JPH04502252A - アンクロドタンパク質及び血栓塞栓症及び糸球体腎炎用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アンクロトタンパク質、その製造及び使用技術分野 本発明は、アンクロトタンパク質（Ａｎｃｒｏｄ−Ｐｒｏｔｅ　１ｎｅ）、その 製造及び予防及び疾病治療のために該タンパク質を使用することに関する。

背景技術 アンクロトは、マレー産マムシ［アゲキストロトン・ロドストーｖ（Ａｇｋｉｓ ｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄ。

ｓｔｏｍａ）］の毒から製出されかつ凝固防止性を有する、フィブリノーゲン分 解酵素である（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１３１，７９９．１９７３）。

アンクロトは、約３８０００ダルトンの分子量及び約３８％の炭水化物分を有す る。

アンクロトの製造方法は高価である。極めて有毒なマレー産マムシはヘビ飼育場 で飼育し、手によって欅毒しなければならず、その後この分泌物の生化学的後処 理を行ってアンクロトを単離することができる。このようにして製出されたアン クロトの使用期間は限定されている。それというのも６〜８週間後には、おそら くアンクロトの作用を無効にする抗体の形成に帰因す毬抵抗現象が発生する可能 性があるからである。まれにはまた出血性合併症も起る。

ところで、治療的適用及び製造に関して従来得られたアンクロトよりも優れてい るアンクロトタンパク質が見出され、純粋に製造された。

発明の開示 本発明の対象は、次のアミノ酸配列： Ｉ　ＶＩＧＧＤＥＣＮＩＮ　ＥＨＲＦＬＶＡＶＹＥ　ＧＴＸ’ＷＴＦＩＣＧＧＶ Ｌ［ＨＰＥＷＶＩＴ　ＡＥＨＣＡＲＲＲＭＮ５１　ＬＶＦＧＭＨＲＫＳＥ　ＫＦ ＤＤＥＱＥＲＹＰ　ＫＫＲＹＦ［ＲＣＸ”ＫＴＲＴＳＷＤＥＤＩＭ　ＬＩＲＬＮ ＫＰＶＸ”Ｎ１０１　５ＥＨ１ＡＰＬＳＬＰ　５ＮＰＰｒＶＧＳＤ（：　ＲＶＭ （ＪＧＳＩＮＲＲＩＨＶＬＳＤＥＩ’ＲＣＡＮＩＮＬＨＸ’ＦＴ１５１　ＭＣＨ ＧＬＦＲＫＭＰ　ＫＫＧＲＶＬＣＡＧＤ　ＬＲＧＲＲＤＳＣＮＳＤＳＧＧＰＬＩ ＣＮＥ　ＥＬＨＧＩＶＡＲＧＰ２０１　ＮＰＣＡＱＰＮＫｌ’Ａ　ＬＹＴＳＶＹ ＤＹＲＤ　ＷＶＮＮＶＩＡＧＸ’Ａ　ＴＣＳＰ［前記配列中Ｘ１．Ｘ！、Ｘ　” 　ｓ　Ｘ　’　及’Ｃ！　Ｘ　’　ｌｔ　天ｌｅｔ　α−アミノ酸の残基である コを有する純粋グリコジル化、部分グリコジル化又は不グリコシル化ポリペプチ ドである。

前記配列中の個々の文字はアミノ酸を表わす（参照：Ｌｕｂｅｒｔ　５ｔｒｙｅ ｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ。

１９７９、Ｓ、１２．Ｓ、Ｒ，Ｖｉｅｗｅｇ）。

同じか又は異なっていてもよいアミノ酸基Ｘ１％Ｘ！、ｘ３、Ｘ’及びＸ’ｉ＊ Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ。

Ｒ，Ｐであり、好ましくはＮ、Ｑ、Ｓ及びＴであり、特にＮ及びＱである。

また本発明は、前記タンパク質をコードしているＤＮＡ塩基配列及び同ＤＮＡ塩 基配列を含むベクターに関する。

本発明によるタンパク質は、公知方法により遺伝子工学的に製造することができ る。

すなわち、マレー産マムシ（Ａｇｋｉｇｔｒｏｄ。

ｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）の膝組縁からｍＲＮＡを単離し、二重鎖ｃＤＮＡに 変換することができる。このｃＤＮＡを市販のクローニングベクター、例えばλ ｇｔ　１０中に挿入することによりｃＤＮＡライブラリーが得られる。この際使 用される方法は、例えばＭａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ等：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ、（１９８２）において調べることができる。

＊たしばしば使用される公知方法は放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブ を用いるこのような遺伝子バンクの選抜である。この方法によればオリゴヌクレ オチドプローブに対して相同性を有するｃＤＮＡ−クローンを分離し、特性化す ることができる。この方法は“ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｖｏｌｌ、ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、１９８５に記載されている。

このように特性化されたｃＤＮＡは、制限酵素によって容易に得られる。この除 土じる断片を、場合により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプター 又は遺伝子断片と組合せて、タンパク質をコードする配列をクローニングするた めに使用することができる。遺伝子断片又は合成りＮＡ塩基配列をクローニング ベクター、例えば市販のプラスミドＭ１３ｍｐ又はｐｋｋ−２２３−３中に組込 む操作は公知法で行う。

