JP2656406B2 - 血管内皮細胞成長因子ｉｉ - Google Patents
血管内皮細胞成長因子ｉｉInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Description
【０００１】血管内皮細胞に対して、適切なる特異性を
有する、細胞由来の二量体マイトジェンが最新新たに分
類同定され、一般的に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と
呼ばれている。マイトジェンは、ラット神経膠腫細胞の
増殖培地〔コーン等、（Connet al.)、プロク. ナトル.
アガド.サイ. ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.Sci.
USA) 、第８７巻：第２６２８−２６３２頁（１９９０
年）〕、あるいは、ウシ下垂体小胞星状細胞の増殖培地
〔フェラーラ及びベンゼル（Ferrara and Henzel) 、バ
イオケム. バイオフィズ. レス. コム. （Biochem. Bio
phys. Res. Comm.) 、第１６１巻、第８５１−８５８頁
（１９８９年）及びゴスポダロヴィッチ等（Gospodarow
incz et al.)、プロク. ナトル. アカド. サイ. ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第８６巻、第
７３１１−７３１５頁（１９８９年）〕から精製される
ものである。血管内皮成長因子Ｉ（ＶＥＧＦＩ）は分子
質量２３ＫＤa のサブユニットから成る、４６ＫＤa の
分子質量を持つホモダイマーである。ＶＥＧＦＩは結合
組織細胞に対するマイトジェンであって大きな血管から
の血管内皮細胞に対してではない血小板由来成長因子
（ＰＤＧＦ）とその構造においてはっきりとした類似性
があった。
有する、細胞由来の二量体マイトジェンが最新新たに分
類同定され、一般的に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と
呼ばれている。マイトジェンは、ラット神経膠腫細胞の
増殖培地〔コーン等、（Connet al.)、プロク. ナトル.
アガド.サイ. ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.Sci.
USA) 、第８７巻：第２６２８−２６３２頁（１９９０
年）〕、あるいは、ウシ下垂体小胞星状細胞の増殖培地
〔フェラーラ及びベンゼル（Ferrara and Henzel) 、バ
イオケム. バイオフィズ. レス. コム. （Biochem. Bio
phys. Res. Comm.) 、第１６１巻、第８５１−８５８頁
（１９８９年）及びゴスポダロヴィッチ等（Gospodarow
incz et al.)、プロク. ナトル. アカド. サイ. ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第８６巻、第
７３１１−７３１５頁（１９８９年）〕から精製される
ものである。血管内皮成長因子Ｉ（ＶＥＧＦＩ）は分子
質量２３ＫＤa のサブユニットから成る、４６ＫＤa の
分子質量を持つホモダイマーである。ＶＥＧＦＩは結合
組織細胞に対するマイトジェンであって大きな血管から
の血管内皮細胞に対してではない血小板由来成長因子
（ＰＤＧＦ）とその構造においてはっきりとした類似性
があった。
【０００２】本発明の目的は、他のタンパク質を含まな
い新規な血管内皮細胞成長因子II（ＶＥＧＦII) を提供
することにある。他の目的は、実質的に純粋なＶＥＧＦ
IIの精製方法を提供するものである。さらに他の目的
は、血管の成長の誘発、血管の修復及び人工血管の作成
