EP2024744A1 - Mikrotiterplatte und deren verwendung - Google Patents

Mikrotiterplatte und deren verwendung

Info

Publication number
EP2024744A1
EP2024744A1 EP07725400A EP07725400A EP2024744A1 EP 2024744 A1 EP2024744 A1 EP 2024744A1 EP 07725400 A EP07725400 A EP 07725400A EP 07725400 A EP07725400 A EP 07725400A EP 2024744 A1 EP2024744 A1 EP 2024744A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microtiter plate
cavities
cavity
nutrient solution
plate according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07725400A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jochen Büchs
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
M2p Labs GmbH
Original Assignee
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Publication of EP2024744A1 publication Critical patent/EP2024744A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0472—Diffusion
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates

Definitions

  • the invention relates to a microtiter plate with a plurality of cavities, each having an opening on a flat top. Moreover, the invention relates to the use of such a microtiter plate for carrying out fermentations.
  • Known embodiments have, for example, a frame with a plate to which a plurality of receptacles forming receptacles is fixed, which protrude from the underside of the plate and whose opening is accessible from the top of the plate.
  • Common microtiter plates have 24, 48, 96, 384 or even 1536 cavities in rows and columns.
  • DE 198 06 681 A1 discloses a microtiter plate with a bottom plate and a cavity plate with hollow cylindrical passages, the bottom plate and the cavity plate being connected to one another in a liquid-tight manner.
  • Microtiter plates are used for different microbiological and immunological procedures; They are used in particular for the screening of technical bioreactions in batch processes. Microtiter plates also have the great advantage that they can be handled fully automatically by laboratory robots.
  • fed-batch processes have proven to be advantageous. It is used to refer to processes with a nutrient supplementation.
  • the feeding of nutrients during fermentation usually improves growth and production performance over pure batch processes.
  • the growth of microorganisms depends strongly on the composition of the culture fluid, in particular the nutrients contained therein. If, for example, there is an inhibition due to excess nutrients, insufficient water activity, ie too high an osmotic pressure, catabolite repression occurs or an overflow mechanism occurs during the fermentation, then the optimal microorganisms and culture conditions can not be found with the fermentation in the batch process.
  • one goal of fed-batch processes is to keep the concentration of limiting nutrients or a precursor in the reaction vessel for a certain period of time in a low concentration range which is found to be advantageous for the biological reaction.
  • Another goal of the fermentation in the fed-batch process may be to cause only a growth of the microorganisms in a first phase and to initiate a conversion to a desired product with the beginning of the targeted feeding.
  • the fed batch shake flask technique was developed (Chemie Ingenieurtechnik (68) 11/96).
  • the simple shaking flask technique was combined with a precise dosing technique adapted to the small reaction volume.
  • the dosing technology consists of a high-precision piston pump that distributes different nutrients via a multi-way valve via dosing to several shake flasks.
  • the control of nutrient dosing is taken over by a process computer. This makes it possible to realize an individual dosing profile for each individual parallelepiped shake flask by specifying a dosing quantity schedule.
  • US 2002/0168757 discloses a test device for investigating cell migration due to chemotaxis, haptotaxis and chemoinvasion, in which two adjacent wells in a plate of the test device are connected to each other by a channel.
  • Chemotaxis refers to the influence of the direction of movement of living beings or cells of living beings by substance concentration gradients. Chemoinvasion is defined as the movement of cells into or through a barrier or gel matrix.
  • a gel matrix can be placed in the junction between the wells. The gel has a high water content and is porous enough to allow cell migration for chemotaxis and chemoinvasion.
  • the connection channels correspond approximately to the diameter of the examined cells.
  • US 2004/0077075 A1 discloses a micro-fermenter with at least one culture vessel having a volume of less than 1 ml.
  • its reaction vessels are connected to channels via which culture liquid and optionally nutrients are fed to the reactor in the batch mode.
  • the supply to the channels via robots for example, take from a microtiter plate materials and bring in the fermenter.
  • the channels themselves are connected to microfluidic devices, in particular pumps.
  • microfluidizer according to US 2004/0077075 A1 has two chambers arranged one above the other in the vertical direction and separated by a membrane. Oxygen and water enter the culture fluid from the lower chamber via the membrane. The circulation in one of the chambers is effected for example by a pump. If the membrane between the two chambers is also permeable to nutrients, it is also possible to carry out continuous fermentations or fermentations in a semi-batch mode. In the semi-batch mode of operation, part of the cell culture is harvested after a certain time. Usually between 70 - 90% and the bioreactor is then filled with fresh medium. This cycle is then repeated. This operation is not comparable to fed-batch operation.
  • the present invention seeks to provide a microtiter plate, which allows a screening of strains, media or products under fed-batch conditions and the development and optimization of dosing strategies for fed-batch fermentations with minimal equipment allows.
  • a use of the microplate for fermentations under fed-batch conditions to be proposed.
  • microtiter plate of the type mentioned above in that the microtiter plate has a plurality of cavities for receiving nutrient solution and for receiving culture liquid, each provided for the reception of nutrient solution cavity of the microtiter plate through a channel with at least one further for intended the inclusion of culture fluid Cavity of the microtiter plate is connected and in each channel a diffusion barrier is arranged, which controls the release kinetics of the nutrients for fed-batch fermentations.
  • the microtiter plate according to the invention can be used for screening under fed-batch conditions by filling the wells with culture fluid and nutrient solution in such a way that each cavity filled with nutrient solution (nutrient cavity) the microtiter plate is connected through the channel with at least one further filled with culture liquid cavity (culture cavity) of the microtiter plate.
  • microtiter plate With the microtiter plate according to the invention, it is possible to screen a multiplicity of strains, media and products by fermentation under fed-batch conditions.
  • the nutrient cavities can be filled with different nutrient solutions so that the microtiter plate can be used for different screening tasks. Suitable nutrients are, for example, various C sources, N or P sources. Inductors can also be placed in the nutrient cavities.
  • the diffusion barrier in the channel between the nutrient solution well and the cavity or wells with the culture liquid (s) controls the release kinetics under fed-batch conditions. Depending on the properties of the diffusion barrier, the nutrients are released faster or slower to the culture fluid.
  • each cavity with culture liquid is in this variant of the invention, a cavity with nutrient solution assigned.
  • each associated cavities serve as a bioreactor for the fermentation and 48 cavities as a reservoir for the nutrient solution.
  • the channels emerging from a plurality of cavities filled with culture fluid flow into a common cavity with nutrient solution.
  • this well-nutrient solution provides several culture wells.
  • the filling volume of the cavity for the nutrient solution is preferably greater than that of the wells for the culture liquid.
  • the culture liquid wells in this case are arranged around the nutrient solution well.
  • three adjacent cavities are connected to each other by channels, wherein in one of the three
  • This central cavity contains the nutrient solution, which is delivered via the two channels to the adjacent cavities with the culture fluid.
  • the main advantage of this variant of the invention is that the cavity, into which several channels open, does not require a shape deviating from the other cavities and / or a different filling volume, so that in the production of the microtiter plate according to the invention on plates with a standard matrix and a standard diameter can be used for the cavities. In the case of a 96-well plate, 64 cavities for the culture fluid are available in this embodiment of the invention.
  • the diameter of the wells for the nutrient solution may be set smaller than the diameter of the wells for the culture fluid.
  • the smaller diameter prevents rotation of the nutrient solution in the cavity due to the higher surface tension after shaking the microtiter plate has begun. This can be a
  • Diffusion barriers are determined by their length, cross section and material properties. If, during the fermentation, the nutrient is to be slowly added to the culture fluid, for example because a microorganism is to be cultivated at a slow rate of growth, then very small channel cross sections in the range of one millimeter would have to be realized in straight-line connection channels which are very difficult to control with high geometric reproducibility in terms of production engineering. In these cases, the channel course between the cavities is preferably not straight, but curved. Due to the curved, longer channel this can have a larger diameter easier to manufacture. Another advantage of a non-linear long connecting channel may be that the nutrient supply into the
  • the channels between the cavities are at least partially, but preferably completely filled with water-insoluble natural or artificial polymers (hydrogel) as a diffusion barrier.
  • the diffusion barrier seals the connection channel between nutrient cavity and culture cavity on the liquid side.
  • a hydrogel is a water-containing, but water-insoluble polymer whose molecules are chemically bound, for example, by covalent or ionic bonds or physically linked to a network.
  • the diffusion barrier can also consist of a microporous material made of plastic, glass, ceramic or metal.
  • Polyacrylamide is the polymer of acrylamide.
  • acrylamide to polyacrylamide is caused by a chain reaction.
  • This reaction may e.g. of ammonium persulfate (APS) as a radical and catalyzed by TEMED (tetramethylethylenediamine).
  • APS ammonium persulfate