また遺伝子又は遺伝子断片も、タンパク質の発現を可能にする、化学的に合成さ れた適当な又は細菌、ファージ、真核細胞又はそれらのウィルスから分離された １１節領域も有していてもよい。

同様に、このようにして得られたハイブリッドプラスミドによる適当な宿主生物 の形質転換及びこのようなプラスミドの宿主への移入も公知であり、詳細に記載 されている［Ｍ、Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｆ　１６　（１９７９） ７７７−７８５；Ｆ、Ｌ。

Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ａ、Ｊ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５ ２（１９７３）４５６〜４６７］、またハイブリッドプラスミドは、培地中への ポリペプチドの分泌を許す適当なシグナル配列を有していてもよい。

哺乳動物細胞における発現の場合には、発現すべき遺伝子、この場合には“アン クロト”−ｃＤＮＡを、マウスのメタロチオネイン−又はウィルス５Ｖ４０−プ ロモーターの調節下に、挿入するベクターを使用することができる（Ｊ、Ｐａｇ ｅ　Ｍａｒｔｉｎ、Ｇｅｎｅ、３７　（１９８５）１３９〜１４４）、遺伝子発 現のためには、アンクロトタンパク質のメチオニン開始コドン及び遺伝子のリー ダー配列／前記列の存在が必要である。この際エビソームとしての前記ベクター 又はゲノムに組込まれた同ベクターの複製を有するクローンを分離する。特に、 ウシ乳頭腫ウィルスをペースとする外来遺伝子の組込み及び発現が有利である。

細菌細胞における複製及び抗生物質耐性をコードする原核配列と相俟って“シャ トル１ベクターの構成も可能である。プラスミドの構成及び増殖は先ず細菌細胞 で行われる０次にこのプラスミドを、真核細胞、倒えばマウスの繊緒芽細胞系ｃ １２７に移す。

またクローン化されたｃＤＮＡ発現のためには、他の細胞系、例えば酵母及び他 の真菌類、昆虫細胞及び動物及びヒトの細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣｏＳ細胞、 Ｌ細胞及び２９３細胞も、適当な発現ベクターと組合せて使用することができる 。

これらの真核発現系は、その生産物を有効にかつ大抵自然の形で分離することが できるという利点を有する。さらに該発現系は、それらの生産物を翻訳直後に修 飾する能力を有する。

すなわちアンクロトタンパク質は真核細胞における発現の際になおグリコシド側 鎖を得る。この側鎖は細菌で生成されたポリペプチドの場合には欠けている。

また同グリコシド側鎖は適当なグリコシダーゼによって酵素により完全に又は部 分的に除去することもできる。細菌で発現された大抵の真核タンパク質は、細胞 内で変性された封入体として生じかつタンパク質化学的に復元しなければならな い、さらに細菌も度々、完成タンパク質から開始アミノ酸・メチオニンを脱離す ることはできない、これらの難点は分泌系を使用することによって回避すること ができる。（Ｄｏｎａｌｄ○ｌ　Ｉ　Ｖ　ｅ　ｒ　、　Ａ　ｎ　ｎ　、　Ｒｅ　 Ｖ　、　Ｍ　Ｉ　Ｃｒ　Ｏｂ　ｌ　ＯＩ　。

ｙｅｂ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｈｅ　ＥＭＥＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．２４３ ７〜２４４２）。

しかしまた、アンクロトタンパク質の発現のために例えば化学的に合成された、 異なるＤＮＡ塩基配列を有する遺伝子を使用してもよい、クローン化された遺伝 子を用いて類似作用を有するアンクロトタンパク質の変種を製出することができ る。

該変種をコードするＤＮＡは、最初にクローン化された遺伝子から、突然変異誘 発（挿入、欠落、点突然変異、ハイブリッド形成）によって生じた。

得られたポリペプチドの精製は、公知法により該ポリペプチドをアフィニティー クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水クロマトグラフィ ーによって培地から分離することによって行う。

本発明によるポリペプチドは、純粋な形で、つまりマムシの有毒膀分泌物からの 出血性残苗物を含まず。

９７％を越える純度で得られる。

また本発明の対象は、場合によっては薬剤学的に許容されるキャリヤー又は結合 剤中に本発明により製出されたアンクロトタンパク質を含有する薬剤であるあま た該薬剤は、本発明により製出されたアンクロトタンパク質と薬理学的に有効な 他の治療薬、例えば血栓崩壊剤（ｔ　ＰＡ、ストレプトキナーゼ）、ヒルジン又 はトロンボキサンレセプターアンタゴニストとの組合せであってもよい。

