KR101437408B1 - 플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 및 항섬유소용해용 조성물 - Google Patents

플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 및 항섬유소용해용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미(Areneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물 또는 항섬유소용해용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 단백질을 구성하는 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 상기 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질은 플라스민 및 엘라스타아제 저해활성이 우수하여 염증 억제제 및 항섬유소용해제로써, 유용하게 사용할 수 있다.

Description

플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제 및 항섬유소용해용 조성물{Kunitz-type serine protease inhibitor derived from Araneus ventricosus having antielastolytic or antiplasmin function and composition for inhibiting inflammation and fibrinolysis comprising the same}
본 발명은 플라스민 및 엘라스타아제 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 조성물에 관한 것이다.
다양한 생물에서 발견되는 세린 프로테아제 저해 단백질은 혈액응고 기작 (blood coagulation), 섬유소용해기능 (fibrinolysis) 및 염증 (inflammation) 제거와 같은 다양한 생리 과정 (physiological process)에 관여하기 때문에 새로운 약제 개발의 잠재성과 함께 많은 주목을 받고 있다[Masci PP et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 11:385-393(2000); Corral-Rodriguez MA et al., Insect Biochem. Mol. Biol., 39:579-595(2009); Flight SM et al., British J. hematol., 145:207-211(2009)]. 특히, 뱀(snake) 독액(venom) 세린 프로테아제 저해 단백질은 항섬유소용해나 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)과 같은 세린 프로테아제 저해 단백질로서 잘 알려져 있다 [Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859; Flight S. et al., Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34:188-193; Shafqat J. et al. FEBS Lett.1990;275:6-8.]. 벌에서 세린 프로테아제 저해 단백질에 대한 연구로는 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에서 키모트립신(chymotrypsin)과 카텝신 G(cathepsin G) 저해 효과가 있는 세린 프로테아제 저해 단백질이 보고되었고 [Bania DR et al., Eur. J. Biochem., 262:680-687(1999); Cierpicki T et al., Protein Sci., 9:976-984(2000)], 호박벌(Bombus ignitus)에서 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 항섬유소용해 기능이 보고되었다 [Choo YM et al. PLoS ONE 7:e10393(2012)].
최근에 타란튤라 거미에서 쿠니츠 타입 독소 단백질들에 대한 보고와 함께 트립신과 키모트립신 저해 효과뿐만 아니라 칼륨 이온 저해(K+ channel blocking)기능이 알려져있다[Yuan CH et al., PLoS ONE.2008;3:e3414; Liang S, Toxicon . 2004;43:575-585]. 그러나 아직까지 섬유소 분해에 주요한 역할을 하는 플라스민(plasmin)의 활성을 저해하고 아울러 염증에 주요한 역할을 하는 사람 뉴트로필 엘라스타제 (human neurophil elastase) 활성을 저해하는 거미 유래 세린 프로테아제 저해 단백질의 유전자나 기능에 대해서는 보고된 바가 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 산왕거미(Araneus ventricosus)유래 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질(Kunitz-type serine protease inhibitor; AvKTI)의 유전자를 클로닝하고, 이를 곤충세포주에 형질전환하여 생산된 단백질이 염증에 주요한 역할을 하는 사람의 플라스민(plasmin) 및 뉴트로필 엘라스타제 (human neutrophil elastase)활성을 저해함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 플라스민 및 엘라스타제의 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 및 항섬유소용해용 약학 조성물을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라스민 및 엘라스타제의 저해 활성을 갖는 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 및 항섬유소용해용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 단백질을 구성하는 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 상기 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질은 플라스민 및 엘라스타제 저해활성이 우수하여 염증 저해제 및 항섬유소용해제로서, 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질과 다른 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질과 상동성을 나타낸 도이다[화살표: 신호서열(signal sequence)의 절단 부위; 별표 (asterisk): P1 영역; 검정색 원(solid circle): 보전된 이황화 결합을 이루는 시스테인 잔기].
도 2는 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 당쇄를 염색한 도이다.
도 4는 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 키모트립신 및 트립신에 대한 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 플라스민 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 섬유소 고체배지에서 플라스민 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 뉴트로필 엘라스타제(human neutrophil elastase)저해 활성을 나타낸 도이다.
본 발명은 플라스민 및 엘라스타제의 저해 활성을 갖는 산왕거미(Araneus ventricosus)유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
보다 구체적으로는, 본원 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해제의 아미노산 서열 및 상기 세린 프로테아제 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 하기와 같이 분리하였다.
