KR101407689B1

KR101407689B1 - 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법

Info

Publication number: KR101407689B1
Application number: KR1020120020795A
Authority: KR
Inventors: 진언선; 김시욱; 김재호; 김귀다; 정슬기
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-06-16
Also published as: KR20130070494A

Abstract

본 발명은 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 고체 배양 방법에 관한 것으로서, 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 상기 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)를 넣고 혼합하는 단계; 및 상기 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 고체 배양 방법에 의하면, 고체 배지 상에서 알렉산드리움 타마렌스 세포는 1달 내지 2달 동안 배지를 갈아주지 않고도 성장한 바, 세포의 장기간 보관이 용이하고, 단일세포의 순수분리가 용이해지는 효과가 있는 바, 실험실 내 알렉산드리움 타마렌스의 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법{Method for solid culture of Alexandrium tamarense}

본 발명은 편모조류(dinoflagellate)의 고체 배양 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 고체 배양 방법에 관한 것이다.

적조(赤潮, red tides)는 플랑크톤이 갑작스럽게 엄청난 수로 번식하여 바다나, 강, 운하, 호수 등의 색깔이 바뀌는 현상을 말한다. 일반적으로 물이 붉게 바뀌는 경우가 많아서, 붉은 물이라는 의미에서 적조라고 하지만, 오랜지색이나 적갈색, 갈색 등으로 되기도 하는 등, 실제로 바뀌는 색은 원인이 되는 플랑크톤의 색깔에 따라서 다르다. 즉, 적조를 일으키는 생물이 가지고 있는 엽록소 이외의 카로테노이드(cartenoid)류의 붉은색, 갈색 색소로 인하여 물의 색이 다르게 변화되는 것이다. 이러한 적조를 일으키는 플랑크톤은 규조류(diatom), 와편모조류(dinoflagellate)와 같은 식물성 플랑크톤이 가장 일반적이며, 한국에서도 상기 두 플랑크톤의 양이 적조 유발여부의 기준이 된다.

상기 식물성 플랑크톤 중에서도 와편모조류(dinoflagellate)는 두 개의 편모를 가지고 있으며 이 편모를 이용하여 그들 스스로 물 속에서 움직일 수 있다. 이들은 규소로 이루어진 외부 골격은 없으나 종종 셀룰로오스 (cellulose)판으로 이루어진 외피를 갖추고 있다. 와편모조류는 일반적으로 작은 생물체이며 보통 단독으로 생활하나 아주 드물게 군체를 이루기도 한다. 이들은 규조류와 마찬가지로 단순 분열로써 생식한다. 이 경우 각각의 딸세포는 원래의 셀룰로오스 외피의 반쪽을 보유하여 어떤 크기의 감소도 없이 잃어버린 반쪽을 재생한다. 종류에 따라서는 독소를 만들어서 해수 중으로 방출하는 능력을 가진 것도 있어, 와편모조류가 극단적으로 많아지면 (해수 1ℓ당 2∼8 백만 개체), 방출된 모든 독소의 누적된 효과는 다른 생물에 영향을 미칠 수 있어 어패류의 대량 폐사를 유발하는 등, 어류와 무척추동물 대량 사망의 원인이 된다.

상기와 같은 와편모조류 중의 하나인 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)는 22 내지 54 ㎛의 길이와 24 내지 56 ㎛의 폭을 가진 세포가 단일세포로서 존재하기도 하고, 2개 또는 4개의 세포가 연쇄군체를 이루어 존재하기도 한다. 삭시톡신(saxitoxin), 네오삭시톡신(neosaxitoxin) 및 고니오톡신(gonyautoxin)이라는 독소를 가지고 있어 마비성 패독을 일으키는 알렉산드리움 타마렌스는 한국의 진해만에서 매년 3월 중순에서 7월 초순 사이에 출현하는 적조종으로서, 최근 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