本発明の他の態様は実施例で詳述する。

さらに遺伝子工学的方法に関しては、例えばＭ　ａ　ｎ１ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ 、の案内書、’Ｍｏ１ｅｃｕｊａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″’、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２又は“ＤＮＡ　ｃ１ｏｎｉ ｎｇ″ＶｏｌＩ〜ＩＩＩＩＲＩ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５−８７、Ｄ、Ｍ、Ｇ１゜ ｖｅｒｌｉを参照されたい。

本発明によるポリペプチドは、糸球体腎炎、心臓梗塞、非虚血性卒中発作、末梢 動脈血流障害（特に閉塞性粥状硬化症、閉塞性血栓血管炎、ＭｐＡ性小血管病及 びレイノー病）、不安定狭心症１重度の静脈血栓症及び他の血栓症、血栓崩壊治 療後の再血栓形成、動脈又は静脈のプラスチック血管の移植時の及び体外循環に おける血栓症の回避のための血管外科的手術後の再血栓形成の治療のために適し ている。

本明細書にに載した純粋ポリペプチドは、マムシから分離されたアンクロトの投 与後に時々観察される出血及び栓塞栓合併症を生じない、さらに、糖構造に関し てマムシ毒から単離された酵素と相違する該ポリペプチドは、抵抗現象を生じる ことなく、マムシ毒から調製される製剤よりも著しく長く投与されうるという利 点も有する。

該アンクロトタンパク質は、生理学的に許容される溶液の形で使用する。溶液は 有利には、保存剤例えばクロルブタノールを含有している。アンクロトタンパク 質は一般には皮下注射する。この治療は、定常的に又は治療の監視のために必要 な、フィブリノーゲン濃度の規則的なコントロールが保証されている場合にはま た外来的に実施してもよい。

アンクロトの静脈内投与は可能である、しかしそれは例外の場合に、定常的な観 察下でのみ行わなければならない。

アンクロトタンパク質は原則的には個々に処方しなければならない。血漿中のフ ィブリノーゲン濃度の状態が重要である。同濃度は７０〜１００ｍｇ／１００ｍ １血漿に徐々に下げねばならない、全治療時間の間にフィブリノーゲン濃度を前 記範囲内の値に調節すべきである。

これらの条件下で、就中血液の流動性が十分に改善され、ＰＡＩ−１−及びＰＧ 　１．−血清濃度が低下され、血清中のｔＰＡの濃度が高められた。

図面の簡単な説明 第１図はグリコペプチド混合物（例１．４）のクロマトグラム（Ｉ〜ＩＶは溶離 したペプチド）であり、第２図はファージベクターλｇｔ　１０の遺伝子地図及 び制限酵素切断地図であり、第３図はクローニングベクターＭ　１３　ｍ　ｐ　 １８及びＭ１３ｍｐ１９の遺伝子地図であり、第４図はアンクロトをコードする ｃＤＮＡの塩基配列図であり、第５図はベクターｐｓＶｐＡを調製する略示工程 図であり、Ｍ６図はプラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−３Ｖｐｏ　ｌｙＡを調 製する略示工程図である。

発明を実施するための最良の形態 例　ｌ アンクロトのタンパク質化学的分析 １、０　アンクロトのアミノ酸配列の部分的決定アンクロトタンパク質のクロー ニングの出発点は、アゲキストロトン・ロドストーマ（Ａｇｋｉｓｔｒ。

ｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｒｏｍａ）からの市販着タンパク質のアミノ酸配列の同 定であった。そのために次のような方法を行った： 前記糖タンパク質のジスルフィド架橋を先ず還元し、次にカルボキシメチル化し た。得られたカルボキシメチル化糖タンパク質の一部分をトリプシンで分断し、 生じる（糖）ペプチドを“逆相”　（ｒ）ＨＰＬＣによって分離した０次に個々 のペプチド画分のアミノ酸配列をガス相配列分析によって確定した。同様にカル ボキシメチル化アンクロトの他の部分からは、Ｎ末端アミノ酸配列をガス相配列 分析によって決定した。

１、１　アンクロトの還元及びカルボキシメチル化０．１Ｍ燐酸塩、Ｏ，ＩＭ　 ＮａＣ１，０，３％トリクロル−第三ブチルアルコールｐＨ６，７〜７．０に溶 かしたアンクロト（商品名ＡＲＷＩＮ）３．５ｍｌを、先ず５０ｍＭ酢酸アンモ ニウム緩衝液ｐＨ７゜０に対して十分に透析した。このようにして得られた、再 緩衝タンパク質溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥物を還元緩衝液（６Ｍグアニ ジン、０．２Ｍトリス／ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１３０ｍＭ　ＤＴＴ、０゜ ０１％ＴＷＥＥＮ８０％ｐＨ８，６＞６ｍｌに溶かし。

３７℃で一晩中インキュベートした０次にヨードアセトアミド３００ｍｇを加え てカルボキシメチル化を開始させた。０℃で暗中で１時間インキュベートした後 、β−メルカプトエタノール３００μｍを加えて反応を停止し、試料を水に対し て十分に透析した。このようにして得られたカルボキシメチル化タンパク質を０ ゜５ｍｌづつ凍結乾燥したが、その前にＮ末端配列の決定（１，２）のために予 め２５μｌ　（約５０μｇに相当する）を取出しておいた。