に関係のある、内皮細胞を刺激しうるＶＥＧＦIIを提供
するものである。別の目的は組織の修復を刺激するＶＥ
ＧＦIIを提供する事にある。
い新規な血管内皮細胞成長因子II（ＶＥＧＦII) を提供
することにある。他の目的は、実質的に純粋なＶＥＧＦ
IIの精製方法を提供するものである。さらに他の目的
は、血管の成長の誘発、血管の修復及び人工血管の作成
に関係のある、内皮細胞を刺激しうるＶＥＧＦIIを提供
するものである。別の目的は組織の修復を刺激するＶＥ
ＧＦIIを提供する事にある。
【０００３】血管内皮細胞成長因子IIは哺乳動物の神経
膠腫細胞を維持する培養培地より精製される。そのタン
パク質はヘテロダイマーで、哺乳動物血管内皮細胞の有
糸分裂誘発を刺激し、その上、血管の成長及び修復の促
進にも有効である。このユニークな成長因子は組織の修
復促進にも有効である。
膠腫細胞を維持する培養培地より精製される。そのタン
パク質はヘテロダイマーで、哺乳動物血管内皮細胞の有
糸分裂誘発を刺激し、その上、血管の成長及び修復の促
進にも有効である。このユニークな成長因子は組織の修
復促進にも有効である。
【０００４】本発明は神経膠腫細胞の増殖培地中より分
離、精製され、血管内皮細胞に対してマイトジェン的刺
激を示す、ユニークな血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ
IIと表示）に関するものである。神経膠腫とは、脳、脊
髄、下垂体後葉及び網膜を含む中枢神経系の間質組織を
形成する種々の型の細胞の１つから由来する腫瘍として
ここでは定義されている。従がって、本発明の範囲に
は、いかなる哺乳動物の神経膠腫組織あるいは細胞系を
も含めた他の細胞などから分離及び精製されたユニーク
な成長因子も含まれている。細胞系には次のものが含ま
れるが、それらに限定されない。神経膠腫由来細胞系、
例えばＣ６、hs６８３及びＧＳ−９Ｌ；神経膠芽腫、Ａ
−１７２及びＴ９８Ｇ；神経芽腫、ＩＭＲ−３２及びＳ
Ｋ−Ｎ−ＭＣ；神経膠腫、Ｈ４；テトローム、ＸＢ−
２；神経膠星状細胞腫、Ｕ−８７ＭＧ及びＵ−３７３Ｍ
Ｇ；胎生期癌及び非形質転換神経膠あるいは星状細胞の
細胞系、ヒト髄芽細胞腫系ＴＥ６７１、中でもＧＳ−９
Ｌ及びＴＥ６７１が好ましい。ＶＥＧＦIIは卵巣、心
臓、及び腎臓を含めてラットの組織中に存在しそして、
そこから単離されてくるものである。下垂体前葉腫瘍細
胞系、例えばＧＨ３及びＨｓ１９９なども用いることが
できる。本発明のＶＥＧＦはラット細胞より分離された
ものとして記載されているが、同様のあるいは本質的に
類似の成長因子は、ヒトの細胞も含めた、他の哺乳動物
の細胞からでも単離することができる。
離、精製され、血管内皮細胞に対してマイトジェン的刺
激を示す、ユニークな血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ
IIと表示）に関するものである。神経膠腫とは、脳、脊
髄、下垂体後葉及び網膜を含む中枢神経系の間質組織を
形成する種々の型の細胞の１つから由来する腫瘍として
ここでは定義されている。従がって、本発明の範囲に
は、いかなる哺乳動物の神経膠腫組織あるいは細胞系を
も含めた他の細胞などから分離及び精製されたユニーク
な成長因子も含まれている。細胞系には次のものが含ま
れるが、それらに限定されない。神経膠腫由来細胞系、
例えばＣ６、hs６８３及びＧＳ−９Ｌ；神経膠芽腫、Ａ
−１７２及びＴ９８Ｇ；神経芽腫、ＩＭＲ−３２及びＳ
Ｋ−Ｎ−ＭＣ；神経膠腫、Ｈ４；テトローム、ＸＢ−
２；神経膠星状細胞腫、Ｕ−８７ＭＧ及びＵ−３７３Ｍ
Ｇ；胎生期癌及び非形質転換神経膠あるいは星状細胞の
細胞系、ヒト髄芽細胞腫系ＴＥ６７１、中でもＧＳ−９
Ｌ及びＴＥ６７１が好ましい。ＶＥＧＦIIは卵巣、心