산왕거미 충체로부터 추출한 poly(A) 및 mRNA를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 유전자 발현 꼬리표(expressed sequence tags, ESTs)를 분석하였다. 산왕거미 ESTs 분석에 의해 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 유전자의 cDNA를 클로닝하였고, 이를 서열번호 1에 나타내었다. 또한, 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 cDNA로부터 번역한 아미노산 서열의 데이터베이스 분석 결과를 서열번호 2에 나타내었다.
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 유전자는 산왕거미에서 처음 분리된 것으로 아직까지 그 특징이 보고되고 있지 아니한 바, 본 발명에서 최초로 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제를 코딩하는 유전자의 서열을 밝혀, 상기 유전자는 NCBI GenBank database에 승인번호 JX844659 (cDNA)을 2012년 9월 19일에 등록하였다.
본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 cDNA를 분리하여 염기서열을 분석한 결과 얻어진 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 유전자의 cDNA는 종결코돈까지 그 길이가 513 bp인 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 코딩하는 단백질은 19개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal sequence) 및 94개의 아미노산으로 이루어진 프로 텝티드 영역(pro-peptide region)이었고, 57개의 아미노산으로 성숙 펩타이드(mature peptide)가 이루어져 있고, 7.2KDa의 계산상 분자량과 전기영동 상에서 13 kDa의 분자량을 가진다.
상기 산왕거미(Araneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해제 유전자가 코딩하는 아미노산 서열은 기존의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 제해 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다
또한, 본 발명은 상기 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)와 벡터 백본(backbone)을 포함한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 진핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 진핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 [Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)] 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 [pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980)]가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 산왕거미 유래 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 곤충 베큘로 바이러스로부터 발현시킨 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에서의 용어 ‘재조합 단백질’이란 두 개 혹은 그 이상의 DNA를 유전자 재조합 기술로 이어 붙여 만든 재조합 DNA에서 만들어지는 단백질이다.
상기 재조합 DNA기술을 통해 과거 자연 상태부터 미량으로 밖에 얻을 수 없던 의료용 단백질 또는 산업용 효소 등을 박테리아(예컨대 E. coli)와 동물세포 등을 이용하여 합성할 수 있다. 박테리아(예컨대 E. coli)를 비롯한 효모(Yeast)와 동물 세포(Mammalian cell)의 발효 및 배양, 의약품 원료 수준의 정제 과정을 통하여 합성 가능하다. 재조합 단백질로 합성된 예로, hGH (Human growth hormone), INS (Insulin), Interleukine 등이 있다.
또한, 본 발명은 산왕거미 유래의 쿠니츠 세린 프로테아제 저해 단백질을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 또는 항섬유소용해용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 세린 프로테아제 저해 단백질은 엘라스타아제 및 플라스민에 대한 저해활성이 우수하여, 염증 억제제 또는 항섬유소용해제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 산왕거미 유래의 쿠니츠 세린 프로테아제 저해 단백질과 함께 염증억제 효과 또는 항섬유소용해 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 산왕거미 유래의 쿠니츠 세린 프로테아제 저해 단백질의 일일 투여량은 0.1~100 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 염증 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 유전자 클로닝 .
산왕거미(Araneus ventricosus) 충체로부터 추출한 poly(A) 및 mRNA를 이용하여 상용화된 키트인 Uni-ZAP XR 벡터와 Gigapack III Gold Packing Extract(Stratagene 사, 미국)에 의해 cDNA 라이브러리를 제작하고, 유전자 발현 꼬리표(expressed sequence tags, ESTs)를 분석하였다. DNA 추출은 상용화 키트인 Wizard mini-preparation 키트(Promega 사, 미국)를 사용하였다. DNA 염기서열은 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems 사, 미국)로 서열을 분석하였다. 그 염기서열들은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 BLAST 프로그램에 의해 비교하였다.
이의 결과, 산왕거미 ESTs 분석에 의해 170개의 아미노산을 코딩하고 있는 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질 유전자의 cDNA를 클로닝하였고, 이를 서열번호 1에 나타내었다. 또한, 산왕거미 유래의 세린 프로테아제 저해 단백질의 cDNA로부터 번역한 아미노산 서열의 데이터베이스 분석 결과를 서열번호 2에 나타내었다.