１．２　アンクロトのＮ末端配列決定 還元及びカルボキシメチル化後に得られたく糖）タンパク溶液（２５μｌ、１． １参照）を蒸発乾固した。

蟻酸２０μｌ中に取りかつＨ，０１０μｌで希釈した後、この（糖）タンパク溶 液をＰＯＬＹＢＲＥＮで被覆したガラス繊維フィルター上にとベットで定液量を 施した０次にガス相配列決定装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｆｏｓｙｓｔｅｍ）により 配列決定を開始した。遊離されたアミノ酸の検出は、ＰＩＴＣ（フェニルインチ オシアネート）で誘導しかつｒＨＰＬｃで分離した後、“線上で”　ＰＴＨ−ア ミノ酸（フェニルチオヒダントイン）として行った６手順の詳細な記載はガス相 配列決定装置の操作法から得られる。

１、３　カルボキシメチル化アンクロトの分断カルボキシメチル化アンクロト４ 　ｍ　ｇを、Ｏ，ＩＭトリス／ＨＣＩ　５００μｌ、１Ｍグアニジン、ｐ）（８ ，５中に溶かし、トリプシン溶液（配列銘柄、Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１００μｍ（２００μｇ）を加えた。３ ７℃で１６時間のインキュベーション後に、混合物を９５℃に５分間加熱して反 応を停止した０次いで試料を継続して使用するまで一２０℃で保管した。

１．４トリプシンペプチドの画分 還元、カルボキシメチル化及びトリプシン分解後に得られた（糖）ペプチド混合 物を、ＨＰ　１０９０装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）でＶＹＤＡＫＣ −１８”床孔“カラム（Ｋａｔ、−Ｎｒ、２０１ＴＰ５４）を用いてＴＦＡ／ア セトニトリル勾配系でｒＨＰＬＣによって分離した。１．３からのタンパク質約 １．３ｍｇ　（２００μｍに相当する）をカラム上に適用し、線形アセトニトリ ル勾配（１〜４５％、１９０分）を施して溶離した。クロマトグラフィーの経過 を、２３０ｎｍでの紫外線吸収を測定することによって追跡した。この際第１図 で図示したクロマトグラムが得られた。溶離したペプチド（第１図でＩ−ＩＶで 示す）を濃縮器で蒸発乾固した。このようにして得られた個々の（糖）ペプチド のアミノ酸配列をガス相配列決定装置を用いて確定した。

１、５　同定したアミノ酸配列 ａ）還元及びカルボキシメチル化によるＮ末端配列決定 ｖｒ／ＫＧＧＩＩＥＣＮｒ１ｘＮＥＨＲｐＬｖＡｖｖＥａＴ−ｗｒｂ）ｒＨＰＬ Ｃ分離によるアミノ酸配列決定（画分の表示は第１図を参照） Ｉ　ＹＦＩ／Ｋ ＩＩ　ＧＰＮＰＥＡＱＰＮＫＰＡＬＹＴＳｒＹＤＹＩＩＩ　ＴＳＷＤＥＤｉＭＬ ＩＲ ＩＶ　ＦＬＶＡＶＥＧＴ−ＷＴＦＩＥＧＧＶＬＩＨＰＥＷＶＴＴＡＥＨ例　２ マレー産マムシ（アゲキストロトン・ロドストーマ）からアンクロトのｃＤＮＡ クローンを単離する。

アゲキストロトン・ロドストーマ属の５年齢マムシの毒腺組織１ｇを、６Ｍグア ニジウムチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，Ｏン、Ｏ，１Ｍ ２−メルカプトエタノール、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＡＸ中の０．５％サルコシル中 で分解した。粗大な細胞片を３０Ｏｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡを４５．００ Ｏｒｐｍで一晩中遠心分離して５．７ＭＣｓＣ１−クッション（Ｋｉｓｓｅｎ） を通して分離した。次にｐｏ１ｙＡ＋含有ＲＮＡ画分を、オリゴ（ｄＴ）−セル ロースによるアフィニティークロマトグラフィーによって分離した。

