JP2012525836A - セリンプロテアーゼインヒビターの改変方法 - Google Patents

セリンプロテアーゼインヒビターの改変方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2012525836A
JP2012525836A JP2012509082A JP2012509082A JP2012525836A JP 2012525836 A JP2012525836 A JP 2012525836A JP 2012509082 A JP2012509082 A JP 2012509082A JP 2012509082 A JP2012509082 A JP 2012509082A JP 2012525836 A JP2012525836 A JP 2012525836A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
modified
spi
residues
thrombin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2012509082A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2012525836A5 (ja
Inventor
キニ，アール．マンジュナサ
イョオウ コー，チョー
スワミナサン，クンチサパダム
サンドラマーシー，クマー
Original Assignee
ナチュラル・エンバイロンメント・リサーチ・カウンシル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ナチュラル・エンバイロンメント・リサーチ・カウンシル filed Critical ナチュラル・エンバイロンメント・リサーチ・カウンシル
Publication of JP2012525836A publication Critical patent/JP2012525836A/ja
Publication of JP2012525836A5 publication Critical patent/JP2012525836A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、阻害の程度、標的セリンプロテアーゼによるセリンプロテアーゼインヒビターの切断後の阻害の維持、セリンプロテアーゼへの結合速度、中和及び結合親和性を含む種々の所望の特性のいずれか1つを獲得又は増強するためにセリンプロテアーゼインヒビターを改変する方法に関する。本発明はまた、かかる改変の産物、及びかかる産物の使用、特にそれらの治療における使用に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、種々の所望の特性のいずれか1つを獲得又は増強するためにセリンプロテアーゼインヒビターを改変する方法に関する。本発明はまた、かかる改変の産物、及びかかる産物の使用、特にそれらの治療における使用に関する。
セリンプロテアーゼは、セリンエンドペプチダーゼとしても知られ、活性部位にセリン残基を含有するタンパク質消化酵素である。これらの酵素は、広く天然に存在し、広範な生物学的機能、例えば消化、血液凝固、免疫系及び炎症などにおいて役割を果たしている。
セリンプロテアーゼの広い分布及び機能のため、これらの酵素に対するインヒビターは一般的である。多くのタンパク質性セリンプロテアーゼインヒビターが天然に見られ、また研究及び治療における使用のために多くの合成化学的セリンプロテアーゼインヒビターが開発されている。
トロンビンは、血液凝固において中心的な役割を果たすセリンプロテアーゼファミリーのメンバーであり、血液凝固プロセスでは、血管損傷に応答して、セリンプロテアーゼの循環チモーゲンが制限的タンパク質分解によって連続的に活性化され、フィブリン塊の形成をもたらす。トロンビンは大部分のチモーゲン及びそれらの補因子と相互作用し、血液凝固において多数の凝固促進的及び抗凝固的役割を果たす（Huntington (2005)、及びDi Cera (2003)）。凝固促進プロテアーゼとして、初期段階中に生成される第1の微量のトロンビンは、第V因子（FV）及び第VIII因子（FVIII）を活性化して正のフィードバックを与え、トロンビンバーストをもたらす。トロンビンは第XI因子も活性化し、固有経路を誘導することができる。トロンビンはフィブリノゲンを切断してフィブリンにし、不溶性凝固塊を形成する。フィブリンポリマーは、トロンビン活性化第XIII因子によって誘導される共有架橋によって、さらに強化及び安定化される。トロンビンは、おそらく2つのメカニズムによって血小板血栓の生成にも寄与する:（a）プロテアーゼ活性化受容体(PAR)と糖タンパク質Vの相互作用によって血小板を活性化し、（b）フォンウィルブラント因子（VWF）を切断する1型トロンボスポンジンモチーフでADAMTS13、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼを不活性化することによって、血小板血栓の不安定化を妨げる。抗凝固的プロテアーゼとして、トロンビンは補因子であるトロンボモジュリンの存在下でプロテインC（APC）を活性化する。APCは第Va因子（FVa）及び第VIIIa因子（FVIIIa）を不活性化し、トロンビンの生成をダウンレギュレーションする（Huntington (2005)、Di Cera (2003)、Davie et al. (1991)、Davie (2003)、及びLane et al. (2005)）。
その中心的役割のため、トロンビンは凝固カスケードを制御するために阻害する主要な標的となっており、多くのトロンビンインヒビターが多年にわたり治療及び研究に使用されている。ヘパリンは典型的なトロンビンインヒビターであり、トロンビンの間接的インヒビターとして機能するが、これはそれが抗トロンビン複合体を介して作用し、直接的にトロンビンの活性部位と相互作用するものではないことを意味している。間接的トロンビンインヒビターは、可溶性トロンビンとのみ相互作用することができ、したがって、血塊が形成された後はトロンビンを阻害することはできない。
より最近では、いくつかの直接的トロンビンインヒビター、例えばヒルジン、ビバリルジン、アルガトロバン及びダビガトランエテキシレートが単離され及び／又は開発されている。これらには、可溶性形態及びフィブリン結合形態の両方のトロンビンを阻害することができるという治療上の利点がある。しかし、このような直接的インヒビターは、決して最適ではないいくつかの特性を有する。例えば、ヒルジンは、出血、腎機能に依存する薬物動態、解毒剤の欠如、免疫原性、及び反動的凝固性亢進のリスクを生じる。タンパク質分解及び腎経路の組合せにより排除されるビバリルジンは、ごくわずかな免疫原性の可能性を有するが、最適ではない治療特性を有してもいる。
セリンプロテアーゼインヒビターの治療的重要性の点から、改善された特性を示す別のセリンプロテアーゼインヒビターを同定する必要がある。特に、可溶性形態及びフィブリン結合形態の両方のトロンビンを阻害する能力があるが、現在利用可能な直接的トロンビンインヒビターと関連する欠点を伴わない直接的トロンビンインヒビターを同定する必要がある。
本発明は、改変型セリンプロテアーゼインヒビター、改変型セリンプロテアーゼインヒビターの作製方法、及び、例えば被験者における標的セリンプロテアーゼを阻害するための、改変型セリンプロテアーゼインヒビターの使用方法を提供する。
従って、第1の態様において、本発明は、標的セリンプロテアーゼ（SP）の阻害の増大を示す改変型セリンプロテアーゼインヒビター（SPI）の作製方法であって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基（catalytic triad）における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるようにSPIを改変するステップを含む方法を提供する。
この態様の一実施形態において、本方法は、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基をSPIに導入することを含む。別の実施形態において、本方法は、阻害持続時間の延長を示す改変型SPIを作製する。一実施形態において、上記1以上の導入されるアミノ酸残基は、置換又は挿入により導入される。
この態様の別の実施形態において、標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基は、ヒスチジン残基を含む。一実施形態において、上記1以上の導入されるアミノ酸はメチオニン-ヒスチジン配列を含む。さらなる実施形態において、1以上の導入されるアミノ酸はメチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む。別の実施形態において、1以上の導入されるアミノ酸はメチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む。一実施形態において、標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上の残基は、触媒セリン残基を含む。
この態様の別の実施形態において、本方法はさらに、SPIへのイオン電荷の領域の導入を含む、SPIを中和することが可能なようにSPIを改変するステップをさらに含み、該イオン電荷の領域は、中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なものである。一実施形態において、導入されるイオン電荷の領域は、SPIのカルボキシ末端に対して（towards）導入される。別の実施形態において、導入されるイオン電荷の領域はアニオン電荷の領域である。一実施形態において、導入されるイオン電荷の領域は、1以上の酸性残基を含む。別の実施形態において、1以上の酸性残基は1以上のグルタミン酸（glutamine）残基を含む。さらなる実施形態において、中和剤は硫酸プロタミンである。
上記方法の例示的な実施形態において、SPIはトロンビンインヒビターである。別の例示的な実施形態において、SPIは配列番号14及び17〜153のいずれか1つからなる群より選択される。
別の態様において、本発明は、上記方法のいずれかにより得ることができる又は得られた改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物を提供する。一実施形態において、改変型SPIはトロンビンインヒビターである。例示的な実施形態では、改変型SPIは、以下のコンセンサス配列：N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド)（配列番号771）を含む。
別の態様において、本発明は、標的SPの阻害の増大を示す改変型SPIを提供し、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるものである。この態様の一実施形態において、改変型SPIは、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基を含む。別の実施形態において、改変型SPIは、阻害持続時間の延長を示す。
この態様の別の実施形態において、標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基はヒスチジン残基を含む。別の実施形態において、標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基は、メチオニン-ヒスチジン配列を含む。別の実施形態において、標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基は、メチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む。さらなる実施形態において、標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基は、メチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む。別の実施形態において、標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上のアミノ酸残基は触媒セリン残基を含む。
この態様の別の実施形態において、改変型SPIはさらにイオン電荷の領域を含み、このイオン電荷の領域は中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なものである。一実施形態において、イオン電荷の領域は、SPIのカルボキシ末端に対して（towards）配置されている。別の実施形態において、イオン電荷の領域はアニオン電荷の領域である。一実施形態において、イオン電荷の領域は1以上の酸性残基を含む。別の実施形態において、1以上の酸性残基は1以上のグルタミン酸（glutamine）残基を含む。例示的な実施形態では、中和剤は硫酸プロタミンである。別の例示的な実施形態において、上記改変型SPIはトロンビンインヒビターである。一実施形態において、改変型SPIは、以下のコンセンサス配列: N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド)（配列番号771）を含む。
別の態様において、本発明は、配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列を含む改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物を提供する。さらなる態様において、本発明は、配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列からなる改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物を提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の改変型SPIをコードする核酸分子を提供する。別の態様において、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて本明細書に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を提供する。
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の改変型SPIをコードする核酸配列、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて本明細書に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含有するベクターを含む。別の実施形態において、本発明は、上記ベクター及び／又は上記核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の改変型SPIを投与することを含む標的SPの阻害方法を提供する。別の態様において、本発明は、血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、本明細書中に記載の改変型SPI、例えばトロンビンインヒビターを投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、被験者においてトロンビン阻害を中和する方法であって、本明細書に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与し、続いてトロンビン阻害の中和が生じるのに十分な量の硫酸プロタミンを該被験者に投与することを含む方法を提供する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
典型的なSPの触媒反応スキームを示す。ポリペプチド基質は、切断可能な結合が上記酵素の活性部位に挿入されて、そのカルボニル炭素がSPの求核性セリン付近に位置するように、SPに結合する。セリン-OHは、カルボニル炭素を攻撃し、SPのヒスチジンの窒素は、上記セリンの-OHから水素を受容して、4面体中間体を生成する。次に、ペプチド結合における窒素‐炭素は、アシル‐酵素中間体を生成し、該中間体に水が付加されると、別の4面体中間体が生成される。最終反応では、上記ペプチドのC末端がはじき出され、上記SPはその本来の状態に戻る。 他のトロンビンインヒビター構造と比較したトロンビン-s-バリエジン複合体の構造を示す。
（A）トロンビン-s-バリエジン複合体構造。トロンビンA-鎖骨格は、水色のリボンとして着色され、B鎖骨格は、白色のリボンとして着色され、また、s-バリエジン骨格及び側鎖原子はピンク色の棒として示されている。
（B）トロンビン-ヒルログ-1複合体構造（PDB：2HGT）。ヒルログ-1は、赤色の棒として着色されている。
（C）トロンビン-ヒルログ-3複合体構造（PDB：1ABI）。ヒルログ-3は、黄色の棒として着色されている。
（D）トロンビン-ヒルゲン複合体構造（PDB：1HGT）。ヒルゲンは、緑色の棒として着色されている。
（E）トロンビン-PPACK複合体構造（PDB：1PPB）。PPACKは、オレンジ色の棒として着色されている。
（F）野生型の、インヒビター非含有及びNa+非含有トロンビン（PDB：2AFQ）。構造は、「低速」形態のトロンビンを表しており、インヒビターを含まない。
37℃及び24℃でのトロンビンによるs-バリエジンの切断の分析を示す。非切断s-バリエジン（赤色四角）、質量1045の切断産物（N末端断片SDQGDVAEPK；配列番号２を表す）（黄色四角）並びに質量2582の切断産物（C末端断片MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES；MH22；配列番号３）（青色四角）の相対割合（％）を、RP-HPLC分析におけるピーク下面積を積分することにより計算した。切断は、室温（24℃）よりも37℃での方が速く進行した（n = 2、エラーバーは標準偏差を表す）。
（A）s-バリエジンとトロンビンを37℃でインキュベートすることにより得られた結果。完全な切断に180分しか要しなかった。
（B）s-バリエジンとトロンビンを24℃でインキュベートすることにより得られた結果。約90％の切断に360分を要した。
s-バリエジンとEP25が、トロンビンにより切断された後、その活性を保持したことを示す図である。
（A）s-バリエジンをトロンビン（3.33 nM）と一緒に室温で最大24時間までインキュベートし、様々な時点で、100μM S2238に対するトロンビンのアミド分解活性を阻害する能力についてアッセイした（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）。
（B）s-バリエジンの代わりにEP25を用いて同様の実験を実施した（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）。
MH22、s-バリエジン及びヒルログ-1によるヒト血漿トロンビンの阻害を示す。ヒト血漿由来トロンビンのアミド分解活性を阻害するMH22、s-バリエジン及びヒルログ-1の能力は、活性部位指定基質S2238（100μM）を用いてアッセイした。MH22（丸）、s-バリエジン（三角）及びヒルログ-1（四角）によって阻害されたトロンビン（1.65 nM）の用量応答曲線はすべて、これらがトロンビンと同様のモル濃度で存在するとき、阻害を示した。
MH22（四角）及びs-バリエジンに用いた濃度は、0.03 nM、0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM及び1,000 nMであった。阻害のIC50は、それぞれ11.46 ± 0.71 nM及び8.25 ± 0.45 nMである（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）。ヒルログ-1（三角）に用いた濃度は、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM及び10,000 nMであった。阻害のIC50は72.6 ± 3.9 nMである（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）。
MH22の見かけ上の阻害定数（Ki'）を示す。MH22は、密着結合インヒビターとして作用するため、基質として様々な濃度のS2238を用いて、様々な濃度（0.195 nM、0.391 nM、0.781 nM、1.56 nM、3.12 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM及び100 nM）のMH22によるトロンビン（1.65 nM）の阻害を試験した。反応は、トロンビンの添加によって開始した。図には、100μMのS2238で実施した実験を示している。得られたデータは、方程式にあてはめることにより、見かけ上の阻害定数（Ki'）（平均値±標準偏差）：14.31 ± 0.26 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）を取得した。 MH22の阻害定数Kiを示す。MH22の見かけ上の阻害定数（Ki'）は、基質S2238の6つの異なる濃度（12.5μM、25μM、50μM、75μM、100μM及び150μM）で決定した。基質濃度に対するKi'のプロットは、全体を通して一定のままであったが、これは、MH22が、S2238に対するトロンビンのアミド分解活性を非競合的に（Ki' = （S + Km）/[( Km / Ki)+(S/αKi)]及びKi' = Ki）阻害することを示している。線形回帰によりKi'値をあてはめると、阻害定数Ki：14.11 ± 0.29 nM（各S2238濃度についてn = 3、エラーバーは標準偏差を表す）が得られた。 トロンビンのバリエジン阻害についての平衡スキームを示す。バリエジンの非存在下で、S2238は、トロンビンに結合し（Ksは、トロンビン-S2238解離の平衡定数であり、青色矢印として示す）、トロンビンによって加水分解されて、有色産物pNAを放出する（Kpは、pNA形成の正方向速度定数であり、緑色の矢印で示す）。
バリエジンの存在下で、トロンビンはバリエジンに結合して（Ki-vはバリエジンの阻害定数であり、褐色矢印として示す）、S2238加水分解は、競合的に阻害される。結合時に、トロンビンはバリエジンをMH22へと切断する（kcは切断の正方向速度定数であり、紫色の矢印で示す）。
MH22は、トロンビンに結合したままであり、トロンビンの古典的非競合インヒビターとして作用する（Ki-mはMH22の阻害定数である）。MH22は、遊離トロンビン、又は同じ親和性（α＝1、従ってKi-m = αKi-m）を有するS2238結合トロンビンに結合する（赤色矢印として示す）。同様に、Ks = αKs、S2238とトロンビンの結合は、MH22によって影響されない。
s-バリエジン結合及びヒルゲン結合構造におけるトロンビン触媒3残基を示す。
（A）トロンビン‐ヒルゲン構造（緑色）において非占有時のトロンビン触媒3残基THis57、TAsp102及びTSer195は、インタクトな電荷中継水素結合系を有する。トロンビン-s-バリエジン構造（ピンク色）において、TSer195 Oγは、1.10Å（青緑色の矢印）変位させられている。THis57 NεとTSer195 Oγの間の距離は、3.77Åであり、従って、水素結合は形成されないため、電荷中継システムは破壊される。
（B）TSer195 Oγの変位は、s-バリエジン（灰色で示す）とトロンビンの触媒3残基との相互作用によるものである。VHis12骨格N（ドナー）は、水素結合（2.77Å）を介してTSer195 Oγ（アクセプター）に結合したが、VHis12側鎖Nδ（アクセプター）は、TSer195 Oγ（ドナー）との弱い水素結合（3.68Å）にしか寄与することができなかった。VHis12骨格Nもまた、水分子（水色）を介してTGly193骨格N及びTCys42 Sγとの水素結合を形成する。従って、TSer195 Oγは、弱い求核基となるため、基質の骨格炭素を攻撃することができなくなる。オキシアニオンホール形成はまた、この水素結合ネットワークにおけるTGly193骨格Nの関与によっても妨害される。
トロンビンとs-バリエジンとの主要なサブサイト相互作用を示す。s-バリエジンについては、残基P2'〜P5'（VHis12〜VAla15）のみを示している。s-バリエジンP1' VMet11の密度は、上記構造において追跡することができない。トロンビンS2'サブサイト（赤色）（TCys42、THis57、TTrp60D、TLys60F、TGlu192及びTSer195によって形成される）は、ヒルログ-3に観察されるS1'サブサイトと部分的に重なる。s-バリエジンP3' VLys13側鎖は、TGlu192側鎖と接近してこれと平行に延びており、その骨格は、TLeu41と接触していて、S3'サブサイト（青緑色）を形成する。s-バリエジンP4' VThr14側鎖は、自己消化ループの底部に向かっており、TGly142, TAsn143, TGlu192, TGly193及びTGlu151により形成される小さなポケットを占めて、S4'サブサイト（ピンク色）を形成する。トロンビンS5'サブサイト（緑色）は、底部でTLeu40によって線で描かれ、これによって、s-バリエジンP5' VAla15はその側鎖を界面に埋め込むことが可能になる。 トロンビンのキャニオン（canyon）様クレフトにしっかりと嵌め込まれたs-バリエジンを示す。
（A）トロンビンは、活性部位から出発して、エキソサイト-Iまで延びる深いキャニオン様クレフト（四角で囲まれている）を有する。
（B）s-バリエジン全体（ピンク色のCPKモデル）が、伸長コンホメーションでキャニオン様クレフトの底部までしっかりと嵌め込まれおり、触媒ポケット、主要なサブサイト及びエキソサイト-Iを覆っている。上記クレフトの底部は、主として無極性残基から構成されている。該クレフトの壁は、エキソサイト-I での34-ループ及び70-ループと一緒に、トロンビン活性部位付近の60-ループ及び自己消化ループによって形成されている。
（C）s-バリエジンと適合したトロンビン残基は、その位置に応じて着色されている：触媒ポケット‐青色；60-ループ‐赤色；自己消化ループ‐青緑色；34-ループ‐黄色；70-ループ‐緑色；クレフトの底部‐オレンジ色。s-バリエジンの球棒モデルをピンク色で示す。
（D）s-バリエジンは、特定の側鎖接触を介してトロンビンと相互作用する。s-バリエジンの5つの残基（VPhe18、VAsp19、VAla22、VGlu26及びVTyr27、すべて白色に着色）を除くすべての残基が、トロンビンとの接触界面中に埋め込まれたその側鎖を有する。
新規のバリエジン変異体の設計を示す図である。新規のバリエジン変異体は、トロンビン‐バリエジン相互作用を改善するように設計した。その手法は、まずバリエジンの長さを最適化した後、バリエジンの複数の重要な位置を最適化するものである。 バリエジン変異体EP21（低速密着結合の競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す。
（A）S2238（100μM）で、トロンビン（1.65 nM）アミド分解活性のEP21（0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM及び10,000 nM）阻害は、低速結合のために、プレインキュベーション時間依存的シフトを示した。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で176.9±6.8 nM、20分のプレインキュベーションを実施した場合（点線）には16.2±2.9 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）100μMのS2238で、様々な濃度のEP21（18.8 nM、25 nM、37.5 nM、50 nM、75 nM、100 nM及び150 nM）によるトロンビン（1.65 nM）阻害の進行曲線（図示していない）を、低速結合インヒビターを表す式：P = Vft + (Vi - Vf) (1 - e-kt) / k + Poにあてはめて、用いたEP21の各濃度についてk値を取得した。EP21濃度に対するkのプロット（実線）は、式：k = K4 + K3It / [It + Ki'(1 + S / Km)]によって表される双曲線であり、従って、これを上記式にあてはめて、Ki'：1.66±0.36 nMを取得したが、これは、初期衝突複合体EIの解離定数を表すものである。全阻害定数（Ki）を式Ki = Ki' [K4 / (K3 + K4)]から計算し、0.315 ± 0.024 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）を得た。
バリエジン変異体MH18（高速かつ密着結合の非競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す図である。
（A）トロンビン（1.65 nM）のアミド分解活性を阻害するMH18（0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM及び10,000 nM）の能力を100μMのS2238中でアッセイした。用量応答曲線は、プレインキュベーション時間に非依存的である。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で10.9±1.2 nM、20分のプレインキュベーション後（点線）、11.7±1.9 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）MH18は、高速かつ密着結合のインヒビターとして作用したため、100μMのS2238で、0.39 nM、0.78 nM、1.56 nM、3.13 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM及び200 nMのMH18を用いて、トロンビン（1.65 nM）阻害を試験した（実線）。データを式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki’Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}にあてはめることにより得られた見かけ上の阻害定数（Ki'）は14.9±3.5 nMであった。阻害定数（Ki）は、式：Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)]及びKi' = Kiに基づいて計算したところ、14.9±3.5 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
バリエジン変異体DV24（高速かつ密着結合の競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す図である。
（A）100μMのS2238におけるDV24（0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM及び3,000 nM）によるトロンビン（1.65 nM）阻害の用量応答曲線は、切断によるプレインキュベーション時間の増大と共に右シフトを示した。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で7.49±0.28 nM、20分のプレインキュベーションを実施した場合（点線）には10.07±0.60 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）DV24は、高速かつ密着結合のインヒビターとして作用したため、100μMのS2238で、0.39 nM、0.78 nM、1.56 nM、3.13 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM及び200 nMのDV24を用いて、トロンビン（1.65 nM）阻害を試験した（実線）。データを式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki’Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}にあてはめることにより得られた見かけ上の阻害定数（Ki'）は、9.74±0.91 nMであった。阻害定数（Ki）は、方程式：Ki' = Ki (1 + S/Km)に基づいて計算したところ、0.306±0.029 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
バリエジン変異体DV24K10R（高速かつ密着結合の競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す図である。
（A）100μMのS2238におけるDV244K10R（0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM及び3,000 nM）によるトロンビン（1.65 nM）阻害の用量応答曲線は、切断によるプレインキュベーション時間の増大と共に右シフトを示した。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で6.98±0.76 nM、20分のプレインキュベーション後（点線）には12.01±0.41 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）DV24K10Rは、高速かつ密着結合のインヒビターとして作用したため、100μMのS2238で、0.39 nM、0.78 nM、1.56 nM、3.13 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM及び200 nMのDV24K10Rを用いて、トロンビン（1.65 nM）阻害を試験した（実線）。データを式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}に当てはめることにより得られた見かけ上の阻害定数（Ki'）は、8.27±0.85 nMであった。阻害定数（Ki）を式（4）に基づいて計算すると、0.259±0.015 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）が得られる。
s-バリエジンにおけるVPro16-VPro17（黄色）の存在がその骨格にねじれを引き起こしたことを示す。それぞれのトロンビン構造に基づいて、s-バリエジン（ピンク色、Cα位置のみ追跡）とヒルログ-3（緑色、Cα位置のみ追跡）とを重ね合わせることによって、ヒルログ-3の対応する残基Gly10及びAsp11から3.16Å及び1.70ÅのVPro18及びVAsp19の変位が明らかになった（Cα位置により測定）（青緑色の双方向矢印）。その結果、VAsp19側鎖は、ヒルログ-3において、反対方向で、類似のAsp11側鎖の方を向いている。ヒルログ-3における上記のAsp11は、TArg73と強力なイオン対（白色）を形成する。VAsp19の変位のために、TArg73 NH2とVAsp19 OD1との間の可能な限り近い距離は、9.22Åであり、これによって、トロンビン-s-バリエジン構造における上記の相互作用は不可能となった。 バリエジン変異体DV23（高速かつ密着結合の競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す。
（A）100μMのS2238におけるDV23（0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM及び3,000 nM）によるトロンビン（1.65 nM）阻害の用量応答曲線は、切断によるプレインキュベーション時間の増大と共に右シフトを示した。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で45.4±1.6 nM、20分のプレインキュベーション後（点線）には77.8±6.1 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）100μMのS2238で、3.91 nM、7.81 nM、15.6 nM、31.3 nM、62.5 nM、125 nM、250 nM及び500 nMのDV23を用いて、トロンビン（1.65 nM）阻害を試験した。データを式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}にあてはめることにより得られた見かけ上の阻害定数（Ki'）は、69.6±7.8 nMであった。阻害定数（Ki）を式：Ki' = Ki (1 + S/Km)に基づいて計算すると、2.19±0.23 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）が得られた。
バリエジン変異体DV23K10R（高速かつ密着結合の競合インヒビター）によるトロンビン阻害を示す図である。
（A）100μMのS2238の存在下で、DV23K10R（0.1 nM、0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM及び3,000 nM）は、トロンビン（1.65 nM）を阻害した。切断後の活性の減少は急速であったが、これは、用量応答曲線の強度の右シフトによって示されている。IC50値は、プレインキュベーションなし（実線）で12.9±1.0 nM、20分のプレインキュベーション後（点線）には101.9±1.2 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
（B）100μMのS2238で、3.91 nM、7.81 nM、15.6 nM、31.3 nM、62.5 nM、125 nM、250 nM及び500 nMのDV23K10Rを用いて、トロンビン（1.65 nM）阻害を試験した（実線）。データを式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}にあてはめることにより得られた見かけ上の阻害定数（Ki'）は、19.1±1.9 nMであった。阻害定数（Ki）は、式：Ki' = Ki (1 + S/Km)に基づいて計算したところ、0.600±0.010 nM（n = 3、エラーバーは標準偏差を表す）であった。
様々なペプチドを注射したゼブラフィッシュ幼魚の閉塞までの遅延時間（TTO）を示す図である。ゼブラフィッシュ4 dpf（孵化後日数）幼魚に、10 nlの様々なペプチドを500μMで注射するか、又は10 nlのPBSを対照として注射した。該ペプチド又はPBSの注射から20分後、レーザー剥離によって幼魚尾部静脈を損傷させた。様々なペプチドの抗血栓効果の比較のために、レーザー剥離後のTTOを150秒まで記録した。PBS、ヒルログ-1、s-バリエジン、EP25及びMH22のTTOは、それぞれ19.0±3.2秒、45.0±5.5秒、120.8±7.4秒、22.5±6.2秒及び33.3±2.9秒であった。150秒以内では、DV24K10RYsulfを注射した幼魚に血栓は形成されなかった。低速結合インヒビターEP25を除いて、TTOを延長するペプチドの能力は、概してそのKiと相関していた（n = 4、エラーバーは標準偏差を表す）。 ペプチドによるトロンビンアミド分解活性の阻害を中和する硫酸プロタミンの能力を示す図であり、該能力は、発色基質S2238を用いてアッセイした。硫酸プロタミン（3 mg/ml、1 mg/ml、0.3 mg/ml、0.1 mg/ml、0.03 mg/ml、0.01 mg/ml、0.003 mg/ml及び0.001 mg/ml）をそれぞれのIC50濃度のペプチド（実線）、すなわち8.25nM s-バリエジン（黒四角）、11.5 nM MH22（黒丸）及び1.4 nM DV24K10RYsulf（黒三角）、と一緒に10分インキュベートした後、トロンビン（1.65 nM）を添加した。トロンビンのアミド分解活性を100μM S2238と一緒にアッセイした。硫酸プロタミンの存在下及び非存在下での阻害の割合（％）は、逆転の割合（％）の計算のために比較した。s-バリエジン及びMH22は、同程度まで逆転させることができるが、DV24K10RYsulfの効果的な逆転のためには、より高濃度のプロタミンが必要である。
