JP2001521730A - カスパーゼ−１４ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アポトーシスの新規なエフェクターである新規なカスパーゼ−１４タンパク質（ＥＲＩＣＥとも呼ばれる）に関する。詳細には、ヒトカスパーゼ−１４タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。カスパーゼ−１４ポリペプチドはまた、カスパーゼ−１４ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法として提供される。さらに、本発明は、カスパーゼ−１４活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。また、アポトーシスに関連する疾患および障害を処置するための治療方法が、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、アポトーシスの新規なエフェクターに関する。より詳細には、ヒト
カスパーゼ−１４ポリペプチド（本明細書中では、以下、しばしば「ＥＲＩＣＥ
」と称される）をコードする、単離された核酸分子が提供される。カスパーゼ−
１４ポリペプチドはまた、それらを産生するためのベクター、宿主細胞および組
換え方法として提供される。本発明はさらに、カスパーゼ−１４活性のアゴニス
トおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。アポト
ーシスに関連する疾患および障害を処置するための治療方法もまた、提供される
。

【０００２】 （発明の背景） 細胞死の仕組みは、進化の過程で保存されており、そしてアクチベーター、イ
ンヒビター、およびエフェクターから構成される（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．
Ｍ．およびＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５５５〜５６２（
１９９６））。細胞死経路のエフェクターアームはカスパーゼと呼ばれるシステ
インアスパルテート特異的プロテアーゼの迅速に成長しているファミリーから構
成される（Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ８７：１７１（１９９６）
）。その名前によって示唆されるように、これらのシステインプロテアーゼは、
アスパラギン酸残基に続く基質を切断する（Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｃｅ
ｌｌ ８７：１７１（１９９６）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ ７８
：３４３〜３５２（１９９４））。通常、カスパーゼは、単一のポリペプチドチ
モーゲンとして存在し、そしてアミノ末端プロドメイン、ならびに大きい触媒サ
ブユニットおよび小さい触媒サブユニットを含む（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３７０：２７０〜２７４（１９９４）；Ｒｏｔｏｎｄａ，Ｊ．ら
、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：６１９〜６２５（１９９６）；Ｆｒａ
ｓｅｒ，Ａ．およびＥｖａｎ，Ｇ．、Ｃｅｌｌ ８５：７８１〜７８４（１９９
６））。２つの鎖の活性酵素（大きいサブユニットおよび小さいサブユニットか
ら構成される）は、内部Ａｓｐ残基におけるタンパク質分解プロセス後に得られ
る。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：２７０〜２７４（１
９９４）；Ｒｏｔｏｎｄａ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：６
１９〜６２５（１９９６）；Ｆｒａｓｅｒ，Ａ．およびＥｖａｎ，Ｇ．、Ｃｅｌ
ｌ ８５：７８１〜７８４（１９９６））。このように、カスパーゼは、凝固カ
スケードで観察されるチモーゲン活性化と同様の様式で互いに活性化され得る（
Ｂｏｌｄｉｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ ８５：８０５〜８１５（１９９６））。
レセプターに関連するカスパーゼとしてのＦＬＩＣＥおよびＭｃｈ４／ＦＬＩＣ
Ｅ２の同定は、細胞傷害レセプターＣＤ−９５およびＴＮＦＲ−１による死経路
の活性化に関する驚くべき直接的機構を示唆する（Ｂｏｌｄｉｎ，Ｍ．Ｐ．ら、
Ｃｅｌｌ ８５：８０５〜８１５（１９９６）；Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ
８５：８１７〜８２７（１９９６）；Ｖｉｎｃｅｎｚ，Ｃ．およびＤｉｘｉｔ
，Ｖ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６５７８〜６５８３（１９９７
）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５〜５１２（１
９９５））。活性化の際に、両方のレセプターはそれらの死ドメインを使用し、
アダプター分子ＦＡＤＤ（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍ
ａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）中の対応するドメインに結合する（Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．
ら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７〜８２７（１９９６）；Ｖｉｎｃｅｎｚ，Ｃ．およ
びＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６５７８〜６５８
３（１９９７）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５
〜５１２（１９９５））。ＦＡＤＤの優性ネガティブバージョンは、Ｎ末端セグ
メントを欠損するが、なおＣＤ−９５誘導性アポトーシスおよびＴＮＦＲ−１誘
導性アポトーシスの両方を強力に阻害する死ドメインを保持する（Ｃｈｉｎｎａ
ｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１〜４９６５（
１９９６）；Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９５２
〜２９５６（１９９７））。死経路に従事する場合にＮ末端セグメントの重要性
を与えられると、それは死エフェクタードメイン（ＤＥＤ）と呼ばれる（Ｃｈｉ
ｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１〜４９
６５（１９９６））。

【０００３】 注目すべきことに、このＤＥＤはＦＬＩＣＥおよびＭｃｈ４／ＦＬＩＣＥ２の
プロドメイン内に存在し、そして変異誘発研究は、ＦＡＤＤのＤＥＤとＦＬＩＣ
ＥまたはＭｃｈ４／ＦＬＩＣＥ２の対応するドメインとの間の同種親和性相互作
用が、ＣＤ−９５およびＴＮＦＲ−１シグナル伝達複合体に対するこれらのプロ
テアーゼの漸増の原因であることを示唆する（Ｍｕｚｉｏ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ
８５：８１７〜８２７（１９９６）；Ｖｉｎｃｅｎｚ，Ｃ．およびＤｉｘｉｔ，
Ｖ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６５７８〜６５８３（１９９７）
；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５〜５１２（１９
９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
４９６１〜４９６５（１９９６））。ひとつにして考えると、これらのデータは
ＦＬＩＣＥおよびＭｃｈ４／ＦＬＩＣＥ２が先端酵素であることと一致し、それ
は下流のカスパーゼの厳しいタンパク質分解プロセスを開始してアポトーシスを
生じる（Ｂｏｌｄｅｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ８５：８０５〜８１５（１９９６
）；Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ，Ｓ．Ｍ．ら、ＰＮＡＳ ９３：１４４８６〜１４
４９１（１９９６）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．ら、ＰＮＡＳ
９３：７４６４〜７４６９（１９９６）；Ｈｅｎｋａｒｔ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ４：１９５〜２０１（１９９６））。多くのウイルス遺伝子産物は
、感染した宿主に抵抗する手段としてＣＤ−９５およびＴＮＦＲ−１媒介性殺傷
をアンタゴナイズする。（Ｓｈｅｎ，Ｙ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．Ｓ．、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ ５：１０５〜１１１（１９９５））。ポックスウイルスがコードする
セルピンＣｒｍＡおよびバキュロウイルス遺伝子産物ｐ３５は直接的なカスパー
ゼインヒビターである（Ｗａｌｋｅｒ，Ｎ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ７８：３４３〜３
５２（１９９４））。対照的に、伝染性軟属腫ウイルスタンパク質ＭＣ１５９お
よびウマヘルペスウイルスタンパク質Ｅ８は、ＤＥＤ含有デコイ分子をコードし
、これはＦＡＤＤ（ＭＣ１５９）またはＦＬＩＣＥ（Ｅ８）のいずれかに結合し
、そしてレセプターシグナル伝達複合体の集合を破壊し、それによって死シグナ
ルを排除する（Ｈｕ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９６２１〜９
６２４（１９９７）；Ｂｅｒｔｉｎ，Ｊ．ら、ＰＮＡＳ ９４：１１７２〜１１
７６（１９９７）；Ｔｈｏｍｅ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：５２７〜５２
１（１９９７））。これらのウイルス性インヒビターは、哺乳動物ゲノムに機能
的に等価な分子がコードされるか否か、という疑問を提起する。

【０００４】 本発明のポリペプチドのような因子の必要性が存在し、治療目的のためにアポ
トーシスを成し遂げるかまたは阻害するために有用である。例えば、アルツハイ
マー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血症ショック、敗血症、発作、
中枢神経炎症、骨粗しょう症、虚血、再灌流障害、心血管疾患関連細胞死、多嚢
胞性腎疾患、心血管系疾患の内皮細胞アポトーシス、変性肝疾患、多発性硬化お
よび頭部外傷損傷の治療において。従って、本発明のカスパーゼ−１４ポリペプ
チドのようなアポトーシスのエフェクターまたはインヒビターのような因子を同
定および特徴付けする必要があり、これはアポトーシスに関連した疾患および障
害を予防し、改善または直す場合に役割を果たし得る。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列または１９９７年５月１５日に
Ａｍｅｒｉｃａｍ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴ
ＣＣ」）受託番号２０９０３９として寄託されたクローンのヒトｃＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列を有するカスパーゼ−１４ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ＡＴＣＣは１０８０
１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇ
ｉｎｉａ ２０１１０〜２２０９に位置する。

【０００６】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によりカスパーゼ−１４ポリペプチドまたは
ペプチドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。

【０００７】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードさ
れるアミノ酸配列を有する単離されたカスパーゼ−１４ポリペプチドを提供する
。本発明はまた、カスパーゼ−１４により誘導される細胞性応答を増強または阻
害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、この方法はカス
パーゼ−１４を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞性応答をアッ
セイする工程、およびこの細胞性応答を標準的な細胞性応答と比較する工程を包
含し、標準とは、候補化合物の非存在下で接触がなされる場合にアッセイされる
；これによって標準を超える増加した細胞性応答は化合物がアゴニストであるこ
とを示し、そして標準を超えて減少した細胞性応答は化合物がアンタゴニストで
あることを示す。