상기 서열의 BLAST 프로그램에 의해 분석결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 회색 쉬파리(grey fleshfly; Neobellieria bullata)의 체액으로부터 분리된 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질(GenBank 승인 번호:P26228) 및 누에(Bombyx mori)와 비교적 높은 상동성을 보이며, 3개의 이황화 결합(disulfide bond)을 이루는 시스테인(cysteine) 잔기들이 잘 보전되어 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2] 재조합 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 발현하는 벡터의 제조 및 곤충세포주에서 발현확인.
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 발현하기 위하여, 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 cDNA를 곤충 베큘로바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) 전이벡터 pBAC8(Clontech 사, 미국)에 삽입한 뒤, 전이벡터 (500 ng)와 비에이시고자 (bAcGOZA) 바이러스 DNA (100 ng) [Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)]를 함께 리포펙틴(Lipofectin; Clonetech 사)을 이용하여 곤충세포주 Sf9(Spodoptera frugiperda 9)에 공-형질감염(co-transfection)하였다. 5일 후 배양액을 수거하여 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 발현하는 재조합 베큘로 바이러스를 제작하였다. 재조합 베큘로바이러스는 Sf9 세포주에서 증식하였고, 재조합 AcCI는 MagneHisTM protein purification system (Promega 사, 미국)을 이용하여 분리하였다. 분리된 산왕거미 유래의 재조합 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 전기영동사진은 도 2에 나타내었으며, 당쇄 염색 결과는 도 3에 나타내었다.
도 2 및 3에 나타난 바와 같이, 산왕거미 유래의 재조합 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질은 당쇄가 부가됨으로써 계산상으로 분자량이 7.2 kDa이고, 전기영동 상에서 13 kDa의 분자량을 나타내는 당단백질 염색 결과를 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3] 산왕거미 유래 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질의 활성 검증
1. 트립신 또는 키모트립신 저해활성 확인
세린 프로테아제를 저해하는 단백질로서의 특성을 검증하기 위해, 세린 프로테아제의 대표적인 트립신(trypsin)과 키모트립신(chymotrypsin)을 저해하는지 확인하기 위하여 100 nM의 트립신(Sigma 사, 미국)과 100 nM 알파 키모트립신(Sigma 사, 미국)에 세린 프로테아제 재조합 단백질을 0~200 nM의 농도별로 20 mM CaCl2와 0.05% Triton X-100를 포함하는 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충액에서 처리하였다. 37℃에서 30 분간 기질 없이 반응시킨 후, 트립신 기질 0.5 mM BApNA(Sigma 사, 미국)와 키모트립신 기질 0.5 mM Suc-AAPF-pNA(Sigma 사, 미국)를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. O.D 405 nm에서 반응을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 키모트립신 및 트립신에 저해활성을 보였다. 보다 구체적으로, 트립신에서 50% 저해농도 IC50은 43.39nM이고 알파 키모트립신의 IC50은 109.25nM이었다.
2. 플라스민 저해활성 확인
본 발명의 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 항섬유소용해제로서의 사용가능성을 확인하기 위하여, 플라스민(plasmin) 저해 활성을 확인하였다.
보다 구체적으로, 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 사람 플라스민(Singma사; 미국에 농도별로 50mM Tris-HCL(pH 7.4)완충액에 처리하여, 37℃에서 30분 동안 기질 없이 반응시키고, 0.5mM S-2251 기질(Chromogenix 사; 스웨덴)을 가한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. O.D 405nm에서 상기 반응을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
또한, 플라스민의 피브린 용해 활성을 저해하는지 가시적으로 확인하기 위하여, 피브린 플레이트 검증(fibrin plate assay)를 수행하였다.
보다 구체적으로, 0.6% 피브리노겐 10ml에 3 유닛(unit)의 트롬빈을 처리하여 피브린 플레이트를 준비하고, 플라스민(1㎍)과 산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제(50㎍ 또는 100㎍)을 처리하여 37℃에서 반응시키고 시간별로 용해된 영역(white zone)을 사진 촬영하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 플라스민에 대한 50% 저해 농도는 10.07nM로 플라스민에 대한 강한 저해 활성을 가짐을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 플라스민의 피브린 용해 능력이 본 발명의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 농도에 따라 현저히 감소됨을 확인하였다.
상기의 결과, 본 발명의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질은 플라스민 저해 활성이 우수하여, 항섬유소억제제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
3. 엘라스타제 저해활성 확인
염증과 관련된 세린 프로테아제인 엘라스타제에 대한 저해 활성을 확인하기 위하여, 사람 뉴트로필 엘라스타제(human neutrophil elastase)에 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질을 0~200 nM의 농도별로 50 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액에서 처리하여 37℃에서 30분 동안 기질 없이 반응시키고, 0.5 mM S-4760 기질(Sigma 사, 미국)을 첨가 후, 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다.