それぞれのIC90濃度（点線）のペプチドで、同様の実験を実施した：s-バリエジンは167 nM（白四角）、MH22は224 nM（白丸）及びDV24K10RYsulfは13.6 nM（白三角）。3つのペプチドすべての逆転には、より高濃度のプロタミンが必要である。s-バリエジン及びMH22はやはり、同程度まで中和されるが、DV24K10RYsulfを中和するのはより難しい。従って、ペプチド酸性C末端残基が、硫酸プロタミン結合の原因である可能性が極めて高い。
本発明は、標的セリンプロテアーゼ（SP）の阻害の増大を示す改変型セリンプロテアーゼインヒビター（SPI）の作製方法であって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基（catalytic triad）における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるようにSPIを改変するステップを含む方法を提供する。
上述したように、セリンプロテアーゼは、ペプチド切断酵素である。当技術分野では、これらの酵素が、酵素の活性部位に存在し、セリン残基、ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基を含む触媒3残基を介して作用するものと認められている。ヒスチジン残基及びアスパラギン酸残基の機能は、電荷中継システムを介してセリン残基を活性化することであり、これを求核性として、基質の切断可能な結合を切断可能なものとする。典型的なセリンプロテアーゼにおける触媒3残基の残基間の相互作用を図1に示す。
本発明者は、驚くべきことに、慣用的な競合的インヒビターであるバリエジンのように活性部位の立体的妨害に加えて、セリンプロテアーゼの直接的インヒビターであるトロンビンもまた、トロンビンの触媒3残基の残基間の相互作用を破壊することによって作用し、それによりその触媒活性を阻害するということを実証した。
バリエジンは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。これは最初にWO03/091284に記載されたダニ由来のタンパク質である。トロンビンへのバリエジンの結合能はWO08/155658に記載されている。しかし、いずれの文献も、バリエジンがトロンビンの触媒3残基におけるアミノ酸間の相互作用を破壊するために作用することを示唆していない。WO03/091284及びWO08/155658の内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
図9Aは、トロンビンの触媒3残基の残基の位置と、触媒セリン残基を活性化するために機能する残基間の相互作用を示す。図9Bは、触媒3残基と相互作用するバリエジンの残基と、触媒3残基の残基の配置に対するその相互作用の影響を示す。この図は、バリエジンのヒスチジン残基がセリンのγOを1.1Å変位させる機能を有し、触媒3残基のセリン残基とヒスチジン残基の間の相互作用を破壊し、トロンビンの活性を劇的に低下させるという予想外の知見を図示する。本発明者が認識する限り、バリエジンは、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させる（displace）ことにより作用することが見出された最初のSPIである。
バリエジンの強力な抗トロンビン活性が、少なくとも部分的には、トロンビンの活性部位における触媒3残基の破壊によるものであり、それにより達成されるメカニズムは、トロンビンインヒビターなどの他のセリンプロテアーゼインヒビターに適用することができることを本発明者は実現するものである。特に、既知のセリンプロテアーゼインヒビターの特性は、標的セリンプロテアーゼの触媒3残基の残基間の相互作用を破壊するように改変することによって改善することができる。そのような改変は、セリンプロテアーゼインヒビターの特性を改善し、既存のセリンプロテアーゼインヒビター、特に既知の直接的トロンビンインヒビターの欠点の多くを克服するよう機能する。
「標的セリンプロテアーゼ」又は「標的SP」という用語は、所与のセリンプロテアーゼインヒビターにより通常阻害されるセリンプロテアーゼに関する。標的SPの一例はトロンビンである。本発明において標的SPの別の例には、凝固因子FXa、FVIIa、FXIIa、FXIa、及びFIXaが含まれる。
本発明の方法により改変されるセリンプロテアーゼインヒビター、すなわちSPIは、直接的SPI又は間接的SPIでありうる。「直接的SPI」という用語は、SPIが、抗SP複合体の一部として存在するか又は中間体を介して作用することなく、SPの活性部位におけるその標的SPと相互作用することを意味する。「間接的SPI」という用語は、SPIが標的SPの活性部位と直接的に相互作用するものではないことを意味する。間接的SPIは、活性部位とは異なる標的SP上の部位と相互作用してもよいし、あるいは間接的SPIは、間接的SPIを含む抗SP複合体を介して標的SP上の活性部位又は他の部位と相互作用してもよい。
本発明の方法により改変可能なSPIの例としては、ヒルログ（配列番号14）、クニッツ/BPTI型インヒビター（例えばウシ膵臓トリプシンインヒビター、配列番号776に示す）、ヒルジン関連トロンビンインヒビター、セルピン、ヘパリン補因子、α1-抗トリプシン様セルピン、カザール型直接的インヒビター、及びクニッツ型/STI（ダイズトリプシンインヒビター）インヒビターが挙げられる。本発明の方法により改変可能なSPIの別の例は、配列番号17〜153に示されている。
「変位させられる（displaced）」とは、標的SPにおけるアミノ酸残基又は該アミノ酸残基内の1以上の原子が、外的影響がない場合に天然にとりうるものとは異なる空間的コンホメーションを占めることを意味する。そのような変位は任意の配向でありうることを理解すべきである。
一態様において、変位は、標的SPの触媒3残基のアミノ酸残基間の相互作用が破壊されるようなものである。そのような破壊は、完全なもの、すなわち触媒3残基の残基が相互作用しないようになってもよいし、あるいは部分的なもの、すなわち残基間の相互作用が、触媒3残基の1以上の残基が変位されていない場合よりも90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％又はそれ以下だけ強くないものであってもよい。触媒3残基のアミノ酸残基間の相互作用の存在は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば結晶学又はNMR、計算方法、例えば限定されるものではないが、分子力学、分子動力学及びドッキング、水素重水素交換及び質量分析などにより測定することができる。
標的SPの触媒3残基の1以上の残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子の変位は、標的SPの触媒3残基の電荷中継システムを破壊しうる。
本発明の一態様では、標的SPの触媒3残基における1以上の残基の変位は、触媒3残基のセリン残基の変位を含む。一態様において、触媒3残基のセリン残基のγO原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のセリン残基のβCを変位させる。別の態様において、触媒3残基のセリン残基のαCを変位させる。
一態様において、触媒3残基のセリン残基の原子は、0.1Å変位させる。さらなる態様において、触媒3残基のセリン残基の原子は、0.2Å、0.3Å、0.4Å、0.5Å、0.6Å、0.7Å、0.8Å、0.9Å、1.0Å、1.1Å、1.2Å、1.3Å、1.4Å、1.5Å、1.6Å、1.7Å、1.8Å、1.9Å、2.0Å、2.5Å、3.0Å、又はそれ以上変位させる。
本発明の一態様では、触媒3残基の1以上の残基の変位は、触媒3残基のヒスチジン残基の変位を含む。一態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のγC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のδC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のεN2原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のζC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のδN1原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のβC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のヒスチジン残基のαC原子を変位させる。
一態様において、触媒3残基のヒスチジン残基の原子は、0.1Å変位させる。さらなる態様において、触媒3残基のヒスチジン残基の原子は、0.2Å、0.3Å、0.4Å、0.5Å、0.6Å、0.7Å、0.8Å、0.9Å、1.0Å、1.1Å、1.2Å、1.3Å、1.4Å、1.5Å、1.6Å、1.7Å、1.8Å、1.9Å、2.0Å、2.5Å、3.0Å、又はそれ以上変位させる。
本発明の一態様では、触媒3残基の1以上の残基の変位は、触媒3残基のアスパラギン酸残基の変位を含む。一態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基のγO原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基のβC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基のαC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基のγC原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基のδO1原子を変位させる。別の態様において、触媒3残基のセリン残基のδO2原子を変位させる。
一態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基の原子は、0.1Å変位させる。さらなる態様において、触媒3残基のアスパラギン酸残基の原子は、0.2Å、0.3Å、0.4Å、0.5Å、0.6Å、0.7Å、0.8Å、0.9Å、1.0Å、1.1Å、1.2Å、1.3Å、1.4Å、1.5Å、1.6Å、1.7Å、1.8Å、1.9Å、2.0Å、2.5Å、3.0Å、又はそれ以上変位させる。
標的SPの1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子の変位は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば結晶学又はNMR、計算方法、例えば限定されるものではないが、分子力学、分子動力学及びドッキング、水素重水素交換及び質量分析などにより測定することができる。
本発明の一態様では、SPIがタンパク質であり、改変が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基のSPIへの導入を含む。これらのアミノ酸残基は、それと相互作用することにより触媒3残基におけるアミノ酸残基を変位させうる。導入されるアミノ酸残基はヒスチジン残基を含む。そのようなヒスチジン残基は、ヒスチジン残基に加えてSPIに導入することができる任意の他の配列の一部として存在してもよい。一実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン（MH）配列を含む。別の実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-リジン（MHK）配列を含む。別の実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-アルギニン（MHR）配列を含む。さらなる実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-リジン-スレオニン（MHKT）配列を含む。別の実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-アルギニン-スレオニン（MHRT）配列を含む。別の実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-リジン-スレオニン-アラニン（MHKTA）配列を含む。別の実施形態において、導入されるアミノ酸は、メチオニン-ヒスチジン-アルギニン-スレオニン-アラニン（MHRTA）配列を含む。
標的SPの触媒3残基の1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができるものであれば、別のアミノ酸残基もまた導入することができる。MHKT配列を考慮する場合、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン又はアラニンをメチオニン及び／又はリジンの代わりに使用してもよいし、アルギニン又はチロシンをヒスチジンの代わりに使用してもよいし、並びに／あるいは、セリン又はアラニンをスレオニンの代わりに使用してもよい。
別の態様において、導入される1以上のアミノ酸残基はリンカー領域を含むものであってもよい。別の態様において、リンカー領域は、1以上のアミノ酸、例えばグリシン又はアラニンを含む。さらなる態様において、リンカー領域は、1、2、3、4又は5個のグリシン残基を含む。別の態様において、リンカー領域は、1、2、3、4又は5個のグリシン残基からなる。
本発明の態様では、標的SPがトロンビンである場合、改変型SPIの作製方法は、トロンビンのエキソサイトIと相互作用可能なペプチド配列の導入又は維持を含む。そのようなペプチド配列の維持とは、ペプチド配列が改変前にSPI配列中に既に存在すること、及びこの配列を改変により破壊又は除去しないことを意味する。
一態様において、トロンビンのエキソサイトIと相互作用可能なペプチド配列は以下の配列の1つを含む：
FEEIPEEYL;
YEPIPEEA;
NGDFEEIPEEYL; 又は
APPFDFEAIPEEYL。
本発明の方法のいずれかにより作製される改変型SPIは、非改変型SPIと比較して、標的SPの阻害の増大を示す。
当業者には理解されるように、種々のアッセイのいずれか1つを用いて、SP阻害の程度を決定し、その改変が標的SPの阻害を増大することを確認することができる。例えば、SPがトロンビンである場合、かかるアッセイはアミド分解アッセイであり、S2238の存在下での改変型トロンビンインヒビターとのトロンビンのインキュベーション後のp-ニトロアニリンの形成を検出する。
本発明の改変型SPIは、30nM未満、25nM未満、20nM未満、15nM未満、14nM未満、13nM未満、12nM未満、11nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、又は1nM未満のIC50を有するものである。本発明の方法により作製されるSPIは、15nM未満、10nM未満、5nM未満、1nM未満、750pM未満、500pM未満、400pM未満、300pM未満、250pM未満、200pM未満、150pM未満、100pM未満、50pM未満、30pM未満、25pM未満、20pM未満、15pM未満、10pM未満、5pM未満、1pM未満、又は100pM未満のKiを有するものである。
慣用的な直接的SPIは、標的SPにより切断されうる標的SPの活性部位に少なくとも結合し、そのため標的SPの基質と結合について競合し、標的SPを競合的に阻害することによって作用することが認容されている。このように作用するSPIの例はヒルログ-1である。そのような競合的阻害は有効な阻害メカニズムでありうるが、いくつかの欠点、特に阻害の一過性の性質と、SPIの迅速な減少に関する欠点がある。
J. Biol. Chem, 2007, 282(40) 29101-29113（Cho Yeow Koh, Maria Kazimirova, Adama Trimnell, Peter Takac, Milan Labuda, Patricia A. Nuttall, and R. Manjunatha Kini）に記載されているように、バリエジンは他の直接的SPIと同じように競合的インヒビターとして機能する。しかし、トロンビンによるバリエジンの切断の際に、MH22として知られるバリエジンの断片（配列番号3として示される）は、トロンビンに結合したままとなり、トロンビンの非競合的インヒビターとして機能する。これは、バリエジンの阻害能力を高め、他の直接的SPIの不利な点の一部を克服する。
トロンビンに結合したバリエジンの結晶構造を分析したところ、本発明者は驚くべきことにMH22がトロンビンの活性部位に結合することを見出した。これは、非競合的インヒビターが一般的には酵素の活性部位とは異なる部位に結合することから通常ではないものである。さらに、結晶構造により、トロンビンの触媒3残基の1以上の残基の変位に関与するバリエジンのヒスチジン残基がMH22配列の一部であり、またそれゆえこのバリエジン断片が、バリエジンの切断後にトロンビンの触媒3残基を破壊し、阻害の持続時間を増大させることが明らかとなった。
したがって、本発明の方法は、標的SPによる改変型SPIの切断後に標的SPに結合したままの改変型SPIを生じうる。このような改変型SPIは、阻害の持続時間の増大を示す。
「作用持続時間の延長」という用語は、標的SPの阻害持続時間が、非改変型SPIを用いた阻害の持続時間と比較して増大していることを意味する。一態様において、作用持続時間は、少なくとも2倍増大している。別の態様において、作用持続時間は、非改変型SPIを用いた阻害の持続時間と比較して、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、又はそれ以上増大している。改変型SPIによる阻害持続時間は、5分を超える、10分を超える、15分を超える、20分を超える、25分を超える、30分を超える、1時間を超える、2時間を超える、3時間を超える、4時間を超える、5時間を超える、6時間を超える、12時間を超える、1日を超える、2日を超える、3日を超える、又はそれ以上である。標的SPの阻害の程度を決定する方法は、上述したとおりである。
本発明の特定の態様では、上記の1以上の導入されるアミノ酸残基は、標的SPによる切断後の活性部位内に保持される改変型SPIの部分のアミノ末端に対して配置される。
「アミノ末端に対して」とは、1以上の導入される残基が、標的SPの切断後のSPIの保持される部分のアミノ末端の5アミノ酸以内にあることを意味することが意図される。いくつかの態様において、1以上の導入される残基は、標的SPによる切断後の活性部位内に保持される改変型直接的SPIの部分のアミノ末端の1残基以内、2残基以内、3残基以内、4残基以内又は5残基以内にある。
当業者には明らかなように、1以上の導入される残基が、標的SPによる切断後の活性部位内に保持される改変型直接的SPIの部分の「アミノ末端に対して」とするには、1以上の導入される残基は、改変型直接的SPIの切断部位の5残基以内となる必要がある。
一態様において、本発明の方法は、SPIを中和可能なようにする、さらなる又は別のSPIの改変ステップを含んでもよく、そのステップはSPIへのイオン電荷の領域の導入を含み、ここでイオン電荷の領域は中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なものであり、その結果、改変型SPIと中和剤との間で得られるイオン性相互作用が改変型SPIの阻害活性を中和し、それにより改変型SPIが標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子をもはや変位させないようにするものである。
バリエジンの配列及びトロンビンと結合したバリエジンの結晶構造から得られたデータに基づき、本発明者は驚くべきことに、バリエジンの阻害活性を中和可能であることを見出した。この中和メカニズムは、バリエジンのカルボキシ末端におけるイオン電荷の領域と、中和剤における逆のイオン電荷の領域とのイオン性相互作用の知見に基づいている。
バリエジンと中和剤とのイオン性相互作用は、バリエジンにおけるイオン電荷の領域とトロンビンにおける逆のイオン電荷の領域とのイオン性相互作用を破壊することにより、バリエジンの阻害活性を中和するようである。トロンビンと結合したバリエジンの構造分析から、トロンビンにおけるイオン電荷の領域がエキソサイト-I内にあると考えられる。
この情報により、他のSPIを、中和可能なように改変することができるようになる。上で論じたようなSPIの治療用途を考え、中和することが可能な改変型SPIは、顕著な治療上の利点を有する。
「中和することが可能な」とは、SPIの活性を、中和剤の添加により全体的に又は部分的に解消させることができること、すなわちSPの活性が中和剤の添加時に回復されることを意味する。この定義では、SP活性の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％又は100％が回復しうる。別の方法では、改変型SPIと標的SPとのイオン性相互作用の破壊後に、SPIの阻害活性の90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％が残りうる。
当業者には理解されるように、標的との結合により作用する大部分のインヒビター（例えば限定されるものではないが、競合的インヒビター）の作用は、結合インヒビターと未結合インヒビターとの間で生じる固有の平衡のためある程度は中和可能なものである。この平衡の位置は、未結合インヒビター寄りの平衡にバイアスがかかるように作用する特定の基質（本明細書中では「中和剤」と記載する）の添加時に変わり、それゆえインヒビターの阻害効果を解消する。しかし、「中和可能ではない（non-neutralisable）」インヒビターの場合には、この平衡は結合インヒビターに向かって大きくバイアスがかかり、中和剤の添加は平衡バランスを壊さない。図8は、バリエジンとトロンビンとの結合についての平衡スキームを示す。このスキームは、例示目的でのみ提供する。
本発明において、「中和」という用語は、平衡バランスを破壊する中和剤の添加によりもたらされた中和のみに関し、そのような固有の平衡の副産物である固有の中和に関するものではないことを意図している。
中和剤は、改変型SPIに導入されるイオン電荷の領域とは逆のイオン電荷の領域を有することによって改変型SPIの阻害活性を中和するよう機能する。改変型SPIと中和剤とのイオン性相互作用の形成は、改変型SPIにおけるイオン電荷の領域と標的SPにおける逆のイオン電荷の領域との間のイオン性相互作用の破壊を生じうる。標的SPにおけるイオン電荷の領域は、エキソサイトの1つ内に存在しうる。別の態様において、イオン電荷の領域はエキソサイト-I内に存在しうる。
本発明の一態様では、中和剤におけるイオン電荷の領域は、カチオン電荷の領域である。したがって、本発明のこの態様において、本発明の方法によりSPIに導入されるイオン電荷の領域は、アニオン電荷の領域である。本発明の別の態様において、標的SPにおけるイオン電荷の領域は、カチオン電荷の領域である。
SPIに導入されるイオン電荷の領域は、SPIのカルボキシ末端に対して導入することができる。「カルボキシ末端に対して」とは、導入されるイオン電荷の領域が、改変型SPIのカルボキシ末端の10アミノ酸以内に位置することを意味するものである。導入されるイオン電荷の領域は、改変型SPIのカルボキシ末端の1残基以内、2残基以内、3残基以内、4残基以内、5残基以内、6残基以内、7残基以内、8残基以内、9残基以内又は10残基以内に存在しうる。
中和剤はカチオン性物質であってもよい。そのようなカチオン性物質は、標的SPIにおけるアニオン電荷の領域との結合についてSPと競合して、改変型SPIの変位と、標的SPの阻害の喪失を生じうる。中和剤は、カチオン性ペプチド、例えば硫酸プロタミンなどでありうる。
SPIに導入されるイオン電荷の領域は、1以上の酸性残基を含んでもよい。1以上の酸性残基は、1、2、3、4、5又はそれ以上の酸性残基を含む。「酸性残基」という用語は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。1以上の酸性残基は、グルタミン酸（glutamine）残基及び／又はアスパラギン酸残基を含む。
導入されるイオン電荷の領域の具体例は、2個のグルタミン酸アミノ酸残基と2個のアスパラギン酸アミノ酸残基を含む。別の具体例では、導入されるイオン電荷の領域は、配列 glu-glu-X-X-asp-asp（式中、Xは任意のアミノ酸残基である）を含む。また別の例では、導入されるイオン電荷の領域は、配列 glu-glu-tyr-lys-asp-aspを含む。
一般論
本発明のいくつかの一般的な態様を記載する。このセクションに含まれる特徴及び方法は、上述した本発明の方法のいずれにも適用可能である。
先行するセクションに記載したように、本発明の方法は、SPIへの1以上の残基の導入を含む。一態様において、そのような導入される残基は、挿入により導入される。別の態様において、残基は置換により導入される。
置換又は挿入の方法は、当業者には明らかである。これには、例えば限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法、PCR突然変異誘発法、トランスポゾン突然変異誘発法、定方向突然変異誘発法、挿入突然変異誘発法、標的化突然変異誘発法、及び化学的タンパク質合成法などがある（Sambrook et al. (2000)）。
本発明の特定の態様では、SPIの改変方法は、1以上の追加ステップを含んでもよい。いくつかの実施形態において、1以上の追加ステップは、初期の追加ステップであり、これらのステップが改変方法の他のステップの前に行われることを意味する。
一態様において、本発明の方法は、SPIに対して行う改変を決定するためにSPIの構造を分析する追加ステップを含んでもよい。分析は、SPIのアミノ酸配列の分析及び／又はSPIの構造の計算機モデル化を含みうる。さらに又はあるいは、本方法は、SP又はSPに結合したSPIの構造の分析を含んでもよい。そのような構造は、結晶構造、赤外線スペクトル、円偏光二色性データ、紫外線スペクトル、NMR分光法、計算方法、例えば限定されるものではないが、分子力学、分子動力学及びドッキング、又は水素重水素交換、並びに質量分析などの形態でありうる。
分析は、SPIの改変方法に従って改変しようとする、SPとSPIとの相互作用に関与するSPIの領域の決定を含む。例えば、上述した標的SPの阻害を増大するためのSPIの改変方法は、標的SPの触媒3残基と相互作用するSPI中の残基を同定する最初のステップを含む。続いて触媒3残基と相互作用するアミノ酸残基を、触媒3残基の1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させるために、例えばこの位置におけるMHKT配列の導入により、改変する。
本発明は、SPIに対して行う改変を決定するために標的SPの構造を分析する追加ステップを含んでもよい。この分析は、SPIの改変方法に従って改変しようとする、標的SPとSPIとの相互作用に関与する標的SPの領域及び／又は残基の決定を含みうる。この分析は、結晶構造、赤外線スペクトル、円偏光二色性データ、紫外線スペクトル、NMRスペクトル又は計算方法からのデータの形態のSPの構造分析を含む。
上述した分析は、SPIの構造と、以前にその構造及び／又は機能が分析されている別のSPIの構造との比較を含んでもよい。そのような分析は、改変しようとするSPIと別のSPに関して生成されたデータのいずれに対しても実施することができる。特に、そのようなデータは、結晶構造、赤外線スペクトル、円偏光二色性データ又は紫外線スペクトル、及びNMRスペクトル又は計算方法からのデータから導き出される。
本発明のさらなる態様において、その構造及び／又は機能が以前に分析されているSPIはトロンビンインヒビターである。また本発明のさらに別の態様では、その構造及び／又は機能が以前に分析されているSPIはバリエジンである。
本発明の一態様では、本発明の方法により改変しようとするSPIはトロンビンインヒビターである。本発明の別の態様では、本発明の方法により改変しようとするSPIは、ヒルログ（配列番号14）、クニッツ/BPTI型インヒビター（例えばウシ膵臓トリプシンインヒビター、配列番号776に示される）、ヒルジン関連トロンビンインヒビター、セルピン、ヘパリン補因子、α1-抗トリプシン様セルピン、カザール型直接的インヒビター、及びクニッツ型/STI（ダイズトリプシンインヒビター）インヒビターからなる群より選択される。別の態様において、本発明の方法により改変しようとするSPIは、配列番号17〜153のいずれか1つである。
改変型SPI
本発明はまた、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型SPIを含む。
別の態様において、本発明は、任意の手段により得ることができる改変型SPIに関する。例えば、本発明の方法により得ることができる改変型SPIは、当技術分野で公知の任意の方法により製造することができる。本明細書に記載する改変型SPIを製造するために有用な技術の例としては、化学ペプチド合成、固相又は液相ペプチド合成、改変型SPIをコードする核酸分子からのin vitro翻訳、又は真核若しくは原核生物組換え発現系を用いる細胞に基づく製造方法がある。例示的な実施形態では、改変型SPIは、配列番号158〜770のいずれかに示される配列を含むポリペプチドである。そのような改変型SPI組成物は、以下に記載するように、本発明の方法、例えばSPの阻害方法などに用いることができる。本発明の一態様では、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型SPIは改変型トロンビンインヒビターである。
本発明の一態様では、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型SPIは、改変型の、ヒルログ（配列番号14）、クニッツ/BPTI型インヒビター（例えばウシ膵臓トリプシンインヒビター、配列番号776に示される）、ヒルジン関連トロンビンインヒビター、セルピン、ヘパリン補因子、α1-抗トリプシン様セルピン、カザール型直接的インヒビター、及びクニッツ型 /STI（ダイズトリプシンインヒビター）インヒビターである。別の態様において、本発明の方法により改変されるSPIは、配列番号17〜153のいずれかである。
本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型のヒルログは、以下のコンセンサス配列を含みうる：
(N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド) (配列番号771)。
一態様において、N末端ペプチドは、配列：フェニルアラニン、フェニルアラニン-プロリン、フェニルアラニン-プロリン-アルギニン、又はフェニルアラニン-プロリン、リジンを含む。
別の態様において、アミノ末端フェニルアラニン残基は、改変されたフェニルアラニン残基であってもよい。一例では、この改変残基はD-フェニルアラニン残基である。
一態様において、X1は任意のアミノ酸である。別の態様において、X1はメチオニン残基である。
一態様において、X2は任意のアミノ酸である。別の態様において、X2はリジン又はアルギニン残基である。
一態様において、nは、1以上のグリシンアミノ酸残基である。別の態様において、nは、2、3、4、5又はそれ以上のグリシンアミノ酸残基である。
一態様において、改変型SPIは、1以上の硫酸化アミノ酸残基を含む。別の態様において、SPIは1以上の硫酸化チロシン残基を含む。
一態様において、エキソサイトI結合ペプチドは、以下の配列の1つを含む：
FEEIPEEYL（配列番号772）;
YEPIPEEA（配列番号773）;
NGDFEEIPEEYL（配列番号774）;又は
APPFDFEAIPEEYL（配列番号775）。
エキソサイトI結合ペプチドは、1以上の酸性残基を含むイオン電荷の領域をさらに含んでもよい。1以上の酸性残基は、1、2、3、4、5又はそれ以上の酸性残基を含む。「酸性残基」という用語は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。1以上の酸性残基は、グルタミン酸（glutamine）残基及び／又はアスパラギン酸残基を含む。イオン電荷の領域は、2個のグルタミン酸アミノ酸残基と2個のアスパラギン酸アミノ酸残基を含む。イオン電荷の領域は、配列glu-glu-X-X-asp-asp（式中、Xは任意のアミノ酸残基である）を含む。また別の例では、イオン電荷の領域は配列 glu-glu-tyr-lys-asp-aspを含む。
一態様において、改変型SPIは、配列番号158〜770から選択される配列を含む。別の態様において、改変型SPIは、配列番号158〜770の1以上からなる。
本発明の改変型SPIは、化学的ペプチド合成により、組換えペプチド合成により、又は宿主細胞系を用いて製造することができる。
本発明はまた、既に記載したように、SPを阻害する増強した能力を保持する、本発明に係る改変型SPIの機能的等価物を含む。
一態様において、「機能的等価物」という用語は、本発明の方法に従って作製される改変型SPIに対して少なくとも50％の配列同一性を有するペプチド分子を包含することを意図している。別の態様において、機能的等価物は、本発明の方法に従って作製される改変型SPIに対して、60％、70％、85％、90％、95％、98％、99％又はそれ以上の配列同一性を有するものである。かかる機能的等価物は、既に記載したように、標的SPを阻害する増強した能力を保持していることが好ましい。
「機能的等価物」という用語はまた、本発明の改変型SPIと比較した場合に、1以上の保存的置換を含む任意のポリペプチドを包含する。一態様において、ポリペプチドは、1以上の保存的置換を含む。別の態様において、ポリペプチドは、本発明の改変型SPIと比較して、2以上、3以上、4以上、又は5以上の保存的置換を含む。保存的置換は、置換されたアミノ酸の特性が、その位置に通常見出されるアミノ酸とは実質的に異なることのないアミノ酸置換である。保存的置換には、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸への置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸への置換、非荷電アミノ酸の別の非荷電アミノ酸への置換、非極性アミノ酸の別の非極性アミノ酸への置換、小さなアミノ酸の別の小さなアミノ酸への置換、又は嵩高いアミノ酸の別の嵩高いアミノ酸への置換が挙げられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリジンである。非荷電アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンである。非極性側鎖は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、及びシステインである。非極性アミノ酸のカテゴリー内では、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びグリシンが小さなアミノ酸とみなされ、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンが嵩高いアミノ酸とみなされる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法に従って作製されるSPIの断片を含む。別の態様において、断片は2以上のアミノ酸を含む。別の態様において、断片は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45又は50個のアミノ酸を含む。別の態様において、断片は、2以上のアミノ酸からなる。別の態様において、断片は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45又は50個のアミノ酸からなる。かかる断片は、既に記載したように標的SPを阻害する増強した能力を保持する。
別の態様において、機能的等価物は、例えば、異種タンパク質配列のコード配列とインフレームにある本発明の改変型SPI又はその変異体若しくは断片をコードするポリヌクレオチドのクローニングによって得られる、融合タンパク質であってもよい。用語「異種」は、本明細書で使用する場合、改変型SPI又はその機能的等価物以外の任意のポリペプチドを指すものとする。N末端又はC末端のいずれかに融合タンパク質を含む異種配列の例は、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域(Fc領域）、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、輸送配列、又はアフィニティクロマトグラフィによる精製を可能にする配列である。発現プラスミドにおける多くのこれらの異種配列は市販されている。これらの配列は、それらと融合するタンパク質の特異的生物活性を著しく害さずに追加の性質を与えるために、融合タンパク質中に一般に含まれるためである（Terpe (2003)）。このような追加の性質の例は、体液中で長時間持続する半減期、細胞外局在、又はヒスチジン若しくはHAタグなどのタグによって可能となるさらに容易な精製手法である。
異種タンパク質はマーカードメインであってもよい。一態様において、マーカードメインは蛍光タグ、アフィニティ結合による精製を可能にするエピトープタグ、組織化学的若しくは蛍光標識を可能にする酵素タグ、又は放射化学的タグとすることができる。別の実施形態では、マーカードメインは放射化学的タグとすることができる。このような融合タンパク質は診断ツールとして有用であり得る。
融合タンパク質を作製するための方法は当技術分野における標準的な方法であり、当業者には知られているはずである。例えば、最も一般的な分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学的技法は、Sambrook et al. (2000)中で見ることができる。一般に融合タンパク質は、2つの核酸配列がインフレームで一緒に融合した核酸分子から組換えによって最も好都合に生成することができる。これらの融合タンパク質は、対象となる融合タンパク質の対応するコード配列を含有する核酸分子によってコードされ得る。
一態様において、本発明に係る改変型SPの機能的等価物は、標的SPの触媒3残基の残基の1つを変位するのに好適な部分を含む任意の分子を含む。一態様において、この分子はタンパク質分子とすることができ、触媒3残基の残基の1つを変位させるのに好適な部分はアミノ酸残基でありうる。当業者には理解されるように、この定義は、個々に任意の残基を包含することはできない。なぜなら、この残基は、触媒3残基の残基の1つを変位させるのに好適な配向及び位置に標的SPの触媒3残基の残基の1つを変位させるのに好適な残基を配置させるために、別の残基を存在させる必要があるためである。一態様において、機能的等価物は、標的SPの触媒3残基の残基の1つを変位させるのに好適なように配置され配向された、タンパク質分子内のヒスチジン残基を含みうる。本発明はまた、上述した改変型SPIの合成類似体を含む。
本発明の方法に従って作製される改変型SPIの断片又は機能的等価物は、SPIとして機能することができる。「SPIとして機能することができる」とは、断片又は機能的等価物がSPのSP活性を阻害することができることを意味する。さらなる態様において、断片又は機能的等価物は、標的SPのSP活性を阻害可能なものである。