알렉산드리움 타마렌스를 포함하는 와편모조류와 같은 해양 미세조류에 관한 연구는 대부분 액체 상태의 배지에서 세포를 키우면서 그 종에 관한 연구를 진행하는 것이 일반적이다. 액체 배양은 플라스크 또는 병에 액체 배지를 부어 세포를 배양하는 방법으로 세포의 성장 속도가 빠르다는 장점을 가지고 있지만, 성장 속도가 빠른 만큼 배지를 자주 교환해 주어야 하며, 장기간 세포의 보관이 용이하지 못하고, 단일세포를 순수분리 하기 어렵다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해서, 많은 연구진들이 해양 미세조류의 고체 배양을 시도하였으나, 세포 자체가 물리적 스트레스에 민감한 와편모조류와 같은 종들은 고체 배지에서의 배양이 어려워 연구에서 거의 이용되지 않고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 고체 배양 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 상기 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)를 넣고 혼합하는 단계; 및 상기 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 상기 고온가압멸균된 배지를 굳히는 단계; 및 상기 굳혀진 배지 상에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)를 도말하여 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 배양 방법에 따르면, 고체 배지 상에서 알렉산드리움 타마렌스 세포는 1달 내지 2달 동안 배지를 갈아주지 않고도 성장한 바, 세포의 장기간 보관이 용이하고, 단일세포의 순수분리가 용이해지는 효과가 있고, 실험실 내 알렉산드리움 타마렌스의 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 도말 고체 배양된 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)의 현미경 사진을 나타낸 것으로서, (A) 내지 (C)는 각각 40배, 100배 및 200배의 현미경 비율로 관찰한 결과이다.
도 2는 액체 배지의 온도에 따른 알렉산드리움 타마렌스의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 3은 한천의 농도에 따른 F2 배지의 고형화 온도를 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 혼합 고체 배양한 알렉산드리움 타마렌스의 단일 콜로니를 촬영한 현미경 사진(×200)이다.
도 5는 알렉산드리움 타마렌스를 2개월 동안 혼합 고체 배양(A) 및 액체 배양(B)한 결과를 촬영한 현미경 사진(×100)이다.
도 6은 알렉산드리움 타마렌스를 오염원(곰팡이)과 접촉시킨 상태에서 각각 혼합 고체 배양 및 도말 고체 배양의 방법으로 배양시킨 결과를 촬영한 현미경 사진이다.
도 7은 알렉산드리움 타마렌스(A), 타 적조종(차토넬라 마리나(Chattonella marina))(B) 및 타 와편모조류종(코콜로듐 폴리크리코이드(Cocholodium polykrikoides))(C)을 본 발명의 혼합 고체 배양 방법으로 배양한 결과를 촬영한 현미경 사진(×100)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 알렉산드리움 타마렌스( A. tamarense )의 혼합 배양 방법

본 발명은 본 발명의 일 측면은 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 상기 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)를 넣고 혼합하는 단계; 및 상기 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 1) 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 넣고 혼합하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양하는 단계를 포함한다.

먼저, 본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 1) 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균한다.

상기 단계 1)의 배지 고형화제는 액체 배지를 고형화시키는 성분으로서, 액체 배지의 성분을 변화시키지 않으면서도 복잡한 구조의 화학식으로 구성되어 상기 알렉산드리움 타마렌스의 대사 작용에 의하여 분해되지 않고, 일정 온도 범위에서 액상으로 존재하면서도 상기 알렉산드리움 타마렌스의 생육온도 범위 내에서 투명한 겔(gel)로 되어, 상기 알렉산드리움 타마렌스의 군락 형태를 쉽게 구분할 수 있는 물질인 것이 바람직하다. 상기 배지 고형화제는 한천(agar), 혈청(serum), 젤라틴(gelatin), 실리카겔(silica gel) 및 알부민(albumin)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것이 바람직하고, 상기 배지 고형화제는 한천, 혈청 및 젤라틴으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것이 더욱 바람직하며, 상기 배지 고형화제는 한천인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 한천은 특히, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 한천을 상기 배지 고형화제로 이용하여 알렉산드리움 타마렌스를 고체 배양하였으나, 이는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 상기 배지 고형화제는 한천에 한정되지 아니하고, 상기 언급된 배지 고형화제들 중에서 당업자의 선택에 따라 적절히 이용될 수 있다.