  • TEMED tetramethylethylenediamine
  • Cellulose or polysaccharides e.g. Alginates, gelan, carrageenan, chitosan and their derivatives, polysiloxanes and their derivatives, polyacrylic acid and its derivatives, polycarbonates and their derivatives, polyolefins and their derivatives, polycarboxylic acids and their derivatives, polyethers and their derivatives, polyesters and their derivatives, polyamines and their derivatives, polyamides and theirs
  • the diffusion barrier ensures a controlled and reproducible transfer of nutrients into the Culture fluid, wherein the release kinetics is determined so that an excess of nutrients or nutrient deficiency is avoided.
  • the culture fluid is supplied with a specific nutrient concentration over a period of a few hours to a few weeks.
  • the permeability of the diffusion barrier for nutrients from carbon-based nutrient solutions is:
  • a permeability of 0.2 has been found to be lower than that of carbon sources, of phosphorus sources a factor of 0.01 lower permeabilities and sulfur sources of a factor of 0.005 lesser permeabilities.
  • the introduction of the diffusion barrier into the channels of the microtiter plate according to the invention takes place, for example, in that a drop of a not yet hardened
  • Hydrogel is added to one of the two each connected through a channel cavities. This can be done for example with a pipetting robot.
  • the uncured hydrogel is drawn by capillary forces into the channels and hardens there. It may be advantageous for the channels (and the cavities) before introducing the not yet cured hydrogel solution z. B. to be hydrophilized by a chemical treatment or a plasma treatment.
  • Another production method is that the uncured hydrogel passes into the channels by centrifuging the microtiter plate. This method will be explained below with reference to the figures.
  • the microtiter plate according to the invention comprises a known base plate and cavity plate with hollow cylindrical or slightly conical passages, wherein the bottom plate and the cavity plate are liquid-tightly interconnected.
  • the structure is consistent with the well-known two-part microtiter plates mentioned above.
  • the microtiter plate according to the invention in the bottom of the cavities forming surface of the bottom plate groove-like depressions are introduced, which are partially sealed liquid-tight by areas between the passages of the cavity plate. As a result, the channels are formed between the cavities.
  • the recesses are also arranged in such a way in the bottom plate, that each end of a depression to below one of the passages in the
  • Cavity plate extends.
  • the introduction of the channel-like depressions in the known base plate can be done by milling or inexpensively by hot stamping. However, it is also possible to provide the groove-like depressions already during injection molding or extrusion of the bottom plate. If the filling of the channels with hydrogel is to take place by centrifuging the microtiter plate according to the invention, the indentation embossed in the bottom plate is preferably designed according to the features of subclaim 16.
  • the floors at least the KuIturkavmaschineen consist at least partially of transparent material.
  • the bottom plate is preferably entirely made of transparent material (such as polystyrene, polycarbonate, polymethylmethacrylate or their derivatives or blends or glass or quat glass)
  • the bottom plate can be very thin in the region of the cavities, e.g. in the range between 10 .mu.m and 500 .mu.m, in order to ensure good transmission for light of short wavelength ( ⁇ 280 mm).
  • a central advantage of the microtiter plate according to the invention is that the cavities can be filled automatically with pipettes.
  • conventional pipetting robots can be used.
  • the sterile cover of the microtiter plates either by conventional self-adhesive films or a removable lid.
  • the nutrient solution can be added with a time delay after the start of the fermentation in the nutrient cavities.
  • the time at which the nutrient solution is added for the first time can be determined by online monitoring of the culture fluids.
  • each filled with nutrient solution cavity can be added time-shifted additional nutrient solution with different concentrations.
  • additional nutrient solution with different concentrations.
  • a small amount of low concentration nutrient solution is added to the nutrient cavity, which is later supplemented by further portions of the higher concentration nutrient solution.
  • the driving concentration gradient between the nutrient solution and the culture fluid is increased.
  • the level of the nutrient solution and the level of the culture liquid in two cavities connected to one another by a channel are the same at the beginning of the fermentation. In some applications, however, the nutrient solution has a very high concentration.
  • FIGS. Show it 1 shows a partial view and a section along the line AA of a microtiter plate according to the invention
  • Figure 2 is a partial view and a section along the
  • FIG. 3a, b is a partial and overall view and a section along the line A-A of Figure 3a of a third embodiment of the microtiter plate according to the invention, wherein each three adjacent cavities are interconnected by channels,
  • Figure 4 is a view of a fourth embodiment of a microtiter plate according to the invention, wherein the channels of a plurality of cavities open in an elongated central cavity and
  • Figure 5 is a partial view and sections along the lines A-A and B-B of a fifth embodiment of a microtiter plate according to the invention with a production-technically advantageous
  • Figure 1 shows a section of a microtiter plate 1 according to the invention with cavities 2, 3, which are each connected by a channel 4 with each other.
  • Microtiter plate 1 is formed by a bottom plate 5 and a cavity plate 6 with hollow cylindrical or slightly conical passages 7 between opposite parallel surfaces of the cavity plate 6, wherein the bottom plate 5 and the cavity plate 6 are joined together liquid-tight.
  • joining processes come eg Laser welding, friction welding, ultrasonic welding, solvent bonding, dosing of adhesive by XY motion units on the adhesive surfaces with air pressure, syringe or piezo encoders, rolling or stamping adhesive or the use of prestructured double-sided adhesive films in question.
  • Cavity plate 6 are closed between the passages 7 upwards.
  • the cavity 2 serves, for example, for receiving the nutrient solution, while the culture fluid is located in the cavity 3.
  • a diffusion barrier 13 is arranged in the channel 4.
  • the representation of the microtiter plate in FIG. 2 largely corresponds to the embodiment of the invention shown in FIG. As far as agreement is made, reference is made to the explanations to FIG. Differences arise only with regard to the formation of the channel 14 between the cavities 2, 3. Deviating from Figure 1, the channel 14 connects the two cavities not on the shortest path but is curved, so that there is a greater length of the channel. In otherwise coincident material for the diffusion barrier 13 results from the larger channel length an overall greater diffusion resistance, which may be desired for a slower and / or delayed feeding of nutrients.
  • FIGS. 3a and 3b show a complete microtiter plate according to the invention in which in each case three adjacent cavities 2, 3 are interconnected by two channels 15, 16, wherein in the middle cavity 2, the two channels 15, 16 open.
  • the middle cavity 2 is filled with nutrient solution and the two outer cavities 2 are filled with culture fluid.
  • a diffusion barrier 13 is arranged in each channel 15, 16 .
  • the two cavities 3 filled with culture fluid are fed with nutrients from the middle cavity 2 via the channels 15, 16.
  • This embodiment has the advantage that 64 wells can be cultured simultaneously with culture liquid on the microtiter plate having 96 wells shown in FIG. 3, wherein in the embodiment according to FIGS. 1 and 2 only 48 wells can be used for cultures.
  • FIG. 4 shows a further variant of the microtiter plate according to the invention, in each of which 16 cavities 3 filled with culture fluid from a cavity 17 are supplied with nutrient.
  • the channels 18 each of 16 cavities 3 open into the cavity 17, which extends between two columns with cavities 3 over the entire width of the microtiter plate 1.
  • In each channel 18 between the cavities 3 and the elongated cavity 17 is a
  • Diffusion barrier 13 With this embodiment, similar to the embodiment shown in Figure 3, 64 wells can be used for cultures, however, only 4 nutrient wells need to be filled instead of 32 in Figure 3. This saves time in preparing the experiment.
  • the microtiter plate 1 shown in partial view in Figure 5 largely corresponds to the microtiter plate of Figure 1.
  • Figure 1 reference is made to explanations to Figure 1 reference.
  • two cavities 2, 3 are connected to each other by a channel 19, which is also formed by a groove-like depression in the bottom plate 5.
  • Figure 1 extends one end of the groove-like depression below the passage 7 in the cavity plate 6.
  • the depth of the recognizable in the sections AA and BB Extension 22 decreases from its approach 23 on the channel-like depression of the channel 19 from.
  • the cavity 2 has a bottom 24 sloping down towards the projection 23.
  • This design of the base 24 has manufacturing advantages in the filling of the channel 19 with one of the
  • Diffusion barrier 13 forming hydrogel.
  • a not yet cured hydrogel solution is applied to the bottom 24 of the cavity 2.
  • the entire microtiter plate 1 is rotated in a centrifuge about the axis of rotation indicated in section A-A.
  • the amount of the hydrogel solution is preferably such that, after centrifuging, a final surface with the surface of the bottom plate 5
  • the cavity 2 is preferably the nutrient cavity and the
  • Cavity 3 the culture cavity. This ensures that the cultures can be tracked through an optically transparent, flawless soil through online monitoring.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte und die Verwendung einer derartigen Mikrotiterplatte zur Durchführung von Fermentationen unter Fed-Batch-Bedingungen. Um eine Mikrotiterplatte zu schaffen, die ein Screening unter Fed-Batch Bedingungen erlaubt wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, die Kavitäten (2) der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte derart mit Kulturflüssigkeit und Nährstoff lösung zu befüllen, dass jede mit Nährstoff lösung befüllte Kavität (2) der Mikrotiterplatte durch einen Kanal (4) mit mindestens einer weiteren, mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavität (3) der Mikrotiterplatte verbunden ist. In dem stoff durchlässigen Kanal (4) ist eine Diffusionsbarriere (13) angeordnet, die die Kinetik des Stofftransfers der Nährstoffe von der Kavität mit Nährstoff lösung zu den Kavitäten mit Kulturflüssigkeit steuert.