当業者には理解されるように、種々のアッセイを使用して、断片又は機能的等価物がSPIとして機能することができるか否かを評価することができる。例として、限定されるものではないが、かかるアッセイは、上述したようにSPアミド分解アッセイであり、これはS2238の存在下における改変型SPIとの標的SPのインキュベーション後のp-ニトロアニリンの形成を検出するものである。本発明の改変型SPIは、そのようなSPアミド分解アッセイで評価した場合に、30 nM未満、25 nM未満、20 nM未満、15 nM未満、14 nM未満、13 nM未満、12 nM未満、11 nM未満、10 nM未満、9 nM未満、8 nM未満、7 nM未満、6 nM未満、5 nM未満、4 nM未満、3 nM未満、2 nM未満又は1 nM未満のIC50を有する。本発明の方法に従って作製されるSPIは、そのようなSPアミド分解アッセイで評価した場合に、15 nM未満、10 nM未満、5 nM未満、1 nM未満、750 pM未満、500pM未満、400pM未満、300 pM未満、250 pM未満、200 pM未満、150 pM未満、100 pM未満、50 pM未満、30 pM未満、25 pM未満、20 pM未満、15 pM未満、10 pM未満、5 pM未満、1 pM未満又は100 pM未満のKiを有する。
一態様において、本発明は、本発明の方法に従って作製される改変型SPIをコードする核酸分子を含む。別の態様において、本発明は、本発明の方法に従って作製される改変型SPIをコードする核酸分子に対して少なくとも50％の配列同一性を有する核酸分子を含む。別の態様において、本発明は、本発明の方法に従って作製される改変型SPIをコードする核酸分子に対して、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸分子を含む。本発明はまた、本発明の方法に従って作製される改変型SPIをコードする核酸分子の断片を含む。一態様において、該断片は、10以上のヌクレオチドを含むものである。別の態様において、断片は、12以上、14以上、16以上、18以上、10以上、25以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、又は100以上のヌクレオチドを含む。
本発明に係る核酸分子は、任意の形態、例えば二本鎖及び一本鎖のRNA、DNA及びcDNAでありうる。
さらなる態様において、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて本発明の核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含む。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミド、5XSSC（150 mM NaCl、15 mMクエン酸三ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5Xデンハルト溶液、10％硫酸デキストラン及び20μg/ml変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中で42℃での一晩インキュベーションと、その後の0.1X SSC中の約65℃でのフィルターの洗浄と本明細書では定義される。
本発明は、本発明の核酸分子を含むクローニング及び発現ベクターも含む。このような発現ベクターは、本発明の核酸分子とインフレームで連結した、適切な転写及び翻訳制御配列、例えば限定されるものではないが、エンハンサーエレメント、プロモーターオペレーター領域、ターミネーター（termination）停止配列、mRNA安定配列、開始及び停止コドン又はリボソーム結合部位を含むことができる。さらに、特定宿主から本発明の改変型SPIを分泌させることが好都合である可能性がある。したがって、このようなベクターのさらなる構成要素は、分泌、シグナル及びプロセシング配列をコードする核酸配列を含むことができる。
本発明に係るベクターには、プラスミド及びウイルス(バクテリオファージと真核生物ウイルスの両方を含む）、並びに他の直線状又は環状DNAキャリア、例えば転位性エレメント（transposable element）又は相同的組換え技術を利用するものなどがある。多くのこのようなベクター及び発現系は当業者には明らかである。特に適切なウイルスベクターには、バキュロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルス系ベクターがある。
組換え発現に適した宿主には、高レベルの組換えタンパク質を発現させることが可能であり容易に大量増殖することが可能である、大腸菌などの一般に使用される原核生物種、又は真核生物酵母がある。特にウイルス誘導性発現系を使用する場合、in vitroで増殖した哺乳動物細胞系も適切である。別の適切な発現系は、宿主として昆虫細胞の使用を含むバキュロウイルス発現系である。発現系は、それらのゲノム中に組み込まれたDNAを有する宿主細胞も構成し得る。タンパク質、又はタンパク質断片はin vivo、例えば昆虫幼虫中又は哺乳動物組織中で発現させることも可能である。
原核又は真核細胞中にベクターを導入するために、様々な技法を使用することができる。適切な形質転換又はトランスフェクション技法は文献中に十分記載されている（Sambrook et al. (2000)）。真核細胞中では、発現系はその系の必要性に応じて一過性（例えばエピソーム性）又は永続性（染色体への組込み）であってよい。
治療方法
本発明はさらに、治療における、本発明の方法に従って得ることができる又は得られた改変型SPIの使用をさらに含む。
本使用及び方法はまた、任意の手段により得られた改変型SPIを用いて実施することも可能である。
本発明は、被験者に本発明の分子を投与することを含むSPの阻害方法を含む。
「本発明の分子」とは、本発明の方法に従って得ることができる又は得られた改変型SPI、本発明の方法に従って得ることができる又は得られた改変型SPIをコードする核酸、本発明の方法に従って得ることができる又は得られた改変型SPIをコードする核酸を含むベクター、及び本発明の方法に従って得ることができる又は得られた改変型SPIをコードする核酸を含むベクターを含有する宿主細胞を意味する。「本発明の分子」はまた、本発明の方法によって得られることができる改変型SPIであって、任意の手段により製造される改変型SPIを包含する。したがって、本発明の改変型SPI分子は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば化学ペプチド合成、固相又は液相ペプチド合成、改変型SPIをコードする核酸分子からのin vitro翻訳、又は真核若しくは原核生物組換え発現系を用いる細胞に基づく製造方法を用いて製造することができる。例示的な実施形態では、「本発明の分子」には、配列番号158〜770のいずれかに示される配列を含むポリペプチドが含まれる。そのような改変型SPI分子を、本発明の方法、例えば本明細書に記載する任意の治療方法において用いることができる。
被験者は一般的には動物である。「動物」という用語は、動物界のメンバーとして分類されるあらゆる生物を包含する。一般的には、動物は、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、ハムスター及びウサギなどである。
本方法は、本発明の分子を治療上有効な量で投与することを含む。用語「治療上有効な量」は、標的疾患又は状態を治療又は改善するのに必要とされる化合物の量を指す。本明細書で使用する用語「予防上有効な量」は、標的疾患又は状態を予防するのに必要とされる化合物の量を指す。正確な用量は一般に、投与時の被験者の状態に応じて異なるはずである。用量決定時に考慮され得る要因には、被験者における疾患状態の重度、被験者の一般的健康状態、年齢、体重、性別、食生活、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ、反応感受性及び治療に対する被験者の耐容性又は応答性がある。正確な量は通常の実験によって決定することができるが、結局は臨床医又は獣医の判断内に存在し得る。一般に、有効な用量は0.01mg/kg（被験者の重量と比較した薬物の重量）〜50mg/kg、好ましくは0.05mg/kg〜10mg/kgとなりうる。本発明の分子は、製薬上許容される担体と併せて医薬組成物の形で供給することができる。
本明細書で使用する用語「製薬上許容される担体」は、賦形剤自体が毒性作用を誘導せず、又は医薬組成物を与える個体に有害な抗体の産生を引き起こさないという条件で、遺伝子、ポリペプチド、抗体、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及び不活性ウイルス粒子又は実際は任意の他の作用物質を含む。製薬上許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの液体、又は例えば湿潤化剤若しくは乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質をさらに含有することができる。賦形剤は医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤に製剤化して、被験者による摂取を容易にすることができる。製薬上許容される担体の詳細な議論はRemington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991）において入手可能である。
一実施形態において、本発明は、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型トロンビンインヒビターを含む治療方法を提供する。
本発明は、血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型トロンビンインヒビターを投与することを含む方法を含む。
本発明はまた、血液凝固障害に罹患している被験者の治療又は血液凝固障害の発症からの被験者の予防に使用するための、本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型トロンビンインヒビターを含む。
「血液凝固障害」とは、血液凝固のあらゆる障害を意味する。
抗凝固が望ましい場合の治療は、診断上又は治療上の理由での経皮的、経血管的又は経器官的カテーテル挿入を行う手法を含む。このような手法は、限定されるものではないが、冠動脈血管形成術、血管内ステント手法、脳卒中又は冠動脈血栓症後などの動脈又は静脈カテーテルを介した血栓溶解剤の直接投与、電気的除細動、心臓ペースメーカーリードの配置、血管内及び心臓内圧のモニタリング、ガス飽和又は他の診断パラメータ；長期、留置、血管内非経口栄養カテーテルの開存性を保証するため、長期又は短期であれ血管アクセスポートの開存性を保証するための、経皮的又は経器官的カテーテル挿入を行う放射線及び他の手法を含み得る。
本発明の方法の追加のin vivo用途には、限定されるものではないが、急性心筋梗塞、血栓性脳卒中、深部静脈血栓症、血栓性静脈炎、肺塞栓症、原因が心臓、動脈硬化性プラーク、人工弁若しくは人工血管又は未知の原因であり得る塞栓及び微小塞栓の出現、播種性血管内凝固症候群(DIC）を含めた、血栓塞栓性事象後の緊急抗凝固がある。
心肺バイパス法、肝臓バイパス法中などの臓器かん流手法中の凝固を予防するため、及び臓器移植の補助として、本発明の方法を使用することもできる。心肺バイパス法によって引き起こされる大量血栓反応を、ヘパリン及びその類似体などの間接的トロンビンインヒビターによって完全に中和することはできない（Edmunds & Colman (2006)）。
抗凝固が望ましい場合のさらなる例には、血液透析、血液濾過又は血漿交換手法中がある。末端循環中の凝固のリスクを最小にするための血管の遮断を行う外科手術中に、抗凝固が望ましい可能性がある。このような手法は、限定されるものではないが、動脈内膜切除、人工血管の挿入、大動脈及び他の動脈瘤の修復を含み得る。
さらに、本発明の方法及び本発明によって得ることができる又は得られた改変型トロンビンインヒビターは、ヘパリン耐性被験者中で抗凝固を誘導するのに有用である可能性がある。
本発明の方法及び本発明の方法により得ることができる又は得られた改変型トロンビンインヒビターは、ヘパリン起因性血小板減少症の治療又は予防において有用である可能性もある。このような治療はHITを有するか又はそのリスクがある被験者、及び活性血栓形成が有るか又は無い被験者に施すことができ、血小板数が正常の範囲内に回復するまで、又は血栓形成のリスクが消失するまで施すことができる(Girolami & Girolami (2006)、Lewis & Hursting (2007))。
本発明の分子は任意の適切な経路によって投与することができる。好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内又は皮下注射、経口投与、舌下投与及び経皮投与がある。治療は静脈内注入によって、又は単回若しくは反復ボーラス注射として連続的に施すことができる。本発明の分子は被験者に個別に投与することができ、又は他の作用物質、薬剤若しくはホルモンと併せて投与することができる。例えば、本発明の分子は、被験者が安定状態になるような時間まで、クマリン誘導体などの経口抗凝固剤と共に投与することができ、その後、被験者をクマリン誘導体単独で治療することができる。
本発明は、本発明の方法により作製される改変型SPIを診断に使用することができることをさらに示す。これらの方法は標的SPとの相互作用によって特異的にSP活性を阻害することを含むので、これらを使用して標的SPの存在を検出することができ、したがってトロンビンの蓄積により引き起こされるフィブリン血栓又は血小板血栓などのSP蓄積により引き起こされる状態を診断することができる。したがって本発明は、被験者又は被験者から単離した組織に上記の本発明の改変型SPIを投与し、該SPI又はその断片若しくは機能的等価物の存在を検出することによる、SP蓄積により引き起こされる状態を診断する方法を提供するものであり、標的SPと結合した改変型SPI又はその断片若しくは機能的等価物の検出は該疾患又は状態を示すものである。改変型SPI又はその機能的等価物は、検出を容易にするために、上でより詳細に記載したマーカードメインを含む融合タンパク質の形態であってもよい。一態様では、既知の画像化法を使用して検出を実施することができるように、マーカードメインは放射化学的タグとすることができる。
本発明のさらなる態様において、本発明のin vivo法を使用して、悪性疾患又は悪性疾患に関連する状態を治療することができる。
悪性疾患は、SPトロンビンレベルの増大により引き起こされる、血栓塞栓症事象の傾向の増大に関連することが多いことは、数十年来認められている。例えばトルソー症候群は、一時的な血栓性静脈炎及び原発性悪性腫瘍を特徴とし、ヘパリンなどのトロンビンインヒビターはその管理において使用されている（Varki (2007)）。より近年、トロンビンを含めた凝血促進因子の生成は、悪性疾患の特定の態様の結果ではなく原因である可能性があることが明らかとなっている（Nierodzik & Karpatkin (2006)）。
SPを阻害して、続いてかかる阻害を中和することが望ましい事例は多くある。例として、限定されるものではないが、かかる阻害及び中和は、手術中に利点があり、手術を行う際にはトロンビン誘導性凝固を阻止するために標的SPの阻害が必要であり、手術終了時には創傷治癒が可能なように阻害の逆転が有利である場合である。
SPIがトロンビンインヒビターである場合、トロンビン活性は、カチオン性ペプチド、例えば硫酸プロタミンの投与により中和することができる。したがって、本明細書に記載のトロンビン阻害に関する治療方法のいずれかは、被験者にある量のカチオン性ペプチドを投与して、トロンビン阻害の中和を生じさせる追加のステップを記載する。一態様において、投与されるカチオン性ペプチドの量は、0.01 mg/ml〜1 mg/mlである。別の態様において、投与されるカチオン性ペプチドの量は、0.01 mg/ml以上、0.02 mg/ml以上、0.03 mg/ml以上、0.04 mg/ml以上、0.05 mg/ml以上、0.06 mg/ml以上、0.07 mg/ml以上、0/08 mg/ml以上、0.09 mg/ml以上、0.1 mg/ml以上、0.11 mg/ml以上、0.12 mg/ml以上、0.13 mg/ml以上、0.14 mg/ml以上、0.15 mg/ml以上、0.16 mg/ml以上、0.18 mg/ml以上、0.19 mg/ml以上、0.2 mg/ml以上、0.3 mg/ml以上、0.4 mg/ml以上、0.5 mg/ml以上、又は1 mg/mlである。
本発明の様々な態様及び実施形態を、実施例によってより詳細に記載する。本発明の範囲から逸脱することなく詳細の変更を行いうることが理解されよう。
本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これらの実施例を限定的なものとして解釈すべきではない。本出願全体を通じて引用されるすべての参照文献、特許及び公開特許出願の内容は、本明細書に参照として組み込むものとする。
実施例全体を通じて、以下の例及びパラメーターの定義を用いる：
V = (VmaxS) / (S + Km)
（Vは、反応の初期速度であり、Sは基質S2238の濃度であり、Kmは、酵素（トロンビン）の基質のミカエリス・メンテン定数である）。
y = A2 + (A1 - A2) / [1 + (x / x0)H]
（yは、阻害率（％）であり、A2は、右側の水平漸近線であり、A1は、左側の水平漸近線であり、xは、インヒビター濃度のlog10であり、x0は、変曲点であり、Hは、曲線の傾きである。IC50は、「50」をyに代入することにより計算した。
Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}
（Vsは、インヒビターの存在下で定常状態速度であり、Voは、インヒビターの非存在下で観測される速度であり、Etは、全酵素濃度であり、Itは、全インヒビター濃度であり、Ki'は、見かけ上の阻害定数である）。
Ki' = Ki (1 + S/Km)
（Ki'は、Sと共に線形増加し、Kiは、阻害定数であり、Sは基質の濃度であり、Kmは、S2238のミカエリス・メンテン定数である）。
Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)]
（αは基質に対する酵素の親和性に関するインヒビターの変更定数であり、これはまた、インヒビターについての酵素の親和性に対する基質の影響を示す）。一方の結合が他方を支持するとき、α＜1であり、一方の結合が他方を妨害するとき、α＞１であり、α = 1のとき、一方の結合は、他方に全く影響しない。混合型の非競合インヒビターの場合、α＜1又はα＞1のいずれかである。
Ki' = Ki
（Ki'は、Sが増加しても一定のままであり、Kiは阻害定数であり、Sは基質S2238の濃度であり、Kmは、S2238のミカエリス・メンテン定数である）。
P = Vft + (Vi - Vf) (1 - e-kt) / k + Po
k = K4 + K3It / [It + Ki`(1 + S / Km)]
（Kiは、全体の阻害定数である）。
Ki = Ki` [K4 / (K3 + K4)]
（Pは、形成された産物の量であり、P0は、産物の初期量であり、Vｆは最終定常状態速度であり、Viは初期速度であり、tは時間であり、kは見かけ上の一次速度定数である）。
［実施例１］
トロンビンに結合したs-バリエジンの結晶構造の決定
材料
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）、HEPESナトリウム塩及びポリエチレングリコール（PEG）8000は、Sigma Aldrich（セントルイース、ミズーリ州、米国）製であった。結晶化トレイ及びグリースは、Hampton Research（アリソビエホ、カリフォルニア州、米国）から購入した。
ペプチドの合成、精製及び質量分析
研究で用いられるすべてのペプチドは、Applied Biosystems Pioneer Model 433A Peptide Synthesizer（フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）の固相ペプチド合成方法を用いて合成した。合成されたペプチドは、それぞれのC末端アミノ酸をプレロードした支持体樹脂上に集合させたが、これは開裂して、C末端で遊離カルボン酸を有するペプチドを放出する。アミノ酸のFmoc基を、DMF中の20％v/vピペリジンによって除去した後、in situ中和化学においてHATU/DIPEAを用いてカップリングさせた。樹脂及び側鎖保護基からの合成ペプチドの切断は、室温で2時間 TFA/1,2-エチレンジチオール/チオアニソール/水（90:4:4:2％ v/v）のカクテルを用いて典型的に実施した。開裂したペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿ペプチドを、水又は0.1％TFAのいずれかに溶解させ、凍結乾燥した後、精製した。
合成粗ペプチドは、SunFireTM C18（100Å、5μm；250 mm x 10 mm）（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ)カラムを用いたAKTATM精製装置（GE Healthcare、ウプサラ、スエーデン）のRP-HPLCにより均質になるまで精製した。典型的には、2つの溶媒（溶媒A：水中0.1％TFA、及び溶媒B：水中0.1％TFA及び80％アセトニトリル）の組合せによって形成される最適化線形溶離勾配を用いて、ペプチドを溶出した。
留意すべきは、ペプチドはスルホチロシンを含有しており（DV24Ysulf、DV24K10RYsulf及びMH18Ysulf）、その硫酸基が、酸に対し不安定であることである。これらペプチドの切断は、すでに記載されている（Kitagawaら、2001）ように90％TFA水溶液を用いて氷上で5時間にわたって実施した。スルホチロシンを含有するペプチド（DV24Ysulf、DV24K10RYsulf及びMH18Ysulf）及びホスホチロシンを含有するペプチド（DV24Yphos 及びDV24K10RYphos）の精製を、イオン対試薬としてTFAではなく、0.1％FAを含む溶媒を用いて実施した。Tyr27の硫酸部分は、質量分析におけるイオン化の間不安定であるため、非硫酸化質量を観察した。硫酸化ペプチドの識別は、以下：（1）ペプチドの非硫酸化質量；（2）280 nmでUVを吸収するチロシン残基とは反対に、スルホチロシン残基は吸収しないこと；（3）硫酸化及び非硫酸化ペプチドはRP-HPLCにおいて共溶出しないこと、に基づいて実施した。
トロンビン
2つの異なるトロンビン源、すなわち、組換えαトロンビン（ヒトαトロンビン配列に基づく）とヒト血漿由来のトロンビンはいずれも、Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute（KAKETSUKEN、日本）から無償で提供されたものである。組換えαトロンビンは、20 mM重炭酸アンモニウム（NH4HCO3）中でHiTrap（商標）脱塩カラム（GE Healthcare, ウプサラ、スエーデン）で脱塩してから、凍結乾燥した後、結晶化のために用いる。ヒト血漿由来のトロンビンを用いて、ペプチドのトロンビン阻害活性をアッセイした。
トロンビン-s-バリエジン複合体の結晶化
ヒトαトロンビンのトロンビン-ヒルゲン複合体及びトロンビン-ヒルログ-1複合体を結晶化するために用いられる、報告された結晶化条件（Skrzypczak-Jankunら、1991）を変更し、最適化した。凍結乾燥したs-バリエジンを、375 mM NaCl含有50 mM HEPESバッファー（pH 7.4）中に、8.34μM（3 mg/ml）の濃度まで溶解させた。脱塩し、凍結乾燥した組換えαトロンビンを、次いでs-バリエジン溶液中に最終濃度5.56μM（20 mg/ml）まで溶解させた。上記の混合物中のs-バリエジンの量は、トロンビンの1.5倍過剰であった。トロンビン-s-バリエジン複合体の結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて達成した。典型的には、1μlのタンパク質溶液を1μlの沈殿剤バッファー（20〜25％（w/v）PEG8000を含む100 mM HEPESバッファー（pH 7.4））と混合し、1mlの沈殿剤バッファーに対して4℃で平衡させた。結晶は、約4週間後に現れ、その2週間後にデータ収集のために回収した。結晶は室温では不安定であるため、結晶の準備、成長及び回収の全工程を冷蔵室（4℃）において実施した。
データ収集
データ収集の前に、結晶を、25％（v/v）グリセロールを添加した母液を含む凍結防止剤溶液中に短時間浸漬させた後、窒素（気体）冷気流（Cryostream cooler、Oxford Cryosystem、オックスフォード、英国）で100Kで瞬間冷却した。シンクロトロンデータをBeamline X29（National Synchrotron Light Source、ブルックヘブン、米国）で測定した。データセットは、Quantum 4-CCD検出器を用いて収集した（表１）。回析データを、プログラムHKL2000（Otwinowski及びMinor、1997）を用いて処理した。結晶は、単斜晶系空間群C2に属し、a = 124.66Å、b = 50.83Å、c= 61.54Å及びV = 385390.59 Å3 Da-1で、2.7Å分解まで回析したところ、溶媒含有率59.09％と一致した。
構造解及び精密化
トロンビン-s-バリエジン複合体の構造を、MolRepプログラム（Vagin及びTeplyakov、2000）を用いて分子置換法により解いた。トロンビン-ヒルログ-3構造の座標（PDBコード1ABI）（Qiuら、1992）を検索モデルとして用いた。ローテーション検索では、1つのトロンビン-ペプチド複合体分子を非対称単位に配置した。翻訳成分を決定した後の剛体の精密化により、相関係数0.60及びR = 0.48が得られた。得られた電子密度マップは高品質であった。フーリエ及び差フーリエマップは、明らかにs-バリエジンの電子密度を示していた。プログラムOバージョン7.0（Jonesら、1991）を用いたマップフィッティングと、プログラムCNSバージョン1.1（Brungerら、1998）を用いた精密化の複数のサイクルにより、R値の収束がもたらされる。結晶学及び精密化統計学を表１に記載する。該モデルの立体化学の正確さをPROCHECK（Ladkowsiら、1993）によって確認した。オンラインサーバーPISA（Krissinel及びHenric、2007）を用いて、上記タンパク質を分析した（図２）。
Figure 2012525836
Figure 2012525836
［実施例２］
トロンビンによる切断後のバリエジンの非競合インヒビターの作製
材料、トロンビン、合成の方法、ペプチドの精製及び質量分析は、実施例１に記載の通りである。
切断のRP-HPLC分析
ペプチドを、100 mM NaCl及び1 mg/ml BSAを含む50 mM Trisバッファー（pH 7.4）中で組換えαトロンビンと一緒にいずれも室温でインキュベートした。トロンビンを含まない反応混合物を対照として調製した。様々なインキュベーション時間後、反応物を0.1％TFAバッファー（pH 1.8）でクエンチし、AKTATM精製装置に取り付けたSun
Fire（商標）C18カラムにロードした。両対照反応混合物及び0分インキュベーションのクロマトグラムに存在するもの以外の新たなピークを切断産物として特定し、これらをESI-MSに付すことにより、その質量を確認した。上記ピークを積分して、ピーク下面積、及び各ピークの相対割合（％）を計算することにより、切断の程度を決定した。
トロンビンによるペプチドの切断
バリエジンは、トロンビン活性部位と正準結合すると仮定されているため、他のセリンプロテアーゼインヒビターと同様に、トロンビンによって切断されうると考えられる（Wittingら、1992；Bode及びHuber, 1992）。従って、本発明者らは、トロンビンによるs-バリエジンの切断と、ペプチド活性に対するその影響を調べた。RP-HPLC分析から、s-バリエジンは、実際に37℃及び室温（約25℃）の両方でトロンビンによって切断されたことがわかった。0分のインキュベーションでは、全長s-バリエジン及びトロンビンに対応するピークのみが存在した。切断産物の2つの新しいピークが現れ、これらは、インキュベーション時間が長くなるにつれ増大した（図３）。上記の新しいピークは、質量がそれぞれ1,045 Da（SDQGDVAEPK；配列番号２）及び2,582 Da（MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES; MH22；配列番号３）であったが、これは、Lys10-Met11ペプチド結合での切断に一致する。切断は、25℃（図３Ｂ）より37℃（図３Ａ）の方が、進行が速かった。
切断産物MH22によるトロンビンアミド分解活性の阻害
バリエジン切断産物が、実際にその持続的活性の原因であるかどうかを試験するために、切断のC末端断片（MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES；MH22；配列番号３）を合成した。X線回析によって得られたトロンビン-バリエジン構造からの予備データは、MH22が切断後にトロンビンに結合することを示唆していたため、上記の断片を最初に選択した。
MH22の阻害定数Ki
基質としてS2238を用いて、MH22の阻害定数Kiを決定した。MH22は、高速かつ密着結合のインヒビターである。見かけ上の阻害定数であるKi'は、式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki'Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}を用いて、様々な濃度のS2238の存在下で決定した。S2238の濃度が増加するにつれて線形増加するKi'（式：Ki' = Ki (1 + S/Km)に示されるように）を有するs-バリエジンとは異なり、MH22のKi'値は、S2238濃度が変化しても、一定のままであった。上記曲線の挙動は、α= 1である、競合的阻害を表す式(式Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)]を用いて)と一致しており、従って、Ki' = Kiである（式Ki' = Kiに示されるように）。線形回帰によるKi'値のあてはめにより、Kiについて14.11 ± 0.29 nMの値が得られた（図７）。s-バリエジンは、ヒト血漿由来のトロンビンでアッセイしたところ、0.318 ± 0.020 nMのKiを示した（組換えαトロンビンのKiは0.146 ± 0.014 nMであった）。従って、全長ペプチドs-バリエジンは、競合インヒビターであり、その切断産物MH22は、トロンビン活性部位機能の非競合インヒビターである。
MH22は、等モル濃度（約15％）でトロンビンアミド分解活性を阻害した。そして、阻害の進行曲線は、定常状態平衡が混合時に達成されたことを示した。従って、s-バリエジン同様、MH22は、高速かつ密着結合のインヒビターである。用量応答曲線は、IC50値：11.46 ± 0.71 nMを示した（図５）。ヒト血漿由来のトロンビンのs-バリエジン阻害は、IC50値：8.25 ± 0.45 nMを有し（図５）、組換えαトロンビンの値（5.40 ± 0.95 nM）よりやや高かった（データは示していない）。
MH22は、トロンビンを非競合的に阻害することが明らかにされた。典型的には、非競合インヒビターは、酵素活性部位から遠い部位に結合し、アロステリックに活性部位機能を阻害する。しかし、MHKTテトラペプチドは、切断可能な結合のすぐ後に位置する。直観的にいえば、このセグメントとトロンビンの結合は、上記活性部位内で起こるようだ。該実験に用いた基質、S2238は、化学構造：D-Phe-ピペコリル-Arg-pNAを有し、そのArg側鎖は、トロンビンS1サブサイトに挿入されており、Arg-pNAの間で切断が起こる。pNA部分はまた、アミド分解中、切断可能な結合のすぐ近傍でS1'も占有していることから、理論上、その存在は、同じ部位とMH22の結合を妨害するはずである。上記の場合、αは、＞１のはずであり（式：Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)]を用いて）、基質濃度に対するKi'のプロットは、基質の濃度が増加するにつれ、双曲線で増加するはずである（Copeland、2000）。このタイプの非競合阻害は、一般に「混合型阻害」と呼ばれる。しかし、本発明者らの実験条件下では、見かけ上の阻害定数Ki'は、基質濃度が変化しても厳密に一定のままであった。従って、MH22は、古典的な非競合インヒビター（遊離トロンビン、及び同じ親和性を有するトロンビン-基質複合体の両方に結合する）として作用する（図８）。同じ重要性で、pNAがMH22結合を妨害するという想定は維持できない。従って、トロンビンへのMH22及びpNAの結合部位は重複しておらず、これは切断可能な結合のすぐ後の残基（Met11）は、トロンビンに結合しないか、あるいは、一般に観察されるS1’以外の別の部位に結合することを示している。
［実施例３］
バリエジン変異体の設計及び特性決定
13の新しいバリエジン変異体が、トロンビン-s-バリエジン構造、並びにトロンビン相互作用に関して入手可能な背景情報に基づいて設計された。一般的手法は、最初にバリエジンの長さを最適化した後、バリエジン上の複数の重要な位置を最適化することにより、トロンビンとの最大の相互作用を取得するものであった（図１２）。
［実施例４］
トロンビン阻害活性
s-バリエジン（配列番号１）、EP25（配列番号６）、MH22（配列番号３）及びヒルログ-1（配列番号１４）の活性を、S2238に対するトロンビンアミド分解活性を阻害する能力によってアッセイした。
各ペプチドの活性は、発色基質S2238を用いてアッセイした組換えαトロンビンアミド分解活性の阻害によって決定した。アッセイはすべて、室温で100 mM NaCl及び1 mg/ml BSAを含む50 mM Trisバッファー（pH7.4）中で96ウェルマイクロプレートにおいて実施した。典型的には、100μlのペプチドと100μlの組換えαトロンビンを様々な時間にわたってプレインキュベートした後、100μlのS2238を添加した。各実験の詳細は、得られた結果を表すグラフと一緒に記載する。着色産物pNAの形成速度を、SPECTRAMax Plusマイクロプレート分光光度計により405 nmで10分にわたって追跡した。インヒビターの非存在下での吸光度の増加率を0％とみなすことによって、阻害割合（％）を計算した。用量応答曲線は、Originソフトウエアを用いてフィッティングすることにより、以下のロジスティックシグモイド方程式：y = A2 + (A1 - A2) / [1 + (x / x0)H]（yは阻害の割合（％）であり、A2は右側の水平漸近線であり、A1は左側の水平漸近線であり、xはインヒビター濃度のlog10であり、x0は変曲点であり、Hは曲線の傾きである）を用いてIC50を計算した。IC50は、「50」をyに代入することにより計算した。
ペプチドのトロンビン阻害活性に対するプレインキュベーション時間（従って切断）の作用を、プレインキュベーション時間及び／又はBSAの濃度を変えて同じアッセイで実施した。長時間にわたるインキュベーション中にトロンビンエキソサイト-Iの完全性を確認する実験のために、28時間のプレインキュベーション後に新しく調製したインヒビターを添加して又は添加せずに、複数のセットのアッセイを並行して実施した。得られたデータはすべて、Originソフトウエアを用いて、IC50の値については、式：y = A2 + (A1 - A2) / [1 + (x / x0)H]に、また、
密着結合阻害については、式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki’Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}；
競合阻害については、式：Ki' = Ki (1 + S/Km)；
非競合阻害については、式：Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)]
古典的非競合阻害については、式：Ki' = Ki；
低速結合阻害については、式：P = Vft + (Vi - Vf) (1 - e-kt) / k + Po；
解離定数の計算については、式：k = K4 + K3It / [It + Ki`(1 + S / Km)]；
全体の阻害定数の計算については、式：Ki = Ki` [K4 / (K3 + K4)]
にあてはめた。
EP21及びMH18によるトロンビンアミド分解活性の阻害
上記複合体構造における4つのs-バリエジンC末端残基[V(29DDES32)]についての電子密度の不足は、これら4つの残基がトロンビンと強力に相互作用していない可能性があることを示していた。さらに、上記残基は、ヒルログ又はヒルゲンに存在しなかった。s-バリエジン及びヒルログ／ヒルゲンのC末端コンホメーション同士の極めて大きな差を考慮すると、上記残基の役割を調べることは興味深いであろう。それぞれEP25及びMH22に対応するが、4つのC末端残基を欠失している、2つの切断変異体、EP21（配列番号８）及びMH18（配列番号９）を設計し、特性決定した。EP25及びs-バリエジンは、同じ親和性でトロンビンと結合することから、s-バリエジンのC末端切断変異体は合成しなかった。EP21（配列番号８）によるトロンビン阻害の進行曲線は、プレインキュベーションの非存在下で、二相平衡を示したが、これは低速結合インヒビターに典型的である。EP21活性は、プレインキュベーション時間に依存的であった。IC50は、176.9 ± 6.8 nM（プレインキュベーションなし）から16.2 ± 2.9 nM（20分のプレインキュベーション後）まで低下した（図１３Ａ）。データを、式：P = Vft + (Vi - Vf) (1 - e-kt) / k + Po、k = K4 + K3It / [It + Ki`(1 + S / Km)]、及びKi = Ki` [K4 / (K3 + K4)]にあてはめることにより、トロンビンのEP21阻害について計算した阻害定数Kiは、0.315 ± 0.024 nMであった（図１３Ｂ）。すべての値がEP25（配列番号６）の値と類似しており、これは、4つのC末端残基の切断が、ペプチド活性を有意に改変しなかったことを示している。
MH18（配列番号９）は、等モル濃度（約15％）でトロンビンアミド分解活性を阻害し、定常状態平衡は、混合時に達成した。従って、MH18はトロンビンの高速かつ密着結合インヒビターである。用量応答曲線は、10.9 ± 1.2 nM（プレインキュベーションなし）及び11.7 ± 1.9 nM（20分プレインキュベーション後）のIC50値を示した（図１４Ａ）。これらの値は、MH22（配列番号３）で得られたデータと実質的に同じである。MH18の見かけ上の阻害定数K'は、100μMのS2238で得られ、式：Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}にデータをあてはめた（図１４Ｂ）。MH18がMH22同様、非競合インヒビターであることを想定して、式：Ki' = (S + Km) / [(Km/Ki) + (S/αKi)] 及びKi' = Kiを解くことにより、阻害定数Ki：14.9 ± 3.5 nMを得たが、これは、MH22のKiと一致している。上記セットの結果により、4つのC末端残基がトロンビンとの結合に関与していないという前述の結論を確認した。
DV24によるトロンビンアミド分解活性の阻害
本発明者の以前のデータから、バリエジンの7つのN末端残基が、その高速結合速度論の原因であることが示された。これらの残基を除去すると、結合特性は、親和性の低減なしに、高速から低速へと変化した（データは示していない）。そこで、本発明者らは、高度に塩基性のトロンビンエキソサイトIIが、バリエジンN-末端残基（その配列1SDQGDVA7に2つの陰性荷電残基を含む）を、短い範囲の相互作用の高速形成を可能にする活性部位に近接の最適配向に導くのを補助することができると仮定した。トロンビンエキソサイトIIは、活性部位から約10Å離れて位置している（Pageら、2005）ため、この距離は、理論上、伸長されたコンホメーションでは少なくとも3つのN末端残基によって覆われている可能性がある。高速結合性を保持したペプチドを作製するために、本発明者らは、EP21のN末端で3つの残基が伸長したペプチドを設計して、特性決定した。2つの酸性N末端残基からの1つ、VAsp5が上記変異体に存在しており、該変異体は、DV24（配列番号１０）と呼ばれる。