【０００８】 別の局面では、アゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニングアッ
セイが提供される。これはＴＮＦＲ−１、ＴＲＡＩＬ、またはＣＤ−９５レセプ
ターに対するカスパーゼ−１４の結合において候補化合物が有する効果を決定す
る工程を包含する。特に、この方法は、カスパーゼ−１４ポリペプチドおよび候
補化合物とＴＮＦＲ−１、ＴＲＡＩＬ、またはＣＤ−９５レセプターを接触させ
る工程、および候補化合物の存在に起因して、ＴＮＦＲ−１、ＴＲＡＩＬ、また
はＣＤ−９５レセプターへのカスパーゼ−１４ポリペプチドの結合が増強するか
または減少するか否かを決定する工程を包含する。

【０００９】 本発明のさらなる局面は、身体におけるカスパーゼ−１４活性の増加したレベ
ルが必要な個体を処置するための方法に関する。この方法は、このような個体に
、本発明の単離されたカスパーゼ−１４ポリペプチドまたはそのアゴニストの治
療的に有効な量を含む組成物を投与する工程を包含する。

【００１０】 本発明のなおさらなる局面は、身体におけるカスパーゼ−１４活性の減少レベ
ルを必要とする個体を処置するための方法に関与し、この方法は、このような個
体に治療的に有効な量のカスパーゼ−１４アンタゴニストを含む組成物を投与す
る工程を包含する。

【００１１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するカスパーゼ−１４（ま
たはＥＲＩＣＥ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された
核酸分子を提供し、これはクローニングされたｃＤＮＡを配列決定することによ
り決定された。略語ＥＲＩＣＥは、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ Ｒｅｌａｔ
ｅｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅを
表す。本発明のカスパーゼ−１４タンパク質は、カスパーゼ−１、カスパーゼ−
４、カスパーゼ−５、Ｉｃｅ−３マウス、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カ
スパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−２、およびカ
スパーゼ−９を含むカスパーゼファミリーの他のメンバーと配列相同性を共有す
る。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ， Ｍａｎａｓｓａ
ｓ， Ｖａｒｇｉｎｉａ ２０１１０に１９９７年５月１５日に寄託され、そし
て受託番号２０９０３９が与えられたｃＤＮＡクローン（ＨＦＪＡＢ３６）クロ
ーンを配列決定することによって得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）に挿入される。

【００１２】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を使
用して決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされ
るポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列
の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された
任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定さ
れる任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤差を含み得る。自動化によって決定
されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配
列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約
９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野におい
て周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決
定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定
されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の
翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド
配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるＤＮＡ分子によ
って実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。このような差異は、こ
のような挿入または欠失の点にて始まる。

【００１３】 本明細書中に提供される情報、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を使用
して、カスパーゼ−１４ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的
クローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使
用してｃＤＮＡをクローニングする手順）を使用して得られ得る。本発明の実例
として、配列番号１に記載される核酸分子は、ヒト皮膚線維芽細胞由来のｃＤＮ
Ａライブラリー中に発見された。配列番号１のカスパーゼ−１４ ｃＤＮＡの決
定されたヌクレオチド配列は、約３３７アミノ酸残基のタンパク質をコードする
、および約４３．３ｋＤａの推定分子量であるオープンリーディングフレームを
含む。配列番号２に示されるカスパーゼ−１４タンパク質は、カスパーゼ−４に
最も密接に関連し、全長においてカスパーゼ−４に対し約７５％の類似性を示す
。カスパーゼ−１４は、カスパーゼファミリーの多数のメンバーと強い類似性を
示し、特に、全てのカスパーゼに保存されるＱＡＣ（Ｒ／Ｑ／Ｇ）Ｇモチーフは
、カスパーゼ−１４（配列番号２における残基２５６〜２６０）に保存されてい
る。

【００１４】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるかまたは合成的に生
産されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本鎖
または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖（ｓｅｎｓｅ
ｓｔｒａｎｄ）としても知られるコード鎖（ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）で
あり得、またはアンチセンス鎖（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とも呼
ばれる非コード鎖（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）であり得る。

【００１５】 「単離された」核酸分子によって、そのネイティブな環境から取り出された核
酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組
換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離さ
れたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮ
Ａ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む
。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロで
のＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成され
たような分子をさらに含む。

【００１６】 本発明の単離された核酸分子としては、配列番号１に示されるオープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；カスパーゼ−１４タンパク質のコ
ード配列を含むＤＮＡ分子；および遺伝子コードの縮重に起因して、さらにカス
パーゼ−１４タンパク質をコードするが、上記のものとは実質的に異なる配列を
含むＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん、遺伝子コードは当該分野において周知
である。従って、このような縮重改変体を生成することは当業者にとって慣用的
である。

【００１７】 別の局面において、本発明は、１９９７年５月１５日にＡＴＣＣ受託番号２０
９３０９として寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列を有するカスパーゼ−１４ポリペプチドをコードする単
離された核酸分子を提供する。さらなる実施態様では、カスパーゼ−１４ポリペ
プチドまたはＮ末端のメチオニンを欠損する全長のカスパーゼ−１４ポリペプチ
ドをコードする核酸分子が提供される。本発明はまた、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の寄託クローンに含ま
れるカスパーゼ−１４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または上記の配列の１つに
相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子（特にＤ
ＮＡ分子）は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マ
ッピングのための、および例えば、ノーザンブロット分析によるヒト組織におけ
るカスパーゼ−１４遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。

【００１８】 カスパーゼ−１４は、プロドメイン（配列番号２の残基１〜９５）、大サブユ
ニットドメイン（配列番号２の残基９６〜２７７）および小サブユニットドメイ
ン（配列番号２の残基２８９〜３７７）からなるプロタンパク質として産生され
ると考えられる。カスパーゼ−１４は、カスパーゼ８によってプロセスされると
考えられ、そして大および小サブユニットドメインが、活性なフラグメントであ
るヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーフラグメントはインビトロに
おいて再生されると考えられる。

【００１９】 本発明は、以下の保存されたドメインを含むポリペプチドを包含する。 （ａ）約１７５アミノ酸からなる大きいサブユニットドメイン（配列番号２の残
基９６〜２７０）；および （ｂ）約８９アミノ酸からなる推定される小さなサブユニットドメイン（配列番
号２の残基２８９〜３７７）。そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドもまた、提供される。

【００２０】 本発明はさらに、本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関
する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくとも
約１５ｎｔ長、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおより好まし
くは少なくとも約３０ｎｔ長、ならびにさらにより好ましくは、少なくとも約４
０ｎｔ長のフラグメントが意図され、これらは本明細書中に議論される診断プロ
ーブおよびプライマーとして有用である。当然のことながら、５０〜６００ｎｔ
長のより長いフラグメントもまた、寄託ｃＤＮＡの全てではないにしろ、ほとん
どのヌクレオチド配列に対応するフラグメントと同様に、または配列番号１に示
されるように、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフ
ラグメントにより、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１に
示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが
意図される。

【００２１】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、カスパーゼ−１４タンパク質のエピト
ープ保有部分をコードする核酸分子を含む。詳細には、本発明のこのような核酸
フラグメントには、以下をコードする核酸分子が含まれる：配列番号２における
約３５〜約７１、約７９〜約９９、約１１０〜約１３８、約１７３〜約２０２、
約２２１〜約２５０、約２５９〜約２９７、約３０５〜約３１８、および約３４
３〜約３７０のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者らは、上記のポリペ
プチドフラグメントが、カスパーゼ−１４タンパク質の抗原性領域であることを
決定した。カスパーゼ−１４タンパク質の他のこのようなエピトープ保有部分の
決定方法は、以下に詳細に記載される。

【００２２】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受託物２０９０３９に含ま
れるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」によって、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０
ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μ
ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュ
ベーション、続いて約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が意図
される。

【００２３】 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより
好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ
、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌク
レオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上に議論
したように、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよび
プライマーとして有用である。

【００２４】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部により、参照ポ
リヌクレオチド（例えば、配列番号１に示される寄託されたｃＤＮＡまたはヌク
レオチド配列）のヌクレオチド配列由来の２０以上の連続したヌクレオチドが意
図される。もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号１に示されるカスパーゼ−
１４ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ））のみに、またはＴ
（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のみにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために
使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリ
ヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体
（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするから
である。

【００２５】 示されるように、カスパーゼ−１４ポリペプチドをコードする本発明の核酸分
子は、それ自体ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペ
プチドおよびさらなる配列をコードする配列（例えば、分泌配列（例えばプレ、
またはプロまたはプレプロタンパク配列）をコードする配列）；上記のさらなる
コード配列を伴ってまたは伴わずに、さらなる非コード配列を伴う、ポリペプチ
ドのコード配列（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列（転写
、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡ
の安定性）を演じる転写非翻訳配列（スプライシングおよびポリアデニル化シグ
ナルを含む）を含むがこれらに限定されない）；さらなるアミノ酸をコードする
さらなるコード配列（例えばさらなる機能性を提供するもの）を含み得るが、こ
れらに限定されない。従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列
（例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列）と融
合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーア
ミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、ｐＱＥベクター
（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に提供されるタグ（多くのものは市販されている）
である。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジン
は融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。「ＨＡ」タグはインフルエ
ンザ血球凝集素タンパク質（これはＷｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−
７７８（１９８４）により記載されている）に由来するエピトープに対応する、
精製に有用な別のペプチドである。以下に議論するように、他のこのような融合
タンパク質は、ＮまたはＣ末端でＦｃと融合したカスパーゼ−１４を含む。

【００２６】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはカスパーゼ−１４
タンパク質の一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の対立
遺伝子改変体のように天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」により、生物の染
色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的な形態のひとつが意
図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然には生じない改変体は、当該
分野に公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。