酵素ＡＭＶ−逆転写酵素及びプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）１２−１８を用 いて、ｐｏｌｙＡ＋−ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡに転写した。二番目の鎖の合成はＥ 、ｃｏ　ｌ　１−ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて行った。二本鎖ｃＤＮＡに、酵 素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて次の配列： ５　′ＡＡＴ丁ＣＣＡＴＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＴＧ（：　３　”を有するＥｃｏＲ Ｉアダプターを付着させた。商業的に得られるファージベクターλｇｔ　１０（ 第２図）を、制限酵素ＥｃｏＲ■で切断した。２種のＤＮＡを相互に連結し、市 販の詰込みエキストラクトを詰込んで感染性ファージとした。この組換えファー ジをＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００Ｈｆｌと一緒に、ＮＺＹＤＴ培地に撤き、３７℃で 一晩中インキユベートした。このようにして得られたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリ ーは２Ｘ１０’の独立クローンを含む、常法によるｃＤＮＡライブラリーの増幅 後に、５０００００個のファージをＣ６００Ｈｆｌ細胞と一緒に撒いた。ファー ジをニトロセルロースフィルター上に移して、０．５Ｎ　ＮａＯＨ／１．５Ｍ　 ＮａｃＩで溶解し、変性されたＤＮＡを８０℃での２時間の加熱によってフィル ターに固定した。同フィルターを５ｘＳＥＴ−緩衝液（ｌｘｓＥＴ＝０．１５Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭトリス／ＨＣＩ、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　、０． １％ＳＤＳ及び５ＸＤｅｎｈａｒｄｔの溶液（１００ｘＤｅｎｈａｒｄｔ＝５０ ｍｌ当りＦｉｃｏｌｌ　Ｉｇ、ポリビニルピロリドン１ｇ、ＢＳＡｌｇ）中で６ ８℃で４時間予めハイブリッド形成させた。ＤＮＡ合成装置を用いて、５９個の 塩基を有するオリゴヌクレオチドプローブ、ＡＲＮＴを製造した。このプローブ は次の配列から成る：５　′ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＣ ＧＧＣＧＴＧ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡＣＣＣＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＴ Ｔ　ＡＣＣＧＣＣＧＡＧ　ＣＡ　３　′同クローンの５′末端にγ−”Ｐ−ＡＴ Ｐの標識を施した。次にこのプローブを、６ＸＳＥＴ、Ｏ１１％ＳＤＳ、３０％ ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ及び１０％デキストランスルフェートを含 有する溶液中で予めハイブリッド形成させたフィルターと一緒に４２℃で軽く振 動させながら一晩中インキユーペートした１次に同フィルターを４２℃で６ＸＳ ＥＴ１０゜１％ＳＤＳ中で数回洗浄し、乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露した。“選 別”時に放射能の応答を与えたクローンを単離し、さらに増殖させた。一つのク ローン（以下ではＡＲ４と記載する）は、コード領域ならびに５′−及び３′− 無コード領域を含む約０．９ｋｂの挿入断片を有していた。精製したファージを プロテアーゼＫ（ａｄ　６０μｇ／ｍｌ）と共に５５℃で１時間インキュベート し、次にフェノール／クロロホルムで抽出することによってＡＲ４のファージ− ＤＮＡを調製した。３容のエタノール（−２０℃〉を加えるとファージ−ＤＮＡ が沈殿した。このものを無菌注射針を用いて７０％エタノール中に移し、洗浄し 、短時間沈殿させた。沈殿小球の短時間の乾燥後にこれらをＴＥ−緩衝液中で懸 濁させた。

例　３ アンクロトをコードする一本鎖ＤＮＡの調製出発点は、例２で記載したファージ クローンＡＲ４であった。ＡＲ４を制限酵＄ＥｃｏＲＩで切断した。

アンクロトをコードするＤＮＡ塩基配列を有するＥｃｏＲＩ断片を、ゲル電気泳 動法により分離した。この断片３０ｎｇを、４℃で１２時間ＥｃｏＲＩで切断さ れる市販のクローニングベクターＭ　１３　ｍ　ｐ　１８又はＭ１３ｍｐ１９（ 第３図）１００ｎｇと連結させた。

連結用溶液の容積は】０μｍであった。８０℃に５分加熱して連結を終Ｙした。

この連結用溶液の１／１０容を、適格５ＲＩＯＩ細胞１００μｌの形質転換のた めに使用した。形質転換の終了後に形質転換溶液に０．２Ｍ　ＩＰＴＧ溶液６０ μｌ及びＸＧａ１　１２０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この溶液を５ＲＩ ＯＩ細胞（ＯＤ、。。＝１）２００μｌを有するＮＺＹＤＴ−寒天平板培地上の ＮＺＹＤＴ−上面寒天中に塗布した。培地ＮＺＹＤＴは市販されている（ＧＩ　 ＢＣＯ−ＢＲＬ）、アンクロト−ｃＤＮＡを含むクローンは、プラークの青色染 色が欠落していることによって同定することができた。同クローンはｍｐＡＲ４ と命名した。アンクロトをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を、ＤＮＡ塩基 配列分析（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ７４，１９７７．５４６３−６７）によって解明した。（第４図ン。

４、１ 真核細胞においてアンクロトを発現するためのベクタの構成 サルウィルスＳＶ４０のＤＮＡを制限酵素Ｂ　ａｍＨＩ及びＢｃｌＩで切断し、 ０．２４ｋｂの断片をゲル電気泳動法により調製した（第５図）１両端に４種の デツキジヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴ ＴＰの存在でフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を充填した６次にＸｈｏＩリンカ− を結合した。