Description

Mikrotiterplatte und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Kavitäten, die jeweils an einer ebenen Oberseite eine Öffnung aufweisen. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung einer derartigen Mikrotiterplatte zur Durchführung von Fermentationen.
Bekannte Ausführungen haben zum Beispiel einen Rahmen mit einer Platte, an der eine Vielzahl Aufnahmen bildender Gefäße fixiert ist, die von der Unterseite der Platte vorstehen und deren Öffnung von der Oberseite der Platte aus zugänglich ist. Gängige Mikrotiterplatten haben in Reihen und Spalten 24, 48, 96, 384 oder gar 1536 Kavitäten.
Die DE 198 06 681 Al offenbart eine Mikrotiterplatte mit einer Boden- und einer Kavitätenplatte mit hohlzylindrischen Durchgängen, wobei die Bodenplatte und die Kavitätenplatte flüssigkeitsdicht miteinander verbunden sind.
Mikrotiterplatten werden für unterschiedliche mikrobiologische und immunologische Arbeitsgänge verwendet; sie kommen insbesondere für das Screening technischer Bioreaktionen in Batch-Prozessen zum Einsatz. Mikrotiterplatten haben außerdem den großen Vorteil, dass sie von Laborrobotern vollautomatisiert gehandhabt werden können.
Für technische Bioreaktionen (Fermentationen) zum Zwecke der Produktproduktion haben sich jedoch Fed-Batch-Prozesse als vorteilhaft herausgestellt. Man bezeichnet damit Prozesse mit einer Zufütterung von Nährstoffen. Die Zufütterung der Nährstoffe während der Fermentation verbessert in der Regel die Wachstums- und Produktionsleistung gegenüber reinen Batch-Prozessen. Das Wachstum von Mikroorganismen hängt stark von der Zusammensetzung der Kulturflüssigkeit, insbesondere der darin enthaltenen Nährstoffe ab. Wenn beispielsweise eine Inhibierung durch Nährstoffüberschuss, zu geringe Wasser- aktivität d.h. zu hoher osmotischer Druck vorliegt, eine Katabolitrepression auftritt oder während der Fermentation ein Overflowmechanismus einsetzt, können mit der Fermentation im Batch-Prozess die optimalen Mikroorganismen und Kulturbedingungen nicht gefunden werden.
Ein Ziel von Fed-Batch-Prozessen besteht in vielen Fällen darin, die Konzentration limitierender Nährstoffe oder eines Precursors im Reaktionsgefäß für einen bestimmten Zeitraum in einem für die biologische Reaktion als vorteilhaft ermittelten niedrigen Konzentrationsbereich zu halten. Ein anderes Ziel der Fermentation im Fed-Batch-Prozess kann darin bestehen, in einer ersten Phase lediglich ein Wachstum der Mikroorganismen hervorzurufen und mit Beginn der gezielten Zufütterung eine StoffUmwandlung zu einem gewünschten Produkt einzuleiten.
Um Schüttelkolben für die Entwicklung von Fed-Batch-Prozessen nutzen zu können, wurde die Fed-Batch-Schüttelkolbentechnik entwickelt (Chemie Ingenieur Technik (68) 11/96) . Hierzu wurde die einfache Schüttelkolbentechnik mit einer dem kleinen Reaktionsvolumen angepassten präzisen Dosiertechnik kombiniert. Die Dosiertechnik besteht aus einer hochpräzisen Kolbenpumpe, die unterschiedliche Nährstoffe mittels eines Mehrwegeventils über Dosierleitungen auf mehrere Schüttelkolben verteilt. Die Steuerung der Nährstoffdo- sierungen wird von einem Prozessrechner übernommen. Damit lässt sich für jeden einzelnen der parallel betriebenen Schüttelkolben über die Vorgabe eines Dosiermenge-Zeitplans ein individuelles Dosierprofil realisieren. Mit dieser Fed- Baten-Schüttelkolbenanlage können bis zu 14 Kolben parallel mit 4 verschiedenen Nährstoffen versorgt werden. Obwohl die bekannte Fed-Batch-Schüttelkolbenanlage eine automatisierte, parallele Entwicklung und Optimierung von Dosierstrategien für Fed-Batch-Fermentationen im Labormaßstab er- möglicht, ist wegen des nach wie vor hohen apparativen Aufwandes die Anzahl der parallel zu betreibenden Reaktionsgefäße beschränkt. Ein Screening von zahlreichen (z.B. mehreren hundert) unterschiedlichen Mikroorganismen, die eine optimale Ausbeute an Biomasse und/oder Produkt liefern, ist daher wirtschaftlich kaum durchführbar.
Aus der US 2002/0168757 ist eine Testvorrichtung zur Untersuchung von Zellmigration aufgrund von Chemotaxis, Haptotaxis und Chemoinvasion bekannt, bei der jeweils zwei benachbarte Wells in einer Platte der Testvorrichtung durch einen Kanal miteinander verbunden sind. Chemotaxis bezeichnet die Beeinflussung der Bewegungsrichtung von Lebewesen oder Zellen von Lebewesen durch Stoffkonzentrationsgradienten. Chemoinvasion ist definiert als die Bewegung von Zellen in bzw. durch eine Barriere oder Gelmatrix. Zur Untersuchung der Chemotaxis und der Chemoinvasion kann eine Gelmatrix in den Verbindungskanal zwischen den Wells gegeben werden. Das Gel hat einen hohen Wasseranteil und ist porös genug, um die Zellwanderung für die Chemotaxis und Chemoinvasion zu ermöglichen. Die Verbindungskanäle entsprechen etwa dem Durchmesser der untersuchten Zellen.
Die US 2004/0077075 Al offenbart einen Mikrofermenter mit mindestens einem Kulturgefäß, das ein Volumen von weniger als 1 ml aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Mikrofermenters sind dessen Reaktionsgefäße mit Kanälen verbunden, über die dem Reaktor in der Batch-Betriebsweise Kulturflüssigkeit und gegebenenfalls Nährstoffe zugeführt werden. Die Zufuhr zu den Kanälen erfolgt über Roboter, die beispielsweise von einer Mikrotiterplatte Materialien aufnehmen und in den Fermenter einbringen. Die Kanäle selbst sind mit tnikrofluidischen Einrichtungen, insbesondere Pumpen, verbunden .
Ein anderes Ausführungsbeispiel des Mikrofermenters nach der US 2004/0077075 Al weist zwei in vertikaler Richtung übereinander angeordnete, durch eine Membran voneinander getrennte Kammern auf. Aus der tiefer gelegenen Kammer gelangt über die Membran Sauerstoff und Wasser in die Kulturflüssigkeit. Die Zirkulation in einer der Kammern wird beispielsweise durch eine Pumpe bewirkt. Sofern die Membran zwischen den beiden Kammern auch für Nährstoffe durchlässig ist, lassen sich auch kontinuierliche Fermentationen oder Fermentationen in Semi-Batch-Betriebsweise durchführen. Bei der Semi-Batch-Betriebsweise wird nach einer gewissen Zeit ein Teil der Zellkultur geerntet. Üblicherweise zwischen 70 - 90 % und der Bioreaktor wird anschließend mit frischem Medium aufgefüllt. Dieser Zyklus wird dann wiederholt. Dieser Betrieb ist mit einer Fed-Batch-Betriebsweise nicht vergleichbar .
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Mikrotiterplatte zu schaffen, die ein Screening von Stämmen, Medien oder Produkten unter Fed- Batch Bedingungen erlaubt und die Entwicklung und Optimierung von Dosierstrategien für Fed-Batch-Fermentationen mit apparativ geringem Aufwand ermöglicht. Außerdem soll eine Verwendung der Mikrotierplatte für Fermentationen unter Fed- Batch-Bedingungen vorgeschlagen werden.