【００２７】 このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生成した改
変体を含み、これは１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体は、コード
領域、非コード領域または両方で変化され得る。コード領域での変化は、保存的
または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得る。これらの中で
特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これはカスパ
ーゼ−１４タンパク質またはその一部の特性および活性を変化しない。このこと
に関してまた特に好ましいものは、保存的置換である。

【００２８】 本発明のさらなる実施態様には、以下のヌクレオチド配列に少なくとも９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドを含む単離された核酸分子含む；（ａ）配列番号２のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のア
ミノ酸配列を有するが、Ｎ−末端メチオニンを欠失するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の残基９６〜２７０として示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号
２の残基２８９〜３７７として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列；ならびに（ｆ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）また
は（ｅ）の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。

【００２９】 カスパーゼ−１４ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば
、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによ
って、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がカ
スパーゼ−１４ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌク
レオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に同一であ
ることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同
一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列に
おける５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで
置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多くのヌ
クレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌ
クレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、または参照配列中のヌク
レオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続したグループのいず
れかに散在されて、これらの末端位置の間の任意の位置で生じ得る。

【００３０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば配列番号１に示されるヌク
レオチド配列あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なく
とも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅ
ｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５
３７１１）のような既知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定
され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８
９ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相
同性の高いセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プロ
グラムを使用して、特定の配列が本発明による参照配列に、例えば９５％同一で
あるか否かを決定する場合、当然のことながらパラメーターは、同一性の割合が
、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の
総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定
される。

【００３１】 問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も全長に及ぶ一致を決
定するための好ましい方法（また包括的配列整列とも言われる）は、Ｂｒｕｔｌ
ａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）
のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定
され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、共にＤＮＡ配
列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較され得る。上記包括
的配列整列の結果は、パーセント同一性にある。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列
において、パーセント同一性を算出するため使用される好ましいパラメーターは
、以下である；Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍ
ａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａ
ｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｌｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃ
ｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ
（いずれか短い方）。

【００３２】 対象配列が、内部欠失のためでなく、５’または３’欠失のために問い合わせ
配列よりも短い場合、結果に対して手動補正がなされなければならない。これは
、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性を算出する際に、対象配列の５
’および３’切断を考慮しないためである。問い合わせ配列と比較して、５’ま
たは３’末端にて切断された対象配列に対しては、パーセント同一性は、対象配
列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基（これは、一致／整列されない
）の数を算出することにより、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして補正
される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結
果により決定される。次いで、最終的なパーセント同一性スコアに到達するため
、このパーセントをパーセント同一性から控除し、特定パラメーターを使用して
上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより算出する。この補正スコアは、本発明の目
的のために使用されるものである。対象配列の５’および３’塩基外の塩基（こ
れは、問い合わせ配列と一致／整列しない）のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列によって
示されるように、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的で算出される。
例えば、９０塩基の対象配列は、パーセント同一性を決定するために１００塩基
の問い合わせ配列と整列される。欠失は対象配列の５’末端に起こり、そしてそ
れゆえ、ＦＡＳＴＤＢ整列は５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない
。１０の不対の塩基は、配列の１０％を表し（５’および３’末端において一致
しない塩基数／問い合わせ配列中の全塩基数）そのため１０％は、ＦＡＳＴＤＢ
プログラムによって算出されるパーセント同一性スコアから控除される。残りの
９０塩基が、完全に一致する場合、最終的なパーセント同一性は９０％であった
。別の実施例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と
比較される。今回、欠失は内部欠失であり、そのため対象配列の５’および３’
において、質問と一致／整列しない塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢ
により算出されたパーセント同一性は、手動で補正されない。もう一度、問い合
わせ配列に一致／整列しない対象配列の５’および３’塩基のみ、手動補正対象
である。本発明の目的に対し、他の手動補正はなされる必要が全くない。

【００３３】 本出願は、配列番号１に示される核酸配列；あるいは寄託されたｃＤＮＡの核
酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核
酸分子に関し、それらがカスパーゼ−１４活性を有するポリペプチドをコードす
るか否かとは無関係である。これは、特定の核酸分子がカスパーゼ−１４活性を
有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者はなお、例えばハイブリ
ダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーのよ
うな核酸分子の使用方法を知っているからである。カスパーゼ−１４活性を有す
るポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、以
下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリーにおけるカスパーゼ−１４遺伝子
またはその対立遺伝子改変体の単離；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載され
ているような、 カスパーゼ−１４遺伝子の正確な染色体位置を提供するための
中期染色体展開物へのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳ
Ｈ」）；および特定の組織でのカスパーゼ−１４ ｍＲＮＡ 発現を検出するた
めのノーザンブロット解析。

【００３４】 しかし、配列番号１に示される核酸配列あるいは寄託されたｃＤＮＡの核酸配
列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有す
る核酸分子であって、実際にカスパーゼ−１４タンパク質活性を有するポリペプ
チドをコードする核酸分子が好ましい。「カスパーゼ−１４活性を有するポリペ
プチド」により、特定の生物学的アッセイによって測定した場合に、カスパーゼ
−１４活性を示すポリペプチドが意図される。

【００３５】 精製されたまたは発現されたカスパーゼ−１４の活性は、当業者に公知の方法
により試験される。１つのそのような方法は、プレＩＬ−βの発現を誘導し、次
いでカスパーゼ−１４およびＡＴＰで処置するためのＬＰＳでのマクロファージ
刺激と呼ばれる。培地における成熟ＩＬ１−βレベルは、Ｌｉら（１９９５）Ｃ
ｅｌｌ ８０：４０１（本明細書中でその全体において、参考として援用する）
に記載されるように、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により測
定される。

【００３６】 もちろん、遺伝コードの縮重により、当業者は、寄託したｃＤＮＡの核酸配列
または配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「カスパーゼ−１４
タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実
際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコード
するので、このことは上記の比較アッセイを実施しなくとも当業者に明らかであ
る。縮重改変体でない核酸分子については、妥当な数のものがカスパーゼ−１４
タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさ
らに認識される。これは、タンパク質の機能に顕著に影響する可能性が低いかま
たはその可能性のないアミノ酸置換（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二の脂
肪族アミノ酸で置換すること）を当業者らは十分に知っているからである。

【００３７】 例えば、表現型にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダン
スは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓ
ａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、その中で著者らは、タン
パク質が、驚くべきことにアミノ酸置換に寛容であることを示す。

【００３８】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベ
クターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるカスパーゼ−１４
ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。

【００３９】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター
に結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のよ
うな沈澱物中か、または荷電脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルス
である場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパ
ッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００４０】 ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター、例えば、少し列挙すると、ファー
ジλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモー
ター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲの
プロモーターなどに作動可能に結合されるべきである。他の適切なプロモーター
は、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、終結のための
部位、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに
含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳
されるポリペプチドの最初の翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最
後に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。

【００４１】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の
細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン
耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞
（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ
９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色
腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿
主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。

【００４２】 細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびに
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩ
Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクタ
ーには、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切な
ベクターは当業者に容易に明らかである。

【００４３】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
達成され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標準
的研究室マニュアルに記載されている。

【００４４】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さ
らなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞における、精製の間の、
または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するために、
ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にす
るためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終
調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改
善するため、および精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドへ付
加することは、当該分野でよく知られており、そして慣用技術である。好ましい
融合タンパク質は、タンパク質の可溶化のために有用な免疫グロブリン由来の異
種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０
４５８６９号）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに、免疫グロブリ
ン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、
融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であ
り、したがって、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０
２３２ ２６２）。他方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載さ
れる有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させ得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用
に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗
原として使用される場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ５レセプタ
ーのようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高
処理能力スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂ
ｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉ
ｔｉｏｎ 第８巻：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
第２７０巻：第１６号；９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。

【００４５】 カスパーゼ−１４タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱
、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そ
して精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ
」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然に精
製された産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（
例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を
含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いら
れる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく
、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは
また、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変された開始
メチオニン残基を含み得る。

【００４６】 （カスパーゼ−１４ポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、ま
たは配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたカスパーゼ−１４ポリペプ
チド、あるいは上記ポリペプチドの一部を含むペプチドまたはポリペプチドを提
供する。

【００４７】 カスパーゼ−１４ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構
造または機能の顕著な効果なしで改変され得ることが、当該分野において認識さ
れる。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク
質の重要な領域が存在するということは、記憶されるべきである。

【００４８】 したがって、本発明はさらに、実質的なカスパーゼ−１４ポリペプチド活性を
示すか、またはカスパーゼ−１４タンパク質の領域（例えば、以下で議論するタ
ンパク質の一部）を含む、カスパーゼ−１４ポリペプチドのバリエーションを含
む。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。
上記のように、表現型的にサイレントである可能性が高いアミノ酸変化に関する
ガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。

【００４９】 ＩＣＥのＸ線結晶構造に基づき、結合および触媒に重要ないくつかのアミノ酸
残基が同定されている。例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｅｌｌ ７８：３４３（１
９９４）を参照のこと。これらの残基は、触媒性二価元素Ｃｙｓ−２５８および
Ｈｉｓ−２１０、ならびに四面体中間体を安定化させるＧｌｙ−２１１を含む。
Ａｒｇ−１５２、Ｇｌｎ−２５６、Ａｒｇ−３１４、およびＳｅｒ−３２０は、
Ｓ１基質の結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ）を形成する。これら
７残基は全てのカスパーゼに保存され、従ってカスパーゼ−１４を含め、大きく
特徴付けられる。さらに、全てのカスパーゼにおいて保存されるＱＡＣ（Ｒ／Ｑ
／Ｇ）Ｇモチーフは、カスパーゼ−１４において保存されている（配列番号２の
２５６〜２６０残基）。従って、本発明のポリペプチド改変体は、好ましくは、
全カスパーゼの間で保存される上記に記載の残基を保有するものを含む。