これを平行的に、市販のベクターｐＵｃ１８を酵素Ｓｍａｌで切断した、次に同 様にＸｈｏｌリンカ−を結合した。このベクター（ｐＵｃ１８Ｘｈｏ”）のＤＮ ＡをＸｈｏｒで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理Ｌ、０．２４ｋｂのＸ ｈｏ　Ｉ　ｌ−ＳＶ４０断片（上記参照）と連結した。ｐＳＶｐＡが生じた。

ｐｓＶｐＡ−ＤＮＡをＸｈｏ　Ｉｔ’切断製取シ、４種のｄＮＴＰの存在で上記 と同様にフレノウ（ＫｌｅｎＯＷ）ポリメラーゼと一緒にインキュベートした。

０゜２４ｋｂの断片をゲルにより単離した。

同時に、ＣＬ２８ＸとｐＢ２−２との連結によって生じた（Ｒｅｄｄｙ　ｅｔ　 ａｌ、ＤＮＡ　６，１９８７．４６１−７２）真核生物発現ベクターＣＬ２８Ｘ ｈｏＢＰＶを、制限酵素Ｘｂａｌで部分的に切断した。つまり該ベクターを、２ つのＸｂａＩの認識配列の一方においてのみ切断されている（第６図）分子が生 じるように、時間的に限定的にインキュベートした。

この溶液を次に前記のようにフレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰと反応させた。

次いでこの線状分子をゲル電気泳動法によって単離した。

次に、線状＋７）ｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ断片をＲ処理した、ＳＶ４０からの０ ．２４ｋｂ断片と連結した。

形質転換及び微小分離物の選別後にＸｈｏｌの位置の３′の方にある以前のＸｂ ａＩの位置にＳＶ４０の断片を有するクローンを単離した。このＤＮＡ（ｐＣＬ ２８ＸｈｏＢＰＶ−８Ｖｐｏ　１ｙＡ）　は“初期”遺伝子のＳＶ４０転写停止 シグナルを有していた。

ｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−８Ｖｐｏ　１ｙＡ（７）プラスミドＤＮＡを制限酵素 Ｘｈｏｌで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。同時にｍ　ｐ　Ａ　 Ｒ４を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０．９ｋｂの断片にＴ４リガーゼを用いて Ｘｈｏリンカ−を付着した。両断片をＴ４−リガーゼで相互に結合した。形質転 換及び微小分離物の分析後に、正しい定位で明らかにアングロドＤＮＡを含むク ローンを単離した：ｐＣＬ２８ＢＰＶ移入及び細胞系の樹立 ｃ１２７Ｉ細胞（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２６　（１９７８）２９２；ＡＴＣＣｃａｔ ａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｃｅＩＩ　１ｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ５ ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５．ｐ１４２）に、カルシウムホスフェート共沈 法を用いてＢＰＶ−発現プラスミドを移入した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２（１９ ７３）／４５６．ＤＮＡ　ｃｏｌｏｎｉｎｇ；ｖｏｌｕｍｅ　ＩＩ、ｅｄ、Ｄ、 Ｍ、ＧｌｏｖｅｒＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、（１９８５）、１４３頁以下及び２１３ 頁）。

ｃ１２７Ｉ細胞５Ｘ１０’を、６０ｍｍのベトリシャーレ中のＤＭＥＭ　（Ｄｕ 　］　ｂ　ｅ　ｃ　ｃ　ｏｓ＝　ｓ　Ｍ。

ｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）＋１０％ＦＣ３（ウシ胎児血清） 中に播いた。次の日培地を２５ｎＭ　Ｈｅｐｅｓ＋１０％ＦＣ８を含むＭＥＭ（ Ｍｏｄｉｆ　ｆｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）に変えた。ｌＯ“ｇ　Ｃｓ Ｃｌ−精製プラスミドＤＮＡと一緒にＣａ−ホスフェート−共沈物を形成させ、 このものをｃ１２７Ｉ細胞上に注意深く施した。同細胞を３７℃；７％ＣＯ２で ４時間インキュベートした。

次のグリセリンショック処理によって移入の効率は著しく増大された。ざらに共 沈物を施して４時間後に培地から細胞を取出した。同細胞を、室温で各２＋ｎｌ の１５％グリセリン／ＨＢＳ（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇＶｏｌ、ＩＩ、１５２頁 ）と−緒に６０ｍｍベトリシャーレ中で３分間インキュベートした。グリセリン ／ＨＢＳ溶液を除去し、細胞をＤＭＥＭ＋　１０％ＦＣ８３ｍ　ｌで洗浄した。

同細胞を３７℃；７％ＣＯ２でＤＭＥＭ＋　ｌ　Ｏ％ＦＣ３と一緒にインキュベ ートした。

週に３回ＤＭＥＭ＋　Ｉ　Ｑ％ＦＣ８を取出し、新しいものと代えた。２〜３週 間後にＢＰＶゲノムを有する移入細胞が、形質転換細胞の集合体、所１ｆＦｏｃ ｔとして認められた。

