｏｌｉ増殖曲線　（３）細胞／ｍ１（４）時 間 −ヒルトフーＵ　−＋−Ｌ−フ１０ス ０　５　Ｔｏ　１５　２０　２５ 時間 Ｂ寺間 国際調査報告 ＦＣＴ　／ＵＳ９０１０３００’ｊ ＡＨｕ（ｈｍｅｎｔ　Ｃｏ　ＰＣｒ と１工り匡■４ ｔｇａｅ １ｌｉａｌ １ｇａ ｈｙｄｒｏｌｙ？ ＋ｙｓａｔｅ ＩＶ！Ｉｓ ｅｄｉａ ｍｅｄｉａｌｌ。

１コｈｅｌ？ （りＱｔｌ’）ｉｌｌ枦 Ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ　ｎａｍｅｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）藻類の水性スラリーを形成し、（ｂ）上記藻類の細胞壁を破壊し、 （ｃ）上記藻類に、上記藻類の蛋白質を部分的に加水分解するのに十分な酸を加 え、生成した加水分解産物は酸溶性フラクション及び酸不溶性フラクションを含 んで成り、 （ｄ）加水分解産物の酸不溶性フラクションを傾瀉し、 （ｅ）溶性フラクションから、そのフラクションのｐＨが少なくとも１．０にな るまで酸を除去し、（ｆ）加水分解産物を塩基で滴定して加水分解産物中に残る あらゆる酸を塩に変え、加水分解産物のｐＨを約６．５ないし約７．０の範囲内 に調節する諸段階から成る藻類ベース加水分解産物の製法。 ２．藻類が一つ以上の安定同位体で標識される請求の範囲第１項記載の製法。 ３．生成加水分解産物が乾燥される請求の範囲第１項記載の製法。 ４．同位体が２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ及び１７Ｏから選択される請求の範囲第２項 記載の製法。 ５．加水分解産物が、細胞増殖を支持するために有用な水溶液として形成され、 その水溶液がさらに細胞増殖のための付加的栄養となる一つ以上の塩及び緩衝液 を含む請求の範囲第１項又は請求の範囲第２項記載の製法。 ６．緩衝液がリン酸緩衝液である請求の範囲第５項記載の製法。 ７．塩が塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ ム、硫酸鉄、及びマンガン、モリブデン、銅、コバルト及び亜鉛の無機塩から選 択される請求の範囲第５項記載の製法。 ８．酸が藻類に添加され、約２ないし約３Ｍの酸濃度を形成する請求の範囲第１ 項記載の製法。 ９．酸がＨＣｌ及び硫酸及びトリフルオロ酢酸から選択される請求の範囲第１項 記載の製法。 １１．塩基がＮａＯＨ、ＫＯＨ：Ｂａ（ＯＨ）２及びＢａＣＯ３から選択される 請求の範囲第１項記載の製法。 １２．酸がＨＣｌで、塩基がＮａＯＨである請求の範囲第１項記載の製法。 １３．藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、 及びＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａ ｓ、Ｐｏｒｐｈｏｒｉｄｉｕｍ及びＤｕｎａｌｌｉｅｌａ種から選択される請求 の範囲第１項記載の製法。 １４．藻類がＣｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓである請求の範囲第１３項記 載の製法。 １５．溶液が約０．２５％ないし約１０．０％の加水分解産物を含む請求の範囲 第５項記載の製法。 １６．（ａ）藻類細胞を増殖させ、 （ｂ）その細胞の水性スラリーを形成し、（ｃ）細胞を崩壊させて細胞溶解物を 生成し、（ｄ）細胞又は細胞溶解物を、細胞蛋白質の不完全加水分解をおこすよ うな条件下で酸加水分解にかけて、部分的加水分解産物を生成し；加水分解産物 は酸溶性フラクション及び酸不溶性フラクションを含み、（ｅ）酸不溶性フラク ションを傾瀉し、（ｆ）溶性フラクションから、そのフラクションのｐＨが少な くとも約１．０になるまで酸を除去し、それからそのフラクションを塩基で約６ ．５ないし約７．０範囲内にまで滴定し、 （ｇ）その部分的加水分解産物に一つ以上の痕跡ミネラル又は栄養を任意に添加 する 諸段階から成る製法によってつくられる原核細胞又は真核細胞培養のための栄養 培地。 １７．（ａ）少なくとも一つの安定同位体で標識化した藻類細胞を増殖させ、 （ｂ）細胞の水性スラリーを生成し、 （ｃ）細胞を崩壊させて細胞溶解物をつくり、（ｄ）細胞又は細胞溶解物を、細 胞蛋白質を不完全加水分解させて部分的加水分解産物を生ずるような条件下で酸 加水分解にかけ、加水分解産物は酸溶性フラクションと酸不溶性フラクションを 含んで成り、（ｅ）酸不溶性フラクションを傾瀉し、（ｆ）溶性フラクションか ら、そのフラクションのｐＨが約１．０になるまで酸を除去し、それからそのフ ラクションを約６．５ないし約７．０の範囲内にまで塩基で滴定し、 （ｇ）その部分的加水分解産物に一つ以上の痕跡ミネラル又は栄養を任意に添加 する 諸段階から成る製法によってつくられる原核細胞又は真核細胞培養のための栄養 培地。 １８．（ａ）約３５ないし約５０重量％のポリペプチドと、（ｂ）約２２ないし 約３０％のアミノ酸と、（ｃ）約５ないし約１５％の砂糖及び還元糖と、（ｄ） 約７ないし約１５％の水 とから成る藻類ベース加水分解産物。 １９．（ａ）約４０ないし約４５重量％のポリペプチドと、（ｂ）約２４ないし 約２８重量％のアミノ酸と、（ｃ）約５ないし約１５重量％の砂糖及び還元糖と 、（ｄ）約７ないし約１５重量％の水 とから成る請求の範囲第１８項記載の加水分解産物。 ２０．一つ以上の安定同位体で標識化した藻類からつくられる請求の範囲第１７ 項記載の加水分解産物。 ２１．グルコース、グリセロール又はフルクトースを補充した請求の範囲第１６ 項又は請求の範囲第１７項記載の増殖培地。 ２２．請求の範囲第１８項記載の加水分解産物の水溶液から成り、上記加水分解 産物が約０．２５ないし約１０％の上記基質を含む、細胞増殖を支持するための 基質。 ２３．請求の範囲第５項記載の方法によってつくられた基質に上記細胞を培養す ることを含んで成る細胞増殖法。 ２４．請求の範囲第１８項記載の加水分解産物を約０．２５ないし約１０％含む 水溶液を含んで成る基質に上記細胞を培養することを含んで成る細胞増殖法。 ２５．細胞が微生物、昆虫、植物及び哺乳動物から選択される請求の範囲第２３ 項記載の方法。 ２６．請求の範囲第１７項記載の加水分解産物の水溶液から成る基質に上記細胞 を培養することを含んで成る、一つ以上の安定同位体で細胞を標識化する方法。 ２７．請求の範囲第１７項記載の加水分解産物の水溶液を含む基質上で、上記高 分子又は化合物を生産する細胞を、上記細胞が高分子又は化合物を生産するよう な条件下で増殖させることを含んで成る、一つ以上の安定同位体で高分子又は化 合物を標識化する方法。