Diese Aufgabe wird bei einer Mikrotiterplatte der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, dass die Mikrotiterplatte mehrere Kavitäten für die Aufnahme von Nährstofflösung und für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit aufweist, wobei jede für die Aufnahme von Nährstofflösung vorgesehene Kavität der Mikrotiterplatte durch einen Kanal mit mindestens einer weiteren für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit vorgesehenen Kavität der Mikrotiterplatte verbunden ist und in jedem Kanal eine Diffusionsbarriere angeordnet ist, die die Freisetzungskinetik der Nährstoffe für Fed-Batch- Fermentationen steuert.
Aufgrund der Verbindung von jeweils mindestens zwei Kavitäten mit einem für Nährstoffe durchlässigen Kanal lässt sich die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte für ein Screening unter Fed-Batch-Bedingungen nutzen, indem die Kavitäten derart mit Kulturflüssigkeit und Nährstofflösung befüllt werden, dass jede mit Nährstofflösung befüllte Kavität (Nährstoffkavität) der Mikrotiterplatte durch den Kanal mit mindestens einer weiteren mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavität (Kulturkavität ) der Mikrotiterplatte verbunden ist.
Mit der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte ist ein Screening einer Vielzahl von Stämmen, Medien und Produkten durch Fermentation unter Fed-Batch-Bedingungen möglich. Die Nährstoffkavitäten können mit unterschiedlichen Nährstofflösungen befüllt werden so dass die Mikrotiterplatte für unterschiedliche Screening-Aufgaben einsetzbar ist. Als Nährstoffe kommen beispielsweise verschiedene C-Quellen, N- oder P-Quellen in Betracht. Es können auch Induktoren in die Nährstoffkavitäten vorgelegt werden.
Die Diffusionsbarriere in dem Kanal zwischen der Kavität mit der Nährstofflösung und der Kavität oder den Kavitäten mit der/n Kulturflüssigkeit/en steuert die Freisetzungskinetik unter Fed-Batch-Bedingungen. Abhängig von den Eigenschaften der Diffusionsbarriere werden die Nährstoffe schneller oder langsamer an die Kulturflüssigkeit abgegeben.
Im einfachsten Fall sind jeweils zwei benachbarte Kavitäten einer Mikrotiterplatte durch einen Kanal miteinander verbunden. Jeder Kavität mit Kulturflüssigkeit ist in dieser Variante der Erfindung eine Kavität mit Nährstofflösung zugeordnet. Bei einer herkömmlichen Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten dienen folglich 48 jeweils zugeordnete Kavitäten als Bioreaktor für die Fermentation und 48 Kavitäten als Vorratsbehälter für die Nährstofflösung.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die von mehreren mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavitäten ausgehenden Kanäle in einer gemeinsame Kavität mit Nährstofflösung münden. In diesem Fall versorgt diese Kavität mit Nährstofflösung mehrere Kulturkavitäten. Soll' eine
Vielzahl von mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavitäten von einer einzigen Kavität mit Nährstofflösung versorgt werden, ist das Füllvolumen der Kavität für die Nährstofflösung vorzugsweise größer als das der Kavitäten für die Kulturflüssigkeit. Vorzugsweise sind die Kavitäten für die Kulturflüssigkeit in diesem Fall um die Kavität mit der Nährstofflösung herum angeordnet.
Besonders bevorzugt sind jeweils drei benachbarte Kavitäten durch Kanäle miteinander verbunden, wobei in eine der drei
Kavitäten zwei Kanäle münden. Diese zentrale Kavität beinhaltet die Nährstofflösung, die über die beiden Kanäle an die benachbarten Kavitäten mit der Kulturflüssigkeit abgegeben werden. Der Hauptvorteil dieser Variante der Erfindung besteht darin, dass die Kavität, in die mehrere Kanäle münden, keine von den übrigen Kavitäten abweichende Form und/oder kein abweichendes Füllvolumen benötigt, so dass bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte auf Platten mit einer Standardmatrix und einem Standarddurchmesser für die Kavitäten zurückgegriffen werden kann. Bei einer Platte mit 96 Kavitäten stehen in dieser Ausgestaltung der Erfindung 64 Kavitäten für die Kulturflüssigkeit zur Verfügung.
Unter bestimmten Fermentationsbedingungen kann es vorteilhaft sein, den Durchmesser der Kavitäten für die Nährstofflösung kleiner zu wählen, als den Durchmesser der Kavitäten für die Kulturflüssigkeit. Der kleinere Durchmesser verhindert aufgrund der höheren Oberflächenspannung eine Rotation der Nährstofflösung in der Kavität, nachdem das Schütteln der Mikrotiterplatte begonnen wurde. Hierdurch kann ein
Überlaufen der Nährstofflösung über den Rand der Kavität bei dem zu Anfang der Fermentation hohen Füllstand vermieden werden.
Die Durchlässigkeit der sich in den Kanälen befindlichen
Diffusionsbarrieren ist durch deren Länge, Querschnitt und Materialbeschaffenheit bestimmt. Soll bei der Fermentation der Nährstoff langsam in die Kulturflüssigkeit nachgeführt werden, beispielsweise weil ein Mikroorganismus mit langsamer Wachstumsrate kultiviert werden soll, müssten bei gradlinigen Verbindungskanälen sehr kleine Kanalquerschnitte im Bereich von einem Millimeter realisiert werden, die fertigungstechnisch sehr schwer mit hoher geometrischer Reproduzierbarkeit beherrschbar sind. In diesen Fällen ist der Kanalverlauf zwischen den Kavitäten vorzugsweise nicht gradlinig, sondern gekrümmt ausgebildet. Infolge des gekrümmten, längeren Kanals kann dieser einen größeren leichter zu fertigenden Durchmesser haben. Ein weiterer Vorteil eines nicht geradlinigen langen Verbindungskanals kann darin liegen, dass die Nährstoffzufuhr in die
Kulturkavität nach dem Befüllen der Mikrotiterplatte und dem Start des Versuches erst verzögert erfolgt.
Die Kanäle zwischen den Kavitäten sind zumindest teilweise, vorzugsweise jedoch vollständig mit wasserunlöslichen natürlichen oder künstlichen Polymeren (Hydrogel) als Diffusionsbarriere gefüllt. Die Diffusionsbarriere dichtet den Verbindungskanal zwischen Nährstoffkavität und Kulturkavität flüssigkeitsseitig ab. Ein Hydrogel ist ein wasserenthaltendes, aber wasserunlösliches Polymer, dessen Moleküle chemisch beispielsweise durch kovalente oder ionische Bindungen oder physikalisch zu einem Netzwerk verknüpft sind. Insbesondere aufgrund ihrer Biokompatibilität und gewebeähnlichen mechanischen Eigenschaften kommen sie zunehmend in der Biotechnologie zum Einsatz . Alternativ kann die Diffusionsbarriere auch aus einem mikroporösem Material aus Kunststoff, Glas, Keramik oder Metall bestehen.
Für die Diffusionsbarriere hat sich als besonders vorteilhaft die Verwendung von Polyacrylamid herausgestellt. Polyacrylamid ist das Polymer von Acrylamid. Die
Polymerisation von Acrylamid zu Polyacrylamid wird durch eine Kettenreaktion hervorgerufen. Diese Reaktion kann z.B. von Ammoniumpersulfat (APS) als Radikal gestartet und von TEMED (Tetramethylethylendiamin) katalysiert werden. Es entsteht eine gelartige Matrix, das Polyacrylamid. Darüber hinaus haben sich die nachfolgend aufgezählten natürlichen und künstlichen Polymere als vorteilhaft herausgestellt:
Cellulose bzw. Polysaccharide wie z.B. Alginate, Gelan, Karragenan, Chitosan und ihre Derivate, Polysiloxane und ihre Derivate, Polyacrylsäure und ihre Derivate, PoIy- carbonate und ihre Derivate, Polyolefine und ihre Derivate, Polycarbonsäuren und ihre Derivate, Polyether und ihre Derivate, Polyester und ihre Derivate, Polyamine und ihre Derivate, Polyamide und ihre