前記Ｆｏｃｉの副次クローニングの後、個々のサブクローンの培地上澄みを、公 知法によりフィブリノーゲン分解活性について検査した。

生産のために、細胞系を集合させてから血清を含まないＤＭＥＭ培地中に保存し た。このようにして得られた細胞培養上澄みから、タンパク質化学的常法によリ アンクロドタンパク質を精製し、薬理学的及びタンパク質化学的分析のために使 用することができる。

例　６ 細菌でのアングロドタンパク質の製造 ６、１ ｍ　ｐ　Ａ　Ｒ４の突然変異誘発 −重鎖ｍｐＡＲ４２ｐｍｏｌを、３塩基交換を除いてｍｐＡＲ４ＤＮＡの変化す べき領域に相補的である配列　５　′ＣＴＣＣＡＡ　ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　 ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＴＴＴ３′　を有するオリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌ と反応させた。突然変異誘発溶液は次のような組成であったニー重鎖ｍｐ　ＡＲ ４１４１（２ｐｍｏ＋）リン酸化オリゴヌクレオチド （リン酸化反応からのＡＴＰを含む）　１　μｌ（５ｐｍｏｌ）１０Ｘリガーゼ 緩衝液　５μ１ １ｍＭ　ｄＮＴＰ　２．５μｍ １ｍＭ　ＡＴＰ　４μ＋ Ｈ２０３６，５μｍ 突然変異誘発溶液を３７℃で１５分インキュベートし、次に室温に冷却し、最後 にフレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１単位を加えた。

室温での１時間のインキュベーション後にＴ４−リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）２ ００単位を加えた１次にこの溶液を４℃で１６時間インキュベートした０次いで この溶液５μｌを成分５ＲＩＯＩ細胞の形質転換のために使用した。これから生 じるファージプラークをニトロセルロース上に施す０次にこのフィルターを５× ＳＳＣ中で５分洗浄し、空気乾燥し、８０℃で２時間加熱した。前ハイブリッド 形成及びハイブリッド形成を、例２で記載したように行った。フィルターの洗浄 を５５〜６５℃の温度で６ｘＳＥＴ１０．１％ＳＤＳを用いて行った。突然変異 誘発溶液で使用したオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。陽性クロー ンをオートラジオグラフィーにより可視化した。陽性クローンはｍ　ｐ　Ａ　Ｒ ４の配列の３つの位置で変異していた。この置換の結果、制限酵素ＮｃｏＩの付 加的認識位置がｍｐＡＲ４ＤＮＡ中に存在することになる。

この位置がコドン（ＧＴＣ）つまり成熟アンクロトの最初のアミノ酸の前で前記 ＤＮＡの切断を可能にする。

このようにして得られたＤＮＡをｍｐＡＲ４，１と命名した。

６．２ ｐＫＫ２３３−２における副次クローニング及び細菌における発現 二本１１ｍｐＡＲ４，１ＤＮＡから、Ｎｃｏｌを用いる限定的制限によって、約 ７２０塩基対の長さを有する断片を単離した。この断片は、成熟アングロドタン パク質の全コード領域を含むことを特徴としている。

この際コード鎖の５′−領域は次のように構成されている： ５　′ＣＡＴＧ　ＧＴＣＡＴＴ　ＧＧＡ、、、。

このＮ　ｃ　ｏ　Ｉ断片を、同様にＮｃｏＩで切断した市販の原核発現ベクター ｐＫＫ２３３−２　（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨＣａｔ、６００３−１）と連結した。

この連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５細胞の形質転換のために使用した。

組換えプラスミドを含むクローンを、幾度も記載したクローニングハイブリッド 形成法によって同定した。このためにハイブリッド形成プローブとして例２で記 載したオリゴヌクレオチドＡＲＮＴを使用した。ハイブリッド形成及び洗浄の条 件は同様に例２で記載した条件に等しい。プローブと共にハイブリッド形成した クローンを、組込まれる断片の定位を決めるために、制限分析によって特性決定 した。

発現のために適した定位で前記断片を含むクローンを、相応の培地で培養した。

０Ｄａｓ。；１でＩＰＩＧを、１０ｍＭの最終濃度が得られるまで加えた。３７ ℃で４時間さらにインキュベートした後、細胞を収得し、ポリペプチドを標準方 法により精製し、復元した。

例　７ 哺乳動物細胞での炭水化物不含アングロドタンパク質及び部分的炭水化物不含ア ンクロトタンパク質の製造７．０　−重鎖ＤＮＡの突然変異誘発 トリペプチドＮＸＴ及びＮＸＳのコドンの組合せの一つ、若干又はすべてが、ト リペプチドＱＸＴ及びＱＸＳのコドンの組合せと代えられるように、プラスミド ｍｐＡＲ４を突然変異誘発させた。−重鎖ＤＮＡの突然変異誘発を例６．１で記 載したように行った。

７、　１ クローンｍ　ｐ　Ａ　Ｒ４の一本鎖ＤＮＡをヌクレオチドＫＨ１で突然変異誘発 させた。

ＫＨ１：　５′ＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＴ　３　′突然 変異されたクローンを、プローブＫＨＩを用いるプラークハイブリッド形成法に よって同定した。３７℃で２０％ＦＡ（ホルムアミド）及びＡｘＳＳＣ中で１６ 時間ハイブリッド形成させた。６０℃で５ＸＳＳＣ１０，ｌ５ＤＳ中で発育させ た。生じるクローンをｍｐＡＲ４，ＫＨｌと命名した。