상기 배지 고형화제는 상기 액체 배지가 흘러내리지 않을 정도로 고형화시키면서도 상기 알렉산드리움 타마렌스의 성장에 물리적인 제약이 되지 않을 정도로 고형화시킬 수 있는 양이 포함되는 것이 바람직하다. 특히 상기 배지 고형화제가 한천인 경우, 상기 한천은 0.5 %(w/v) 내지 2.0 %(w/v)의 농도로 상기 액체 배지에 포함되는 것이 바람직하고, 상기 배지 고형화제가 젤라틴인 경우, 상기 젤라틴은 15 %(w/v) 내지 20 %(w/v)의 농도로 상기 액체 배지에 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 1 %(w/v) 농도의 한천을 이용하여 알렉산드리움 타마렌스를 고체 배양하였다.

상기 단계 1)의 액체 배지는 상기 알렉산드리움 타마렌스의 성장에 있어 직접적인 영양분을 제공하는 물질로서, 조류 배양에 이용될 수 있는 배지라면 제한없이 이용될 수 있다. 상기 액체 배지는 ES 배지, F2 배지 또는 콘위(Conwy) 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 F2 배지를 이용하여 알렉산드리움 타마렌스를 배양하였다.

상기 단계 1)의 고온가압멸균은 상기 배지 고형화제의 액화를 유도함과 동시에 상기 액체 배지 및 배지 고형화제 내에 포함된 미생물을 멸균하는 과정으로서, 일반적으로 상기 배지 고형화제를 액화시키면서, 상기 배지 조성물 내의 미생물을 사멸시킬 수 있을 정도로 높은 온도 및 압력의 조건 하에서 진행된다. 특히, 상기 고온가압멸균은 150 ℃ 내지 600 ℃의 온도 및 250 atm 내지 1200 atm의 압력의 조건하에서 진행되는 것이 바람직하다.

다음으로, 본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 2) 상기 단계 1)의 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 넣고 혼합한다.

상기 단계 2)의 고온가압멸균된 후 식혀진 배지 온도는 40 ℃ 내지 50 ℃인 것이 바람직하다. 상기 식혀진 배지의 온도가 40 ℃ 이하이면 알렉산드리움 타마렌스의 세포가 혼합될 수 없을 정도로 배지가 고형화되고, 상기 식혀진 배지의 온도가 50 ℃ 이상이면 혼합된 알렉산드리움 타마렌스의 세포가 사멸하게 된다.

상기 단계 2)의 식혀진 배지에 혼합되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 2 × 10⁴ 개 내지 5 × 10⁴ 개인 것이 바람직하고, 상기 혼합되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 3 × 10⁴ 개 내지 4 × 10⁴ 개인 것이 더욱 바람직하다. 상기 알렉산드리움 타마렌스의 세포수가 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 2 × 10⁴ 개 이하인 경우에는 단일세포의 콜로니를 수득하는데 까지 걸리는 배양 시간이 너무 길어지게 되고, 상기 알렉산드리움 타마렌스의 세포수가 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 5 × 10⁴ 개 이상인 경우에는 세포 밀도가 높아서 상기 알렉산드리움 타마렌스의 배양 효율이 떨어지는 문제가 있다. 본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 3 × 10⁴ 개의 알렉산드리움 타마렌스 세포를 혼합하여 고체 배양하였다.

마지막으로 본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 3) 상기 단계 2)의 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양한다.