低速結合インヒビターについて一般に見とめられる二相平衡ではなく、トロンビン阻害のDV24（配列番号１０）進行曲線は、s-バリエジンに類似しており、混合時に定常状態平衡に到達した。従って、DV24は、高速かつ密着結合のインヒビターである。DV24の活性は、トロンビンによる切断のためにプレインキュベーション時間の増大と共に低下した。用量応答曲線は、IC50 値：7.49 ± 0.28 nM（プレインキュベーションなし）及び10.07 ± 0.60 nM（20分のプレインキュベーション後）を示した（図１５Ａ）。競合阻害を想定すると、式Vs = (Vo/2Et) {[(Ki' + It - Et)2 + 4Ki' Et]1/2 - (Ki' + It - Et)}及びKi' = Ki (1 + S/Km)を用いて、阻害定数Ki：0.306 ± 0.029 nMを取得したが、これはs-バリエジンのKiと一致する（図１５Ｂ）。従って、本発明者らは、s-バリエジンより短い8残基であるが、同じKiで高速結合速度論を保持するペプチドを設計することにこぎつけた。
DV24K10Rによるトロンビンアミド分解活性の阻害
バリエジンと別のトロンビン基質／インヒビターとの1つの違いは、切断可能な結合のP1位置におけるLysの存在である。典型的には、Argはトロンビン基質のこの位置に存在する。S1サブサイトにおけるArgの側鎖グアニジウム基とTAsp189の側鎖カルボン酸基との間の静電相互作用が通常好ましい。対照的に、P1 Lysは通常水分子を介してAsp 189と相互作用し（Perona及びCraik、1995）、これにより、親和性及び特異性が低減する（Vindigniら、1997）。トロンビン-s-バリエジン構造における、切断可能な結合[V(1SDQGDVAEPK10)]の前の残基の電子密度の非存在は、恐らく、上記セグメント内のトロンビンに対する強力な親和性の不足を暗示している。従って、鋳型配列としてDV24を用いることにより、DV24K10R（配列番号１１）と呼ばれる新たな変異体では、P1残基Lys10をArgで置換した。
プレインキュベーションなしの場合、DV24K10Rについて得られたIC50は、6.98 ± 0.76 nMであり、これはDV24のIC50（7.49 ± 0.28 nM）と類似している。しかし、20分のプレインキュベーション後では、DV24K10Rについて得られたIC50は、12.01 ± 0.41 nMであり、これはDV24のIC50（10.07 ± 0.60 nM）よりやや高い。上記ペプチドの切断は、P1 Argが存在するとより速く進行するようだ（図１６Ａ）。トロンビンに対する親和性はやや増加したが、これは、0.259 ± 0.015 nM へのKi値のわずかな低下（DV24についての0.306 ± 0.029 nMと比較して）によって示されている（図１６Ｂ）。従って、P1 Lysは一般にP1 Argより10倍弱く結合するという以前の観測結果にもかかわらず、ArgでLys10を置換しても、バリエジンのトロンビン親和性は最小限にしか改善されなかった（Pageら、2005）。上記の観測結果に留意して、次に、新たな変異体の設計を、P1位置におけるLys及びArgの両方を用いて、典型的に実施する。
DV23及びDV23K10Rによるトロンビンアミド分解活性の阻害
VPhe20のフェニル基は、トロンビンにおける非極性空洞に挿入されて、π-πスタッキングによりTPhe34と相互作用する。この相互作用はまた、ヒルログ、ヒルゲン及びヒルジン複合体構造物にも存在し、C末端セグメント：DFEA(E)IPEEYL（s-バリエジンとヒルログ／ヒルゲンはほぼ同じである）の開始を表している。s-バリエジンにおいては、P1 Lys残基とPheとの間に存在する9つの残基[V(11MHKTAPPFD19)]がある。しかし、ヒルログ-1/3においては、同じ距離に8つの残基（4PGGGGNGD11）しか存在しない。トロンビン-s-バリエジン構造の分析から、VPro16及びVPro17は、その骨格にねじれを誘導し、これにより、トロンビンから離れて上方にやや曲がりが生じたことがわかった。これは、Cα原子同士の距離によって測定されるように、ヒルログ-3において対応する残基：Gly10及びAsp11から約3.16Å及び1.70ÅのVPhe18及びVAsp19の変位を引き起こした（図１７）。重要なことには、ヒルログ-3のAsp11は、類似のVAsp19とTArg73との間に存在しないTArg73とイオン対を形成する。実際、VAsp19側鎖は、溶媒中に反対方向に向いており、VAsp19 OδとTArg73 NH2との間に距離9.22Åを形成する（図７）。従って、Pro16をs-バリエジン配列から欠失させて、VAsp19の再配置のために骨格中のねじれを除去することにより、イオン性相互作用を復元する。鋳型配列としてDV24及びDV24K10Rを用いて、変異体DV23（配列番号１３）及びDV23K10R（配列番号１２）を設計し、合成して、特性決定した。
DV23及びDV23K10Rの両方が、その鋳型と比較して活性の低下を示した。DV23 IC50値は、45.4 ± 1.6 nM（プレインキュベーションなしの場合）及び77.8 ± 6.1 nM（20分のプレインキュベーション後）である（図１８Ａ）。DV23 Kiは、2.19 ± 0.23 nMである（図１８Ｂ）。すべての値は、DV24と比較して活性が平均して約7倍低下していた。他方の変異体、DV23K10Rもやはりその鋳型、DV24K10Rと比較して活性が低い。上記ペプチドについてのペプチドIC50値は、12.9 ± 1.0 nM（プレインキュベーションなしの場合）及び101.9 ± 1.2 nM（20分のプレインキュベーション後）である（図１９Ａ）。DV23K10R Kiは、0.600 ± 0.010 nMである（図１９Ｂ）。トロンビンに対する親和性は、DV24K10Rの約2倍弱い。DV23K10Rは、プレインキュベーションなしでDV23よりトロンビンに対して活性であるが、この傾向は20分のプレインキュベーション後に逆転する。これは、P1にArgを含むペプチド（DV24K10R）が、P1にLysを含むペプチド（DV24）よりも高速にトロンビンにより加水分解される観測結果と一致する。さらに、活性の急速な低下はまた、切断産物が、もはやトロンビンを強力に阻害しないことを意味する。従って、VPro16の欠失は、インタクトなペプチドと切断産物の両方の活性に悪影響を与えるようだ。バリエジンP'残基とVPro16の近接を考慮すると、この残基の除去は、恐らく主要なサブサイト内での相互作用を損なっている。
［実施例５］
トロンビン活性部位とトロンビンインヒビターの相互作用及び触媒3残基の残基の変位
17個の観測されたs-バリエジン残基のうち、選択した数個のN末端残基が特に興味深い。1つの共通の特徴（いずれも、エキソサイト-Iを占有するが、活性部位の非主要サブサイトは占有しない）を有していたため、トロンビン-s-バリエジン構造をトロンビン-ヒルゲン構造（PDB：1HGT）と比較した（s-バリエジンのN末端切断産物は存在しないため）。3つの触媒残基（THis57、TAsp102及びTSer195）のうち、最も驚くべき相違は、TSer195のOγ原子に関する。トロンビン-s-バリエジン構造では、TSer195 Oγは1.1Å変位させられている。その結果、THis57のNε（触媒電荷中継システムの一部であると考えられる）との水素結合は、トロンビン-s-バリエジン構造に存在しない。2つの原子同士の距離は3.77Åまで増大した（図９Ａ）。トロンビン−ヒルゲン構造において対応する距離は2.79Åである（図９Ａ）。TSer195 Oγの変位は、s-バリエジンとの相互作用によるものである。特に、VHis12、TSer195、TGly193及びTCys42並びに水分子間の水素結合の新しくかつ広いネットワークは、触媒電荷中継ネットワークを混乱させる。重要なことには、VHis12骨格N（ドナー）は、水素結合（2.77Å）を介してTSer195のOγ（アクセプター）と結合するが、VHis12側鎖Nδ（アクセプター）はTSer195 Oγ（ドナー）との弱い水素結合（3.68Å）に寄与することができる。さらに、VHis12骨格Nはまた、水素結合によりTGly193の骨格Nと結合し、また水分子を介してTCys42のSγと結合する。実際に、TSer195 Oγ上の電子は、水素結合ネットワークへと移され、これによって弱い求核基となり、基質の骨格Cを効率的に攻撃することができなくなる。加えて、水素ネットワークへのTGly193の主鎖Nの関与は、オキシアニオンホールの形成を防止し、さらに該複合体の触媒能力を低減する（図９Ｂ）。
その他の大きな構造的変化は、非主要サブサイト（切断可能な結合に対する基質残基N末端によって占有される）及びNa+結合ループを含め、活性部位クレフトの周囲に観測されていない。このことは、s-バリエジンのC末端切断断片（MH22；配列番号３）が、S2238のような小さなペプチジル基質の結合親和性に影響を与えないことを示している。この観測結果は、MH22について見とめられた古典的非競合阻害を支持するものである。図８に示すように、トロンビンとの基質（S2238）結合（Ks）は、MH22による影響を受けなかったが、非効率的な触媒のために低下した反応の産物形成の速度（kp）は影響を受けた。見とめられた古典的非競合阻害の条件は、S2238のpNA部分によって占められる同じ部位においてVMet11の結合を妨げる。この想定は、上記構造におけるVMet11密度の非存在によって支持される。従って、VMet11は、トロンビンと直接接触していない可能性があり、上記複合体において不規則であった。VMet11とトロンビンとの相互作用の欠如は、トロンビンS1'が、Gly、Ala又はSerなどの小さな側鎖を含む残基を選択する（Bodeら、1992）という考えと一致する。
［実施例６］
バリエジンとトロンビンのエキソサイトとの相互作用、及びトロンビンのキャニオン（canyon）様クレフトへのバリエジンの円滑なフィッティング
水素結合の広いネットワーク以外に、s-バリエジンP2’〜P5’（VHis12、VLys13、VThr14及びVAla15）とトロンビンとの他の相互作用は、上記の部分をトロンビンの主要サブサイトにさらに結合させる。s-バリエジンのVHis12〜VAla15と、60-ループ、自己消化ループ及び34-ループにおける残基によって形成されるトロンビン表面との広範囲の界面接触が観測された（図１０）。残基同士を比較すると、s-バリエジン（VHis12）のP2’は、ヒルログ-3(Gly5)のP2’と比較して、活性部位に向かって2.77Å変位させられている（Cα原子の変位により測定）。この不一致は、ヒルログ-3においてP1としてβホモ-Argが使用されたために、P1'の骨格原子が約1結合長さ変位させられたことによって一部を説明することができる。また、トロンビン活性部位を含む広い水素結合ネットワークへのVHis12の関与にもよる可能性があり、これによって残基はTSer195近くに引き寄せられる（図９Ｂ）。その結果、VHis12側鎖は、ヒルログ-3で観測された小さなS1'サブサイトの一部を占有した。VHis12骨格Oは、TLys60F Nζに水素結合されている（2.74Å）。s-バリエジン構造中のP2' VHis12は、TCys42、THis57、TTrp60D、TLys60F、TGlu192及びTSer195に取り囲まれ、これらと接触している。S1'におけるVHis12による部分的占有は、P1' VMetの嵩高の側鎖を収容するのに利用可能な空間を限定する。従って、P1' VMetが溶媒中へと向かうようにすることが可能である。P3' VLys側鎖は、TGlu192側鎖に接近し、これと平行に延びており、両残基の脂肪側鎖同士の疎水性相互作用を可能にする。しかし、VLys13とTGlu21の間の強力なイオン対形成は、2つの電荷間の距離が5.0Å以上であるため、可能ではないようである。VLys13の骨格はまた、TLeu41とも接触する。P4' VThr側鎖は、自己消化ループの基部へと向かっているようであり、これにより、該ループの柔軟性のために、分析の確実性が低下した。それでも、上記側鎖は、TGly142、TAsn143、TGlu192、TGly193及びTGlu151によって境界を画定される小さな空洞を占有する。水素結合は、VThr14 OγとTGlu192骨格O（2.53Å）、並びにTAsn143 Oδ (3.29Å)との間に見とめられる。P5’Ala側鎖を、Leu40によって画定されるキャニオン（canyon）様クレフトの底部に深く埋め込み、疎水性接触をもたらす。
エキソサイト-Iにおけるトロンビン- s-バリエジン結合は、主に疎水相互作用によって駆動される。全体として、s-バリエジンは、トロンビン活性部位からエキソサイト-Iまで延びるキャニオン（canyon）様クレフトにしっかりと嵌っている（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。これらループ間に存在する多数の非極性残基は、クレフトの底部を画定していた。クレフトの壁は、トロンビン活性部位付近の60-ループ及び自己消化ループ、並びにエキソサイト-I周辺の34-ループ及び70-ループによって形成される（Rydelら、1991; Bodeら、1992; Huntington, 2005）。s-バリエジンとトロンビンの結合は、上記クレフトの非極性底部及び壁で、主に疎水性接触によって駆動される。結合に関与するトロンビンの残基としては、以下のものがある：（i）これら表面ループの底部：TMet32、TLeu40、TLeu41、TCys42、TLeu65、TArg67、TLys81、TIle82及びTMet84；（ii）60-ループ：TTrp60D及びTLys60F；（iii）自己消化ループ：TGly142、TAsn143及びTGln151；（iv）34-ループ：TPhe34、TLys36、TPro37、TGln38及びTGlu39；（iv）70-ループ：TArg73、TThr74、TArg75、TTyr76及びTArg77A（図１１Ｃ）。全s-バリエジンポリペプチド鎖上の5つの残基（VPhe18、VAsp19、VAla22、VGlu26及びVTyr27）を除くすべての残基がトロンビンとの境界に埋め込まれた側鎖を有していることから、特定の側鎖の相互作用が重要である（図１１Ｄ）。また、観測された最も強力な疎水接触のいくつかは以下のものを含む：（1）VPhe20とTMet32、TPhe34（π-πスタッキング）及びTLeu40；（2）VIle23とTPhe34、TLeu65、TTyr76及びTIle82；（3）VPro24とTTyr76。
キャニオン（canyon）様クレフトの底部の非極性とは対照的に、これらループ、特に70-ループの上部表面は、陽性荷電残基によって占有されている。上記塩基性残基としては、TArg35、TLys36、TArg73、TArg75、TLys81、TArg77A、TLys109、TLys110及びTLys149Eがあり、非極性キャニオン（canyon）様クレフト上方に陽性荷電の入口を形成する。s-バリエジンC末端に多数の酸性残基（VAsp19、VGlu21、VGlu25及びVGlu26）が存在するにもかかわらず、ただ1つのイオン対がVGlu21とTArg75との間に形成される。興味深いことには、ヒルログ、ヒルゲン及びヒルジン構造では、類似Gluは、2倍対称関連分子のTArg75とイオン対を形成する（Rydelら、1990；Skrzypczak-Jankunら、1991；Qiuら、1992）。
上記の相互作用は、構造的には観測されていないが、溶液中の同じトロンビン‐インヒビター対内で起こることが示されている（Rydelら、1990）。本発明の構造では、TArg75側鎖を、ヒルログ-3のTArg75と比較してCγを中心に96.8°回転させることによって、VGlu21との静電気相互反応を促進し、予測した相互作用の存在についての構造的証拠を提供する。同様に、ヒルログ-1/3及びヒルゲン構造では、ただ1つのイオン対を見とめることができる。しかし、上記の相互作用は、TArg73同士の間で起こり、AspはVAsp19と一致する。トロンビン-s-バリエジン構造における同等のイオン対の形成は、VAsp19側鎖が溶媒中へと反対方向で向かっている。側鎖配向の上記の変化は、Pro16-Pro17によって誘導されるs-バリエジン骨格中のねじれによる可能性が極めて高い。
キャニオン（canyon）様クレフトの末端では、トロンビン残基TAsp63-TIle68及びTLys81-TLeu85によって形成された比較的平板な表面である。近接して存在するにもかかわらず、s-バリエジンC末端残基VPro24とVLeu28は、上記表面の上部にゆるく重なり、2つの側鎖（VGlu26及びVTyr27）が溶媒へと向かっている（図１１Ｄ）。このs-バリエジンセグメントは、類似した配列を共有するにもかかわらず、ヒルログ-3/ヒルゲンと比較して異なるコンホメーションをしている。圧縮されたキャニオン（canyon）様クレフトと比較して、上記領域周辺は比較的開放的な表面であることが、前述したヒルジン/ヒルログ/ヒルゲン/s-バリエジンC末端コンホメーション不均質性の原因であると考えられる。
［実施例７］
静脈血栓症の動物モデル
材料
ゼブラフィッシュ成魚及びゼブラフィッシュ幼魚は、北テキサス大学（デントン、テキサス州、米国）生物化学科で維持した。
ペプチドの合成、精製及び質量分析
実施例１に記載した手順に従って、全ペプチドの合成、精製及び質量分析を実施した。
ゼブラフィッシュの飼育
ゼブラフィッシュ飼育タンクは、2つの1Lタンクで構成した。一方のタンクの底部を切り取り、滅菌したメッシュの上に配置した。次に、該タンクを、インタクトな底部を有する第2のタンク中に挿入した。1対のゼブラフィッシュを光サイクルの終わりに飼育タンクに入れた。上記メッシュは、上部タンクにおいて上記対のゼブラフィッシュを隔離する役割を果たした。次の光サイクルの最初の2時間以内に、魚は産卵し始め、上記メッシュの保護下、飼育タンクの底部で卵を回収した。魚を回収した後、上記飼育タンク内の水をブラインシュリンプネットでろ過し、該ネットに卵を保持する。上記ネットを、E3培地（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4及び10％〜5％メチレンブルー）を含むペトリ皿上に直ちにひっくり返して、卵及びその他の汚染物質、例えば糞などを放出させた。次に、上記卵をプラスチックパスツールピペットで、新鮮なE3培地に移した。上記の洗浄ステップを2回繰り返した後、卵を新しいタンクに移し、孵化のために28.5℃で維持した。
マイクロインジェクション
孵化後日数（dpf）4日の幼魚を用いて、静脈血栓症モデルにおけるペプチドのin vivo活性を決定する。鉛直ピペットプラー（Knopf、ツジュンガ、カリフォルニア州）で抜かれるガラス注射針（3.5インチ毛管）を備えたNanoject II（Drummond、ブルーモール、ペンシルバニア州、米国）を用いて、ペプチドの静脈内マイクロインジェクションを実施した。抜いた針の先端を小さなハサミでクリップし、リン酸緩衝液（PBS）に溶解させた500μMのペプチドを充填した。10 nlのペプチド又はPBSを後部（尾部）主静脈から幼魚の循環中に注射した。
アガロース中のゼブラフィッシュ幼魚のマウント
ペプチドを注射した各幼魚は、麻酔のために6μlの10 mMトリカイン溶液を添加した0.5 mlの蒸留水に入れた。幼魚を含む上記の水に等量の1％低融点アガロース溶液（水浴中に35℃で維持する）を添加した。混合物（麻酔した幼魚を含む）を、長方形のゴムガスケット内の顕微鏡のガラススライド上に流して、アガロース中に腹を横にして平たくした幼魚をマウントした。
レーザー剥離
幼魚の静脈のレーザー剥離は、レーザー強度を10に設定して、10パルス／秒で、クマリン440色素（445 nm）（MicroPoint Laser system, Photonic Instrument、セントチャールズ、イリノイ州、米国）からポンプしたパルス窒素レーザー光を用いて実施した。剥離の前にレーザーの精度を試験した。各幼魚のレーザー剥離をペプチドのマイクロインジェクションから20分後に実施した。ガラススライドをOptipnot位相差蛍光顕微鏡（Nikon、メルビル、ニューヨーク、米国）の下に配置した。幼魚を20倍レンズ（10倍接眼レンズ）で観察して、レーザー剥離のための部位を位置決めしたが、これは、肛門孔から尾部末端に向けて5原節の地点であった（データは示していない）。剥離部位内の尾部静脈に向けたレーザービームを3秒間トリガーした。このプロセスは、ビデオホームシステム（VHS）レコーダー及びモニターに接続したデジタルカメラを用いて記録した。レーザー剥離による静脈損傷後の血栓形成をモニターし、損傷した静脈の完全な閉塞にかかった時間を記録した。
5つのインヒビターを代表的なペプチドとして選択して、ゼブラフィッシュ幼魚の静脈血栓症モデルを用いてその抗血栓症効果をin vivoで試験した。上記インヒビターは以下の通りである：（1）s-バリエジン（天然バリエジンの全長配列；高速かつ密着結合の競合インヒビター；Ki = 0.318 ± 0.020 nM；配列番号１）；（2）EP25（7つのN末端残基なしで、トロンビンに対し同様の親和性を有するが、低速結合インヒビターである；Ki = 0.370 ± 0.11 nM；配列番号６）；（3）MH22（切断産物、高速かつ密着結合の非競合インヒビター；Ki = 14.11 ± 0.29 nM；配列番号３）；（4）DV24K10RYsulf（強力なin vitro活性を有するペプチド；Ki = 0.0420 ± 0.0061 nM；配列番号１６）；並びに（5）ヒルログ-1（現在市販されている高速かつ密着結合の競合インヒビター；Ki = 2.94 ± 0.12 nM；配列番号１４）。ヒルログ-1は、実験の陽性対照として用いた。
5つのペプチドはすべて単一用量（500μM、10 nl）で後部（尾部）主静脈からゼブラフィッシュ幼魚の循環へと注射した。レーザー剥離後の尾部静脈の閉塞までの時間（TTO）を遅延させる全ペプチドの能力によって、上記ペプチドの抗血栓症効果を測定する。レーザー剥離後、野生型4 dpf幼魚の対照TTOは約21秒であった（Jagadeeswaranら、2006）。典型的には、血栓の形成が阻害されたら（抗血栓症剤又は遺伝的欠損のいずれかによって）、TTOを150秒まで遅延させることができる。尚、この時間を超えると、完全な閉塞は起こらない（Seongcheol Kim, personal communication）。従って、注射用量（500μM、10 nl）は、いくつかの予備実験に基づいて注意深く選択し、これにより、全部でないにしても、ペプチドの大部分について明確なTTOを得ることができるようにする（データは示していない）。
同じ量のPBSを注射したゼブラフィッシュ幼魚は、TTO（平均値±標準偏差）：19.0 ± 3.2秒を有する（図２０）。s-バリエジン（Ki = 0.318 ± 0.020 nM）は強力な抗血栓作用を有し、TTOは120.8 ± 7.4秒であった。対照的に、EP25は、s-バリエジンと同等のKiを有するにもかかわらず、まったく活性を示さなかった。TTO：22.5 ± 6.2秒で、EP25は、PBSを注射した同じバッチの幼魚と比較して何ら有意な抗血栓効果を示さなかった。MH22（Ki = 14.11 ± 0.29 nM）は、TTOが33.3 ± 2.9秒で、優れた活性を示した。DV24K10RYsulf（Ki = 0.0420 ± 0.0061 nM）は、最も強力なインヒビターであり、これは血栓の形成を完全に阻害した（データは示していない）。基準薬としてのヒルログ-1／ビバリルジン(Ki = 2.94 ± 0.12 nM)は、TTOを45.0 ± 5.5秒まで引き延ばした。全体として、EP25を除き、ペプチドの抗血栓効果は、トロンビンについての親和性と十分に相関するものであった。従って、低速の結合阻害モード（EP25）は、in vivo効果について望ましくなくないのに対し、高速競合阻害（s-バリエジン、DV24K10RYsulf及びヒルログ-1）及び高速非競合阻害（MH22）は有効である（図２０）。本発明者らが得た結果は、効果的抗血栓薬の高速トロンビン阻害の重要性について以前報告されていた類似の観測結果と一致するものである（Stone及びTapparelli、1995）。
［実施例８］
ペプチドのトロンビン阻害活性の中和
ペプチドによるトロンビンアミド分解活性の阻害を中和する硫酸プロタミンの能力を、発色基質S2238を用いてアッセイした。プロタミンは、本来魚精子核から抽出した高度にカチオン性のペプチドの混合物である。硫酸プロタミンは、アニオン性ヘパリン分子に結合することにより、ヘパリンの抗凝固効果の逆転のために臨床的に用いられている（Schulman及びBijsterveld、2007）。バリエジンは、そのC末端に複数の酸性残基を有しており、該残基は、硫酸プロタミンの標的となりうる。この選択肢は、硫酸プロタミン投与についての豊富な臨床経験があるため、最初に調べられている。
アッセイはすべて、室温で100 mM NaCl及び1 mg/ml BSAを含む50 mM Trisバッファー（pH7.4）中で96ウェルマイクロプレートにおいて実施した。典型的には、100μlのペプチドと100μlの硫酸プロタミンを10分プレインキュベートした後、50μlのヒト血漿由来トロンビンを添加した。50μlのS2238を添加して反応を開始した。着色産物pNAの形成速度を、SPECTRAMax Plusマイクロプレート分光光度計（Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国）により405 nmで10分にわたり追跡した。硫酸プロタミンの存在下及び非存在下での阻害の割合（％）を比較することによって、逆転の割合（％）を計算した。固定濃度のs-バリエジン、DV24K10RYsulf及びMH22（それぞれのIC50及びIC90で）を様々な濃度の硫酸プロタミンと一緒にインキュベートした後、残留トロンビン阻害活性をアッセイした。硫酸プロタミンは、3つのペプチドすべての用量依存的効果を逆転した（図２１）。s-バリエジン及びMH22の活性は、同様の程度まで逆転された。s-バリエジン（8.25 nM）及びMH22（11.5 nM）のIC50で、0.1 mg/mlの硫酸プロタミンを用いて、約50％の逆転が達成された。逆転の割合（％）は、高濃度の硫酸プロタミンにもかかわらず、約75％で飽和した。対照的に、DV24K10RYsulfの場合には、そのIC50濃度（1.4 nM）、すなわち1 mg/mlの硫酸プロタミンが約50％の逆転に必要であった。予想通り、IC90のペプチドの効果を中和するのに必要な硫酸プロタミンの濃度は、IC50より高かった（図２１）。従って、硫酸プロタミンは、バリエジンペプチドの効果のほとんどを中和することができる。s-バリエジン及びMH22は、同じC末端（MH22配列により表される）を有するが、DV24K10RYsulf C末端（MH18Ysulf配列により表される）は、硫酸化され、トロンビンについてより強力な親和性を有する。s-バリエジン及びMH22は、同様の程度まで中和された。DV24K10RYsulfの逆転のためには、より高濃度の硫酸プロタミンが必要である。従って、硫酸プロタミンとペプチドとの結合は、バリエジンペプチドの酸性C末
端を介して媒介されると思われる。
参考文献
Huntington JA. (2005) Molecular recognition mechanisms of thrombin Journal of Thrombosis and Haemostasis 3:1861-1872.
Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W (1991) The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation Biochemistry 30:10363-10370.
Davie EW. (2003) A brief historical review of the waterfall/cascade of blood coagulation Journal of Biological Chemistry 278:50819-50832.
Lane DA, Philippou H, Huntington JA. (2005) Directing thrombin Blood 106:2605-2612.
Hirsh J, O'Donnell M, Weitz JI (2005) New anticoagulants Blood 105:453-463.
Gurm HS, Bhatt DL (2005) Thrombin, an ideal target for pharmacological inhibition: a review of direct thrombin inhibitor American Heart Journal 149:S43-S53.
Bates SM, Weitz JI (2006) The status of new anticoagulant British Journal of Haematology 134:3-19.
WO2003091284 Anticoagulants Evolutec Limited
Maraganore JM, Bourdon P, Jablonski J, Ramachandran KL, Fenton JW (1990) Design and characterization of hirulogs: a novel class of bivalent peptide inhibitors of thrombin Biochemistry 29:7095-7101.
Skrzypczak-Jankun E, Carperos VE, Ravichandran KG et al. (1991) Structure of the hirugen and hirulog 1 complexes of alpha-thrombin Journal of Molecular Biology 221:1379-1393.
Sambrook et al. (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Edmunds and Colman (2006) The Annals of Thoracic Surgery 82: 2315-22.
Girolami and Girolami (2006) Seminars in thrombosis and hemostatsis 32: 803-9
Lewis, B. E., and M. J. Hursting (2007) Expert Review of Cardiovascular Therapy 5: 57-68.
Varki A. (2007) Trousseau's Syndrome: multiple definitions and multiple mechanisms. Blood.
Nierodzik & Karpatkin (2006) Thrombin induces tumor growth, metastasis, and angiogenesis: Evidence for a thrombin-regulated dormant tumor phenotype Cancer Cell 10(5):355-62.
Terpe K, (2003) Applied Microbiology and Biotechnology 60: 523-33, 2003.
Eriksson,B.I., Smith,H., Yasothan,U., and Kirkpatrick,P. (2008). Dabigatran etexilate. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 557-558.
Greinacher,A. and Warkentin,T.E. (2008). The direct thrombin inhibitor hirudin. Thromb. Haemost. 99, 819-829.
Warkentin,T.E., Greinacher,A., and Koster,A. (2008). Bivalirudin. Thromb. Haemost. 99, 830-839.
Yeh,R.W. and Jang,I.K. (2006). Argatroban: update. Am. Heart J. 151, 1131-1138.
Bode,W., Turk,D., and Karshikov,A. (1992). The refined 1.9-A X-ray crystal structure of D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone-inhibited human alpha-thrombin: structure analysis, overall structure, electrostatic properties, detailed active-site geometry, and structure-function relationships. Protein Sci. 1, 426-471.
Brunger,A.T., Adams,P.D., Clore,G.M., DeLano,W.L., Gros,P., Grosse-Kunstleve,R.W., Jiang,J.S., Kuszewski,J., Nilges,M., Pannu,N.S., Read,R.J., Rice,L.M., Simonson,T., and Warren,G.L. (1998). Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 54, 905-921.
Jones,T.A., Zou,J.Y., Cowan,S.W., and Kjeldgaard,M. (1991). Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallogr. A 47 ( Pt 2), 110-119.
Kitagawa,K., Aida,C., Fujiwara,H., Yagami,T., Futaki,S., Kogire,M., Ida,J., and Inoue,K. (2001). Facile solid-phase synthesis of sulphated tyrosine-containing peptides: total synthesis of human big gastrin-II and cholecystokinin (CCK)-39. J. Org. Chem. 66, 1-10.
Krissinel,E. and Henrick,K. (2007). Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. J. Mol. Biol. 372, 774-797.
Laskowsi,R.A., MacArthur,M.W., Moss,D.S., and Thornton,J.M. (1993). PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291.
Otlewski,J., Jelen,F., Zakrzewska,M., and Oleksy,A. (2005). The many faces of protease-protein inhibitor interaction. EMBO J. 24, 1303-1310.
Page,M.J., Macgillivray,R.T., and Di Cera,E. (2005). Determinants of specificity in coagulation proteases. J. Thromb. Haemost. 3, 2401-2408.
Perona,J.J. and Craik,C.S. (1995). Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. Protein Sci. 4, 337-360.
Qiu,X., Padmanabhan,K.P., Carperos,V.E., Tulinsky,A., Kline,T., Maraganore,J.M., and Fenton,J.W. (1992). Structure of the hirulog 3-thrombin complex and nature of the S' subsites of substrates and inhibitors. Biochemistry 31, 11689-11697.
Rydel,T.J., Ravichandran,K.G., Tulinsky,A., Bode,W., Huber,R., Roitsch,C., and Fenton,J.W. (1990). The structure of a complex of recombinant hirudin and human alpha-thrombin. Science 249, 277-280.
Rydel,T.J., Tulinsky,A., Bode,W., and Huber,R. (1991). Refined structure of the hirudin-thrombin complex. J. Mol. Biol. 221, 583-601.
Schulman,S. and Bijsterveld,N.R. (2007). Anticoagulants and their reversal. Transfus. Med. Rev. 21, 37-48.
Skrzypczak-Jankun,E., Carperos,V.E., Ravichandran,K.G., Tulinsky,A., Westbrook,M., and Maraganore,J.M. (1991). Structure of the hirugen and hirulog 1 complexes of alpha-thrombin. J. Mol. Biol. 221, 1379-1393.
Stone,S.R. and Tapparelli,C. (1995). Thrombin inhibitors as antithrombotic agents: the importance of rapid inhibition. J. Enzyme Inhib. 9, 3-15.
Vagin,A. and Teplyakov,A. (2000). An approach to multi-copy search in molecular replacement. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 56, 1622-1624.
Vindigni,A., Dang,Q.D., and Di Cera,E. (1997). Site-specific dissection of substrate recognition by thrombin. Nat. Biotechnol. 15, 891-895.
Witting,J.I., Bourdon,P., Brezniak,D.V., Maraganore,J.M., and Fenton,J.W. (1992). Thrombin-specific inhibition by and slow cleavage of hirulog-1. Biochem. J. 283 ( Pt 3), 737-743.
Cho Yeow Koh, Maria Kazimirova, Adama Trimnell, Peter Takac, Milan Labuda, Patricia A. Nuttall, and R. Manjunatha Kini (2007) J. Biol. Chem, 282(40) 29101-29113.
配列表