【００５０】 カスパーゼ−１４内のカスパーゼ−８プロセシング部位を位置付けるため、潜
在的アスパラギン酸切断部位を変異し、そしてカスパーゼ−８基質として試験し
た。増殖性切断は、Ａｓｐ−２８９の、プロセシングを崩壊されたこの残基の交
代が必要であるということが見出された（データは示さず）。従って、カスパー
ゼ−１４はＡｓｐ−２８９の後にカスパーゼ−８によって、活性化異種二量体酵
素を産生するために切断されなければならない。特に、このアスパラギン酸残基
は、カスパーゼ−８切断の好ましい基質である配列コンテクスト（ｃｏｎｔｅｘ
ｔ）ＬＥＥＤ（配列番号２の２８６〜２８９）において見出される。従って、こ
の２８６〜２８９領域内のアミノ酸を含むカスパーゼ−１４ポリペプチド改変体
は、好ましくは配列番号２として示される全長のカスパーゼ−１４ポリペプチド
内のＡｓｐ−２８９に対応する位置に、Ａｓｐ残基を保有する。

【００５１】 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、
あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるものは、（ｉ）１つ以上のア
ミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保
存的アミノ酸残基）で置換されたもの（そのような置換されたアミノ酸残基は、
遺伝コードによってコードされたものであってもなくてもよい）、あるいは（ｉ
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレン
グリコール）のような別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）さらな
るアミノ酸、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分
泌配列、あるいはこの成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に利用
される配列が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。このような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示からの当業者の範
囲内であると見なされる。

【００５２】 特に興味深いのは、荷電したアミノ酸を別の荷電したアミノ酸および中性もし
くは負に荷電したアミノ酸で置換することである。後者は、カスパーゼ−１４タ
ンパク質の特徴を改善するための還元された正電荷を有するタンパク質を生じる
。凝集の防止は高度に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の喪失を生じるだけ
ではなく、薬学的処方物を調製する場合においてもまた、問題であり得る。なぜ
なら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ
．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓ
ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら
、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７ （１９９３））。

【００５３】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合選択性を変化し得る。Ｖ
ａｎ Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は
、特定の変異が、ＴＮＦ変異体の、２つの型の既知ＴＮＦレセプターのうち１つ
のみへの選択的結合を生じたことを記載している。従って、本発明のカスパーゼ
−１４は、天然の変異体または人為的操作のいずれかに由来する、１つ以上のア
ミノ酸置換、欠失、または付加を包含し得る。

【００５４】 示されるように、変化は好ましくはマイナーな性質であり、例えばタンパク質
の折り畳みにも活性にも顕著な影響を与えない保存的アミノ酸置換である（表１
を参照のこと）。

【００５５】

【表１】 機能に必須である、本発明のカスパーゼ−１４タンパク質中のアミノ酸は、当
該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異
誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０
８１−１０８５（１９８９））により同定され得る。後者の手順は、分子のすべ
ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生
物学活性（例えば、インビトロでのレセプター結合またはインビトロでの増殖活
性）について試験される。リガンド−レセプター結合について重要な部位はまた
、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識）により決定され
得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９
２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９
２））。

【００５６】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離
されたポリペプチド」とは、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプチ
ドを意図する。したがって、組換え宿主細胞内で産生され、そして／またはその
中に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられ
る。組換え宿主細胞から、部分的もしくは実質的に精製されたポリペプチドもま
た、「単離されたポリペプチド」として意図される。例えば、カスパーゼ−１４
ポリペプチドの組換え産生バージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ
ｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載される一工程法により実質的に精
製され得る。

【００５７】 本発明のポリペプチドは、寄託したｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ド；配列番号２のアミノ酸約１〜約３７７を含むポリペプチド；アミノ酸約２〜
約３７７を含むポリペプチド；アミノ酸約９６〜約２７０を含むポリペプチド；
アミノ酸約２８９〜約３７７を含むポリペプチド、ならびに上記に記載されるポ
リペプチドに対して、少なくとも９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９
６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてま
た、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を
有するこのようなポリペプチドの部分を含む。

【００５８】 カスパーゼ−１４ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９
５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列
が、カスパーゼ−１４ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり５
つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配
列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列
に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るため
に、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のア
ミノ酸で置換され得、または参照配列における総アミノ酸残基の５％までの多数
のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ
酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置でまたはこれらの末端位置
の間のどこかで、参照配列中の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以上
の連続した群のいずれかに散在して、起こり得る。

【００５９】 実際に、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示されるアミノ
酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に
対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
かどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉ
ｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用
して従来通りに決定され得る。特定の配列が、本発明の参照配列に、例えば、９
５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配
列整列プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性の割合が参照アミ
ノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の
５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターが設定され
る。

【００６０】 好ましくは、本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％
「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドの
アミノ酸配列は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００
個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合
わせ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列
に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために
、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎ
ｄｅｌｓ））または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、
参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、また
はそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、ま
たは参照配列内の１つ以上の連続するグループにおいてのいずれかで、散在され
る。

【００６１】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列に対して、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミ
ノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使
用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最
良の全体的な一致（全体的配列整列とも言及される）を決定するための好ましい
方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． （１９９
０） ６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータ
ープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせおよび対
象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であ
るかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示
される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａ
ｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ
Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏ
ｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚ
ｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対
象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。

【００６２】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正がその結果に対してなされなけらばな
らない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定
する場合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。
Ｎ末端およびＣ末端で短縮された対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の
問い合わせ残基位置のみである。

【００６３】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【００６４】 本発明のポリぺプチドは、当業者に周知の方法を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
上でまたは分子ふるいゲルろ過カラム上で分子量マーカーとして有用である。

【００６５】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本明細書に記載のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピト
ープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、
抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。他方、抗体が結合し得
るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の
免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例
えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１
：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。

【００６６】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の部
分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されたタンパク質と
反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓ
ｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．
およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ
ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タン
パク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示さ
れ、１セットの単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタ
ンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端ま
たはカルボキシル末端にも、制限されない。

【００６７】 したがって、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、
本発明のポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体を含む、抗体を
惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７
−７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。

【００６８】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは本
発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、
より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは少なくとも約１５〜約３
０個の間のアミノ酸の配列を含む。

【００６９】 カスパーゼ−１４特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリぺプチ
ドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２の約３５か
ら約７１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約７９から約９
９までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１１０から約１３８
までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１７３から約２０２ま
でのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約２２１から約２５０まで
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約２５９から約２９７までの
アミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約３０５から約３１８までのア
ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約３４３から約３７０までのアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド。上記のように、本発明者らは、上記ポリペプチド
フラグメントが、カスパーゼ−１４タンパク質の抗原性領域であることを決定し
た（図２を参照のこと）。

【００７０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より産生され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅ
ｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａ
ｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：５１３１−５１３５。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈ
ｔｅｎらの米国特許第４,６３１,２１１号（１９８６）にさらに記載される。

【００７１】 当業者が理解するように、本発明のカスパーゼ−１４ポリペプチドおよびその
上記のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメイ
ンの部分と合わされ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質
は、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、
ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブリ
ンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示されている（ＥＰＡ ３９４,８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔ ｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結
合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体カスパーゼ−１４タンパク
質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子と結合することおよびこ
れを中和することにおいて、より効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。

【００７２】 （ガンの診断および予後） 乳ガン細胞（ＭＣＦ７）および胚腎細胞（２９３）を、全長カスパーゼ−１４
ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトし、そしてアポトー
シスについてアッセイした。他のカスパーゼと同様、カスパーゼ−１４は細胞死
を誘導し得た。しかし、カスパーゼ−４およびカスパーゼ−５とは異なり、プロ
ドメインの除去は、アポトーシスを誘導するためには必要ではなかった。さらに
、カスパーゼ−１４によって誘導されるアポトーシスは、ウイルスにコードされ
たカスパーゼインヒビターｐ３５およびＣｒｍＡによって効率的に阻害された。

【００７３】 カスパーゼ−１４がカスパーゼ−８（近位死レセプターシグナル伝達に関与す
るアピカルカスパーゼ）によって生産的にプロセシングされるか否かを検言する
ために、カスパーゼ−１４をカスパーゼ−８とインキュベートし、そして活性カ
スパーゼ−１４の発生を、タンパク分解性能力のある（活性な）カスパーゼの大
きなサブユニット内部に触媒性のシステインを共有結合する、ビオチン化したＹ
ＶＡＤ ｃｍｋとの反応によって評価した。カスパーゼ−１４のカスパーゼ−８
プロセシングにより、２つのサブユニットが生じることを誘導した。一方のサブ
ユニットは、プロドメイン＋大きな触媒性サブユニット（ｐｒｏ＋ｌａｒｇｅ）
であり、他方は、小さな触媒性サブユニットであった。これは、ｐ４５チモーゲ
ンが最初に安定なｐ３５ ｐｒｏ＋大きなサブユニットをプロセシングしなけれ
ばならないようなカスパーゼ−１の活性化と同様である。さらにプロセシング、
つまりｐｒｏと大きなサブユニットとの間の切断は、非常に希釈に対して敏感で
あり、およびインビトロで非常に非効率的である。それゆえに、インビトロで翻
訳されたチモーゲンは、完全なプロセシングを受けない。インビトロで翻訳され
た低濃度のカスパーゼ−１４を与えた場合、カスパーゼ−８がｐｒｏ＋ｌａｒｇ
ｅサブユニットおよび小さなサブユニットにのみプロセシングすることは意外で
はなかった。とにかく、カスパーゼ−１４にプロセシングされたカスパーゼ−８
は、ビオチン化されたＹＶＡＤで効率的に標識され、これは活性化カスパーゼ−
１４の生成の指標となった。