상기 단계 3)의 알렉산드리움 타마렌스의 세포 배양은, 상기 단계 2)의 배지와 알렉산드리움 타마렌스 세포가 혼합된 채로 굳어짐으로써, 상기 고체 배지의 내부에서 진행된다. 즉, 굳어져서 고형화된 배지의 내부에서 상기 알렉산드리움 타마렌스의 세포가 배양되는 것이다. 상기와 같이, 고형화된 배지의 내부에서 상기 알렉산드리움 타마렌스의 세포가 배양되는 경우, 상기 알렉산드리움 타마렌스 세포를 덮고 있는 고체 배지에 의하여 배양 과정에서 외부로부터 주입되는 오염원들(contaminants)을 보다 효과적으로 차단할 수 있게 되어, 무균 상태의 알렉산드리움 타마렌스 단일세포를 수득하는 것이 훨씬 용이해지게 된다. 본 발명이 구체적인 실시예에서 상기와 같이 알렉산드리움 타마렌스를 혼합하여 고체 배양한 결과, 배양 3주 후 배지 내에서 작은 콜로니를 형성하며 자라는 세포의 모습을 관찰할 수 있었고, 배지의 교체 없이도 1 내지 2달 동안 알렉산드리움 타마렌스를 배양할 수 있었고, 단일 콜로니를 선택적으로 선별하여 단일세포를 얻을 수 있었다(도 4 및 도 5 참조). 또한, 상기와 같은 알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양 방법과 하기 "2. 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)의 도말 배양 방법 " 항목에서 설명되는 도말 배양 방법을 곰팡이에 의하여 오염된 환경에서 수행하여, 배양된 알렉산드리움 타마렌스를 관찰한 결과, 도말 고체 배양의 경우 고체 배지의 표면에서만 세포가 자라기 때문에 세포가 곰팡이에 의해 오염되어 알렉산드리움 타마렌스 세포만을 순수하게 배양되지 않고, 곰팡이들로 인해 알렉산드리움 타마렌스 세포들이 모여 자라지 않고 흩어져서 자라는 반면(도 6의 (A) 참조), 혼합 고체 배양의 경우 곰팡이에 의해 배지가 오염되었음에도 불구하고, 고체 배지 내에서 세포가 오염되지 않고 순수하게 모여서 자라는 것을 확인하였다(도 6의 (B) 참조). 상기와 같은 결과로부터, 혼합 고체 배양 방법이 도말 고체 배양 방법에 비하여 무균 상태의 단일세포를 수득하는데 유리함을 알 수 있다.

2. 알렉산드리움 타마렌스( A. tamarense )의 도말 배양 방법

본 발명은 다른 측면은 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 상기 고온가압멸균된 배지를 굳히는 단계; 및 상기 굳혀진 배지 상에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 도말하여 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 1') 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계; 2') 상기 단계 1')의 고온가압멸균된 배지를 굳히는 단계; 및 3') 상기 단계 2')의 굳혀진 배지 상에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 도말하여 배양하는 단계를 포함한다.

상기 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법에서 상기 단계 1')의 배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계에 관해서는 상기 "1. 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)의 혼합 배양 방법 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)의 혼합 배양 방법 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 알렉산드리움 타마렌스의 도발 배양 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

본 발명의 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법은 2') 상기 단계 1')의 고온가압멸균된 배지를 굳힌 다음, 3') 상기 단계 2')의 굳혀진 배지 상에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 도말하여 배양한다.

상기 알렉산드리움 타마렌스의 도발 배양 방법은 상기 "1. 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)의 혼합 배양 방법 "과는 달리 고온가압멸균된 배지를 알렉산드리움 타마렌스의 세포와 혼합하여 굳히는 것이 아니라, 고온가압멸균된 배지를 먼저 굳힌 다음, 굳혀진 배지 상에 알렉산드리움 타마렌스의 세포를 도말하여 배양한다. 상기 도말되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 1 × 10⁴ 개 내지 4 × 10⁴ 개인 것이 바람직하고, 상기 도말되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 2 × 10⁴ 개 내지 3 × 10⁴ 개인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 도말되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수가 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 1 × 10⁴ 개 이하인 경우에는 단일세포의 콜로니를 수득하는데 까지 걸리는 배양 시간이 너무 길어지게 되고, 상기 알렉산드리움 타마렌스의 세포수가 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 4 × 10⁴ 개 이상인 경우에는 세포 밀도가 높아서 상기 알렉산드리움 타마렌스의 배양 효율이 떨어지는 문제가 있다. 본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 3 × 10⁴ 개의 알렉산드리움 타마렌스 세포를 도말하여 고체 배양하였다. 그 결과, 배양 3주 후 배지 내에서 작은 콜로니를 형성하며 자라는 세포의 모습을 관찰할 수 있었고, 배지의 교체 없이도 1 내지 2달 동안 알렉산드리움 타마렌스를 배양할 수 있었고, 단일 콜로니를 선택적으로 선별하여 단일세포를 얻을 수 있었다(도 1 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense) 세포 현탁액의 제조