Derivate, Polylsulfone und ihre Derivate, Polyurethane und ihre Derivate, Polyvinyle und ihre Derivate insbesondere Polyvinylalkohole, sowie Copolymere der genannten Polymere und durch Modifizierung erhaltene Derivate.
Die Diffusionsbarriere gewährleistet einen kontrollierten und reproduzierbaren Transfer für Nährstoffe in die Kulturflüssigkeit, wobei die Freisetzungskinetik so bestimmt wird, dass ein Nährstoffüberschuss oder Nährstoffmangel vermieden wird. Je nach Fermentation wird die Kulturflüssigkeit mit einer spezifischen Nährstoffkonzentration über einen Zeitraum von einigen Stunden bis wenigen Wochen versorgt.
Die Durchlässigkeit der Diffusionsbarriere für Nährsoffe aus Nährstofflösungen auf Kohlenstoffbasis beträgt:
2 , 5 ~ 25 0 CfNährstoff / (■'-'Kul turvol umen X ^Geεamtkul turzei t > J bZW .
0 , 08 - 8 (LKul turvolumen x £iGeεamtkul turzei t) ,
bevorzugt
12 ~ 72 <7NaΛrs toff / ( J->κul turvolumen X ^Gesamtkul turzei t ' J ^ZW .
0, 4 - 2, 4 i^olKohlenstoffatom/ (LKulturvolumen x hGeεamtkul turzeit) betragt .
Bei Stickstoffquellen haben sich, auf Atombasis gerechnet, um einen Faktor 0,2 geringere Durchlässigkeiten als bei Kohlenstoffquellen bewährt, bei Phosphorquellen um einen Faktor 0,01 geringere Durchlässigkeiten und bei Schwefelquellen um einen Faktor 0,005 geringer Durchlässigkeiten.
Das Einbringen der Diffusionsbarriere in die Kanäle der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte erfolgt beispielsweise dadurch, dass ein Tropfen einer noch nicht ausgehärteten
Hydrogellösung in eine der beiden jeweils durch einen Kanal verbundenen Kavitäten gegeben wird. Dies kann beispielsweise mit einem Pipetier-Roboter erfolgen. Das nicht ausgehärtete Hydrogel wird durch Kapillarkräfte in die Kanäle gezogen und härtet dort aus. Dafür kann es vorteilhaft sein die Kanäle (und die Kavitäten) vor dem Einbringen der noch nicht ausgehärteten Hydrogellösung z. B. durch eine chemische Behandlung oder eine Plasmabehandlung zu hydrophilisieren. Eine andere Herstellungsmethode besteht darin, dass das noch nicht ausgehärtete Hydrogel durch Zentrifugieren der Mikrotiterplatte in die Kanäle gelangt. Dieses Verfahren wird weiter unten anhand der Figuren näher erläutert.
Besonders preiswert lässt sich die erfindungsgemäße
Mikrotiterplatte herstellen, wenn auf die Komponenten einer herkömmlichen Mikrotiterplatte mit Boden- und Kavitätenplatte zurückgegriffen wird. In dieser Ausgestaltung der Erfindung umfasst die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte eine an sich bekannte Bodenplatte und Kavitätenplatte mit hohlzylindrischen oder leicht konischen Durchgängen, wobei die Bodenplatte und die Kavitätenplatte flüssigkeitsdicht miteinander verbunden sind. Insoweit stimmt der Aufbau mit den eingangs erwähnten bekannten zweiteiligen Mikrotiterplatten überein. Zusätzlich werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte in die den Boden der Kavitäten bildende Oberfläche der Bodenplatte rinnenartige Vertiefungen eingebracht, die teilweise durch Bereiche zwischen den Durchgängen der Kavitätenplatte flüssigkeitsdicht verschlossen sind. Hierdurch werden die Kanäle zwischen den Kavitäten ausgebildet. Um die Stoffdurchlässige Verbindung zwischen zwei Kavitäten durch die Kanäle zu gewährleisten, sind die Vertiefungen außerdem derart in der Bodenplatte angeordnet, dass sich jedes Ende einer Vertiefung bis unter einen der Durchgänge in der
Kavitätenplatte erstreckt. Das Einbringen der rinnenartigen Vertiefungen in die an sich bekannte Bodenplatte kann durch Fräsen oder kostengünstig durch Heißprägen erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, die rinnenartigen Vertiefungen bereits beim Spritzgießen oder Extrudieren der Bodenplatte vorzusehen. Sofern die Befüllung der Kanäle mit Hydrogel durch Zentrifugieren der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte erfolgen soll, ist die in die Bodenplatte eingeprägte Vertiefung vorzugsweise nach den Merkmalen des Unteranspruchs 16 gestaltet.
Um ein Online-Monitoring der Kulturflüssigkeiten während des Schütteins der Mikrotiterplatte zu ermöglichen, bestehen die Böden zumindest der KuIturkavitäten zumindest teilweise aus transparentem Material. Ist die Mikrotiterplatte aus Boden- und Kavitätenplatte zusammengesetzt, besteht die Bodenplatte vorzugsweise vollständig aus transparentem Material (wie z.B. Polystryrol, Polycarbonat , Polymethylmethacrylat oder deren Derivate oder Blends oder Glas oder Quatzglas) , um ein
Online-Monitoring zu ermöglichen. Die Bodenplatte kann im Bereich der Kavitäten sehr dünn, z.B. im Bereich zwischen 10 μm und 500 μm, ausgeführt sein, um eine gute Durchlässigkeit für Licht geringer Wellenlänge (<280 mm) zu gewährleisten.
Ein zentraler Vorteil der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte besteht darin, dass die Kavitäten mit Pipetten automatisiert befüllt werden können. Hierfür können herkömmliche Pipetier- Roboter zum Einsatz gelangen. Die steriltechnische Abdeckung der Mikrotiterplatten erfolgt entweder durch herkömmliche selbstklebende Folien oder einen abnehmbaren Deckel.
Mit der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte ist es nicht nur möglich, die Nährstofflösung auszuwählen und die Freisetzungskinetik festzulegen, sondern darüber hinaus kann die Nährstofflösung mit zeitlicher Verzögerung nach Beginn der Fermentation in die Nährstoffkavitäten zugegeben werden. Hierdurch kann ein Nährstoffüberschuss der Kulturflüssigkeit in der Anfangsphase wirksam vermieden werden. Der Zeitpunkt, zu dem die Nährstofflösung erstmals zugegeben wird, kann durch Online-Monitoring der Kulturflüssigkeiten bestimmt werden .
Darüber hinaus kann in jede mit Nährstofflösung befüllte Kavität zeitversetzt weitere Nährstofflösung mit unterschiedlicher Konzentration zuzugeben werden. Zunächst wird beispielsweise eine kleine Menge Nährstofflösung mit geringer Konzentration in die Nährstoffkavität gegeben, die später durch weitere Portionen der Nährstofflösung mit höherer Konzentration ergänzt wird. Durch diese Maßnahme wird das treibende Konzentrationsgefälle zwischen der Nährstofflösung und der Kulturflüssigkeit erhöht. So lässt sich der diffusive Transfer der Nährstoffe an die steigenden Bedürfnisse einer anwachsenden Kultur anpassen.
Üblicherweise sind der Füllstand der Nährstofflösung und der Füllstand der Kulturflüssigkeit in zwei miteinander durch einen Kanal verbundenen Kavitäten zu Anfang der Fermentation gleich hoch. In einigen Anwendungsfällen weist die Nährstofflösung jedoch eine sehr hohe Konzentration auf.
Infolgedessen kann sich ein starker Gradient im osmotischen Druck ausbilden, der zu einer Diffusion von Wasser aus der Kulturflüssigkeit in die Nährstofflösung führt. Dies ist unerwünscht, da der Füllstand der Kulturflüssigkeit abfällt und der Füllstand der Nährstofflösung ansteigt. In diesen Fällen kann es daher vorteilhaft sein, zu Beginn der Fermentation den Füllstand der Nährstofflösung höher zu wählen als den Füllstand der Kulturflüssigkeit. Der unterschiedliche hydrostatische Druck wirkt dem osmotischen Druck entgegen und die Diffusion von Wasser aus der