【００７４】 ガンを有する哺乳動物における特定の組織は、対応する「標準的な」哺乳動物
（すなわち、ガンを有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合、有意に減少し
たレベルのカスパーゼ−１４タンパク質およびカスパーゼ−１４タンパク質をコ
ードするｍＲＮＡを発現すると考えられる。さらに、ガンを有さない同じ種の哺
乳動物からの血清と比較した場合、減少したレベルのカスパーゼ−１４タンパク
質は、ガンを有する哺乳動物からの特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、およ
び脊髄液）中に検出され得ると考えられる。したがって、本発明は、腫瘍の診断
の際の有用な診断方法を提供する。この方法は、哺乳動物細胞または体液におけ
るカスパーゼ−１４タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする
工程、およびその遺伝子発現レベルを標準的なカスパーゼ−１４遺伝子発現レベ
ルと比較する工程であって、ここで標準に対する遺伝子発現レベルの減少が、特
定の腫瘍の指標である、工程を包含する。

【００７５】 腫瘍診断が、既に、従来の方法に従ってなされている場合、本発明は、予後の
インジケータとして有用である。ここで、減少したカスパーゼ−１４遺伝子発現
を示す患者は、上昇したレベルで遺伝子を発現する患者と比較して、より悪い臨
床的結果を経験する。

【００７６】 「カスパーゼ−１４タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイす
る」とは、第１の生物学的サンプルにおいて、カスパーゼ−１４タンパク質のレ
ベルまたはカスパーゼ−１４タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接
的に（例えば、絶対的タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または推定
することによって）のいずれかで、あるいは相対的に（例えば、第２の生物学的
サンプルにおけるカスパーゼ−１４タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対
して比較することによって）、定性的または定量的に測定するかまたは推定する
ことを意図する。

【００７７】 好ましくは、第１の生物学的サンプルにおけるカスパーゼ−１４タンパク質レ
ベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または推定され、そして標準的なカスパーゼ−
１４タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル（標準は、ガンを有さない個体から
得られる第２の生物学的サンプルから得られる）に対して比較される。当該分野
で理解されるように、一旦標準的なカスパーゼ−１４タンパク質レベルまたはｍ
ＲＮＡレベルが知られると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得
る。

【００７８】 「生物学的サンプル」とは、カスパーゼ−１４タンパク質またはｍＲＮＡを含
む、個体、細胞株、組織培養物、他の供給源から得られる任意の生物学的サンプ
ルを意図する。生物学的サンプルには、分泌カスパーゼ−１４タンパク質および
特定の線維芽細胞組織を含有する哺乳類の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液
および脊髄液）が挙げられる。

【００７９】 本発明は、哺乳動物において、ガンを検出するために有用である。詳細には、
本発明は、哺乳動物における以下の型のガンの診断の間に有用である：乳、卵巣
、前立腺、骨、肝臓、肺、膵臓、および皮膚。好ましい哺乳動物には、サル（ｍ
ｏｎｋｅｙｓ）、類人猿（ａｐｅｓ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ
、およびヒトが含まれる。特に好ましくはヒトである。

【００８０】 総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜１５９（１９８７）に記載される一工程グアニ
ジンチオシアネートフェノールクロロホルム法を使用して生物学的サンプルから
単離され得る。次いで、カスパーゼ−１４タンパク質をコードするｍＲＮＡのレ
ベルは、任意の適切な方法を使用してアッセイされる。これらには、ノーザンブ
ロット分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３〜３１２（１９９０））
、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング(Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７〜３ ６７（１９８７）)、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)、ポリメラーゼ連鎖反応と
組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ)（Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５〜３０１（１９９０））、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆
転写（ＲＴ−ＬＣＲ)が含まれる。

【００８１】 生物学的サンプルにおけるカスパーゼ−１４タンパク質レベルのアッセイは、
抗体に基づく技術を用いて行い得る。例えば、組織でのカスパーゼ−１４タンパ
ク質の発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎ
ｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６〜９８５（１９８５）
；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７〜３
０９６（１９８７））。

【００８２】 カスパーゼ−１４タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基
づく方法は、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を包含する。

【００８３】 適切な標識は当該分野で公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような
酵素標識、ならびにヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素(¹⁴Ｃ)、イオウ（³⁵Ｓ）、ト
リチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）、およびテクネチウム（^99mＴｃ）の ような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標
識、ならびにビオチンを含む。

【００８４】 （カスパーゼ−１４結合分子およびアッセイ） 本発明はまた、カスパーゼ−１４に結合する分子（例えば、レセプター分子）
を同定するための方法も提供する。カスパーゼ−１４に結合するタンパク質（例
えばレセプタータンパク質）をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法
（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング）によって同定され得
る。そのような方法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）のよ
うな多くの実験マニュアルに記載されている。

【００８５】 例えば、発現クローニングは、この目的に対して利用され得る。この目的に対
して、ポリアデニル化されたＲＮＡをカスパーゼ−１４に反応する細胞から調製
し、このＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーをプール
に分割する。そして、このプールで、カスパーゼ−１４に反応性のない細胞を個
々トランスフェクトする。次いで、トランスフェクトされた細胞を標識されたカ
スパーゼ−１４に曝露する。（カスパーゼ−１４は、標準的な放射性ヨウ素化方
法または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含む種々の周
知の技術によって標識され得る。）曝露後、細胞を固定し、そしてカスパーゼ−
１４の結合を決定する。これらの手順を、ガラススライド上で簡便に行う。

【００８６】 プールを、カスパーゼ−１４−結合細胞を産生するｃＤＮＡに同定する。サブ
プールを、これらの陽性から調製し、宿主細胞中にトランスフェクトし、および
上記の通りにスクリーニングする。反復性のサブプーリングおよび再スクリーニ
ング方法の使用によって、推定される結合分子をコードする１つ以上の単一のク
ローン（例えば、レセプター分子）を単離し得る。

【００８７】 あるいは、標識されたリガンドを、リガンドと結合する分子（例えば、レセプ
ター分子）を発現する細胞から調製された細胞抽出物（例えば、膜および膜抽出
）に対して、光親和性結合し得る。架橋した物質を、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（「ＰＡＧＥ」）によって分離し、そしてＸ線フィルムに曝露する。この
リガンドレセプターを含む標識された複合体を摘出し得、ペプチドフラグメント
に分離し得、そしてタンパク質微小配列決定にかけ得る。微小配列決定により得
られたアミノ酸配列は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定された
レセプター分子をコードする遺伝子を同定するために、一意または縮重のオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。

【００８８】 本発明のポリペプチドはまた、細胞調製物または無細胞調製物におけるカスパ
ーゼ−１４結合分子（例えば、レセプター分子）のカスパーゼ−１４結合能力を
評価するために使用され得る。

【００８９】 （アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子） 本発明はまた、レセプター分子のようなカスパーゼ−１４結合分子との相互作
用のような、カスパーゼ−１４の作用を増強または阻止する分子を同定するため
の化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは、カスパーゼ−１４の
天然の生物学的機能を増強する化合物、またはカスパーゼ−１４と類似の様式で
機能する化合物であり、一方、アンタゴニストは、そのような機能を減少または
排除する。

【００９０】 例えば、細胞のコンパートメント（例えば、膜またはその調製物）は、カスパ
ーゼ−１４に結合する分子（例えば、カスパーゼ−１４によって調節されるシグ
ナル伝達または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。この調製物
を、カスパーゼ−１４のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の
存在下または非存在下で、標識されたカスパーゼ−１４とインキュベートする。
この候補分子が結合分子と結合する能力は、標識されたリガンドの結合の減少に
反映される。無償で（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓｌｙ）結合する分子、すなわちカス
パーゼ−１４結合分子の結合に対するカスパーゼ−１４の効果を誘導しない分子
は、最も良いアンタゴニストになりそうである。カスパーゼ−１４と良く結合し
、そしてカスパーゼ−１４と同じまたはそれに密接に関連する効果を誘導する分
子は、アゴニストである。

【００９１】 アゴニストおよびアンタゴニストの可能性のあるカスパーゼ−１４様の効果を
、例えば、細胞または適切な細胞調製物と候補分子との相互作用に続く２次メッ
センジャー系の活性を決定すること、およびカスパーゼ−１４と同じ効果を誘発
するカスパーゼ−１４または分子の相互作用を比較することによって測定し得る
。このことに関して有用であり得る２次メッセンジャー系は、下流のカスパーゼ
のタンパク質分解を包含するが、制限されない。

【００９２】 カスパーゼ−１４のアンタゴニストについてのアッセイの別の実施例は、競合
阻害アッセイについての適切な条件下で、膜結合カスパーゼ−１４レセプター分
子または組換えカスパーゼ−１４レセプター分子と、カスパーゼ−１４および潜
在的アンタゴニストとを併用する競合的アッセイである。カスパーゼ−１４は、
例えば放射能によって標識され得、その結果、レセプター分子に結合したカスパ
ーゼ−１４の数を正確に決定して、潜在的アンタゴニストの効力を評価し得る。

【００９３】 このアゴニストは、例えば、カスパーゼ−１４ポリペプチドの作用を増強する
ために使用され得る。

【００９４】 このアンタゴニストは、例えば、カスパーゼ−１４ポリペプチドの作用を阻害
するため（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗
血症性ショック、敗血症、脳卒中、中枢神経系炎症、骨粗鬆症、虚血、再灌流傷
害、循環器病に伴う細胞死、多発性嚢胞腎疾患、循環器疾患における内皮細胞の
アポトーシス、変性肝疾患、ＭＳおよび頭部外傷の処置）に使用され得る。