알렉산드리움 타마렌스를 하기 표 1과 같은 조성의 F2 액체 배지에서 약 60 μmol photons/㎡s(12h/12h)의 광도 및 20 ℃의 온도 조건에서 정치배양하였다. 세포 밀도가 1 ~ 4 × 10⁵ 세포/㎖가 될 때까지 배양한 뒤, 배양액 50 ㎖를 3200rpm 및 20 ℃에서 원심분리하여 세포 펠릿(pellet)을 수득하였다. 상기 세포 펠릿을 1 ㎖의 액체 배지로 다시 현탁하여 알렉산드리움 타마렌스 세포 현탁액을 제조하였다.

알렉산드리움 타마렌스의 도말 고체 배양

500 ㎖의 F2 액체 배지에 0.5 내지 1 %의 한천(agar) 분말을 넣고 고온가압멸균한 뒤, 페트리 디쉬(지름×높이 = 90㎜×15㎜)에 약 15 ㎖ 내지 20 ㎖ 정도 부어 굳혔다. 상기 굳은 고체 배지 상에 상기 실시예 1에서 제조한 세포 현탁액 1 ㎖ 중에서 20 내지 30 ㎕를 도말하여 약 60 μmol photons/㎡s(12h/12h)의 광도 및 20 ℃의 온도 조건에서 배양하였다.

그 결과, 배양 3주 후 배지 상에서 작은 콜로니를 형성하며 자라는 세포의 모습을 관찰할 수 있었고, 배지의 교체 없이도 1 내지 2달 동안 알렉산드리움 타마렌스를 배양할 수 있었고, 단일 콜로니를 선택적으로 선별하여 단일세포를 얻을 수 있었다(도 1).

알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양을 위한 조건 확인

<3-1> 온도에 따른 알렉산드리움 타마렌스의 생존률 확인

상기 실시예 1과 같이 알렉산드리움 타마렌스의 세포 현탁액을 제조한 다음, 동일한 세포 밀도를 가진 세포 현탁액을 5개의 군으로 나누어 액체 배지 상에서 온도에 대한 개체의 생존률을 확인하였다. 상기 5개 군의 세포 현탁액을 각각 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ 및 80 ℃의 온도에서 20분간 배양한 다음, 다시 20 ℃의 온도 조건에서 7일 동안 세포를 배양하면서 세포수를 측정하였다.

그 결과, 40 ℃ 내지 50 ℃의 온도 범위 내에서 배양한 경우 3일 정도 동안 생존율이 약 60 %까지 떨어졌지만, 그 이후 더 이상 떨어지지 않고 유지되었다. 반면, 60 ℃ 보다 높은 온도에서 배양한 경우, 생존율이 현저하게 떨어졌다(도 2).

상기와 같은 결과로부터, 알렉산드리움 타마렌스는 배양액의 온도가 60 ℃ 보다 높게 올라가면 생존률이 떨어지게 되나, 배양액의 온도가 40 ℃ 내지 50 ℃ 정도까지 올라가더라도 어느 정도의 생존률은 유지할 수 있음을 알 수 있다.