Kulturflüssigkeit durch die Diffusionsbarriere in die Nährstofflösung wird vermindert.
Nachfolgend wird die Erfindung an Hand der Figuren näher erläutert. Es zeigen Figur 1 eine Teilansicht sowie einen Schnitt längs der Linie A-A einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte ,
Figur 2 eine Teilansicht sowie einen Schnitt längs der
Linie A-A einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte mit gebogenen Kanälen,
Fig. 3a, b eine Teil- und Gesamtansicht sowie einen Schnitt längs der Linie A-A nach Figur 3a einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte, wobei jeweils drei benachbarte Kavitäten durch Kanäle miteinander verbunden sind,
Figur 4 eine Ansicht einer vierten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte, wobei die Kanäle einer Vielzahl von Kavitäten in einer lang gestreckten zentralen Kavität münden sowie
Figur 5 eine Teilansicht sowie Schnitte längs der Linien A-A sowie B-B einer fünften Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte mit einer produktionstechnisch vorteilhaften
Kanalgestaltung .
Figur 1 zeigt einen Ausschnitt einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte 1 mit Kavitäten 2, 3, die jeweils durch einen Kanal 4 miteinander verbunden sind. Die
Mikrotiterplatte 1 wird durch eine Bodenplatte 5 und eine Kavitätenplatte 6 mit hohlzylindrischen oder leicht konischen Durchgängen 7 zwischen gegenüberliegenden parallelen Oberflächen der Kavitätenplatte 6 gebildet, wobei die Bodenplatte 5 und die Kavitätenplatte 6 flüssigkeitsdicht miteinander gefügt sind. Als Fügeprozesse kommen z.B. Laserschweißen, Reibschweißen, Ultraschallschweißen, Lösungsmittelkleben, Dosieren von Kleber durch X-Y- Verfahreinheiten auf die Klebflächen mit Luftdruck-, Spritzen- oder Piezodosierern, Aufrollen oder Aufstempeln von Kleber oder die Verwendung von vorstrukturierten beidseitig klebenden Haftfolien infrage.
In die den Boden 8, 9 der Kavitäten 2, 3 bildende Oberfläche der Bodenplatte 5 sind längliche, rinnenartige Vertiefungen 11 eingebracht, die teilweise durch Bereiche 12 der
Kavitätenplatte 6 zwischen den Durchgängen 7 nach oben verschlossen sind. Die stegartigen Bereiche 12 zwischen den Durchgängen 7 bilden zusammen mit den Vertiefungen 11 den Kanal 4, der sich zwischen den Böden 8, 9 der Kavitäten 2, 3 erstreckt . Die Kavität 2 dient beispielsweise zur Aufnahme der Nährstofflösung, während sich in der Kavität 3 die Kulturflüssigkeit befindet. In dem Kanal 4 ist eine Diffusionsbarriere 13 angeordnet.
Die Darstellung der Mikrotiterplatte in Figur 2 entspricht weitgehend der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform der Erfindung. Soweit Übereinstimmung besteht, wird auf die Erläuterungen zu Figur 1 verwiesen. Unterschiede ergeben sich lediglich hinsichtlich der Ausbildung des Kanals 14 zwischen den Kavitäten 2, 3. Abweichend zu Figur 1 verbindet der Kanal 14 die beiden Kavitäten nicht auf dem kürzesten Weg sondern ist gekrümmt ausgeführt, so dass sich eine größere Länge des Kanals ergibt . Bei im übrigen übereinstimmenden Material für die Diffusionsbarriere 13 resultiert aus der größeren Kanallänge ein insgesamt größerer Diffusionswiderstand, der für eine langsamere und/oder zeitverzögerte Zufütterung der Nährstoffe gewünscht sein kann.
Figuren 3a und 3b zeigen eine vollständige erfindungsgemäße Mikrotiterplatte in der jeweils drei benachbarte Kavitäten 2, 3 durch zwei Kanäle 15, 16 miteinander verbunden sind, wobei in die mittlere Kavität 2 die beiden Kanäle 15, 16 münden. Die mittlere Kavität 2 ist mit Nährstofflösung und die beiden äußeren Kavitäten 2 sind mit Kulturflüssigkeit befüllt. In jedem Kanal 15, 16 ist eine Diffusionsbarriere 13 angeordnet. Die beiden mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavitäten 3 werden aus der mittleren Kavität 2 über die Kanäle 15, 16 mit Nährstoff gefüttert. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass auf der in Figur 3 dargestellten Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten 64 Kavitäten mit Kulturflüssigkeit gleichzeitig kultiviert werden können, wobei bei der Ausführungsform nach Figur 1 und 2 nur 48 Kavitäten für Kulturen verwendet werden können .
Figur 4 zeigt eine weitere Variante der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte, in der jeweils 16 mit Kulturflüssigkeit befüllte Kavitäten 3 aus einer Kavität 17 mit Nährstoff versorgt werden. Die Kanäle 18 von jeweils 16 Kavitäten 3 münden in der Kavität 17, die sich zwischen zwei Spalten mit Kavitäten 3 über die gesamte Breite der Mikrotiterplatte 1 erstreckt. In jedem Kanal 18 zwischen den Kavitäten 3 und der lang gestreckten Kavität 17 befindet sich eine
Diffusionsbarriere 13. Mit dieser Ausführungsform lassen sich ähnlich wie bei der in Figur 3 gezeigten Ausführungsform 64 Kavitäten für Kulturen verwenden, jedoch müssen nur 4 Nährstoffkavitäten befüllt werden anstatt von 32 in Figur 3. Das spart Zeit bei der Vorbereitung des Versuchs .
Die in Figur 5 in Teilansicht dargestellte Mikrotiterplatte 1 entspricht weitgehend der Mikrotiterplatte nach Figur 1. Insoweit wird auf Erläuterungen zu Figur 1 Bezug genommen. Jeweils zwei Kavitäten 2, 3 werden durch einen Kanal 19 miteinander verbunden, der ebenfalls durch eine rinnenartige Vertiefung in der Bodenplatte 5 gebildet ist. Abweichend von Figur 1 erweitert sich ein Ende der rinnenartigen Vertiefung unterhalb des Durchgangs 7 in der Kavitätenplatte 6. Die Tiefe der in den Schnitten A-A und B-B erkennbaren Erweiterung 22 nimmt von ihrem Ansatz 23 an der rinnenartigen Vertiefung des Kanals 19 aus ab. Die Kavität 2 besitzt infolgedessen einen zum Ansatz 23 hin abfallenden Boden 24. Diese Ausbildung des Bodens 24 hat herstellungstechnische Vorteile bei der Befüllung des Kanals 19 mit einem die
Diffusionsbarriere 13 bildenden Hydrogel . Zur Befüllung wird beispielsweise mittels eines Pipetier-Roboters eine noch nicht ausgehärtete Hydrogellösung auf den Boden 24 der Kavität 2 aufgebracht. Anschließend wird die gesamte Mikrotiterplatte 1 in einer Zentrifuge um die im Schnitt A-A angedeutete Drehachse gedreht. Infolge der Zentrifugalkräfte wird die noch nicht ausgehärtete Hydrogellösung in den Kanal 19 geschleudert. Die Menge der Hydrogellösung wird vorzugsweise so bemessen, dass sich nach dem Zentrifugieren eine mit der Oberfläche der Bodenplatte 5 abschließende
Hydrogelschicht ergibt. Hierdurch ist gewährleistet, dass die Form der Diffusionsbarriere und die Größe von deren Kontaktflächen mit der Nährstofflösung / Kulturflüssigkeit genau bestimmt sind. Bei der hier gezeigten Ausführungsform ist die Kavität 2 bevorzugt die Nährstoffkavität und die
Kavität 3 die Kulturkavität . Dadurch ist gewährleistet, dass die Kulturen durch einen optisch transparenten, einwandfreien Boden durch online Monitoring verfolgt werden können.
Bezugszeichenliste