【００９５】 アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、以下に記載するような、薬学的
に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。

【００９６】 （治療剤） 本発明の、カスパーゼ−１４と命名された新規の哺乳類エフェクターは、カス
パーゼ−４ならびにＴＮＦＲ−１、ＴＲＡＩＬ、およびＣＤ−９５誘導アポトー
シスを増強する他のカスパーゼの触媒的に活性な構造的ホモログである。アポト
ーシスは、細胞の成長および増殖における有用な制御因子である。それゆえに、
カスパーゼ−１４は、ガン、特に皮膚ガンの処置に有用である。このようなガン
は、メラノーマを包含する。

【００９７】 （投与の様式） 個体における標準的または正常なレベルのカスパーゼ−１４活性の減少によっ
て引き起こされる状態は、カスパーゼ−１４タンパク質の投与によって処置され
得ることが理解される。したがって、本発明はさらに、増大したレベルのカスパ
ーゼ−１４活性を必要とする個体を処置する方法を提供し、この方法は、このよ
うな個体においてカスパーゼ−１４活性レベルを増大させるに有効な、有効量の
本発明の単離されたカスパーゼ−１４ポリぺプチド(特に、カスパーゼ−１４の 成熟形態）を含む薬学的組成物を、そのような個体に投与する工程を包含する。

【００９８】 一般的な提案として、１用量あたりに非経口的に投与されるカスパーゼ−１４
ポリペプチドの薬学的に有効な量の合計は、患者体重につき約１μｇ/ｋｇ/日〜
１０ｍｇ/ｋｇ/日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量を受ける
。より好ましくは、この用量は、少なくとも０.０１ｍｇ/ｋｇ/日、そしてヒト について最も好ましくは、ホルモンについて約０.０１と１ｍｇ/ｋｇ/日との間 である。継続的に投与される場合、カスパーゼ−１４ポリペプチドは、代表的に
は、約１μｇ/ｋｇ/時間〜約５０μｇ/ｋｇ/時間の用量速度で、1日あたり１〜 ４回の注射によるか、または、例えば、ミニポンプを使用する連続的皮下注入に
よるかのいずれかで投与される。静脈内バッグ溶液もまた使用され得る。

【００９９】 本発明のカスパーゼ−１４を含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口
、槽内、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチによるよう
な）、口腔粘膜に（ｂｕｃａｌｌｙ）、または経口もしくは経鼻スプレーとして
投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性固体、半固体もし
くは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の型の処方補助剤を意味
する。本明細書で使用される場合、用語「非経口」とは、静脈内、筋肉内、腹腔
内、胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下、および関節内の注射および注
入を包含する、投与様式をいう。

【０１００】 （染色体アッセイ) 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズ
し得る。本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患
に関連した遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一段階である。

【０１０１】 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡは、カスパーゼ−１４タンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングす
るために用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およ
びライブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のための周知の技術を
用いて、インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。

【０１０２】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー( 好ましくは、１５〜２５ｂｐ)を調製することにより、染色体にマッピングされ 得る。遺伝子の３非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにお
いて１より多いエキソンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しないプ
ライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体
を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。

【０１０３】 中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、一工程で、正確な染色体位置を提供
し得る。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤＮＡ由来のプローブと
共に用いられ得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照
のこと。

【０１０４】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｅｌｃ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出
される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係
が、連鎖解析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝)によって同定される。

【０１０５】 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。

【０１０６】 （薬物スクリーニング） カスパーゼ１４、またはその生物学的もしくは免疫学的に活性なフラグメント
は、任意の種々の薬物スクリーニング技術において、化合物をスクリーニングす
るために使用される。そのような試験に使用されるカスパーゼ−１４ポリペプチ
ドまたはフラグメントは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に付着している
か、細胞表面に保有されているか、または細胞内に位置するかのいずれかである
。薬物スクリーニングの１つの方法は、カスパーゼ−１４またはそのフラグメン
トを発現する組換え核酸を用いて安定的に形質転換されている、真核生物宿主細
胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、そ
のような形質転換された細胞に対してスクリーニングされる。そのような細胞は
、生存可能な形態または固定された形態のいずれにおいても、標準結合アッセイ
のために使用され得る。例えば、カスパーゼ−１４と試験される薬剤との間の複
合体の形成を測定し得る。あるいは、試験される薬剤により引き起こされる、カ
スパーゼ−１４とその標的細胞（単球またはマクロファージ）との間の複合体形
成（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の減少を調べ得る。

【０１０７】 従って、本発明は、薬物、天然のインヒビター、または炎症および疾患に影響
を与え得る任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの
方法は、当該分野で周知の方法による以下の工程を含む：そのような薬剤とカス
パーゼ−１４ポリペプチドまたはそのフラグメントを接触させる工程、および１
）その薬剤とカスパーゼ−１４ポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体
の存在についてアッセイする工程、または２）カスパーゼ−１４ポリペプチドま
たはフラグメントとその細胞との間の複合体の存在についてアッセイする工程。
このような競合結合アッセイにおいては、カスパーゼ−１４ポリペプチドまたは
フラグメントは、代表的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離
のカスパーゼ−１４ポリペプチドまたはフラグメントは、結合した形態で存在す
るカスパーゼ−１４ポリペプチドまたはフラグメントから分離される。そして、
遊離かまたは複合体化していない標識の量が、その特定の薬剤が、カスパーゼ−
１４と結合する能力、またはカスパーゼ−１４／細胞複合体およびカスパーゼ−
１４／薬剤複合体を妨げる能力の尺度である。

【０１０８】 薬物スクリーニングのための別の技術は、カスパーゼ−１４ポリペプチドに対
して適切な結合親和性を有する化合物についての高処理能スクリーニングを提供
する。そしてこの技術は、１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願８４
／０３５６４に詳細に記載されており、本明細書中に参考として援用される。簡
潔に述べると、多数の異なるペプチド試験化合物が、プラスチックピンまたはい
くつかの他の表面のような固体基体上で合成される。ペプチド試験化合物は、カ
スパーゼ−１４ポリペプチドと反応させられ、そして洗浄される。結合したカス
パーゼ−１４ポリペプチドは次に、当該分野において周知の方法によって検出さ
れる。精製されたカスパーゼ−１４はまた、前述の薬物スクリーニング技術にお
ける使用のために、プレートの上に直接コーティングされ得る。さらに、非中和
抗体は、このペプチドを捕獲するために使用され得、そして固体支持体上に非中
和抗体を固定し得る。

【０１０９】 本発明はまた、カスパーゼ−１４と特異的に結合し得る中和抗体が、カスパー
ゼ−１４ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する結合について試験化合物
と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイの使用も意図する。この様式にお
いては、その抗体は、カスパーゼ−１４と１つ以上の抗原決定基を共有する任意
のペプチドの存在を検出するために使用され得る。

【０１１０】 一般的に本発明を記載しているが、本発明は、以下の実施例（例示として提供
され、かつ限定することは意図しない）の参照によって、より容易に理解される
。

【０１１１】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるカスパーゼ−１４の発現および精製） 細菌性発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例において、細菌性発現のために使
用する（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａ
ｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ｐＱＥ６０はアンピシリン抗生物質耐性
（「Ａｍｐ^r」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ 誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎ
ｃ．（前出）より販売されるニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）親
和性樹脂を用いる親和性精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコ
ドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポ
リペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドの
カルボキシル末端に共有結合的に連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６
×Ｈｉｓタグ」）を伴うポリペプチドを発現するように、配置される。

【０１１２】 カスパーゼ−１４タンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、カスパ
ーゼ−１４タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列、およびｃＤＮＡコード配
列に対して３’側の寄託された構築物における配列とアニールするＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。ｐ
ＱＥ６０ベクターにおけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌ
クレオチドを、それぞれ、５’および３’配列に付加する。

【０１１３】 このタンパク質のクローニングのために、５’プライマーは、下線を付したＮ
ｃｏＩ制限部位、続いて図１のカスパーゼ−１４配列のアミノ末端コード配列に
相補的な１７（すなわち、４７〜６３）ヌクレオチドを含む、配列５’ ＣＧＣ
ＣＣＡＴＧＧ ＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣ ３’（配列番号３）を
有する。当然のことながら、当業者は、タンパク質コード配列における、５’プ
ライマーが始まる点は、より短いかまたは長い形態の、完全なタンパク質の任意
の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するために変化し得ることを
、理解する。３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて
図１のカスパーゼ−１４ ＤＮＡ配列中の終止コドンのすぐ前のコード配列の３
’末端に相補的な１８（すなわち、１２３０〜１２４７）ヌクレオチドを含む、
配列５’ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧ
３’（配列番号４）を有し、コード配列はｐＱＥ６０ベクターにおいて６つのＨ
ｉｓ残基のリーディングフレームとともにそのリーディングフレームを維持する
ように、制限部位と配列されている。

【０１１４】 増幅されたカスパーゼ−１４ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０
を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡを、一緒に連
結する。制限処理されたｐＱＥ６０ベクターへカスパーゼ−１４ ＤＮＡを挿入
することによって、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの下流に、かつ開始ＡＵＧおよ
び６つのヒスチジンコドンとインフレームに、カスパーゼ−１４タンパク質コー
ド領域を配置する。

【０１１５】 標準的な手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるような手順）を使用
して、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を連結混合物で形質転換する。プラスミ
ドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（ｌａ
ｃリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（「Ｋａｎ^r」）を付与する）を使 用して、本明細書において記載される説明のための実施例を行う。カスパーゼ−
１４タンパク質の発現に適切である多くの株のうちの１つにすぎないこの株は、
ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）から市販される。形質転換体は、アンピシリン
およびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖するその能力によって同定
される。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされ
たＤＮＡの同一性を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認する
。