<3-2> 한천의 농도에 따른 F2 배지의 고형화 온도 확인

F2 배지에 한천을 넣어 고체 배지를 만드는 경우, 배지 자체의 염 농도가 높아 한천에 의하여 고형화되는 온도가 높아지게 된다. 따라서, 본 발명자들은 서로 다른 농도의 한천이 포함된 F2 배지가 고형화되는 온도를 확인함으로써, 알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양을 위한 한천의 적정 농도를 찾아내었다. 이를 위하여, 500 ㎖의 F2 액체 배지 4개에 각각 1 %(w/v), 3 %(w/v), 5 %(w/v) 및 10 %(w/v)의 한천 분말을 넣고 고온가압멸균한 뒤, 배지의 온도를 60 ℃로 낮추어 배지가 고형화되는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 1%의 한천이 포함된 F2 배지는 60 ℃에서 고형화되었으나, 3 %(w/v) 이상의 한천이 포함된 F2 배지는 60 ℃에서 고형화되지 않았다(도 3). 또한, 상기 각 배지의 고형화 온도를 측정한 결과, 1 %(w/v)의 한천이 포함된 F2 배지는 40 ℃ 내외에서 고형화되었으나, 3 %(w/v)의 한천이 포함된 F2 배지는 60 ℃에서, 5 %(w/v) 이상의 한천이 포함된 F2 배지는 80 ℃ 이상의 온도에서 고형화됨을 확인하였다.

상기와 같은 결과로부터, F2 배지에 0.5 % 내지 2 %의 한천이 포함되는 경우에 배지가 40 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 고형화됨을 알 수 있다.

알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양

<4-1> 혼합 고체 배양을 위한 최적 조건

상기 실시예 <3-1> 및 <3-2>와 같은 결과로부터, 알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양을 위한 최적의 조건을 도출하였다.

먼저 상기 실시예 <3-1>의 결과로부터, 알렉산드리움 타마렌스의 경우 배지의 온도가 60 ℃ 보다 높아지게 되면 세포의 생존률이 현저히 감소하게 되는 바, 배지의 온도는 최대 50 ℃ 정도까지만 높일 수 있음을 알 수 있다.

다음으로 상기 실시예 <3-2>의 결과로부터, F2 배지를 50 ℃ 이하의 온도에서 고형화시킬 수 있기 위해서는 F2 배지에 포함되는 한천은 0.5 %(w/v) 내지 2 %(w/v)의 농도 범위 내에서 포함되어야 함을 알 수 있다.

<4-2> 알렉산드리움 타마렌스의 혼합 고체 배양

상기 실시예 <4-1>에서 도출된 최적의 조건에 따라, 500 ㎖의 F2 액체 배지에 '0.5 내지 1 %(w/v)'의 한천(agar) 분말을 넣고 고온가압멸균한 뒤, 상기 고온가압멸균된 배지가 '40 ℃ 내지 50 ℃'가 될 때까지 상온에서 식히고, 상기 실시예 1에서 제조한 1 ㎖의 세포 현탁액을 넣어 혼합하였다. 세포와 잘 섞인 배지를 페트리 디쉬(지름×높이 = 90㎜×15㎜)에 약 20 ㎖ 내지 25 ㎖ 정도 부어 굳인 후, 약 60 μmol photons/㎡s(12h/12h)의 광도 및 20 ℃의 온도 조건에서 배지 교체 없이 2개월 동안 배양하였다.

그 결과, 배양 3주 후부터 고체 배지 내에서 작은 콜로니를 형성하며 자라는 세포의 모습을 관찰할 수 있었고(도 4), 상기와 같은 고체 배지 내의 단일 콜로니를 일반 파이펫으로 팁을 통해 살짝 빨아들여 분리해 낼 수 있었다.

<4-3> 혼합 고체 배양의 효과 비교

상기 실시예 <4-2>와 같은 혼합 고체 배양의 효과를 확인하기 위하여, 고온가압멸균된 500 ㎖의 F2 액체 배지에 상기 실시예 1과 같이 제조한 1 ㎖의 세포 현탁액을 넣어 배지 교체 없이 2개월 동안 액체 배양하였다.

그 결과, 2개월이 경과한 후에도 상기 실시예 <4-2>와 같이 혼합 배양한 알렉산드리움 타마렌스는 고체 배지 내에서 정상적인 외형(morphology)을 가지고 생존해 있었으나(도 5의 (A)), 상기 실시예 <4-3>과 같이 액체 배양한 알렉산드리움 타마렌스는 온전히 생존해 있는 세포를 확인할 수 없었다(도 5의 (B)).