Claims

Patentansprüche
1. Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Kavitäten, die an einer ebenen Oberseite eine Öffnung aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass
die Mikrotiterplatte mehrere Kavitäten (2,3,17) für die Aufnahme von Nährstofflösung und für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit aufweist,
wobei jede für die Aufnahme von Nährstofflösung vorgesehene Kavität (2,17) der Mikrotiterplatte durch einen Kanal (4,15,16,18,19) mit mindestens einer weiteren für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit vorgesehenen Kavität (3) der Mikrotiterplatte verbunden ist
und in jedem Kanal eine Diffusionsbarriere (13) angeordnet ist, die die Freisetzungskinetik der Nährstoffe für Fed-Batch-Fermentationen steuert.
2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzungskinetik der Diffusionsbarriere so bestimmt wird, dass zunächst ein Nährstoffüberschuss besteht und anschließend die Kultur in eine Nährstofflimitation gerät.
3. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Diffusionsbarriere den Kanal flüssigkeitsdicht abdichtet.
4. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässigkeit der
Diffusionsbarriere für Kohlenstoffquellen
■^ ' -) ~ Zt) U 5 Kohlenstoff quelle / ' ■'-'Kul turvolumen ^ ^Gesamtkul turzei t ' J beträgt .
5. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässigkeit der
Dif fusionsbarriere für Stickstof f quellen 0 , 016 - 1 , 6 molstickstoffatom/ (LKul turvolumen x hGesamtkul turzei t )
beträgt .
6. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässigkeit der
Diffusionsbarriere für Phosphorquellen
0 , 0008 - 0 , 08 rtlOl phosphora tom/ (LiKulturvolumen X ^Gesamtkulturzei t ' beträgt .
7. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässigkeit der
Diffusionsbarriere für Schwefelquellen
0 , 0004 - 0 , 04 mθlSchwefelatom/ ( LKulturvolumen X ^βeεamtkul turzeα t ' beträgt.
8. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 - 7 , dadurch gekennzeichnet, dass jeweils zwei benachbarte Kavitäten (2,3) durch einen Kanal (4) miteinander verbunden sind.
9. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle (15,16,18,) mehrerer Kavitäten (3) für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit in einer Kavitat (2, 17) für die Aufnahme von Nährstofflösung münden.
10. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils drei benachbarte Kavitäten (2,3) durch Kanäle (15,16) miteinander verbunden sind, wobei in eine Kavitat (2) für die Aufnahme von Nährstofflösung zwei Kanäle münden.
11. Mikrotiterplatte nach Anspruch 9 oder 10, dadurch ge- kennzeichnet, dass jede Kavität (17) für die Aufnahme von Nährstofflösung, in die mehrere Kanäle (18) münden, eine von den übrigen Kavitäten (3) für die Aufnahme von Kulturflüssigkeit abweichende Form und/oder ein abweichendes Füllvolumen aufweist.
12. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanalverlauf zwischen den Kavitäten (2,3,17) geradlinig ist.
13. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanalverlauf zwischen den Kavitäten (2,3) gekrümmt ist.
14. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle (4,15,16,18,19) zwischen den Kavitäten (2,3,17) zumindest teilweise mit Polyacrylamid als Diffusionsbarriere (13) gefüllt sind.
15. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte (1) eine Bodenplatte (5) und eine Kavitätenplatte (6) mit Durchgängen (7) zwischen gegenüberliegenden Oberflächen umfasst, wobei die Bodenplatte (5) und die Kavitätenplatte (6) flüssigkeitsdicht miteinander verbunden und in die den Boden (8,9,24) der Kavitäten (2,3,17) bildende Oberfläche der Bodenplatte (5) rinnenartige Vertiefungen (11,21) eingebracht sind, die teilweise durch Bereiche (12) zwischen den Durchgängen (7) der Kavitätenplatte flüssigkeitsdicht verschlossen sind, wobei die Vertiefungen (11,21) derart in der Bodenplatte angeordnet sind, dass sich jedes Ende einer Vertiefung bis unter einen der Durchgänge (7) in der Kavitätenplatte (6) erstreckt.
16. Mikrotiterplatte nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sich ein Ende jeder Vertiefung (21) unterhalb einem der Durchgänge (7) in der Kavitätenplatte
(6) erweitert und die Tiefe der Erweiterung (22) in der Bodenplatte (5) von ihrem Ansatz (23) aus abnimmt.
17. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Böden (8,9,24) der
Kavitäten (2,3,17) zumindest teilweise aus transparentem Material bestehen.
18. Mikrotiterplatte nach Anspruch 17, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Bodenplatte (5) aus transparentem
Material besteht .
19. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte (1) mit einem Schüttler verbunden ist.
20. Verwendung einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Fermentation mit gezielter Zufütterung von Nährstoffen in die Kulturflüssigkeit mehrerer Kavitäten, wobei die Kavitäten (2,3,17) derart mit Kulturflüssigkeit und Nährstofflösung befüllt werden, dass jede mit Nährstofflösung befüllte Kavität (3) der Mikrotiterplatte durch einen Kanal (4,15,16,18,19) mit mindestens einer weiteren, mit Kulturflüssigkeit befüllten Kavität (2,17) der Mikrotiterplatte (1) verbunden ist .
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Kavitäten (2,3,17) mit Pipetten automatisiert befüllt werden.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotiterplatte (1) während der Fermentation geschüttelt wird.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährstofflösung in die dafür vorgesehenen Kavitäten (2,10) mit zeitlicher Verzögerung nach Beginn der Fermentation zugegeben wird.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass in jede mit Nährstofflösung befüllte Kavität (3, 17) zeitversetzt nach Beginn der Kultivierung weitere Nährstofflösung mit unterschiedlicher Konzentrationen zugegeben wird.
EP07725400A 2006-05-26 2007-05-21 Mikrotiterplatte und deren verwendung Withdrawn EP2024744A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006025011A DE102006025011A1 (de) 2006-05-26 2006-05-26 Mikrotiterplatte und deren Verwendung
PCT/EP2007/004493 WO2007137722A1 (de) 2006-05-26 2007-05-21 Mikrotiterplatte und deren verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2024744A1 true EP2024744A1 (de) 2009-02-18