【０１１６】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養物中
で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：２５〜１：２５
０の希釈率で大規模培養物に接種する。細胞を、０．４と０．６との間の６００
ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル
−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加して１ｍＭの最終濃
度にして、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することにより、ｌａｃリプレッサー
感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３時間から４時間の間
引き続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。

【０１１７】 次に、細胞を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８中で、４℃で３〜４時間の間、
攪拌する。細胞の細片を遠心分離によって除去し、そしてカスパーゼ−１４タン
パク質を含有する上清をニッケル−ニトリロ−三酢酸（「ＮｉＮＴＡ」）親和性
樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）にロードする。６
×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、ＮＩ−ＮＴＡ樹脂に高親和性で結合し、そ
して単純な一工程手順において精製され得る（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ、１９９５、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）を参
照のこと）。手短には、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８中でカラムに
ロードし、カラムを１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８でまず洗浄し、
次に、１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にカスパーゼ
−１４を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５を用いて溶出する。

【０１１８】 次に、精製されたタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ Ｎａ−酢酸、ｐＨ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析す
ることにより、再生する。あるいは、タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに固定
化されている間に首尾良く再折り畳みされ得る。推奨される条件は、以下のとお
りである：プロテアーゼインヒビターを含有する、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０
％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素
の直線な勾配を用いて再生する。再生は、１．５時間以上の時間にわたり行われ
るべきである。再生後、タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールの添加によって
、溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ
６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最後の透析工程によって除去する
。精製されたタンパク質を、４℃にて保存するか、または−８０℃で凍結する。

【０１１９】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるカスパーゼ−１４タンパク質の
クローニングおよび発現） この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を用いて、完
全なタンパク質をコードするクローニングされたＤＮＡを、Ｓｕｍｍｅｒｓら、
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７）に記載の
ような標準的な方法を用いてバキュロウイルスに挿入し、カスパーゼ−１４タン
パク質を発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモー
ター、続いてＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８のような都合良い制限部位を含む。
シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリ
アデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミド
は、同じ方向で、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、野生型ウイルスＤＮＡとの
細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側に隣接しており、クローニン
グされたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを産生する。

【０１２０】 当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要に応じて、シグナルペプチ
ドおよびインフレームＡＵＧを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置
されたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば
、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）を、上記のベクターの代
わりに用い得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １７０：３１〜３９に記載される。

【０１２１】 図１（配列番号２）に示されるＡＵＧ開始コドンを含む寄託されたクローン中
の全長カスパーゼ−１４タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’
配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅する。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位、真核生物細胞に
おける翻訳開始に有効なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１９６：９４７〜９５０（１９８７）に記載される通りに）、続いて図１に示す
、ＡＵＧ開始コドンで開始される、完全なカスパーゼ−１４タンパク質の配列の
１７（すなわち４３〜６０）塩基を含む、配列５’ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣ ３’（配列番号５）を有
する。３’プライマーは、下線を付したＡｓｐ７１８制限部位、続いて図１の３
’非コード配列に相補的な１７（１２３０〜１２４７）ヌクレオチドを含む、配
列５’ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧ ３’
（配列番号６）を有する。

【０１２２】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）を用いて、１％アガロースゲル
から単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で
消化し、そして、再度１％アガロースゲルで精製する。

【０１２３】 プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして必要
に応じて、当該分野で公知の慣用手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用い
て脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅ
ａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）を用いて１％アガ
ロースゲルから単離する。

【０１２４】 フラグメントおよび脱リン酸化プラスミドを一緒に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで
連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）細胞
のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、そして培養
プレートに塗布する。ＰＣＲ法（ここで、この遺伝子を増幅するために使用され
たプライマーの１つ、および第２のプライマーは、十分にベクターの内部由来で
あり、その結果、カスパーゼ−１４遺伝子フラグメントを含有する細菌コロニー
のみがＤＮＡの増幅を示す）を用いて、ヒトカスパーゼ−１４遺伝子を有するプ
ラスミドを含有する細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ
配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で、ｐＢａｃカスパ
ーゼ−１４と称する。

【０１２５】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃカスパーゼ−１４を、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８
７）によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状
化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ ＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）とともに
同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡお
よび５μｇのプラスミドｐＢａｃカスパーゼ−１４を、５０μｌの無血清グレー
ス培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ、ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。そ
の後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合
し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、このトランスフェク
ション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート
内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。新
たに添加した溶液を混合するために、プレートを前後に揺らす。次いでプレート
を、２７℃で５時間インキュベートする。５時間後に、トランスフェクション溶
液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレー
ス昆虫培地を添加する。プレートをインキュベータに戻して、培養を、２７℃で
４日間継続する。

【０１２６】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記
載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガ
ロースゲルを用いて、青色に染色されたプラークを生じるｇａｌ発現クローンの
簡素な同定および単離を可能にする。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳
細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、によって配布されるＴｈｅ ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーショ
ン後、青色に染色されたプラークをマイクロピペッターのチップ（例えば、Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌの
グレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイル
スを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染さ
せる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で
保存する。この組換えウイルスをＶ−カスパーゼ−１４と称する。

【０１２７】 カスパーゼ−１４遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱非
働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞に、約２の感染多重度
（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−カスパーゼ−１４を感染させる。
６時間後にその培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ
９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）に置き換える。放射性標識タンパク質が所望さ
れる場合、４２時間後に、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓ−
システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時
間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク
質および細胞内タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（放射性標識された場合
）オートラジオグラフィーにより分析する。精製タンパク質のアミノ末端のアミ
ノ酸配列の微量配列決定を用いて、成熟タンパク質のアミノ末端配列、従って存
在する場合には分泌シグナルペプチドの切断点および長さを決定し得る。

【０１２８】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるカスパーゼ−１４のクローニングおよび発
現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写
の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物
のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エン
ハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナー部位
およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写
を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、Ｒ
ＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）ならびにサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性
エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた使用され得る。本発明
の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ＰＳＶＬおよびＰ
ＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａ
ｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、な
らびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げられる
。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ ２９３細胞、Ｈ９細
胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏ
ｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細
胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

【０１２９】 あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン
、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェク
トされた細胞の同定および単離を可能にする。

【０１３０】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅され、大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の
遺伝子の数百またはさらに数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用で
ある。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（
Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；
Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７
５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地にお
いて増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は
染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。

【０１３１】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５：４３８
−４４７（１９８５）およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒ
ｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニ
ング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１
８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに
、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化シグナ
ル、および終結シグナルを含む。

【０１３２】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるカスパーゼ−１４のクローニングおよ
び発現） 発現プラスミドｐカスパーゼ−１４ ＨＡを、カスパーゼ−１４をコードする
ｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これら
は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手し得
る）へクローニングすることによって作製する。

【０１３３】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび
他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミ
ド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細
胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリ
ンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが都合良くＣＭＶプロモーターの
発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イ
ントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置さ
れた、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルが続く、赤血球凝集素フラグメ
ント（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）をコードするいくつか
のコドン。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１
９８４）によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来する
エピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープ
を認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にす
る。ｐｃＤＮＡＩＩＩはさらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。

【０１３４】 カスパーゼ−１４をコードするＤＮＡフラグメントを、組換えタンパク質発現
がＣＭＶプロモーターによって指向されるように、ベクターのポリリンカー領域
にクローン化する。プラスミド構築戦略は、以下のとおりである。寄託されたク
ローンのカスパーゼ−１４ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるカスパーゼ−１
４の発現のためのベクターの構築について先に記載されるのとほぼ同じように、
都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、
以下の本実施例に使用されるプライマーを含む。５’プライマーは、下線を付し
たＳｍａＩ部位、コザック配列、ＡＵＧ開始コドン、および完全なカスパーゼ−
１４の１６塩基の５’コード領域を含み、以下の配列を有する：５’ ＣＧＣＣ ＣＣＧＧＧ ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣ ３’（４３〜
６０）（配列番号７）。３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩ部位、終止コ
ドン、および１８ｂｐの３’コード配列を含み、以下の配列を（３’末端に）有
する：５’ ＣＧＣ ＴＣＴＡＧＡ ＴＣＡ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＧＧ ＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧ
Ｔ ３’（１１５７〜１１７３）（配列番号８）。

【０１３５】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、Ｓｍ
ａＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで連結する。連結混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉ株
ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９
９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃ
Ａ ９２０３７より入手可能）を形質転換し、そして形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートにプレートして、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性
コロニーの増殖を可能にする。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そ
してカスパーゼ−１４をコードするフラグメントの存在について制限分析または
他の手段によって調べる。

【０１３６】 組換えカスパーゼ−１４の発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載
のようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記のように発現ベクターでトラ
ンスフェクトする。細胞を、ベクターによるカスパーゼ−１４の発現のための条
件下でインキュベートする。

【０１３７】 カスパーゼ−１４−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の
方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的のため、
トランスフェクションの２日後に、細胞を、³⁵Ｓ−システインを含む培地中で８
時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を採取し、そし
て細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記に引用される）に記載されるよう
に界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０
．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５で溶解する。
タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培
地から沈降させる。次いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
オートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細
胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては見られな
い。

【０１３８】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるカスパーゼ−１４のクローニングおよ
び発現） ベクターｐＣ４を、カスパーゼ−１４タンパク質の発現のために使用する。プ
ラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４
６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で
、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされて
いるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細
胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択さ
れ得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子
の増幅は、十分に考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ
，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９
７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，
Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈ
ａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照
のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の
結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を発達
させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子と連結される場合、通常、同時増幅され
、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する
細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野において
公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれると、宿主細胞の１つ以上
の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。