臓、及び腎臓を含めてラットの組織中に存在しそして、
そこから単離されてくるものである。下垂体前葉腫瘍細
胞系、例えばＧＨ３及びＨｓ１９９なども用いることが
できる。本発明のＶＥＧＦはラット細胞より分離された
ものとして記載されているが、同様のあるいは本質的に
類似の成長因子は、ヒトの細胞も含めた、他の哺乳動物
の細胞からでも単離することができる。
【０００５】血管内皮成長因子IIは、上記記載の種々の
細胞あるいは組織のうちの１つあるいはそれ以上のもの
から単離され種々の微小不均一形（microheterogenous
form）で存在するものである。ここにおける微小不均一
形とは単一の遺伝子産物を示すものであり、すなわちｍ
ＲＮＡレベルであるいは翻訳後に構造的に修飾を受ける
ＤＮＡの単一遺伝子ユニットより産生されるペプチドの
ことである。ペプチド及びタンパク質はここにおいては
相互交換的に用いられる。微小不均一形はすべて等しく
マイジェンとしての活性を有している。“生物学的活
性”及び“生物学的な活性力”も相互交換的に用いら
れ、ここにおいては、以下に記載されている様に血管内
皮細胞をも含めてその標的細胞中におけるＤＮＡ合成を
刺激して細胞増殖を引き起こすＶＥＧＦIIの能力として
定義する。修飾はインビボあるいは単離、精製の過程中
でも起こりうるものである。インビボにおける修飾と
は、これらに限定されるものではないけれども、蛋白分
解、グリコシレーション、リン酸化、脱アミノ酸、ある
いはＮ末端のアセチル化などにより引き起こされるもの
である。蛋白分解にはエクソ蛋白分解（exoproteolysi
s) が含まれ、それにより１つあるいはそれ以上の末端
のアミノ酸は配列的、及び酵素的に解裂されて、本来の
遺伝子産物よりも少ないアミノ酸数を持った微小不均一
形が形成される。蛋白分解にはエンド蛋白分解修飾（en
doproteolytic modification) も含まれる。この修飾は
アミノ酸配列中の特異な位置でペプチドを解裂するエン
ドプロテアーゼの作用によって生じる。類似の修飾は微
小不均一形を生じる精製過程中においても認められる。
精製過程における最っとも一般的な修飾はプロテアーゼ
阻害剤の使用により最少化される蛋白分解である。ほと
んどの条件下において、１つあるいはそれ以上の微小不
均一形が天然のＶＥＧＦIIの精製の後に存在している。
天然のＶＥＧＦIIとはＶＥＧＦII産生細胞から単離、精
製されたＶＥＧＦIIを示すものである。血管内皮成長因
子IIは種々の二者択一的にスプライシングされた形に存
在することができ、エクソンの特異的な処理に関連する
ｍＲＮＡの産生物としてここで定義される。エクソンと
は最終タンパク質産生物をコードしている真核細胞の遺
伝子のＤＮＡ配列の部分として定義される。
細胞あるいは組織のうちの１つあるいはそれ以上のもの
から単離され種々の微小不均一形（microheterogenous
form）で存在するものである。ここにおける微小不均一
形とは単一の遺伝子産物を示すものであり、すなわちｍ
ＲＮＡレベルであるいは翻訳後に構造的に修飾を受ける
ＤＮＡの単一遺伝子ユニットより産生されるペプチドの
ことである。ペプチド及びタンパク質はここにおいては
相互交換的に用いられる。微小不均一形はすべて等しく
マイジェンとしての活性を有している。“生物学的活
性”及び“生物学的な活性力”も相互交換的に用いら
れ、ここにおいては、以下に記載されている様に血管内
皮細胞をも含めてその標的細胞中におけるＤＮＡ合成を
刺激して細胞増殖を引き起こすＶＥＧＦIIの能力として
定義する。修飾はインビボあるいは単離、精製の過程中
でも起こりうるものである。インビボにおける修飾と
は、これらに限定されるものではないけれども、蛋白分
解、グリコシレーション、リン酸化、脱アミノ酸、ある