O.D 405 nm에서 반응을 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질의 50% 저해 농도는 446.93nM로 비교적 높은 저해 활성을 나타남을 확인하였다.
상기의 결과, 산왕거미 유래 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질은 엘라스타제 활성이 우수함을 확인하였고, 이를 이용하여 염증을 억제할 수 있음을 확인하였다.
제제예 1 : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 200 ml 유당 100 ml
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 200 ml
옥수수전분 100 ml
유당 100 ml
스테아르산 마그네슘 2 ml
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 200ml
옥수수전분 100ml
유당 100ml
스테아르산 마그네슘 2ml
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사제의 제조
산왕거미 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질 200ml
만니톨 100ml
Na2HPO4 ·2H2O 2ml
주사용 멸균 증류수 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2) 상기의 성분을 혼합하여 주사제를 제조하였다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Kunitz-type serine protease inhibitor derived from Araneus ventricosus having antielastolytic or antiplasmin function and composition for inhibiting inflammation and fibrinolysis comprising the same <130> P-1-39 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is DNA sequence coding Kunitz-type serine protease inhibitor derived from Araneus ventricosus <400> 1 atccagcatg gctaaactgt tgtgcacttt gttcctggca ggctttgtct ttctggcaaa 60 tgcctacagt acggatccgc cgaatccccc cgatattgaa aatgtttttg acgggattcc 120 cagcattttc aatccggtca attggatttc taatattgcc agctttttta atccttctaa 180 ctgggtttcc aatattccaa gcatcttgaa tcctgtaaat tgggttaaaa agattatcga 240 cattaataat cctttcacct acattcccga ttttctgaat cctttccact actttcccaa 300 actgaatcct ataaaatgga tccctggatg gattcctggt ttgggtaaag atagatgcct 360 tcttccgaag gtaacaggac cttgcaaagc tagtctgacc cgttactatt atgacaagga 420 caccaaagca tgcgtggaat tcatctacgg tggctgcaga ggaaacagga acaatttcaa 480 acagaaagat gagtgcgaaa aagcctgcac ggatcactaa cataaactct ctgatggatc 540 tcggacagcg tgaaggatgc atggaaaagc aattttaata tgagcaccaa taatttattt 600 caaaactact tttgcatatt tgtacttaat tgatcgcgtt cttttgttaa aataaaatat 660 tttttgtgga cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 701 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is amino acid sequence for Kunitz-type serine protease inhibitor derived from Araneus ventricosus <400> 2 Met Ala Lys Leu Leu Cys Thr Leu Phe Leu Ala Gly Phe Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Asn Ala Tyr Ser Thr Asp Pro Pro Asn Pro Pro Asp Ile Glu Asn 20 25 30 Val Phe Asp Gly Ile Pro Ser Ile Phe Asn Pro Val Asn Trp Ile Ser 35 40 45 Asn Ile Ala Ser Phe Phe Asn Pro Ser Asn Trp Val Ser Asn Ile Pro 50 55 60 Ser Ile Leu Asn Pro Val Asn Trp Val Lys Lys Ile Ile Asp Ile Asn 65 70 75 80 Asn Pro Phe Thr Tyr Ile Pro Asp Phe Leu Asn Pro Phe His Tyr Phe 85 90 95 Pro Lys Leu Asn Pro Ile Lys Trp Ile Pro Gly Trp Ile Pro Gly Leu 100 105 110 Gly Lys Asp Arg Cys Leu Leu Pro Lys Val Thr Gly Pro Cys Lys Ala 115 120 125 Ser Leu Thr Arg Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asp Thr Lys Ala Cys Val Glu 130 135 140 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Arg Asn Asn Phe Lys Gln Lys 145 150 155 160 Asp Glu Cys Glu Lys Ala Cys Thr Asp His 165 170

Claims (9)

  1. 플라스민 및 엘라스타제의 저해 활성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 산왕거미(Areneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질(Kunitz-type serine protease inhibitor; AvKTI).
  2. 제 1항의 산왕거미(Areneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 베큘로 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 베큘로 바이러스는 산왕거미(Areneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 재조합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
  6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 산왕거미(Areneus ventricosus) 유래의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 억제용 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 단백질은 엘라스타제의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 염증 억제용 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
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