７．２ クローンｍｐＡＲ４，ＫＨＩの一本鎖ＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＫＨ２で突 然変異誘発させた。

Ｋ　Ｈ２：　５　ＴＡＣＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＡＡＴＡＡＡ　３　 ′突然変異されたクローンを、プローブＫＨ２を用（Ｘるプラークハイブリッド 形成法によって同定した。２０％ＦＡ及び５ｘｓｓｃ中で１６時間ハイブリッド 形成させ、６５℃で５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で発育させた。生じるクロー ンをｍ　ｐ　Ａ　Ｒ４、Ｋ　Ｈ１、２と命名した。

７．３ クローンｍｐＡＲ４，ＫＨＩ、２の一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドＫ）（３ で突然変異誘発させた。

Ｋ　Ｈ３：　５　”　ＧＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＡＡＣＡＧＧＴＴＴＧ　３　 ”突然変異されたクローンを、プローブＫＨ３を用いるプラークハイブリッド形 成法によって同定した。３５℃で５ＸＳＳＣ中で１６時間ハイブリッド形成させ 、５８℃で５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で発育させた。

生じるクローンをｍ　ｐ　Ａ　Ｒ４、Ｋ　Ｈ１、２、３と命名した。

７．４ クローンｍ　ｐ　Ａ　Ｒ４、Ｋ　Ｈ１、２、３の一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオ チドＫＨ４で突然変異誘発させた。

Ｋ　Ｈ４：　５　′ＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡ　３　 ’突然変異されたクローンを、プローブＫＨ４を用いるプラークハイブリッド形 成法によって同定した。３７℃で２０％ＦＡ及び５ｘＳＳＣ中で１６時間ハイブ リッド形成させ、６０℃で５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で発育させた。生じる クローンをｍｐＡＲ４，ＫＨｌ、２，３．４と命名した。

７．５ ｍｐＡＲ４，ＫＨＩ、２，３．４の一本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドＫＨ５で 突然変異誘発させた。

Ｋ　Ｈ５：　５　”　ＡＧＣＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＡＡ　３ 　′突然変異されたクローンをプローブＫＨ５を用（するプラークハイブリッド 形成法によって同定した。３７℃で２０％ＦＡ及び５ｘＳＳＣ中で１６時間ハイ ブリッド形成させ、６０℃で５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で発育させた。生じ るクローンをｍｐＡＲ４，ＫＨｌ、２，４．５と命名した。

例６．１〜例６．５で記載したＥＣ０ＲＩ挿入断片を、例３で記載したように適 当な真核発現ベクターで再クローン化し、移入（例４）後に適当な細胞で発現さ せた。細胞培養上澄みからのタンパク質の精製は標準法により行った。

９＾ｂｂ、１ 八ｂｂ、２ Ａｂｂ、３ ロ　ロ　ロ　ロ　ロ ロ　ロ　ロ　ロ　ロ Ａｂｂ、５ Ａｂｂ、６ 国際調査報告 ＰＣτ／ＥＰ　ｌ！９１０１ｍ２７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．次のアミノ酸配列： １【配列があります】 ５１【配列があります】 １０１【配列があります】 １５１【配列があります】 ２０１【配列があります】 ［前記配列中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は天然α−アミノ酸の残基である ］を有する純粋グリコシル化、部分グリコシル化又は不グリコシル化ポリペプチ ド。
2. ２．請求項１記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ塩基配列 。
3. ３．請求項２記載のＤＮＡ塩基配列を含む組換えＤＮＡ分子。
4. ４．適当な宿主系における発現を可能にする発現調節配列と機能的に関連してい る、請求項２記載のＤＮＡ塩基配列を含む請求項３記載の組換えＤＮＡ分子。
5. ５．発現調節配列がＥ．ｃｏｌｉ中で有効なプロモーター系、Ｅ．ｃｏｌｉバク テリオファージのプロモーター系、酵母発現調節配列又は他の真核発現調節配列 である、請求項４記載の組換えＤＮＡ分子。
6. ６．請求項３、４又は５記載の少なくとも１種の組換えＤＮＡ分子を含むことを 特徴とする宿主生物。
7. ７．細菌、真菌、動物細胞又はヒト細胞である、請求項６記載の宿主生物。
8. ８．請求項１記載のペプチド配列をコードしている発現用ＤＮＡ塩基配列を、適 当な宿主生物中に導入することを特徴とする、請求項１記載のポリペプチドの遺 伝子工学的製造方法。
9. ９．疾病の予防及び撲滅の際に使用するための請求項１記載のポリペプチド。
10. １０．栓塞栓症及び糸球体腎炎の治療及び予防のための薬剤の製造のために請求 項１記載のポリペプチドを使用すること。