配列番号1 (s-バリエジン)
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

配列番号2 (バリエジン切断産物)
SDQGDVAEPK

配列番号3 (MH22)
MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

配列番号4 (バリエジン E31H)
SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS

配列番号5 (MH22A22E)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

配列番号6 (EP25)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES

配列番号7 (EP25A22E)
EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

配列番号8 (EP21)
EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

配列番号9 (MH18)
MHKTAPPFDFEAIPEEYL

配列番号10 (DV24)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL

配列番号11 (DV24K10R)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL

配列番号12 (DV23K10R)
DVAEPRMHKTAPFDFEAIPEEYL

配列番号13 (DV23)
DVAEPKMHKTAPFDFEAIPEEYL

配列番号14 (ヒルログ; Hirulog)
DFPRPGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号15 (MH22A22E)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES

配列番号16 (DV24K10RYsulf)
DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEY*L (*Yは硫酸化されている)

配列番号17 (ヒルリン-P18; Hirullin-P18)
VSYTDCTSGQNYCLCGGNFCGDGKHCEMDGSENKCVDGEGTPKRQTSGPSDFEEFSLDDIEQ

配列番号18 (ヒルジン(Hirudin) 変異体-1)
VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号19 (ヒルジン変異体-2)
AICVSQAITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQCVTGEGTPNPESHNNGDFEEIPEEYLQ

配列番号20 (ヒルジン-3B')
VVYTDCTESGQNLCLCQGSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ
配列番号21 (ヒルジン-3B)
VVYTDCTESGQNLCLCQDSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号22 (ヒルジン-3A')
VVYTDCTESGEDLCLCEGSNVCGEGNKCILGSDGEKNECVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号23 (ヒルジン-3A)
VVYTDCTESGQNLCLCEDSNVCGEGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号24 (ヒルジン)
VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPGPQSHNDGDFEEPEEYL

配列番号25 (ヒルジン-HM2)
MFSLKLFVVFLAVCICVSQAVSYTDCTESGQNYCLCVGSNVCGEGKNCQLSSSGNQCVHGEGTPKPKSQTEGDFEEIPDEDILN

配列番号26 (ヒルジン-HM1)
MFSLKLFVVFLAVCICVSQAVSYTDCTESGQNYCLCVGGNLCGGGKHCEMDGSGNKCVDGEGTPKPKSQTEGDFEEIPDEDILN

配列番号27 (ヒルジン-3)
VVYTDCTESGQNLCLCEDSNVCGQGNKCILGSNGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号28 (ヒルジン-2B)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号29 (ヒルジン-2')
ITYTDCTESGQDLCLCEGSDVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号30 (ヒルジン-2)
ITYTDCTESGQDLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGEENQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号31 (ヒルジン-2A)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGNGNKCKLGSDGEENQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEYLQ

配列番号32 (ヒルジン-P6)
MRYTACTESGQNQCICEGNDVCGQGRNCQFDSSGKKCVEGEGTRKPQNEGQHDFDPIPEEYLS

配列番号33 (ヒルジン-PA)
ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSQGKDNQCVTGEGTPKPQSHNQGDFEPIPEDAYDE

配列番号34 (米国特許第5985833号からの配列25)
NGDFEEIPEEYL

配列番号35 (米国特許第5985833号からの配列24)
VEYEALYPEDD

配列番号36 (米国特許第5985833号からの配列23)
EVEYEALYPEDD

配列番号37 (米国特許第5985833号からの配列22)
AEVEYEALYPE

配列番号38 (米国特許第5985833号からの配列21)
AEVEYEALYPED

配列番号39 (米国特許第5985833号からの配列20)
AEVEYEALYPEDD

配列番号40 (米国特許第5985833号からの配列19)
EALYPEDDL
配列番号41 (米国特許第5985833号からの配列3)
VSVEHEVDVEYP

配列番号42 (米国特許第5985833号からの配列4)
VRVEHHVEIEYD

配列番号43 (米国特許第5985833号からの配列5)
NGDFEEIPEEYLQ

配列番号44 (米国特許第5985833号からの配列6)
FPRFPRP

配列番号45 (米国特許第5985833号からの配列7)
QSHNDG

配列番号46 (米国特許第5985833号からの配列9)
AVRPEHPAETEYESLYPEDDL

配列番号47 (米国特許第5985833号からの配列10)
PEHPAETEY

配列番号48 (米国特許第5985833号からの配列11)
EHPAETEYESLYPEDDL

配列番号49 (米国特許第5985833号からの配列12)
EHPAETEFESLYPEDDL

配列番号50 (米国特許第5985833号からの配列13)
AETEYESLYPEDDL

配列番号51 (米国特許第5985833号からの配列14)
VRPEHPAEVEYEALYPEDDL

配列番号52 (米国特許第5985833号からの配列15)
PEHPAEVEY

配列番号53 (米国特許第5985833号からの配列16)
EHPAEVEYEALYPEDDL

配列番号54 (米国特許第5985833号からの配列17)
AEVEYEALYPEDDL

配列番号55 (米国特許第5985833号からの配列18)
EYEALYPEDDL

配列番号56 (米国特許第5985833号からの配列1)
AGDV

配列番号57 (米国特許第5985833号からの配列2)
VRPEHPAETEYESLYPEDDL

配列番号58 (トロンビンインヒビター, 推定 [Ixodes scapularis])
MHQEGDFKMGHCSDLKVSALEIPYKGNKMSMVILLPEDVEGLSDLEEHLTAPKLLALLGGMYVTSDVNLHFPKFKLEQSMGLKDVLMAMGVKDFFTFLADLSGISATGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAILMDCIPQVVNFFVDHPFMFLICSHDPDAVLFMGSIREL

配列番号59 (インヒビター, 推定 [Ixodes scapularis])
MHQKGDFKMGHCSDLKVTALEIPYKGNKMSMIILLPEDVEGLSVLEEHLTAPKLSALLGGMYVTPDVNLRLPKFKLEQSIGLKDVLMAMGVKDFFTSLADLSGISAAGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAIPMMLMCARFPQVVNFFVDHPFMFLIHSHDPDVVLFMGSIREL

配列番号60 (トロンビンインヒビター, 推定 [Ixodes scapularis])
MASDFSNSLISFSVDLYKKLKSESDGASNFICSPFSIAAALSMTLAGAKHDTAKQISNALHMQDTTVHENFAYFFSKLPGYAPDVILHVANRLYAEETYNTLDEFTHLLEKSYSTTVEKVDFKRNAEKTRLQVNTWVEEVTQSKIKDLLAEGTIDDFTSLIIINAVYFKGLWHDQFDPKRTSQQEFHLTADRTKMVDMMHHKQRFRMCRHPNFKVSALEIPYKGQKMSMVILLPEEIDGLADLEETLTSSKIREIIQELSYQGDIELSLPRFKLEHTVGLKNVLAAMGIEDMFDALKCDLSGISPDNALVVSDVVHKAFIEVNEEGTEAAAATAMVMLCCMSFPTRFTVDHPFLFLIRCHDPDVILFIGSVAQI
配列番号61 (セリンプロテアーゼインヒビター [Echinococcus multilocularis])
MFAKTSFIPFTQALYAQLQPSEGRSNFFMSPLSVYSALSLALAGSESETREELVSVLGLAPGKDIDTIVKSLGENLQAVADGDAKKTLVEANGVFIQAGSQIRETYTSAVSKHLKADMKQLDFGGDSEGSRISINRWIAEKTREKVKDLLAQGSITPMTHVVLANAVYFKGVWKCKFEKSKTDRSGVFHSLDSGDVRVSMMTQKASYPMADFVDLEVRALKVPFETHEMLIVLPEKNDGLPNLLKQLSANAKHLEEMLTSDQYFDTEVVLKLPKFSLGGHNMKLKEPLHKMGLKSAFDAERADFSGITNDRSLAVSDVYHQAVIDVDEEGAEAAAATAMPMMVRCMPAPPVDFFVDHPFIFFIVTKTGIPVFMGHVVHPESK

配列番号62 (トロンボスタシン前駆体 [Stomoxys calcitrans])
MKYFVFIGIIALSAVSQAQNGRWQGDLHGLSGHRGSGLPGLSGHRGSGQPGLSGHRGSEQSGEAGAPSYDYFSQPGLSGSRRHGQRDLEVEDSRPARSLDPLNSVPEWNENDEDDHEFGPYRKPQDNQRDRRRPQRSFDS
FYSVPEWNEDNEADQGYRKRQDNQQNRHRAQPQRPLHPHYSHPEWEEEDEGDQQFGRYRKPHDNQQDRRRGKAQPQMRLHPFNSHPEWEDEDEGDQQFGPYRRPQDNQQNRRGESRPIRSNGDELSSDDQLASFFGFPAGDVPEDLKNLVRLFSGPNNDFGGNNQFEED

配列番号63 (抗トロンビン-III)
MISNGIGTVTAGKRSICLLPLLLIGLWGCVTCHRSPVEDVCTAKPRDIPVNPMCIYRSSEKKATEGQGSEQKIPGATNRRVWELSKANSHFATAFYQHLADSKNNNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSELVSANRLFGGKSITFNETYQDISEVVYGAKLQPLDFKGNAEQSRLTINQWISNKTEGRITDVIPPQAINEFTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSVLMMYQESKFRYRRVAESTQVLELPFKGDDITMVLILPKLEKTLAKVEQELTPDMLQEWLDELTETLLVVHMPRFRIEDSFSVKEQLQDMGLEDLFSPEKSRLPGIVAEGRSDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTVISIAGRSLNSDRVTFKANRPILVLIREVALNTIIFMGRVANPCVD

配列番号64 (α-1-抗トリプシン様タンパク質 GS55-MS)
MPSSISWGLLLLAGLSCLVAGSLAEDAQETGASKHDQEHPASHRIAPNLAEFALSLYRVLAHESNTTNIFFSPVSIAMALASLSLGTKADTHTQIMEGLGFNLTETAESDIHQGFQHLLQTLNKPNSQLQLTTGNGLFIDHNLKLLDKFLQDVKNLYHSEAFSTDFTNTEEAKKQINTYVEKGTQGKIVDLVKDLNRDSVLALVNYIFFKGKWEKPFEVDHTKEEDFHVDQVTTVRVPMMNRMGMFEVHYCSTLASWVLQMDYLGNATAIFLLPDEGKLQHLEDTITKEILAKFLKNRESSSVNLHFPKLNISGTMDLKPVLTRLGITNVFSYKADLSGITEDDPLRVSQALHKAVLTIDERGTEAAGATFLEMMPMSLPPEVKFDKPFLVVIIEHSTKSPLFVGKVVNPTLH

配列番号65 (無名のタンパク質産物 [Homo sapiens])
MLKKPLSAVTWLCIFIVAFVSHPAWLQKLSKHKTPAQPQLKAANCCEEVKELKAQVANLSSLLSELNKKQERDWVSVVMQVMELESNSKRMESRLTDAESKYSEMNNQIDIMQLQAAQTVTQTSADAIYDCSSLYQKNYRISGVYKLPPDDFLGSPELEVFCDMETSGGGWTIIQRRKSGLVSFYRDWKQYKQGFGSIRGDFWLGNEHIHRLSRQPTRLRVEMEDWEGNLRYAEYSHFVLGNELNSYRLFLGNYTGNVGNDALQYHNNTAFSTKDKDNDNCLDKCAQLRKGGYWYNCCTDSNLNGVYYRLGEHNKHLDGITWYGWHGSTYSLKRVEMKIRPEDFKP

配列番号66 (ニューロセルピン [Mus musculus])
MTYLELLALLALQSVVTGATFPDETITEWSVNMYNHLRGTGEDENILFSPLSIALAMGMMELGAQGSTRKEIRHSMGYEGLKGGEEFSFLRDFSNMASAEENQYVMKLANSLFVQNGFHVNEEFLQMLKMYFNAEVNHVDFSQNVAVANSINKWVENYTNSLLKDLVSPEDFDGVTNLALINAVYFKGNWKSQFRPENTRTFSFTKDDESEVQIPMMYQQGEFYYGEFSDGSNEAGGIYQVLEIPYEGDEISMMLALSRQEVPLATLEPLLKAQLIEEWANSVKKQKVEVYLPRFTVEQEIDLKDILKALGVTEIFIKDANLTAMSDKKELFLSKAVHKSCIEVNEEGSEAAAASGMIAISRMAVLYPQVIVDHPFLYLIRNRKSGIILFMGRVMNPETMNTSGHDFEEL

配列番号67 (グリア由来ネキシン)
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITTGSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP

配列番号68 (グリア由来ネキシン)
MNWHFPFFILTTVTLYSVHSQFNSLSLEELGSNTGIQVFNQIIKSRPHENVVVSPHGIASILGMLQLGADGKTKKQLSTVMRYNVNGVGKVLKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFLRNGFKMEVPFAVRNKDVFQCEVQNVNFQDPASASESINFWVKNETRGMIDNLLSPNLIDGALTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPESTKKRTFVAGDGKSYQVPMLAQLSVFRSGSTRTPNGLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHITTKTIDSWMNTMVPKRMQLVLPKFTAVAQTDLKEPLKALGITEMFEPSKANFTKITRSESLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFSIRHNPTGAILFLGQVNKP

配列番号69 (ニューロセルピン)
MAYLGLLSLVALQSLVTGAAFPDETIAEWSVNVYNHLRATGEDENILFSPLSIALAMGVMELGAQGSTLKEIRHSMGYESLKSGEEFSFLRDFSSMVSAEEGQYVMKIANSLFVQNGFHINEEFLQMMKMYFNAEVNHVDFSENVAVANYINKWVENYTNSLLKDLVSPGDFDAVTHLALINAVYFKGNWKSQFRPENTRTFSFTKDDESEVQIPMMYQQGEFYYGEFSDGSNEAGGIYQVLEIPYEGDEISMMLVLSRQEVPLATLEPLLKPQLIEEWANSVKKQKVEVYLPRFTVEQEIDLKDILKALGVTEIFIKDANLTAMSDKKELFLSKAVHKSFIEVNEEGSEAAVASGMIAISRMAVLFPQVIVDHPFLFLIKNRKTGTILFMGRVMHPETMNTSGHDFEEL

配列番号70 (セルピンペプチダーゼインヒビター, クレードC, メンバー1 [Homo sapiens])
MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICTAKPRDIPMNPMCIYRSPEKKATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAINKWVSNKTEGRITDVIPSEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSKLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK
配列番号71 (ヘパリン補因子II [Xenopus laevis])
MKLLHLATIFLLIHATLGGVKDLQEHFEDTSTGINPRGSQTQAVENLLDDTVTNDLSTEGEDEEDYLDFDKIFGEDEDYIDIIDAAPEIKNSETQQGNIFELFHGKTRVQRLNIINANFGFNLYRAIKNNTDASENILLAPVGISTAMATISLGTKGQTLEQVLLTLGFKDFLNASSKYEILTLHNVFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDIYVKRDFLIREPFKNNLKNYYFAEAQTVDFGYKDFLTKANKRIQQLTKGLIEEALTNVDPALLMLLVNCIYFKGTWENKFPVEYTQNMNFRLNEKELVKVPMMKTKGNFLVAADPELDCAVLQLPYVGNISMLIVLPHKLSGMKLLEKQISPQVVERWQNIMTNRTREVFLPRFKLEKSYDLQKVLSNMGATDLFTHGDFSGVSDKDINIGLFQHQGTITVNEEGTEAAAVTVVGFMPLSTQARFVADRPFLFLIYEHRTNCLVFMGRVANPTKS

配列番号72 (ヘパリン補因子II [Gallus gallus])
GTFCGIKDFSDHFESLKDAHTHENGTYNMPDLPLEFHRENTITNDLIPEEEEEEDYLDLDKILGEDDYSDIIDAAPHIVSEIQQGNILELFQGKTRIQRLNILNANFGFNLYRSVADKANSSDNILMAPVGISTAMAMISLGLKGQTQQEVLSVLGFEDFINASAKYELMTVHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYIRKDFSILNDFRNNMKTYYFADAQPADFSDPNFITKTNERILKLTKGLIKEALVNVNPTTLMMILNCLYFKGTWENKFPVEMTTKRSFRLNEKQTIKVPMMQTKGNFLAAADPELDCGVIQLPFVGNISMLIVLPHKLSGMKALEKQITPQVVEKWQKSMTNRTREVVLPKFKLEKNYNLIGFLRSMGIEELFSEKGNYCGVSEEKVSIDRFNHQGTITVNEEGTEAGAITNVGFMPLSTQIRFIVDRPFLFLIYEHRTNCLLFMGRVVNPAKP

配列番号73 (ヘパリン補因子2)
MQHRPHLLLISLTIMSVCGGSNGLTDQLNNKNLTMPLLPIEFHKENTVTNDWIPEGEEDDDYLDLEKLLSEDDDYIDIIDAVSPTDSEASAGNILQLFQGKSRIQRLNILNAKFAFSLYRALKDQANAFDNIFIAPVGISTAMGMISLGLKGETHEQVHSVLHFRDFVNASSKYEILTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYVQKQFPIREDFKAKVREYYFAEAQAADFSDPAFISKANNHILKVTKGLIKEALENVDPATQMMILNCIYFKGTWVNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELACDVLQLEYVGGISMLIVVPHKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNYNLVEALKSMGVTELFDKNGNMSGISDQGITMDLFKHQGTITVNEEGTQAAAVTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGKVANPVRS

配列番号74 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードD, メンバー1前駆体 [Mus musculus])
MKHPLCTLLSLITFMCIGSKGLAEQLTNENLTTSFLPANFHKENTVTNDWIPEGEEDEDYLDLEKLLGEDDDYIYIIDAVSPTDSESSAGNILQLFQGKSRIQRLNILNAKFAFNLYRVLKDQATTSDNLFIAPVGISTAMGMISLGLRGETHEEVHSVLHFRDFVNASSKYEVTTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNGLYIQKQFPIREDFKAAMREFYFAEAQEANFPDPAFISKANNHILKLTKGLIKEALENIDPATQMLILNCIYFKGTWVNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDILQLEYVGGISMLIVVPRKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNYNLVEVLKSMGITKLFNKNGNMSGISDQRIAIDLFKHQSTITVNEEGTQAAAVTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGKVTNPAKS

配列番号75 (ヘパリン補因子2)
MKHPAYTLLLSLIMSMCAGSKGLAEQLTKENLTVSLLPPNFHKENTVTNDWIPEGEEDDDYLDLEKLLSEDDDYIYVVDAVSPTDSESSAGNILQLFQGKSRIQRLNILNAKFAFNLYRVLKDQATSSDNIFIAPVGISTAMGMISLGLRGETHEEVHSVLHFKDFVNASSKYEVTTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLQSVNDLYIQKQFPIREDFKAAMREFYFAEAQEADFSDPAFISKANSHILKLTKGLIKEALENTDSATQMMILNCIYFKGAWMNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDILQLEYVGGISMLIVIPRKLSGMKTLEAQLTPQVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNYNLVEVLKSMGITKLFNKNGNMSGISDQRIIIDLFKHQSTITVNEEGTQAAAVTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLVYEHRTSCLLFMGRVANPAKS

配列番号76 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードD (ヘパリン補因子), メンバー1 [Danio rerio])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESIPLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFYEPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPVGISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKANQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRVNEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRSLEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKGDFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFLFLIYEHRTGCVVFMGRVVDPSQT

配列番号77 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードD (ヘパリン補因子), メンバー1 [Danio rerio])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESIPLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFYEPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPVGISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKANQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRVNEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRSLEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKGDFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFLFLIYEHRTGCVVFMGRVVDPSQS

配列番号78 (セルピンペプチダーゼインヒビター, クレードD (ヘパリン補因子), メンバー1 [合成構築物])
MWMLQRGVDQPGRLSLCSVFPPSFSSAKMKHSLNALLIFLIITSAWGGSKGPLDQLEKGGETAQSADPQWEQLNNKNLSMPLLPADFHKENTVTNDWIPEGEEDDDYLDLEKIFSEDDDYIDIVDSLSVSPTDSDVSAGNILQLFHGKSRIQRLNILNAKFAFNLYRVLKDQVNTFDNIFIAPVGISTAMGMISLGLKGETHEQVHSILHFKDFVNASSKYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYIQKQFPILLDFKTKVREYYFAEAQIADFSDPAFISKTNNHIMKLTKGLIKDALENIDPATQMMILNCIYFKGSWVNKFPVEMTHNHNFRLNEREVVKVSMMQTKGNFLAANDQELDCDILQLEYVGGISMLIVVPHKMSGMKTLEAQLTPRVVERWQKSMTNRTREVLLPKFKLEKNYNLVESLKLMGIRMLFDKNGNMAGISDQRIAIDLFKHQGTITVNEEGTQATTVTTVGFMPLSTQVRFTVDRPFLFLIYEHRTSCLLFMGRVANPSRS

配列番号79 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードD (ヘパリン補因子), メンバー1 [Danio rerio])
MWLVPVIVVACLLNSPALAGVKDLSSHFSTLEKEKTVDARGLSPGGENTDMESIPLDFHRENTVTNDLPEGQDDEDYVDFDKILGEDDYSEGDHIDEISTPAPDLDLFYEPSDPKIRRARLLRLFHGQTRLQRINVVNARFGFRLYRKLRNRLNQTDNILLAPVGISIAMGMMGLGVGPNTQEQLFQTVGFAEFVNASNHYDNSTVHKLFRKLTHRLFRRNFGYTLRSVNDLYVKRNVQIQDSFRADAKTYYFAEPQSVDFADPAFLVKANQRIQKITKGLIKEPLKSVDPNMAVMLLNYLYFKGTWEQKFPKELTHHRQFRVNEKKQVRVLMMQNKGSYLAAADHELNCDILQLPYAGNISMLIAVPQKLSGMRSLEQEISPTLVNKWLSNMTNRTREVVFPRFKLEQNYDLIEHLKEMGMTDIFTEKGDFSPMTSEKVIINWFKHQGSITVNEEGTEAAAMTHIGFMPLSTQTRFIVDRPFPFL
IYEHRTGCVVFMGRVVDPSQT

配列番号80 (セルピン B6)
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAAQMAQILSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRMANRLFGEKSCDFLSSFRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINTWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTRLVLVNAVYFRGNWDEQFDKENTEERLFKVSKNEEKPVQMMFKQSTFKKTYIGEIFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEEVEVSLPRFKLEESYDMESVLRNLGMTDAFELGKADFSGMSQTDLSLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHSKTNGILFCGRFSSP
配列番号81 (トロンビンインヒビター [Homo sapiens])
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAAQMAQILSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRVANRLFGEKSCDFLSSFRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINTWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTRLVLVNAVYFRGNWDGQFDKENTEERLFKVSKNEEKPVQMMFKQSTFKKTYIGEIFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEEVEVSLPRFKLEESYDMESVLRNLGMTDAFELGKADFSGMSQTDLSLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHRKTNGILFCGRFSSP

配列番号82 (セルピン B6)
MDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAAQMAQVLSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGEKSCDFLSSFRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINSWVAEKTEGKIAELLSPGSVDPLTRLVLVNAVYFKGNWNEQFDKENTEERRFKVSKNEEKPVQMMFMQSTFRKTYIGEIFTQILVLPYVGKELNMIIMLPDETTDLRTVEKELTYEKFVEWTRLDMMDEEKVEVSLPRFKLEESYDMESVLCSLGMTDAFELGKADFSGMSKADLCLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAATAAIMMMRCARFVPRFCADHPFLFFIQHSKTNGVLFCGRFSSP

配列番号83 (胎盤トロンビンインヒビター (細胞質抗プロテイナーゼ) (CAP) (プロテアーゼインヒビター6) (PI-6) (セルピン B6) アイソフォーム2 に類似 [Canis familiaris])
MDTLSEANGTFAISLLKKLGEDGSKNVFFSPMSISSALSMVFMGAKGNTAAQMSQTLSLSKSGGGGDVHQGFQALLNEVNSAEARYLLRTANRLFGEKTCGFLSSFKDSCRTFYQAEMEELDFLSACEQSREHITAGVTEGRKVKTRGKIVDLLSPGSVDPGTNLILVNAIYFKGNWDKQFNKEQTTERPFKVSKNEKKPVQMMFKKSTF
QMTYIGEIFTKILVLPYVGRELNMIIMLPDENVSLETVETELTYEKFTEWTRPDMLDEEEVEVFLPRFKLEEEYDMKAVLCSLGMTDAFEQSKADFSGMSSRGDLYLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAASAAVMMLRCARIVPRFCADRPFLFFIQHSKSRSVLFCGRFSSP

配列番号84 (胎盤トロンビンインヒビター (細胞質抗プロテイナーゼ) (CAP) (プロテアーゼインヒビター6) (PI-6) (セルピン B6) アイソフォーム3 に類似 [Canis familiaris])
MDTLSEANGTFAISLLKKLGEDGSKNVFFSPMSISSALSMVFMGAKGNTAAQMSQTLSLSKSGGGGDVHQGFQALLNEVNSAEARYLLRTANRLFGEKTCGFLSVSPLSPARKIVDLLSPGSVDPGTNLILVNAIYFKGNWDKQFNKEQTTERPFKVSKNEKKPVQMMFKKSTFQMTYIGEIFTKILVLPYVGRELNMIIMLPDENVSLETVETELTYEKFTEWTRPDMLDEEEVEVFLPRFKLEEEYDMKAVLCSLGMTDAFEQSKADFSGMSSRGDLYLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAASAAVMMLRCARIVPRFCADRPFLFFIQHSKSRSVLFCGRFSSP

配列番号85 (セルピン B6 (胎盤トロンビンインヒビター) (細胞質抗プロテイナーゼ) (CAP) (プロテアーゼインヒビター 6) (PI-6) アイソフォーム1 に類似 [Equus caballus])
MDTLSEANGTFALNLLKKLGEDNSKNVFFSPMSISSALAMVFMGAKGNTAAQMSQVLSLSKSGGEVGDVHQGFQSLLSEINRPGTQYLLRTANRLFGEKSYDFLSSFKDSCHKFYQAEMEQLDFISATEESRKHINTWVAKKTEGKITELLSSDSVDLLTKLILVNAIYFKGNWDDQFDKQQTKERPFKVSKNEEKPVQMMFKKSTFKRTYIGEIFTQILMLPYVGEELNMIIMLPDENTDLKTVEKELTYEKFVEWTRPDMMDETEMEVFLPRFKLEEDYDMEAVLRSLGMTDAFEQARADFSGMSSRADLFLSKVVHKSFVEVNEEGTEAAAATAAVMMMRCVRIIPRFCADHPFLFFIQHSKTNSILFCGRFSSP

配列番号86 (セルピン B6)
MDPLQEANGTFALNLLKILGEDSSKNVFLSPMSISSALAMVFMGAKGTTASQMAQALALDKCSGNGGGDVHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGDKTCDLLASFKDSCLKFYEAELEELDFQGATEESRQHINTWVAKKTEDKIKEVLSPGTVNSDTSLVLVNAIYFKGNWEKQFNKEHTREMPFKVSKNEEKPVQMMFKKSTFKMTYIGEIFTKILLLPYVSSELNMIIMLPDEHVELSTVEKEVTYEKFIEWTRLDKMDEEEVEVFLPKFKLEENYNMNDALYKLGMTDAFGGRADFSGMSSKQGLFLSKVVHKAFVEVNEEGTEAAAATAGMMTVRCMRFTPRFCADHPFLFFIHHVKTNGILFCGRFSSP

配列番号87 (トロンビンインヒビター アイソフォーム2 に類似 [Bos taurus])
MEELDFLSATEESRKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNAMTRLVLVNAIYFKGNWDTQFNKEHTKERPFRVSKNMEKPVQMMFKKSTFKSTYIGEISTQILVLPYVGKELNMVILLPSESTDLNTVEKALTYEKFVTWTKLDVMDEDEVEVFLPRFTLEESYDMECVLRDLGVTDAFEAAQADFSGMSCQQDLHLSKIVHKSFVEVTEEGTEAAAATVARITPRILRIVPRFCADHPFLFFIQHSRTGAILFCGRFCSP

配列番号88 (トロンビンインヒビター [Bos taurus])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGNSKNVFISPLSISSALAMVLLGAKGNTAAQMCQTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLSEVNRRDTQYLLRTANRLFGEKTYDFLSSFKDSCHKFYQAEMEELDFVSATEQSRKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNPMTRLVLVNAIYFKGNWDTQFNKEHTEERPFRVSKNVEKPVQMMFKKSTCKITYIGEISTQILVLPYVGQELNMVILLPSESTDLNTVEKALTYEKFIAWTKPDVMDEEEVEVFLPRFTLEESYDMEEFLQELGMTDAFEETRADFSGMSSGRGLHLSKVMHKSFVEVTEEGTEAAAATGAVVMMRCLMVVPRFNANHPFLFFIQHSKTGAILFCGRFCSP

配列番号89 (トロンビンインヒビターに類似 [Monodelphis domestica])
MVMNFPITFEPNILLSGSQVYKRWCVRMPALSEANNTFALNFFKKIGEEESEENVFYSPLSLYYALTMVLEGATGETAEQIQQVLSLSKNTDVHQSFQSFLAEVNKTGAPPLLRVANALFGEKTCGFLSPFKESCQKFYFSNVEELDFAHMPEAARKHINDWVEEKTEGKISELLANDSVDVMTNLVLVNAIYFNGKWEKPFDKAKTAEKMFNISEKKQKPVQMMYQRSTFSMTFIEDIPTQILVLPYAGGHMDMVILLPVENKHLKMLKKRLTSENLVDWINPEMMNEIEVEVFLPKFILAEHLDVEVILQKLGMLDAFDKTKADFSKMSARNDLCLSKVIHKAYVEVNEEGTVAVSSTAAVMMTRSERMSLEFKADHPFIFYLIEKQTNKIVFIGEVTSP

配列番号90 (胎盤トロンビンインヒビター (プロテアーゼインヒビター6) (PI-6) (セルピン B6) に類似 [Rattus norvegicus])
METLNVRRQILTRSSPDDFGMLSIKITSGEMLKDLESLRLAFWDSKKVSILLSVSDEIVQLTIMDPLLKANGNFAIKLFKVLGEDISKNVFFSLPSISSALSMILMGANGTTASQICQAMSLDKCNSIGGGDVHQHFLSLLTKVNKTDTRCMLRKANSVFIEDSFEILASFKDACHKLYEAEIEELDFKGAPEQSRQHINTWVAKKTEDIIRELLPPCTVNSNTCLFLVNVIYFKGSLEKPFNKADTREMPFKVSMVTTVHLLNERKSVYMFYKISTFKMTYVEEVSTKILLLLYVSIELTMIMLFSPRGWKHEIVGGCANCLDARDRNKAQIEEWACALRHLPAASGVKWDSACPEVEIMDSFHMKFSSELHFGLDFSLLCGWTESFVVLSKRYASEKQVSKPLFS
配列番号91 (セルピン B6 (胎盤トロンビンインヒビター) (細胞質抗プロテイナーゼ) (CAP) (プロテアーゼインヒビター6) (PI-6) に類似 [Macaca mulatta])
MAAGKASGESEEASPSLTAEEREALGGLDRWRQDEGPTGQGKAAASRSADTVSPAGAALAPGPAAGSALIVAADDGRGASGKLFPASALPPPTVNGRVSGAGPFLEPGQHSVSLEAPETRRWGPELVKAKASGQGGVDPRVPPRLSQCSGPGTPPASPRVFEVRGGSGVSTRRSTRSPPWVGKAGGASVCGGRGSGAGQRAAGPGTRVGQRRAGTREPREWGVAARGCDPRRPSRAGARASVRLGFPSGASQLRRTATRPVGRAWPRARPVTPLTRGPRAHRPSAHGRGGRRGMGAAQSLPGHRSAIMDVLAEANGTFALNLLKTLGKDNSKNVFFSPMSMSCALAMVYMGAKGNTAAQMAQVLSFNKSGGGGDIHQGFQSLLTEVNKTGTQYLLRTANRLFGEKSCDFLSSFRDSCQKFYQAEMEELDFISAVEKSRKHINSWVAEKTEGENVLLSTRNSI

配列番号92 (セルピン B6 (胎盤トロンビンインヒビター) (細胞質抗プロテイナーゼ) (CAP) (プロテアーゼインヒビター6) (PI-6) に類似 [Macaca mulatta])
MAKAHYRFLTENSQAVAVFTRIEIGRFAHIRKSRGLRDPPRPPAQAPAGLTVMDALSEGNGTFALNLLKKLGENNSPNLKILFGNWQGPNKEKPVQMMFKKSTFQMTYAKEILNKILVLSYVGKELNMLPDENTDLKMLMSVEKELSYERLIEWTKPDNMHEREMEVFLPRFKLEETYNMEDVLRSMDMVDALEQDRADLKDLYLSKVMHKSFVEVNEEGTEAAAATTEEIVLCCASYSLRFCADHPFLFFIQHNKTNGILFCCRFSSP

配列番号93 (トロンビンインヒビターに類似 [Bos taurus])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGNSKNVLIAPLSISSALAMVLLGARGNTAAQMCQTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLCEVNRTDTRYLLRTANRLFGEKTYNFLSSFKDSCRKFYQAEMEELDFVCATEESRKHINTWVAEKTEGKIRDLLSANSVYPMTCLVLVNAIYFKGNWDKQFYKVHTKERPFQVSKVNKTVQMMFRKSTFKMTY
IAEICTQILVLPYVGQELNMVILLPRERTDLNTVEKALTYEKFVVWTKPDMLAEEEVEVFLPRFTLEESYDMECVLRDLGMTDGFNMARADFIGLSCQPGLHLSKVVHKPFVEVTEEGTEAVAASEARIRGLSLRTVPRFCANRPFLFFIQHSSTGAILFCGRFCSP

配列番号94 (トロンビンインヒビターに類似 [Bos taurus])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGSSKNVLIAPLSISSALAMVLLGARGNTAAQMCQTLSLNKSSGGGEDVHQDFQNLLSEVNRTDTQYLLRTANRLFGEKPYDFLSSFKNACHIFYQAEMEELDFVSATEEPTKHINTWVAEKTEGKIRDLLPANSVNPMTRLVLVSAVYFKGNWAKPFLKGRTMEGIFNVCKNVQKRALMIYNWSTFKTACIAEICSQILVLPYVGQELNMVILLPFESTDLITVEKALTYEKFVTWTKPDVLAEVEVEVFLPCFTLEESYDMECVLRDLGMTDAFNAARADFSGMSCQPGLHLSKVMHKSFLEVTEEGTEAVAASEARIRRSLGVVHHFYANRPFLFFIQHSRTGAILFCGRFCSP

配列番号95 (α-1-抗トリプシン1-2)
MTPSISWGLLLLAGLCCMVPSFLAEDVQETDTSQKDQSPASHEIATNLGDFAISLYRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFAMLSLGSKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIHKSFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQAEVFSVNFAESEEAKKVINDFVEKGTQGKIVEAVKELDQDTVFALANYILFKGKWKKPFDPENTEEAEFHVDKSTTVKVPMMMLSGMLDVHHCSILSSWVLLMDYAGNASAVFLLPEDGKMQHLEQTLNKELISKILLNRRRRLVQIHIPRLSISGDYNLKTLMSPLGITRIFNNGADLSGITEENAPLKLSKAVHKAVLTIDETGTEAAAATVFEAVPMSMPPILRFDHPFLFIIFEEHTQSPIFVGKVVDPTHK

配列番号96 (α-1-抗トリプシン1-1)
MTPSISWGLLLLAGLCCLVPSFLAEDVQETDTSQKDQSPASHEIATNLGDFAISLYRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFAMLSLGSKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIHKSFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQAEVFSVNFAESEEAKKVINDFVEKGTQGKIAEAVKKLDQDTVFALANYILFKGKWKKPFDPENTEEAEFHVDESTTVKVPMMTLSGMLHVHHCSTLSSWVLLMDYAGNATAVFLLPDDGKMQHLEQTLSKELISKFLLNRRRRLAQIHFPRLSISGEYNLKTLMSPLGITRIFNNGADLSGITEENAPLKLSQAVHKAVLTIDETGTEAAAVTVLQMVPMSMPPILRFDHPFLFIIFEEHTQSPIFLGKVVDPTHK

配列番号97 (α-1-抗プロテイナーゼ)
MTPSISWGLLLLAGLFCLVPSFLAEDVQETDTSRRDSVPASHDTPYNLELSISLYRELGHKSTTSNIFFSQVSIATAFAMLSLGEKGDTHTQILEGLQFNLTQTSEADIHKAFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGSLLNNDLKLVEKFLEEAKNNYHSEVFSVNFAESEEAKKVINDFVEKGTQGKIAEAVKDPDEDTVFALANYILFKGKWKKPFDPKHTEEAEFHVDTVTTVKVPMMTLTGMLDVHHCSTLSSWVLLMDYLGNRTAVFLLPDDGKMQHLEQTLNKELISKFLLNRHRRLAQVHLPRLSLSGNYTLNTLMSHLGITRIFNNGADLSGITEENAPLKLSKAADKAVLTMDETGTEAAAATVLQAVPMSMPPILNFNKPFIFIIVEEHTQSPLFVGKVVDPTRK

配列番号98 (α-1-抗プロテイナーゼ)
MTPSISWRLLLLAGLCCLVPSYLAEDVQETDTSQKDQSPASHEMATNLGDFAFSLYRELVHQSNTSNIFFSPVSIATAFALLSLGSKGDTQTQILEGLQFNLTQTSEADIHKVFQHLLQTLNRPDSELQLSTGNGLFVNNDLKLVEKFLEEAKNHYQSEVFSVNFAKSEEARKMINDFVEKGTQGKIVDAVKDLDEDTVFALANYIFFQGKWKTPFDPEHTTEADFHVNESTTVRVPMMNLMRMLDVHYCSTLSSWVLMMDYLGNATAVFLLPDDGKMQHLEQTLNKELISKFLLNRHRSLAEIHFPRLSISGSYNLKALMAPLGITRVFNNGADLSGITEENAPLRLSKAVHKAVLTIDERGTEAAATTIVEAVFMSLPPILHFNHPFVFTIVETHTQTPLFVGKVVDPTRK

配列番号99 (α-1-抗プロテイナーゼ)
MAPSISRGLLLLAALCCLAPSFLAEDAQETDTSQQDQSPTYRKISSNLADFAFSLYRELVHQSNTSNIFFSPMSITTAFAMLSLGSKGDTRKQILEGLEFNLTQIPEADIHKAFHHLLQTLNRPDSELQLNTGNGLFVNKNLKLVEKFLEEVKNNYHSEAFSVNFADSEEAKKVINDYVEKGTQGKIVDLMKQLDEDTVFALVNYIFFKGKWKRPFNPEHTRDADFHVDKSTTVKVPMMNRLGMFDMHYCSTLSSWVLMMDYLGNATAIFLLPDDGKMQHLEQTLTKDLISRFLLNRQTRSAILYFPKLSISGTYNLKTLLSSLGITRVFNNDADLSGITEDAPLKLSQAVHKAVLTLDERGTEAAGATVVEAVPMSLPPQVKFDHPFIFMIVESETQSPLFVGKVIDPTR

配列番号100 (α-1-抗トリプシン)
MKPSISWGILLLAGLCCLVPSFLAEDAQETDASKQDQEHQACCKIAPNLADFSFNLYRELVHQSNTTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKGVTHTQILEGLGFNLTEIAEAEVHKGFHNLLQTFNRPDNELQLTTGNGLFIHNNLKLVDKFLEEVKNDYHSEAFSVNFTDSEEAKKVINGFVEKGTQGKIVDLVKDLDKDTVLALVNYIFFKGKWKKPFDADNTEEADFHVDKTTTVKVPMMSRLGMFDVHYVSTLSSWVLLMDYLGNATAIFILPDDGKMQHLEQTLNKEIIGKFLKDRHTRSANVHFPKLSISGTYNLKTALDPLGITQVFSNGADLSGITEDVPLKLGKAVHKAVLTIDERGTEAAGATFMEIIPMSVPPEVNFNSPFIAIIYDRQTAKSPLFVGKVVDPTR
配列番号101 (α-1-抗トリプシン)
HVEDPQGDAAQKTDTSHHDQEHSTFNKITPSLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLHTLNKPDSQLQLTTGNGLFLNKSVKVVDKFLEDVKKLYHSEAFSVNFEDTEEAKKQINNYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVEATKEEDFHVDQATTVKVPMMRRLGMFNIYHCEKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENENRRSANLHLPKLAITGTYDLKTVLGHLGITKVFSNGADLSGVTEDAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK

配列番号102 (α-1-抗トリプシン)
LLLAGLCCLLPGSLAEDPQGDAAQKTDTPPHDQNHPTLNKITPSLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLNFNLTEIPEAQVHEGFQELLRTLNKPDSQLQLTTGNGLFLNKSLKVVDKFLEDVKNLYHSEAFSVNFEDTEEAKKQINNYVEKGTQGKVVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVEATEEEDFHVDQATTVKVPMMRRLGMFNIYHCEKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENENRRSANLHLPKLAITGTYDLKTVLGHLGITKVFSNGADLSGVTEDAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFIGKVVNPTQK

配列番号103 (α-1-抗トリプシン)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHSEILEGLHFNLTEIPEAQVHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLNESLKLVDKFLEDVKKLYHSDAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTKEEDFHVDEVTTVKVPMMRRLGMFNIHYCEKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENENRRSASLHLPKLSITGTYDLKRVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFVGKVVNPTQK

配列番号104 (α-1-抗プロテイナーゼ)
MALSITRGLLLLAALCCLAPISLAGVLQGHAVQETDDTSHQEAACHKIAPNLANFAFSIYHHLAHQSNTSNIFFSPVSIASAFAMLSLGAKGNTHTEILKGLGFNLTELAEAEIHKGFQHLLHTLNQPNHQLQLTTGNGLFINESAKLVDTFLEDVKNLYHSEAFSINFRDAEEAKKKINDYVEKGSHGKIVELVKVLDPNTVFALVNYISFKGKWEKPFEMKHTTERDFHVDEQTTVKVPMMNRLGMFDLHYCDKLASWVLLLDYVGNVTACFILPDLGKLQQLEDKLNNELLAKFLEKKYASSANLHLPKLSISETYDLKSVLGDVGITEVFSDRADLSGITKEQPLKVSKALHKAALTIDEKGTEAVGSTFLEAIPMSLPPDVEFNRPFLCILYDRNTKSPLFVGKVVNPTQA

配列番号105 (α-1-抗トリプシン)
MASSSTWGLLLLAGLCCLVPISLAEGLQGHAVQETDVPRHDHEQHQEAACHRIAPNLADFAFSLYRQVARQSNTSNIFLSPVTIARAFAMLSLGTKGATHAEILEGLQFNLTEKAEAEIHEGFQHLLHTLNQPDNQLQLTTGNGLFIDEKAKLVPKFLEDVKNLYHSEAFSINFRDTEEAKKCINDYVEKGSQGKIVDLVDELDKDTVFALVNYIFFKGKWEKPFEVEQTTEEDFHVDEETTVKVPMMNRLGMFDLHHCDKLSSWVLLMDYVATATAFFILPDQGKLHQLEDMLTKEIRAKFLEKRYPSSANLHLPKLTISGTYDLKSLLGNLGITKVFSDEADLSGVTEEQPLKLSKALHRAVLTIDEKGTEATGATILEAIPMSIPPNVKFNKPFLFLIYDTKTKAVLFMGKVMNPTQK

配列番号106 (α-1-抗プロテイナーゼ F)
MPPSVSRALLLLAGLGCLLPGFLADEAQETAVSSHEQDHPACHRIAPSLAEFALSLYREVAHESNTTNIFFSPVSIALAFAMLSLGAKGDTHTQVLEGLKFNLTETAEAQIHDGFRHLLHTVNRPDSELQLAARNALVVHENLKLQHKFLEDAKNLYQSEAFLVDFRDPEQAKTKINSHVEKGTRGKIVDLVQELDARTLLALVNYVFFKGKWEKPFEPENTKEEDFHVNATTTVRVPMMSRLGRYDLFHCSTLASTVLRMDYKGNATALFLLPDEGKLQHLEDTLTTELITKFLAKSSLRSVTVHFPKLSISGTYDLKPLLGKLGITQVFSDNADLSGITEQEPLKASQALHKAVLTIDERGTEAAGATYMEIIPMSLPDSITLDRPFLFVIYSHEIKSPLFVGKVVDPTQH

配列番号107 (α-1-抗プロテイナーゼ)
MMPSTLSLCLMLAGLCSLVTSHLTEEIQASNDTENEYSSTRRISPYMTDFSIDFYRLLVSKSNTTNIFFSPISIYTAFTLLALGAKSATRDQILTGLRFNRTEISEEHIFEGFQQLLNTFNLPENELQLTTSNGLFIDKNLKLVAKFLEDSKRLYASDTFSTNFEDNMAAKKQINDYVEKETQGKIVDLIQNLDSNVVFVLVNCIFFKGKWEKPFMTELTTECPFHVDSKTTVPVQTMRRLGMFNVFYDQDLSCWVLKMKYMGNATALFILPDTGKIEKVENALNKMLFHKWTRNLKRRAISLYFPKVSISGNYDLKILRELGITDVFGSNADLSGITEETNLKLSQAVHKAVVNIDEKGTEASGATFAEGIPMSIPPTVEFLRPFIFIILEENTKSVLFMGKVMNPTGN

配列番号108 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードA (α-1 抗プロテイナーゼ, 抗トリプシン), メンバー5 [Homo sapiens])
MQLFLLLCLVLLSPQGASLHRHHPREMKKRVEDLHVGATVAPSSRRDFTFDLYRALASAAPSQSIFFSPVSISMSLAMLSLGAGSSTKMQILEGLGLNLQKSSEKELHRGFQQLLQELNQPRDGFQLSLGNALFTDLVVDLQDTFVSAMKTLYLADTFPTNFRDSAGAMKQINDYVAKQTKGKIVDLLKNLDSNAVVIMVNYIFFKAKWETSFNHKGTQEQDFYVTSETVVRVPMMSREDQYHYLLDRNLSCRVVGVPYQGNATALFILPSEGKMQQVENGLSEKTLRKWLKMFKKRQLELYLPKFSIEGSYQLEKVLPSLGISNVFTSHADLSGISNHSNIQVSEMVHKAVVEVDESGTRAAAATGTIFTFRSARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP

配列番号109 (セリン(又はシステイン)プロテイナーゼインヒビター, クレードA, メンバー5 [Mus musculus])
MRFFPILCLVLFISHGVASRRHSHSKKKKAKESSVGAVGPPSSKDFAFRLYRALVSESPGQNVFFSPLSVSMSLGMLSLGAGLKTKTQILDGLGLSLQQGQEDKLHKGFQQLLQRFRQPSDGLQLSLGSALFKDPAVHIRDDFLSAMKTLYMSDTFSTNFGNPEIAKKQINNYVAKQTKGKIVDFIKDLDSTHVMIVVNYIFFRAKWQTAFSETNTHKMDFHVTPKRTTQVPMMNREDGYSYYLDQNISCTVVGIPYQGNAIALFILPSEGKMKQVEDGLDERTLRNWLKMFTKRRLDLYLPKFSIEATYKLENVLPKLGIQDVFTTHADLSGITDHTNIKLSEMVHKSMMEVEESGTTAAAITGAIFTFRSARPSSLKIEFTRPFLLTLMEDSHILFVGKVTRP

配列番号110 (セリン(又はシステイン)ペプチダーゼインヒビター, クレードC (抗トロンビン), メンバー1 [Rattus norvegicus])
MYSPGIGSAVAGERKLCLLSLLLIGALGCAVCHGNPVDDICIAKPRDIPVNPMCIYRSPAKKATEEDVLEQKVPEATNRRVWELSKANSRFATNFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSNLVSANRLFGDKSLTFNESYQDVSEIVYGAKLQPLDFKENPEQSRVTINNWVANKTEGRIKDVIPQGAIDELTALVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKEPFHKVDGQSCLVPMMYQEGKFKYRRVGEGTQVLEMPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEQELTPELLQEWLDELSEVMLVVHVPRFRIEDSFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSQLPGIIAEGRDDLFVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTSVVITGRSLNPSRVTFKANRPFLVLIREVALNTIIFMGRVSNPCVN
配列番号111 (抗トロンビン-III)
MYSPGAGSGAAGERKLCLLSLLLIGALGCAICHGNPVDDICIAKPRDIPVNPLCIYRSPGKKATEEDGSEQKVPEATNRRVWELSKANSRFATNFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSDLVSANRLFGDKSLTFNESYQDVSEVVYGAKLQPLDFKENPEQSRVTINNWVANKTEGRIKDVIPQGAINELTALVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKEPFYKVDGQSCPVPMMYQEGKFKYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEQELTPELLQEWLDELSETMLVVHMPRFRTEDGFSLKEQLQDMGLIDLFSPEKSQLPGIVAGGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTSVVITGRSLNPNRVTFKANRPFLVLIREVALNTIIFMGRVANPCVN

配列番号112 (抗トロンビン-III)
MYSNVIGTITSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICIAKPRDIPMNPMCIYRSPEKKATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAINKWVSNKTEGRITDVIPPEAINELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDGFSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSKLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAVVIAGRSLNPNRVTFKANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK

配列番号113 (抗トロンビン-III)
MISNGIGTVTTGKRSMCLFPLLLIGLWGCVTCHRSPVEDICTAKPRDIPVNPMCIYRSPEKKATEGEGSEQKIPGATNRRVWELSKANSHFATAFYQHLADSKNNNDNIFLSPLSISTAFAMTKLGACNNTLKQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSELVSANRLFGDKSITFNETYQDISEVVYGAKLQPLDFKGNAEQSRLTINQWISNKTEGRITDVIPPQAIDEFTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTKKELFYKADGESCSVPMMYQEGKFRYRRVAEGTQVLELPFKGDDITMVLILPKLEKPLAKVERELTPDMLQEWLDELTETLLVVHMPHFRIEDSFSVKEQLQDMGLEDLFSPEKSRLPGIVAEGRNDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTVISIAGRSLNLNRVTFQANRPFLVLIREVALNTIIFMGRVANPCVN

配列番号114 (トロンビンインヒビター インフェスチン前駆体 [Triatoma infestans])
LEENDCACPRVLHRVCGSDGNTYSNPCTLDCAKHEGKPDLVQVHEGPCDPNDHDFEDPCECDNKFEPVCGTDHITYSNLCHLECAAFTTSPGVEVKYEGECHAEIMEQHQILKSCICTKMYKPVCGTDGHTYPNLCVLKCRISSKPGLKLAHVGKCGIGLLAVETKEVRNPCACFRNYVPVCGSDGKTYGNPCMLNCAAQTKVPGLKLVHEGRCQRSNVEQF

配列番号115 (ブラジリエンシン(brasiliensin)前駆体 [Triatoma brasiliensis])
MRYLLLLGLAAFSAVSAEEKDPPCACPLIWKPVCGNDGQTYPNECLLNCIKYVLKKDIEVAYQGICKHFVHAAAEAEELVESKPPCACPLIWKPVCGNDGQTYPNECMLNCMKYILKKDIEVAYQGMCKHFVHAAAEAEELVESKNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNPCTLNCAKHEGKPDLVQVHEGPCSPDEHDFEDPCECDNKFDPVCGTDKVTYRNLCXLECAMFTTSPGVEVDYEGECLAETVLLEENHCACPRVLHRVCGSDGNTYSNPCTLDCAKHEGKPDLVQVHEGPCDPNDHDFEDPCECDNKFEPVCGTDHITYSNLCHLECAAFTTSPGVEVKYEGECHAEIMEQHQILKSCICTKIYSPVCGTDGHTYPNLCILECHISFNPGLKLAHVGKCGTDLQDIETKQVRNPCACFRNYLPVCGSDGKTYGNPCMLNCAAHTKVPGLKLAHKGRCQRSDVEQF

配列番号116 (セリンプロテアーゼインヒビタージペタロガスチン(dipetalogastin))
LIKELVNMVIQHAEEEEVKELKNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNPCMLNCAKHEGNPDLVQVHKGPCDEHDHDFEDPCKCDNKFEPVCGDDQITYLNLCHLECATFTTSPGVEVAYEGECHAETTNAMEVLFQGNPCECPRALHRVCGSDGNTYSNPCMLTCAKHEGNPDLVQVHEGPCDEHDHDFEDTCQCDDTFQPVCGDDEITYRNLCHLECATFTTSPGVEVKHEGECHPETKVNQLILKSCMCPKIYKPVCGTDGRTYPNICVLKCHISSNPGLGLAHLGECKVAVLAKETGEVRNPCNCFRNFNPVCGTDGKTYGNLCMLGCAAETKVPGLKLLHNGRCLPKEQL

配列番号117 (トロンビンインヒビタータンパク質 [Rhodnius prolixus])
RLLLLLGLAALVAAEGGEPCACPHALHRVCGSDGETYSNPCTLNCAKFNGKPELVKVHDGPCEPDEDEDVCQECDGDEYKPVCGSDDITYDNNCRLECASISSSPGVELKHEGPCRTEEKKILKRSDEFEMYRCACPKIYYPVCGTDGETYPNLCVLECHMRMNPGLQLHHYGHCQHHHHHHPPPHHHHHHHPHHTTEKPVEPCACPHALHRVCGSDGETYSNPCTLNCAKHNGKPGLVKVHDGPCEPDEDEDVCQECDDVDYEPVCGTDDKTYDNNCRLECASISSSPGVELKHEGICRKEEKKLPKRSVGLEHTCVCPYNYFPVCGTDGETYPNLCALQCRMREVPGLELKHTGKCLPHLDFPDPV

配列番号118 (トロンビンインヒビタータンパク質 [Rhodnius prolixus])
MKRLLLLLGLAALVAAEGGEPCACPHALHRVCGSDGETYSNPCTLNCAKFNGKPELVKVHDGPCEPDEDEDVCQECDGDEYKPVCGSDGITYDNNCRLECASISSSPGVELKHEGICRKEEKKLPKRSVGLEHTCVCPYNYFPVCGTDGETYPNLCALQCRMREVPGLELKHTGKCLPHLDFPDPV

配列番号119 (トロンビンインヒビター ヘマリン(haemalin) [Haemaphysalis longicornis])
MKLFVFLALFGAAFAQRNGFCRLPAEPGICRAFMPRYYFDVEKGQCEQFIYGGCKGNENNFETLKECQDACGEPERASDFEKADFETGCKAAPETGLCKASFERWFFNAASGECEEFIYGGCGGNDNNYENKEECEFACKY

配列番号120 (ブーフィリン(boophilin) [Boophilus microplus])
MKCIILLAVLGTAFAQRNGFCRLPADEGICKALIPRFYFNTETGKCTMFSYGGCGGNENNFETIEECQKACGAPERVNDFESADFKTGCEPAADSGSCAGQLERWFYNVQSGECETFVYGGCGGNDNNYESEEECELVCKNM
配列番号121 (ブーフィリン [Boophilus microplus])
MKYLILLAVLGTAFAQRNGFCRLPADEGICKALIPRFYFNTETGKCTMFSYGGCGGNENNFETIEDCQKACGAPERVSDFEGADFKTGCEPAADSGSCAGQLERWFYNVRSGECETFVYGGCGGNDNNYESEEECELVCKNM

配列番号122 (オルニトドリン(Ornithodorin))
LNVLCNNPHTADCNNDAQVDRYFREGTTCLMSPACTSEGYASQHECQQACFVGGEDHSSEMHSSCLGDPPTSCAEGTDITYYDSDSKTCKVLAASCPSGENTFESEVECQVACGAPIEG

配列番号123 (トロンビンインヒビター [Ornithodoros moubata])
LNVLSNNPHTADCNNDAQVDRYFREGTTCLMSPACTSEGYASQHECLRPALLAGKTTAVKCTAHALVTRPLPARKARTSPTTILIAKHVRY

配列番号124 (サビグニン(savignin) [Ornithodoros savignyi])
MLFYVVITLVAGTVSGLNVRCNNPHTANCENGAKLESYFREGETCVGSPACPGEGYATKEDCQKACFPGGGDHSTNVDSSCFGQPPTSCETGAEVTYYDSGSRTCKVLQHGCPSSENAFDSEIECQVACGVSME

配列番号125 (トロンビンインヒビター [Amblyomma hebraeum])
MGFLVASAVLVCVTSQRVPGYCKKKPAVGPCKALIEKWYFDYSTQSCKTFYYGGCGGNGNKFSSRKKCREACLPKRPSVPVCKQMPDPGFCRAYMPHWFFNSKSGYCEGFVYGGCQGNDNRFKSCWQCMKKCRTAREANRLCWKLTKEFNKKFLRNVPTAKPLPPK

配列番号126 (トロンビンインヒビター [Amblyomma americanum])
MRPQAFIGAFVFTLVLRQAAGIKWSRCFRPKAVGNCQNKVPAWYYDFWSFRCKGFLYSGCGGNSNRFPTEEECQKSCLRKSKRKEVCSLKPKTGKCKAAIPLWYYDPELDECRGLIYGGCKGNANRFETCLKCMKRCSGNNNARKICKKQTKKFLEENNLGSNRHHKKPSWPQLSIRIPFIEK

配列番号127 (トロンビンインヒビター [Ixodes scapularis])
MHQEGDFKMGHCSDLKVSALEIPYKGNKMSMVILLPEDVEGLSDLEEHLTAPKLLALLGGMYVTSDVNLHFPKFKLEQSMGLKDVLMAMGVKDFFTFLADLSGISATGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAILMDCIPQVVNFFVDHPFMFLICSHDPDAVLFMGSIREL

配列番号128 (トロンビンインヒビター [Ixodes scapularis])
MHQKGDFKMGHCSDLKVTALEIPYKGNKMSMIILLPEDVEGLSVLEEHLTAPKLSALLGGMYVTPDVNLRLPKFKLEQSIGLKDVLMAMGVKDFFTSLADLSGISAAGNLCASDVIHKAFVEVNEEGTEAAAATAIPMMLMCARFPQVVNFFVDHPFMFLIHSHDPDVVLFMGSIREL

配列番号129 (トロンビンインヒビター [Ixodes scapularis])
MASDFSNSLISFSVDLYKKLKSESDGASNFICSPFSIAAALSMTLAGAKHDTAKQISNALHMQDTTVHENFAYFFSKLPGYAPDVILHVANRLYAEETYNTLDEFTHLLEKSYSTTVEKVDFKRNAEKTRLQVNTWVEEVTQSKIKDLLAEGTIDDFTSLIIINAVYFKGLWHDQFDPKRTSQQEFHLTADRTKMVDMMHHKQRFRMCRHPNFKVSALEIPYKGQKMSMVILLPEEIDGLADLEETLTSSKIREIIQELSYQGDIELSLPRFKLEHTVGLKNVLAAMGIEDMFDALKCDLSGISPDNALVVSDVVHKAFIEVNEEGTEAAAATAMVMLCCMSFPTRFTVDHPFLFLIRCHDPDVILFIGSVAQI

配列番号130 (ツェツェバエトロンビンインヒビター前駆体 [Glossina morsitans morsitans])
MKFFTVLFFLLSIIYLIVAAPGEPGAPIDYDEYGDSSEEVGGTPLHEIPGIRL
配列番号131 (トロンビンインヒビター マダニン(madanin)2 [Haemaphysalis longicornis])
MKHFVILILAVVASAVVMAYPERDSAKDGNQEKERALLVKVQERYQGNQGDYDEYDQDETTPPPDPTAQTARPRLRQNQD

配列番号132 (トロンビンインヒビター マダニン1 [Haemaphysalis longicornis])
MKHFAILILAVVASAVVMAYPERDSAKEGNQEQERALHVKVQKRTDGDADYDEYEEDGTTPTPDPTAPTAKPRLRGNKP

配列番号133(抗トロンビン-III)
MHLFIGVSLRPLGHGIPAPYAVEDICTAKPRDIPVNPICIYRNPEKKPQERRGAGAGEGQDPGVHKPPASGSCPGPTRAFGRRSFLQAPGPTPRTMRRTSSCRPS

配列番号134 (トロンビンインヒビター [Amblyomma hebraeum])
MGFLVASAVLVCVTSQRVPGYCKKKPAVGPCKALIEKWYFDYSTQSCKTFYYGGCGGNGNKFSSRKKCREACLPKRPSVPVCKQMPDPGFCRAYMPHWFFNSKSGYCEGFVYGGCQGNDNRFKSCWQCMKKCRTAREANRLCWKLTKEFNKKFLRNVPTAKPLPPK

配列番号135 (トロンビンインヒビター [Amblyomma americanum])
MRPQAFIGAFVFTLVLRQAAGIKWSRCFRPKAVGNCQNKVPAWYYDFWSFRCKGFLYSGCGGNSNRFPTEEECQKSCLRKSKRKEVCSLKPKTGKCKAAIPLWYYDPELDECRGLIYGGCKGNANRFETCLKCMKRCSGNNNARKICKKQTKKFLEENNLGSNRHHKKPSWPQLSIRIPFIEK

配列番号136 (トロンビンインヒビター, TTI=抗血栓性ペプチド [Glossina morsitans])
GEPGAPIDYDEYGDSSEEIG

配列番号137 (トロンビンインヒビター [Amblyomma americanum])
MEIKRCVHVLLTLATVYGTSVSISSICSLPQVKGNCRGIFEMWHYNSTKDTCSLFTYGGCGGNENRFENCTQCMESCSTNENRTEICQLLEKEADEDYYSGWDDNTGGDGYTAPPREAYDEDYDEE

配列番号138 (テロミン(Theromin))
ECENTECPRACPGEYEFDEDGCNTCVCKGCDDAQCRCSSDANGCESFCTCNTRCSAADECNPRCTCK

配列番号139 (モノビン(monobin) [Argas monolakensis])
MRLLALFAFAVAVVSAQRNQMCQQPRTQGSCDASNQITKFFYTGSGCTSAPVCSDTDGGYGTEDECIQACTVQGGHHNEGAGEEGCSGDPPRGDCGGQVEERYYFDSTTRTCQTFEYRGCSSGNPDNSYETEIECEIACPSASS

配列番号140 (トロンビンインヒビターに類似 [Hydra magnipapillata])
MCLRCRPCEPDLCPPRPLCNGGYVKGICGCCDTCAKVDGEECGGLWNMYGKCDVGFVCAQVKRHTKGVCVSVKKKSNNKENTCALKPETGPCRAAIKAWYYDYKTDTCKRFVYGGCGGNSNRFREKKMCQKTCYA
配列番号141 (トロンビンインヒビター サブユニット1)
EKFPAVNQKPQAAXL

配列番号142 (トロンビンインヒビターに類似 [Bos taurus])
MDALSEANGTFALTLLKKLGEGSSKNVFISPLSISSALAMVLMGARGNTAAQMCQTLSLNKSSGGGEDVHQGFQNLLSEVNRTDPRLLAQNRQRGFSGDKTYDFLSSFKDSCRXILPSRDGRAGLYQRYGAVQEAHKHLGS

配列番号143 (トリプシンインヒビター 1)
MATTMAKLITLVVLAILAFVEVSVSGYKTSISTITIEDNGRCTKSIPPICFPDGRP

配列番号144 (ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1)
MPVDLGKWSGPLSLQEVEERPQHALHVKYTGTEVDELGKVLTPTQVKNRPTSIAWDGLDPGKLYTLVLTDPDAPSRKDPKYREWHHFLVVNMKGNDISSGTVLSDYVGSGPPKGTGLHRYVWLVYEQSGPLKCDEPILSNRSGDHRGKFKVASFRKKYELGPPVAGTCYQAEWDDYVPKLCEQLSGK

配列番号145 (ボスロジャラシン(bothrojaracin)=トロンビン誘導血小板凝集インヒビター 15 kda ポリペプチド {N末端} [Bothrops jararaca])
DCPSDWSPYGQGCYXF

配列番号146 (トロンボスタシン [Haematobia irritans])
NINIMKHFVVIGILALSAVCQAQNVLSGRRQHGAQGLSGYSGDNDWGYYGEAGAPGSDYSGSSGQWAPLDFDYNSLPGLSGYNHEQQDYEEDSYRHVRSAGPITLQLDDDDDDDSGIPIFEMDDEDEDSNDNQKFPLSFERFPENEKNQVGLRARFNKFMAKFTSLFGRRRGVNVPNAA

配列番号147 (ヘマジン(hemadin) [Haemadipsa sylvestris])
CDCGEKICLYGQSCNDGQCSGDPKPSSEFEEFEIDEEEK

配列番号148 ( [Anopheles gambiae str. PEST])
MASKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTYDEEDFDEESLKPHSSSSSDDGEEEFDPSLLEEHADAPTARDPGRNPEFLRNSNTDEQASAPAASSSESDE

配列番号149 (アノフェリン様フネストリン(funestolin) [Anopheles funestus])
MATKLIVIAFLCAALIAVVQSAPQYAQGEEPTYDEDDDEPVKPHSSADPDASYEEFDPSQLTEYANTAQDPGRRPHFLEQANSNNGDQLPSQSDSSSESTEH

配列番号150 (唾液抗トロンビンアノフェリン [Anopheles stephensi])
MASKVIVIALLCIALAAFVQGAPQYTHGEEPEYDEDDGADEPVQPHSSSNHADTEDDFDLSLLDKPYANAPENADPGRRPEFLKQHNNENQSDSSSGSTEN
配列番号151 (唾液抗トロンビンペプチドアノフェリン [Anopheles darlingi])
MANKLFLISLLCVALVAKIAQAAPQYAPGEEPSYDEDTDDKLIENDTSITDEDYAEIEASLSQAFGTAADPGRRLGEGKKP

配列番号152 (唾液抗トロンビンペプチドアノフェリン [Anopheles albimanus])
MANKLVLISLLCVVLVAKITQAAPQYAPGDEPSYDEDTDDSDKLVENDTSITDEDYAAIEASLSETFNTAADPGRRLGEGSKP

配列番号153 (ヒルジン, * Yは硫酸化されている)
VYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEY*LQ

配列番号154 (合成ペプチド)
FEEIPEEYL

配列番号155 (合成ペプチド)
YEPIPEEA

配列番号156 (合成ペプチド)
NGDFEEIPEEYL

配列番号157 (合成ペプチド)
APPFDFEAIPEEYL

配列番号158 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号159 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号160 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
配列番号161 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号162 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号163 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号164 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号165 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号166 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号167 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号168 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号169 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号170 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号171 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号172 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号173 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号174 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号175 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号176 (改変型ヒルログ)
FPRXHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号177 (改変型ヒルログ)
FPRXHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号178 (改変型ヒルログ)
FPRXHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号179 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号180 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTGNGDFEEIPEEYL
配列番号181 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号182 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号183 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号184 (改変型ヒルログ)
FPRXHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号185 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号186 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号187 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号188 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号189 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号190 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号191 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号192 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号193 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号194 (改変型ヒルログ)
FPRMHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号195 (改変型ヒルログ)
FPRMHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号196 (改変型ヒルログ)
FPRMHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号197 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号198 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号199 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号200 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTAGNGDFEEIPEEYL
配列番号201 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号202 (改変型ヒルログ)
FPRMHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号203 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号204 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号205 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号206 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号207 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号208 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号209 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号210 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号211 (改変型ヒルログ)
FDPRMHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号212 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号213 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号214 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号215 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号216 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号217 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号218 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号219 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号220 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL
配列番号221 (改変型ヒルログ)
FPRMHRGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号222 (改変型ヒルログ)
FPRMHRGGNGDFEEIPEEYL

配列番号223 (改変型ヒルログ)
FPRMHRGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号224 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号225 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTGNGDFEEIPEEYL

配列番号226 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号227 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号228 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTANGDFEEIPEEYL

配列番号229 (改変型ヒルログ)
FPRMHRTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号230 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号231 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRGGNGDFEEIPEEYL

配列番号232 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号233 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号234 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTGNGDFEEIPEEYL

配列番号235 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号236 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号237 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTANGDFEEIPEEYL

配列番号238 (改変型ヒルログ)
FDPRMHRTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号239 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号240 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGNGDFEEIPEEYL
配列番号241 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号242 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号243 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号244 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号245 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号246 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号247 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号248 (改変型ヒルログ)
FPKMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号249 (改変型ヒルログ)
FPKMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号250 (改変型ヒルログ)
FPKMHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号252 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号253 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号254 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号255 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号256 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号257 (改変型ヒルログ)
FPKMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号258 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号259 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号260 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKGGGGNGDFEEIPEEYL
配列番号261 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号262 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号263 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号264 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号265 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号266 (改変型ヒルログ)
FDPKMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号267 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号268 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号269 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号270 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号271 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号272 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号273 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号274 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号275 (改変型ヒルログ)
FDPKXHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号276 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号277 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号278 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号279 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号280 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGNGDFEEIPEEYL
配列番号281 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号282 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号283 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号284 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号285 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号286 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号287 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号288 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号289 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号290 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号291 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号292 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号293 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号294 (改変型ヒルログ)
PRMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号295 (改変型ヒルログ)
PRMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号296 (改変型ヒルログ)
PRMHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号297 (改変型ヒルログ)
PRMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号298 (改変型ヒルログ)
PRMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号299 (改変型ヒルログ)
PRMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号300 (改変型ヒルログ)
PRMHKTAGNGDFEEIPEEYL
配列番号301 (改変型ヒルログ)
PRMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号302 (改変型ヒルログ)
PRMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号303 (改変型ヒルログ)
PRXHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号304 (改変型ヒルログ)
PRXHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号305 (改変型ヒルログ)
PRXHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号306 (改変型ヒルログ)
PRXHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号307 (改変型ヒルログ)
PRXHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号308 (改変型ヒルログ)
PRXHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号309 (改変型ヒルログ)
PRXHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号310 (改変型ヒルログ)
PRXHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号311 (改変型ヒルログ)
PRXHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号312 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号313 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号314 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号315 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号316 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号317 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号318 (改変型ヒルログ)
PRXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号319 (改変型ヒルログ)
PRXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号320 (改変型ヒルログ)
PRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL
配列番号321 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号322 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号323 (改変型ヒルログ)
PRXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号324 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号325 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号326 (改変型ヒルログ)
PRXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号327 (改変型ヒルログ)
PRXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号328 (改変型ヒルログ)
PRXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号329 (改変型ヒルログ)
PRXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号330 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号331 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号332 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号333 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号334 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号335 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号336 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号337 (改変型ヒルログ)
PKXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号338 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号339 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号340 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGNGDFEEIPEEYL
配列番号341 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号342 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号343 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号344 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号345 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号346 (改変型ヒルログ)
PKXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号347 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号348 (改変型ヒルログ)
RMHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号349 (改変型ヒルログ)
RMHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号350 (改変型ヒルログ)
RMHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号351 (改変型ヒルログ)
RMHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号352 (改変型ヒルログ)
RMHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号353 (改変型ヒルログ)
RMHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号354 (改変型ヒルログ)
RMHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号355 (改変型ヒルログ)
RMHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号356 (改変型ヒルログ)
RMHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号357 (改変型ヒルログ)
RXHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号358 (改変型ヒルログ)
RXHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号359 (改変型ヒルログ)
RXHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号360 (改変型ヒルログ)
RXHKTGGNGDFEEIPEEYL
配列番号361 (改変型ヒルログ)
RXHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号362 (改変型ヒルログ)
RXHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号363 (改変型ヒルログ)
RXHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号364 (改変型ヒルログ)
RXHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号365 (改変型ヒルログ)
RXHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号366 (改変型ヒルログ)
RXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号367 (改変型ヒルログ)
RXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号368 (改変型ヒルログ)
RXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号369 (改変型ヒルログ)
RXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号370 (改変型ヒルログ)
RXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号371 (改変型ヒルログ)
RXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号372 (改変型ヒルログ)
RXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号373 (改変型ヒルログ)
RXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号374 (改変型ヒルログ)
RXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号375 (改変型ヒルログ)
RXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号376 (改変型ヒルログ)
RXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号377 (改変型ヒルログ)
RXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号378 (改変型ヒルログ)
RXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号379 (改変型ヒルログ)
RXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号380 (改変型ヒルログ)
RXHXTGGGNGDFEEIPEEYL
配列番号381 (改変型ヒルログ)
RXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号382 (改変型ヒルログ)
RXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号383 (改変型ヒルログ)
RXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号384 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号385 (改変型ヒルログ)
KXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号386 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号387 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号388 (改変型ヒルログ)
KXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号389 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号390 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号391 (改変型ヒルログ)
KXHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号392 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号393 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号394 (改変型ヒルログ)
KXHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号395 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号396 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号397 (改変型ヒルログ)
KXHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号398 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号399 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号400 (改変型ヒルログ)
KXHXTANGDFEEIPEEYL
配列番号401 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号402 (改変型ヒルログ)
MHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号403 (改変型ヒルログ)
MHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号404 (改変型ヒルログ)
MHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号405 (改変型ヒルログ)
MHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号406 (改変型ヒルログ)
MHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号407 (改変型ヒルログ)
MHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号408 (改変型ヒルログ)
MHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号409 (改変型ヒルログ)
MHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号410 (改変型ヒルログ)
MHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号411 (改変型ヒルログ)
XHKGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号412 (改変型ヒルログ)
XHKGGNGDFEEIPEEYL

配列番号413 (改変型ヒルログ)
XHKGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号414 (改変型ヒルログ)
XHKTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号415 (改変型ヒルログ)
XHKTGNGDFEEIPEEYL

配列番号416 (改変型ヒルログ)
XHKTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号417 (改変型ヒルログ)
XHKTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号418 (改変型ヒルログ)
XHKTANGDFEEIPEEYL

配列番号419 (改変型ヒルログ)
XHKTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号420 (改変型ヒルログ)
XHXGGGNGDFEEIPEEYL
配列番号421 (改変型ヒルログ)
XHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号422 (改変型ヒルログ)
XHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号423 (改変型ヒルログ)
XHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号424 (改変型ヒルログ)
XHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号425 (改変型ヒルログ)
XHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号426 (改変型ヒルログ)
XHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号427 (改変型ヒルログ)
XHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号428 (改変型ヒルログ)
XHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号429 (改変型ヒルログ)
XHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号430 (改変型ヒルログ)
XHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号431 (改変型ヒルログ)
XHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号432 (改変型ヒルログ)
XHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号433 (改変型ヒルログ)
XHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号434 (改変型ヒルログ)
XHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号435 (改変型ヒルログ)
XHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号436 (改変型ヒルログ)
XHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号437 (改変型ヒルログ)
XHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号438 (改変型ヒルログ)
XHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号439 (改変型ヒルログ)
XHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号440 (改変型ヒルログ)
XHXGGGGNGDFEEIPEEYL
配列番号441 (改変型ヒルログ)
XHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号442 (改変型ヒルログ)
XHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号443 (改変型ヒルログ)
XHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号444 (改変型ヒルログ)
XHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号445 (改変型ヒルログ)
XHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号446 (改変型ヒルログ)
XHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号447 (改変型ヒルログ)
XHXGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号448 (改変型ヒルログ)
XHXGGNGDFEEIPEEYL

配列番号449 (改変型ヒルログ)
XHXGGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号450 (改変型ヒルログ)
XHXTGGNGDFEEIPEEYL

配列番号451 (改変型ヒルログ)
XHXTGNGDFEEIPEEYL

配列番号452 (改変型ヒルログ)
XHXTGGGNGDFEEIPEEYL

配列番号453 (改変型ヒルログ)
XHXTAGNGDFEEIPEEYL

配列番号454 (改変型ヒルログ)
XHXTANGDFEEIPEEYL

配列番号455 (改変型ヒルログ)
XHXTAGGNGDFEEIPEEYL

配列番号456 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGNGDYEPIPEEA

配列番号457 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGNGDYEPIPEEA

配列番号458 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号459 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGNGDYEPIPEEA

配列番号460 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGNGDYEPIPEEA
配列番号461 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号462 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGNGDYEPIPEEA

配列番号463 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTANGDYEPIPEEA

配列番号464 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号465 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGNGDYEPIPEEA

配列番号466 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGNGDYEPIPEEA

配列番号467 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号468 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGNGDYEPIPEEA

配列番号469 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGNGDYEPIPEEA

配列番号470 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号471 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGNGDYEPIPEEA

配列番号472 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTANGDYEPIPEEA

配列番号473 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号474 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGNGDYEPIPEEA

配列番号475 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGNGDYEPIPEE

配列番号476 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号477 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGNGDYEPIPEEA

配列番号478 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGNGDYEPIPEEA

配列番号479 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGGNGDFYEPIPEEA

配列番号480 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGNGDYEPIPEEA
配列番号481 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTANGDYEPIPEEA

配列番号482 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号483 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号484 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号485 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号486 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号487 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号488 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号489 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号490 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号491 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号492 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号493 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号494 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号495 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号496 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号497 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号498 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号499 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号500 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGNGDYEPIPEEA
配列番号501 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号502 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号503 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号504 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号505 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号506 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号507 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号508 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号509 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号510 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号511 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号512 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号513 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号514 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号515 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号516 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号517 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号518 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号519 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号520 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGNGDYEPIPEEA
配列番号521 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号522 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号523 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号524 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号525 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号526 (改変型ヒルログ)
PKXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号527 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号528 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号529 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号530 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号531 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号532 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号533 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号534 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号536 (改変型ヒルログ)
PKXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号537 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号538 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号539 (改変型ヒルログ)
KXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号540 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGNGDYEPIPEEA
配列番号541 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号542 (改変型ヒルログ)
KXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号543 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号544 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号545 (改変型ヒルログ)
KXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号546 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号547 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGNGDYEPIPEEA

配列番号548 (改変型ヒルログ)
KXHXGGNGDYEPIPEEA

配列番号549 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGNGDYEPIPEEA

配列番号550 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGNGDYEPIPEEA

配列番号551 (改変型ヒルログ)
KXHXTGNGDYEPIPEEA

配列番号552 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGNGDYEPIPEEA

配列番号553 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGNGDYEPIPEEA

配列番号554 (改変型ヒルログ)
KXHXTANGDYEPIPEEA

配列番号555 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGNGDYEPIPEEA

配列番号556 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号557 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号558 (改変型ヒルログ)
FPRMHKGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号559 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号560 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号561 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号562 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号563 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号564 (改変型ヒルログ)
FPRMHKTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号565 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号566 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号567 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号568 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号569 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号570 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号571 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号572 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号573 (改変型ヒルログ)
FDPRMHKTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号574 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号575 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号576 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号577 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号578 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号579 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号580 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号581 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号582 (改変型ヒルログ)
FDPRXHKTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号583 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGAPPFDFEAIPEEYLL

配列番号584 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号585 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号586 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号587 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号588 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号589 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号590 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号591 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL
FDPRXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号592 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号593 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号594 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号595 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号596 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号597 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号598 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号599 (改変型ヒルログ)
FDPRXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号600 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号601 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号602 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号603 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号604 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号605 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号606 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号607 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号608 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号609 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号610 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号611 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号612 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号613 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号614 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号615 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号616 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号617 (改変型ヒルログ)
FDPKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号618 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号619 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号620 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号621 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号622 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号623 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号624 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号625 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号626 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号627 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号628 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号629 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号630 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号631 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号632 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号633 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号634 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号635 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号636 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号637 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号638 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号639 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号640 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号641 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号642 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号643 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号644 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号645 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号646 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号647 (改変型ヒルログ)
PKXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号648 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号649 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号650 (改変型ヒルログ)
PKXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号651 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号652 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号653 (改変型ヒルログ)
PKXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号654 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号655 (改変型ヒルログ)
KXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号656 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号657 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号658 (改変型ヒルログ)
KXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号659 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号660 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号661 (改変型ヒルログ)
KXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号662 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号663 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号664 (改変型ヒルログ)
KXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号665 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号666 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号667 (改変型ヒルログ)
KXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号668 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号669 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号670 (改変型ヒルログ)
KXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号671 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号672 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号673 (改変型ヒルログ)
KXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号674 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号675 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号676 (改変型ヒルログ)
KXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号677 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号678 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号679 (改変型ヒルログ)
KXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号680 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL
配列番号681 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号682 (改変型ヒルログ)
KXHXGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号683 (改変型ヒルログ)
KXHXGGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号684 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号685 (改変型ヒルログ)
KXHXTGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号686 (改変型ヒルログ)
KXHXTGGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号687 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号688 (改変型ヒルログ)
KXHXTAAPPFDFEAIPEEYL

配列番号689 (改変型ヒルログ)
KXHXTAGGAPPFDFEAIPEEYL

配列番号690 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEIPEEDILN

配列番号691 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEIPEEDILN

配列番号692 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEIPEEDILN

配列番号693 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEIPDEDILN

配列番号694 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEIPDEDILN

配列番号695 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEIPDEDILN

配列番号696 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEIPEAYDE

配列番号697 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEIPEAYDE

配列番号698 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEIPEAYDE

配列番号699 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEAIPEAYDE

配列番号700 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEAIPEAYDE
配列番号701 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEAIPEAYDE

配列番号702 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEPIPEAYDE

配列番号703 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEPIPEAYDE

配列番号704 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEPIPEAYDE

配列番号705 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEFPEAYDE

配列番号706 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEFPEAYDE

配列番号707 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEFPEAYDE

配列番号708 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEAFPEAYDE

配列番号709 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEAFPEAYDE

配列番号710 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEAFPEAYDE

配列番号711 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEPFPEAYDE

配列番号712 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEPFPEAYDE

配列番号713 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEPFPEAYDE

配列番号714 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEIPDAYDE

配列番号715 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEIPDAYDE

配列番号716 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEIPDAYDE

配列番号717 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEAIPDAYDE

配列番号718 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEAIPDAYDE

配列番号719 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEAIPDAYDE

配列番号720 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEPIPDAYDE
配列番号721 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEPIPDAYDE

配列番号722 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEPIPDAYDE

配列番号723 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEEFPDAYDE

配列番号724 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEEFPDAYDE

配列番号725 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEEFPDAYDE

配列番号726 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEAFPDAYDE

配列番号727 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEAFPDAYDE

配列番号728 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEAFPDAYDE

配列番号729 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGNGDFEPFPDAYDE

配列番号730 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGNGDFEPFPDAYDE

配列番号731 (改変型ヒルジン)
FPRMHKGGGNGDFEPFPDAYDE

配列番号732 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGNGDFEEIEIDEE

配列番号733 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGGNGDFEEIEIDEE

配列番号734 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGGGNGDFEEIEIDEE

配列番号735 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGNGDFEEFEIDEE

配列番号736 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGGNGDFEEFEIDEE

配列番号737 (改変型ヘマジン)
FPRMHKGGGNGDFEEFEIDEE

配列番号738 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGVNDFEEIPEEYL

配列番号739 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGVNDFEEIPEEYL

配列番号740 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGGVNDFEEIPEEYL
配列番号741 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGVNDFEEIEIDEE

配列番号742 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGVNDFEEIEIDEE

配列番号743 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGGVNDFEEIEIDEE

配列番号744 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGVNDFEEFEIDEE

配列番号745 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGVNDFEEFEIDEE

配列番号746 (改変型ブーフィリン)
FPRMHKGGGVNDFEEFEIDEE

配列番号747 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYLDLEYL

配列番号748 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYLDLEYL

配列番号749 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYLDLEYL

配列番号750 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYVDLEYL

配列番号751 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYVDLEYL

配列番号752 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYVDLEYL

配列番号753 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYLDFEYL

配列番号754 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYLDFEYL

配列番号755 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYLDFEYL

配列番号756 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYVDFEYL

配列番号757 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYVDFEYL

配列番号758 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYVDFEYL

配列番号759 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYLDLDYL

配列番号760 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYLDLDYL
配列番号761 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYLDLDYL

配列番号762 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYVDLDYL

配列番号763 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYVDLDYL

配列番号764 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYVDLDYL

配列番号765 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYLDFDYL

配列番号766 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYLDFDYL

配列番号767 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYLDFDYL

配列番号768 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGNGDFDYVDFDYL

配列番号769 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGNGDFDYVDFDYL

配列番号770 (改変型ヘパリン補因子Ii)
FPRMHKGGGNGDFDYVDFDYL

配列番号771 (コンセンサス配列)
(N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド)

配列番号772 (合成ペプチド)
FEEIPEEYL

配列番号773 (合成ペプチド)
YEPIPEEA

配列番号774 (合成ペプチド)
NGDFEEIPEEYL

配列番号775 (合成ペプチド)
APPFDFEAIPEEYL

配列番号776 (BPTI - ウシ膵臓トリプシンインヒビター)
MKMSRLCLSVALLVLLGTLAASTPGCDTSNQAKAQRPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNDFKSAEDCMRTCGGAIGPWENL

Claims (50)

  1. 標的セリンプロテアーゼ（SP）の阻害の増大を示す改変型セリンプロテアーゼインヒビター（SPI）の作製方法であって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるようにSPIを改変するステップを含む方法。
  2. 標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基をSPIへ導入することを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 阻害持続時間の延長を示す改変型SPIを作製する、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 1以上の導入されるアミノ酸残基が置換又は挿入により導入される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基を含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン配列を含む、請求項5に記載の方法。
  7. 1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む、請求項6に記載の方法。
  8. 1以上の導入されるアミノ酸がメチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む、請求項7に記載の方法。
  9. 標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上の残基が触媒セリン残基を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. SPIを中和することが可能なようにSPIを改変するステップであって、SPIへのイオン電荷の領域の導入を含むステップ、をさらに含み、該イオン電荷の領域が中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  11. 導入されるイオン電荷の領域が、SPIのカルボキシ末端に対して導入される、請求項10に記載の方法。
  12. 導入されるイオン電荷の領域がアニオン電荷の領域である、請求項10又は11に記載の方法。
  13. 導入されるイオン電荷の領域が1以上の酸性残基を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 1以上の酸性残基が1以上のグルタミン酸(glutamine)残基を含む、請求項13に記載の方法。
  15. 中和剤が硫酸プロタミンである、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
  16. SPIがトロンビンインヒビターである、請求項1〜15のいずれか1項に記載のSPIの改変方法。
  17. SPIが配列番号14及び17〜153のいずれか1つからなる群より選択される、請求項16に記載のSPIの改変方法。
  18. 請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法により得ることができる又は得られた改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
  19. SPIがトロンビンインヒビターである、請求項18に記載の改変型SPI。
  20. コンセンサス配列：
    N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド) (配列番号771)
    を含む、請求項19に記載の改変型SPI。
  21. 配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列を含む若しくはそれからなる請求項19若しくは20に記載の改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
  22. 請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子。
  23. 請求項22に記載の核酸配列を含むベクター。
  24. 請求項23に記載のベクター又は請求項22に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  25. 被験者に請求項18〜21のいずれか1項に記載の改変型SPIを投与することを含む、標的SPの阻害方法。
  26. 血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、請求項19に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与することを含む方法。
  27. 被験者においてトロンビン阻害を中和する方法であって、
    （a）請求項19に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与するステップ、
    （b）続いて、トロンビン阻害の中和が生じるのに十分な量の硫酸プロタミンを被験者に投与するステップ
    を含む方法。
  28. 標的SPIの阻害の増大を示す改変型SPIであって、該SPIとその標的SPとの結合が、標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させるものである、改変型SPI。
  29. 標的SPの触媒3残基における1以上のアミノ酸残基、又は該アミノ酸残基の1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基を含む、請求項28に記載の改変型SPI。
  30. 阻害持続時間の延長を示す、請求項29に記載の改変型SPI。
  31. 標的SPの触媒3残基における1以上の残基、又はその1以上の原子を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基を含む、請求項29に記載の改変型SPI。
  32. 標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン配列を含む、請求項29に記載の改変型SPI。
  33. 標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン-リジン配列を含む、請求項32に記載の改変型SPI。
  34. 標的SPの触媒3残基における1以上の残基を変位させることができる1以上のアミノ酸残基がメチオニン-ヒスチジン-リジン-トレオニン配列を含む、請求項33に記載の改変型SPI。
  35. 標的セリンプロテアーゼの触媒3残基における、変位させられる1以上のアミノ酸残基が触媒セリン残基を含む、請求項28〜34のいずれか1項に記載の改変型SPI。
  36. 中和剤における逆のイオン電荷の領域と相互作用可能なイオン電荷の領域をさらに含む、請求項28〜34のいずれか1項に記載の改変型SPI。
  37. イオン電荷の領域が、SPIのカルボキシ末端に対して配置されている、請求項36に記載の改変型SPI。
  38. イオン電荷の領域がアニオン電荷の領域である、請求項36に記載の改変型SPI。
  39. イオン電荷の領域が1以上の酸性残基を含む、請求項36に記載の改変型SPI。
  40. 1以上の酸性残基が1以上のグルタミン酸（glutamine）残基を含む、請求項39に記載の改変型SPI。
  41. 中和剤が硫酸プロタミンである、請求項36〜40のいずれか1項に記載の改変型SPI。
  42. SPIがトロンビンインヒビターである、請求項28〜41のいずれか1項に記載の改変型SPI。
  43. コンセンサス配列：N末端ペプチド) -X1-H-X2-(G)n- (エキソサイトI 結合ペプチド) (配列番号771)
    を含む、請求項42に記載の改変型SPI。
  44. 配列番号158〜770のいずれか1つから選択される配列を含む若しくはそれからなる改変型SPI、又はその断片若しくは機能的等価物。
  45. 請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下にて請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIをコードする核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス核酸分子。
  46. 請求項45に記載の核酸配列を含むベクター。
  47. 請求項46に記載のベクター又は請求項45に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  48. 請求項28〜44のいずれか1項に記載の改変型SPIを投与することを含む、標的SPの阻害方法。
  49. 血液凝固障害に罹患している被験者を治療する又は血液凝固障害の発症から被験者を予防する方法であって、請求項42に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与することを含む方法。
  50. 被験者においてトロンビン阻害を中和する方法であって、
    （a）請求項42に記載の改変型トロンビンインヒビターを投与するステップ、
    （b）続いて、トロンビン阻害の中和が生じるのに十分な量の硫酸プロタミンを被験者に投与するステップ
    を含む方法。
JP2012509082A 2009-05-05 2010-05-05 セリンプロテアーゼインヒビターの改変方法 Pending JP2012525836A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0907698.5A GB0907698D0 (en) 2009-05-05 2009-05-05 Method of modifying serine protease inhibitors
GB0907698.5 2009-05-05
US25041209P 2009-10-09 2009-10-09
US61/250,412 2009-10-09
PCT/GB2010/000889 WO2010128285A2 (en) 2009-05-05 2010-05-05 Method of modifying serine protease inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2012525836A true JP2012525836A (ja) 2012-10-25
JP2012525836A5 JP2012525836A5 (ja) 2013-06-20

Family

ID=40792252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012509082A Pending JP2012525836A (ja) 2009-05-05 2010-05-05 セリンプロテアーゼインヒビターの改変方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20120135931A1 (ja)
EP (1) EP2427487A2 (ja)
JP (1) JP2012525836A (ja)
CN (1) CN102574909A (ja)
GB (1) GB0907698D0 (ja)
WO (1) WO2010128285A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020501561A (ja) * 2016-12-16 2020-01-23 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー 脳卒中および関係する凝固性障害の処置のためのトロンビン阻害剤
JP2021052793A (ja) * 2013-10-29 2021-04-08 オムリックス・バイオファーマシューティカルズ・リミテッドＯｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ． トロンビン活性を安定化させるための化合物及び方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1737889E (pt) 2004-10-19 2010-12-13 Lonza Ag Método para síntese de péptidos em fase sólida
WO2012075407A2 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Becton, Dickinson And Company Blood collection devices containing blood stabilization agent
CN103044542B (zh) * 2012-08-17 2015-08-19 常熟理工学院 鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用
GB201310949D0 (en) * 2013-06-19 2013-07-31 Cambridge Entpr Ltd Binding Motif
CN103641911B (zh) * 2013-12-17 2015-07-15 华中农业大学 大腹园蛛丝氨酸蛋白酶抑制剂AvSPI基因及其编码蛋白和应用
CN107849091B (zh) * 2015-04-16 2021-09-10 医诺生药开发有限公司 能够在人脂肪衍生的干细胞和肝细胞中抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物
WO2020024142A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Vanford Bio-Drug Development Limited Novel peptides and its derivatives capable of stimulating cytokine release
CN112759625B (zh) * 2019-10-18 2023-05-05 沛尔生技医药股份有限公司 肽作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途
WO2021152554A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 Fernando Biyagamage Ruchika Use of an anticoagulant inhibitor for the prevention of blood feeding by parasites or insects
CN115572329B (zh) * 2021-06-21 2024-02-06 王大勇 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法
CN115677850B (zh) * 2021-07-24 2024-03-08 王大勇 具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076484A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants
WO2008155658A2 (en) * 2007-06-18 2008-12-24 Institute Of Zoology Of The Slovak Academy Of Sciences Thrombin inhibitor

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196404B1 (en) * 1989-08-18 1996-09-10 Biogen Inc Inhibitors of thrombin
US5985833A (en) * 1996-09-17 1999-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Thrombin inhibitor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076484A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 National Research Council Of Canada Peptide inhibitors of thrombin as potent anticoagulants
WO2008155658A2 (en) * 2007-06-18 2008-12-24 Institute Of Zoology Of The Slovak Academy Of Sciences Thrombin inhibitor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5012012539; ＫＯＨ　ＣＨＯ　ＹＥＯＷ: 'ＶＡＲＩＥＧＩＮ，Ａ　ＮＯＶＥＬ　ＦＡＳＴ　ＡＮＤ　ＴＩＧＨＴ　ＢＩＮＤＩＮＧ　ＴＨＲＯＭＢＩＮ　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ　ＦＲＯＭ　ＴＨＥ　ＴＲＯＰＩＣＡＬ　ＢＯＮＴ　ＴＩＣＫ' ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ２８２　Ｎ４０, 20070806, Ｐ２９１０１-２９１１３, ＡＭＥＲＩＣＡＮ　ＳＯＣＩＥＴＹ　ＦＯＲ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩ *
JPN5012012540; ＫＯＨ　ＣＨＯ　ＹＥＯＷ: 'ＮＯＮＣＯＭＰＥＴＩＴＩＶＥ　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ　ＯＦ　ＴＨＲＯＭＢＩＮ' ＣＨＥＭＢＩＯＣＨＥＭ Ｖ１０　Ｎ１３, 200909, Ｐ２１５５-２１５８ *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021052793A (ja) * 2013-10-29 2021-04-08 オムリックス・バイオファーマシューティカルズ・リミテッドＯｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ． トロンビン活性を安定化させるための化合物及び方法
JP7102498B2 (ja) 2013-10-29 2022-07-19 オムリックス・バイオファーマシューティカルズ・リミテッド トロンビン活性を安定化させるための化合物及び方法
JP2020501561A (ja) * 2016-12-16 2020-01-23 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー 脳卒中および関係する凝固性障害の処置のためのトロンビン阻害剤
JP2022130527A (ja) * 2016-12-16 2022-09-06 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー 脳卒中および関係する凝固性障害の処置のためのトロンビン阻害剤

Also Published As

Publication number Publication date
US20120135931A1 (en) 2012-05-31
GB0907698D0 (en) 2009-06-10
EP2427487A2 (en) 2012-03-14
WO2010128285A2 (en) 2010-11-11
CN102574909A (zh) 2012-07-11
WO2010128285A3 (en) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2012525836A (ja) セリンプロテアーゼインヒビターの改変方法
ES2753183T3 (es) Aplicación terapéutica de inhibidores de la proteasa de serina de tipo Kazal
Corral-Rodríguez et al. Tick-derived Kunitz-type inhibitors as antihemostatic factors
Macedo-Ribeiro et al. Isolation, cloning and structural characterisation of boophilin, a multifunctional Kunitz-type proteinase inhibitor from the cattle tick
JP5699393B2 (ja) トロンビンインヒビター
US5373090A (en) Aprotinin analogues and a process for the production thereof
JPH09509838A (ja) クニッツドメイン拮抗剤蛋白質
JPH11511963A (ja) クニッツタイプのプラスマカリクレイン阻害剤
Campos et al. The Kazal-type inhibitors infestins 1 and 4 differ in specificity but are similar in three-dimensional structure
SI9520043A (en) Methods of producing effective recombinant serine protease inhibitors and uses of these inhibitors.
Iyer et al. Avathrin: a novel thrombin inhibitor derived from a multicopy precursor in the salivary glands of the ixodid tick, Amblyomma variegatum
Rios-Steiner et al. Active and exo-site inhibition of human factor Xa: structure of des-Gla factor Xa inhibited by NAP5, a potent nematode anticoagulant protein from Ancylostoma caninum
EP3310807B1 (en) Novel thrombin inhibitors
CN101395274A (zh) 嵌合Kunitz结构域及其用途
EP3604329A1 (en) Recombinant protein and fragments thereof, method for producing said recombinant protein, synthetic gene and use of the sculptin or recombinant protein for preparing a medicament or pharmaceutical composition for the prophylaxis and/or treatment of thromboembolic diseases or as a direct and specific inhibitor of thrombin
AU2008214916B2 (en) Therapeutic application of Kazal-type serine protease inhibitors
WO2009123573A1 (en) Anticoagulants derived from naja nigricollis snake venom
TW200846356A (en) Preparation and use of variants of the kunitz domain 2 of the human placental bikunin gene
Arni Active and Exo-site Inhibition of Human Factor Xa: Structure of des-Gla Factor Xa Inhibited by NAP5, a Potent Nematode Anticoagulant
JPH07242700A (ja) 新規ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130430

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130430

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140924

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20141222

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20150109

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20150109

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150623

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151022

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20151029

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20160108