알렉산드리움 타마렌스 종의 혼합 고체 배양과 도말 고체 배양의 비교

알렉산드리움 타마렌스를 상기 실시예 2와 같이 도말 고체 배양하는 경우와 상기 실시예 4와 같이 혼합 고체 배양하는 경우의 배양 효과를 비교하기 위하여, 상기 실시예 2 및 상기 실시예 <4-2>와 같은 각각 도말 고체 배양 및 혼합 고체 배양의 방법으로 알렉산드리움 타마렌스를 배양하되, 배지 뚜껑 열고 약 일주일 이상 먼지가 많은 환경에서 두었다가 자라는 곰팡이를 다시 알렉산드리움이 자라는 배지로 옮겨서 한 달 간 배양함으로써 알렉산드리움 타마렌스의 배양 환경을 오염시켰다.

그 결과, 도말 고체 배양의 경우, 고체 배지의 표면에서만 세포가 자라기 때문에 세포가 곰팡이에 의해 오염되어 알렉산드리움 타마렌스 세포만을 순수하게 배양되지 않고, 곰팡이들로 인해 알렉산드리움 타마렌스 세포들이 모여 자라지 않고, 흩어져서 자라는 것을 확인하였다(도 6의 (A)). 이에 반하여, 혼합 고체 배양의 경우, 곰팡이에 의해 배지가 오염되었음에도 불구하고, 고체 배지 내에서 세포가 오염되지 않고 순수하게 모여서 자라는 것을 확인하였다(도 6의 (B)).

상기와 같은 결과로부터, 도말 고체 배양에 비하여 혼합 고체 배양하는 경우, 상기 알렉산드리움 타마렌스 세포를 덮고 있는 고체 배지에 의하여 배양 과정에서 외부로부터 주입되는 오염원들(contaminants)을 보다 효과적으로 차단할 수 있게 되어, 무균 상태의 알렉산드리움 타마렌스 단일세포를 수득하는 것이 훨씬 용이해지게 됨을 알 수 있다.

타 적조종 및 타 와편모조류종에의 적용 가부

상기 실시예 <4-2>와 같은 혼합 고체 배양 방법이 알렉산드리움 타마렌스 이외의 타 적조종이나 타 와편모조류종에도 적용될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 적조종의 대표종인 차토넬라 마리나(Chattonella marina) 및 와편모조류종의 대표종인 코콜로듐 폴리크리코이드(Cocholodium polykrikoides)를 이용하여 상기 실시예 <4-2>와 동일한 방법으로 2주 동안 혼합 고체 배양하였다.

그 결과, 알렉산드리움 타마렌스의 경우, 살아있는 세포를 확인할 수 있었지만(도 7의 (A)), 상기 차토넬라 마리나 및 코콜로듐 폴리크리코이드의 경우에는 온전히 생존해 있는 세포를 관찰할 수 없었다(도 7의 (B) 및 (C)).

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 혼합 고체 배양 방법은 일반적으로 모든 적조종 및 와편모조류종의 배양에 이용될 수 없고, 알렉산드리움 타마렌스의 배양에 최적화된 방법임을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

배지 고형화제가 포함된 액체 배지를 고온가압멸균하는 단계;
상기 고온가압멸균된 배지를 식히고, 굳기 전에 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)의 세포를 넣고 혼합하는 단계; 및
상기 혼합된 배지를 굳혀 상기 알렉산드리움 타마렌스를 배양하는 단계를 포함하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
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제1항에 있어서, 상기 배지 고형화제는 한천(agar), 혈청(serum), 젤라틴(gelatin), 실리카겔(silica gel) 및 알부민(albumin)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
제3항에 있어서, 상기 배지 고형화제는 한천(agar)인 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
제4항에 있어서, 상기 한천은 0.5 %(w/v) 내지 2.0 %(w/v)의 농도로 상기 액체 배지에 포함된 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 액체 배지는 F2 배지인 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 고온가압멸균된 후 식혀져 굳기 전의 배지 온도는 40 ℃ 내지 50 ℃인 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합되는 알렉산드리움 타마렌스의 세포수는 상기 고온가압멸균된 배지 1 ㎖ 당 3 × 10⁴ 개 내지 4 × 10⁴ 개인 것을 특징으로 하는 알렉산드리움 타마렌스의 고체 배양 방법.
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