【０１３９】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：
４３８〜４４７（１９８５））の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌ
ｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））から単離されたフラグメントを含む。
プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ
、およびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位が存在する。これらのクローニング部位
の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンお
よびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトアクチ
ンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウ
イルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）もまた、発現の
ために使用され得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺
伝子発現系および類似する系は、哺乳動物細胞において調節された方法でカスパ
ーゼ−１４を発現するために使用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａ
ｒｄ，Ｈ．１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例
えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も、同様に使用され得る。
染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー
（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェ
クションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、
Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが、有利である。

【０１４０】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次い
で仔ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化
する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。

【０１４１】 完全カスパーゼ−１４タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５
’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅
する。５’プライマーは、下線を引いたＢａｍＨＩ制限酵素部位、真核生物細胞
における翻訳を開始するために効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）により記載される通り）、
続いてＡＵＧ開始コドンで始まる、図１に示した１７（すなわち、４３〜６０）
塩基の完全カスパーゼ−１４タンパク質の配列を含む以下の配列を有する：５’
ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣ
３’（配列番号９）。３’プライマーは、下線を引いたＡｓｐ７１８制限部位、
続いて、図１の３’非コード配列に相補的な１７（１２３０〜１２４７）ヌクレ
オチドを含む以下の配列を有する：５’ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧ
ＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号１０）。

【０１４２】 増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼであるＢａｍＨＩおよびＡｓ
ｐ７１８で消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離し
たフラグメントおよび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する
。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換
し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメ
ントを含む細菌を同定する。

【０１４３】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２
−ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優
性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコ
ードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そ
して１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレー
ト（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一
のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎ
Ｍ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペ
トリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサー
トで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、
５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順
を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所
望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。

【０１４４】 （実施例４：カスパーゼ−１４ ｍＲＮＡ発現の組織分布） ヒト組織におけるカスパーゼ−１４遺伝子発現を調べるために、ノーザンブロ
ット分析を、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上で引用）により記載された方法を
使用して行なう。カスパーゼ−１４タンパク質のヌクレオチド配列全体（配列番
号１）を含むｃＤＮＡプローブを、製造者の説明書に従って、ｒｅｄｉｐｒｉｍ
ｅ^TM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を
使用して³²Ｐで標識する。標識後、プローブを、製造者のプロトコール番号ＰＴ
１２００−１に従って、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TMカラム（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して精製する。次いで
、精製した標識プローブを使用して、様々なヒト組織を、カスパーゼ−１４ ｍ
ＲＮＡについて調べた。

【０１４５】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し得、そして、製造者のプロ
トコール番号ＰＴ１１９０−１に従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TMハイブリダイ
ゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、標識プローブを用いて調べる
。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットをマウントし、−７０℃で
一晩フィルムに曝露し、そしてフィルムを標準的手順に従って現像する。

【０１４６】 上記のように実質的に行われた実験は、カスパーゼ−１４が、種々のヒト組織
において構成的に発現することを明らかにした。カスパーゼ−１４は、ＨｅＬａ
細胞において高度に発現したが、バーキットリンパ腫、ラージ細胞、または前骨
髄球性白血病ＨＬ−６０細胞を含む、形質転換された造血細胞株においては発現
しなかった。

【０１４７】 本発明が上記の記載および実施例において特に記載された以外に実施され得る
ことは明らかである。

【０１４８】 本発明の多くの改変および変形は、上記の教示を考慮して可能であり、従って
、これらは、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【０１４９】 本明細書において引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術誌文献、実
験室マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の全体の開示は、本明細書にお
いて参考として援用される。

【０１５０】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、カスパーゼ−１４（受託番号２０９３０９としてＡＴＣＣに寄託され
たｃＤＮＡクローンＨＦＪＡＢ３６によってコードされる）のヌクレオチド（配
列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このタンパク質
は、３７７アミノ酸残基および約４３．３ｋＤａの推定分子量を有する。

【図２】 図２は、カスパーゼ−１４のアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
、および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」
のグラフにおいて、図１（配列番号２）の約３５〜約７１、約７９〜約９９、約
１１０〜約１３８、約１７３〜約２０２、約２２１〜約２５０、約２５９〜約２
９７、約３０５〜約３１８、および約３４３〜約３７０のアミノ酸残基は、カス
パーゼ−１４タンパク質の示された高抗原性領域に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｐ 9/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 35/00 45/00 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/00 5/00 Ｂ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 FA02 FA08 GA11 GA13 HA14 4B050 CC03 DD11 FF05E FF15E LL01 4B063 QA01 QA18 QQ61 QQ79 QR16 QR48 QR56 QR60 QR77 QR80 QS05 QS36 QS38 QX07 4B065 AA26X AA90X AA93X AA93Y AA95X AB01 BA02 BA05 BD17 CA33 CA44 CA46 4C084 AA06 AA07 AA17 BA22 CA53 CA56 CA59 NA14 ZA021 ZA161 ZA361 ZA511 ZA751 ZA891 ZA961 ZB151 ZB221 ZB351 ZC781

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって： （ａ）配列番号２においてアミノ酸残基１〜３７７として示されるポリペプチ
   ドをコードする核酸配列； （ｂ）配列番号２においてアミノ酸残基２〜３７７として示されるポリペプチ
   ドをコードする核酸配列； （ｃ）配列番号２においてアミノ酸残基９６〜２７０として示されるポリペプ
   チドをコードする核酸配列； （ｄ）配列番号２においてアミノ酸残基２８９〜３７７として示されるポリペ
   プチドをコードする核酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによっ
   てコードされるポリペプチドをコードする核酸配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれる該ヒトｃＤＮＡクローンによ
   ってコードされるポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここで該ポリペ
   プチドがＮ末端のメチオニンを欠損する核酸配列； （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の核酸配列と少
   なくとも９５％同一である核酸配列； （ｈ）ストリジェントな条件下で、ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれる
   ヒトｃＤＮＡに、または配列番号１として示される核酸配列の相補物からなるポ
   リヌクレオチドにハイブリダイズする核酸配列； （ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１〜３７７として示されるポリペプチド、ま
   たはＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされ
   るポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列； （ｊ）配列番号２のアミノ酸残基１〜３７７として示されるポリペプチド、ま
   たはＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされ
   るポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列であって
   、ここで該ポリペプチドは少なくとも１つの保存的置換を有する核酸配列；およ
   び （ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
   （ｉ）、（ｊ）または（ｋ）のいずれかの核酸配列と相補的なヌクレオチド配列
   、からなる群から選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド配列を有
   する、請求項１に記載の核酸分子
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有す
   るカスパーゼ−１４ポリペプチドをコードする配列番号１のヌクレオチド配列を
   有する、請求項１に記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含
   まれるｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分
   子。
5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ受託番号２０９３０９に含
   まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するカスパーゼ
   −１４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の
   核酸分子。
6. 【請求項６】 ストリジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項
   １の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のヌクレオチド配列と同一の
   ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオ
   チドを含む単離された核酸配列であって、該ハイブリダイズするポリヌクレオチ
   ドが、ストリジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ
   残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ
   しない、単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の
   アミノ酸配列を有するカスパーゼ−１４ポリペプチドのエプトープ保有部分のア
   ミノ酸配列をコードするポリペプチドを含む、単離された核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の単離された核酸分子であって、配列番号２
   に示される３５〜７１、７９〜９９、１１０〜１３８、１７３〜２０２、２２１
   〜２５０、２５９〜２９７、３０５〜３１８、および３４３〜３７０のアミノ酸
   残基を含むポリペプチド、からなる群から選択されるカスパーゼ−１４ポリペプ
   チドのエピトープ保有部分をコードする、単離された核酸分子。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドをベクターに
   挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法によって産生される、組換えベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する
    工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法によって産生される、組換え宿主
    細胞。
13. 【請求項１３】 カスパーゼ−１４ポリペプチドを産生するための組換え方
    法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１２に記載の
    組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を含む
    、組換え方法。
14. 【請求項１４】 単離されたカスパーゼ−１４ポリペプチドであって： （ａ） 配列番号２のアミノ酸残基１〜３７７； （ｂ） 配列番号２のアミノ酸残基２〜３７７； （ｃ） 配列番号２のアミノ酸残基９６〜２７０； （ｄ） 配列番号２のアミノ酸残基２８９〜３７７； （ｅ） ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによっ
    てコードされるポリペプチドのアミノ酸配列； （ｆ） ＡＴＣＣ受託番号２０９０３９に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによっ
    てコードされるポリペプチドのアミノ酸配列であって、該ポリペプチドがＮ末端
    のメチオニンを欠損する、アミノ酸配列； （ｇ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列
    に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列； （ｈ） 配列番号２のアミノ酸残基１〜３７７として示されるポリペプチドの生
    物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９０
    ３９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの生物学的に活
    性なフラグメントのアミノ酸配列； （ｉ） 少なくとも１つの保存的な置換を有する（ｈ）のアミノ酸配列；ならび
    に （ｊ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド
    のいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
    する、単離されたカスパーゼ−１４ポリペプチド。
15. 【請求項１５】 カスパーゼ−１４タンパク質のエピトープ保有部分を含む
    単離されたポリペプチドであって、ここで、該部分が、配列番号２の３５〜７１
    、７９〜９９、１１０〜１３８、１７３〜２０２、２２１〜２５０、２５９〜２
    ９７、３０５〜３１８、および３４３〜３７０のアミノ酸残基を含むポリペプチ
    ド、からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
16. 【請求項１６】 組換え宿主細胞中において産生されるかまたは含まれる、
    請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
17. 【請求項１７】 前記組換え宿主細胞が哺乳動物である、請求項１６に記載
    の単離されたポリペプチド。