Family

ID=37906996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP07725400A Withdrawn EP2024744A1 (de) 2006-05-26 2007-05-21 Mikrotiterplatte und deren verwendung

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8268611B2 (de)
EP (1) EP2024744A1 (de)
DE (1) DE102006025011A1 (de)
WO (1) WO2007137722A1 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2158966B1 (de) 2008-08-26 2011-07-20 Roche Diagnostics GmbH Hochdichte Multiwellplatte für PCR
DE102011078976A1 (de) * 2011-07-11 2013-01-17 Robert Bosch Gmbh Mikrofluidische Vorrichtung sowie Verfahren zur Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung
US20150004686A1 (en) * 2012-02-02 2015-01-01 Corning Incorporated Automatic continuous perfusion cell culture microplate consumables
US8790599B2 (en) 2012-08-13 2014-07-29 David Childs Microtiter plate system and method
US9388945B2 (en) 2013-02-01 2016-07-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for emulsion aspiration
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
AU2013202778A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Gen-Probe Incorporated Systems, methods, and apparatuses for performing automated reagent-based assays
CN113680404B (zh) * 2017-06-08 2023-01-31 因特格拉生物科学有限公司 一次性存储器内衬及套件
CN107287095A (zh) * 2017-08-24 2017-10-24 熹农生物科技（涟源）有限公司 微生物培养容器

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5422270A (en) * 1987-05-19 1995-06-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services One-step tray test for release of soluble mediators and apparatus therefore
US5232838A (en) * 1991-12-09 1993-08-03 Minnesota Mining And Manufacturing Company Culture media device and method of use
DE9419230U1 (de) * 1994-12-02 1995-03-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Anordnung für fed-batch-Prozeßuntersuchungen in einer Schüttelkolbenserie
US5972694A (en) * 1997-02-11 1999-10-26 Mathus; Gregory Multi-well plate
DE19806681B4 (de) 1998-02-18 2006-07-27 Carl Zeiss Jena Gmbh Mikrotiterplatte
US6555389B1 (en) 1999-05-11 2003-04-29 Aclara Biosciences, Inc. Sample evaporative control
US6699665B1 (en) 2000-11-08 2004-03-02 Surface Logix, Inc. Multiple array system for integrating bioarrays
US6742661B1 (en) * 2001-04-03 2004-06-01 Micronics, Inc. Well-plate microfluidics
WO2003104439A2 (en) * 2002-03-12 2003-12-18 Surface Logix, Inc. Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
JP2005523717A (ja) 2002-05-01 2005-08-11 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 生化学的過程の迅速なスクリーニングおよび分析のための微小発酵槽
US7507579B2 (en) 2002-05-01 2009-03-24 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and methods for simultaneous operation of miniaturized reactors
CN101061213B (zh) * 2004-05-19 2012-12-19 麻省理工学院 灌注的三维细胞/组织疾病模型
WO2007008609A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for cell culture array

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2007137722A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8268611B2 (en) 2012-09-18
US20090170183A1 (en) 2009-07-02
WO2007137722A1 (de) 2007-12-06
DE102006025011A1 (de) 2007-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2024744A1 (de) Mikrotiterplatte und deren verwendung
EP1718409B1 (de) Vorrichtung für mikrofluiduntersuchungen
EP2192984B1 (de) Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion
EP2255881B1 (de) Mikrofluid-Vorrichtung und Verfahren zur Erzeugung diffusiv aufgebauter Gradienten
EP2038062B1 (de) Mikroreaktoren-array, vorrichtung mit einem mikroreaktoren-array und verfahren zur verwendung eines mikroreaktoren-arrays
DE4132379C2 (de)
DE202015009494U1 (de) Fluidische Vorrichtungen und Systeme zur Einkapselung und Partitionierung von Reagenzien, und deren Anwendungen
EP2181188B1 (de) Mikrobioreaktor sowie mikrotiter-platte mit mehreren mikrobioreaktoren
WO2005012504A1 (de) Zellkultivierungs- und aufzuchtverfahren
DE3718934A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur herstellung von polymer-perlen
DE3409501A1 (de) Verfahren zur kultivierung von zellen
EP1879995B1 (de) Fermentationsverfahren und anordnung zu dessen durchführung
EP3083931B1 (de) Mikrofluidischer bioreaktor mit modularem aufbau zur synthese von zellmetaboliten, das verfahren zur nutzung sowie dessen verwendung
DE102012105540A1 (de) Gefäßmodell, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
WO2007014739A1 (de) Probenkammer und verfahren zu ihrer herstellung
DE10244859B4 (de) Bioreaktor mit modularem Aufbau, insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung
DE102015106870B3 (de) System zur Inkubation von mikrofluidischen Tropfen und Verfahren zur Bereitstellung von homogenen Inkubationsbedingungen in einer Tropfeninkubationseinheit
DE102020107599B3 (de) Verfahren zur Kultivierung von Zellen
EP3807537B1 (de) Verfahren zur erhöhung der dosierpräzision von mikrofluidischen pumpen oder ventilen sowie schweissvorrichtung und spannvorrichtung zur durchführung des verfahrens
EP1379622B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum kultivieren und/oder verteilen von partikeln
WO2018069169A1 (de) Mikrobioreaktor-modul
DE102016206918A1 (de) Bioreaktor für die Kultivierung von Organismen mit einer verbesserten Gaszuführung
DE102021204675B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Zellkultivierung
EP2251668B1 (de) Verfahren zum Positionieren einer organischen, biologischen und/oder medizinischen Probe
WO2023247007A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur erzeugung von organoiden sowie zellkultur

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20081117

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA HR MK RS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20110411

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: M2P-LABS GMBH

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: M2P-LABS GMBH

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20141129