いはＮ末端のアセチル化などにより引き起こされるもの
である。蛋白分解にはエクソ蛋白分解（exoproteolysi
s) が含まれ、それにより１つあるいはそれ以上の末端
のアミノ酸は配列的、及び酵素的に解裂されて、本来の
遺伝子産物よりも少ないアミノ酸数を持った微小不均一
形が形成される。蛋白分解にはエンド蛋白分解修飾（en
doproteolytic modification) も含まれる。この修飾は
アミノ酸配列中の特異な位置でペプチドを解裂するエン
ドプロテアーゼの作用によって生じる。類似の修飾は微
小不均一形を生じる精製過程中においても認められる。
精製過程における最っとも一般的な修飾はプロテアーゼ
阻害剤の使用により最少化される蛋白分解である。ほと
んどの条件下において、１つあるいはそれ以上の微小不
均一形が天然のＶＥＧＦIIの精製の後に存在している。
天然のＶＥＧＦIIとはＶＥＧＦII産生細胞から単離、精
製されたＶＥＧＦIIを示すものである。血管内皮成長因
子IIは種々の二者択一的にスプライシングされた形に存
在することができ、エクソンの特異的な処理に関連する
ｍＲＮＡの産生物としてここで定義される。エクソンと
は最終タンパク質産生物をコードしている真核細胞の遺
伝子のＤＮＡ配列の部分として定義される。
【０００６】ラット細胞系ＧＡ−９Ｌの様な神経膠腫細
胞を約１７５cm2 の組織培養フラスコ中で、約１０％新
生牛血清（ＮＣＳ）を添加したダルベッコ改良イーグル
培地（ＤＭＥＭ）などの細胞培養用培地を用いて単層培
養する。培養細胞がフラスク底面全域に広がり増殖して
いたら、培地を取り除き、細胞層をＣａ++、Ｍｇ++、を
含まないリン酸塩で緩衝した塩類液（ＰＢＳ）で洗浄し
た後、約０．１％のトリプシン、約０．０４％のＥＤＴ
Ａ溶液を用いて細胞をフラスク中より採集する。約１×
１０8 個の細胞を遠心分離で沈降させ、それを約５％の
ＮＣＳを含むＤＭＥＭ約１５００mlで再浮遊し、６００
０cm2 の表面積を持つ１０段階のセルファクトリー（ce
ll factory) 〔ヌンク（ＮＵＮＣ）〕に分注する。細胞
の培養は約５％ＣＯ2 下で、約４８から９６時間、好ま
しくは７２時間、約３７℃において行う。培養終了後、
培地を除去し、ＰＢＳで約３回、このセル ファクトリ
ーを洗浄する。次にそこへ約１５ｍＭヘペス、約５μｇ
／mlインシュリン、約１０μｇ／mlトランスフェリンを
含む１：２のハム−Ｆ１２／ＤＭＥＭの混合培地より成
る新鮮培地約１５００mlを約１．０mg／mlの仔牛血清ア
ルブミンを添加又は添加しないで加える。そして約２４
時間後に、この培地を新鮮培地と交換して、以後、４８
時間毎に培地を採集する。採集し調整した培地をワット
マン（Whatmen)＃１紙により濾過し、細胞片を除去した
後、約−２０℃に保存する。
胞を約１７５cm2 の組織培養フラスコ中で、約１０％新
生牛血清（ＮＣＳ）を添加したダルベッコ改良イーグル
培地（ＤＭＥＭ）などの細胞培養用培地を用いて単層培
養する。培養細胞がフラスク底面全域に広がり増殖して
いたら、培地を取り除き、細胞層をＣａ++、Ｍｇ++、を
含まないリン酸塩で緩衝した塩類液（ＰＢＳ）で洗浄し
た後、約０．１％のトリプシン、約０．０４％のＥＤＴ
Ａ溶液を用いて細胞をフラスク中より採集する。約１×
１０8 個の細胞を遠心分離で沈降させ、それを約５％の
ＮＣＳを含むＤＭＥＭ約１５００mlで再浮遊し、６００
０cm2 の表面積を持つ１０段階のセルファクトリー（ce
ll factory) 〔ヌンク（ＮＵＮＣ）〕に分注する。細胞
の培養は約５％ＣＯ2 下で、約４８から９６時間、好ま
しくは７２時間、約３７℃において行う。培養終了後、
培地を除去し、ＰＢＳで約３回、このセル ファクトリ
ーを洗浄する。次にそこへ約１５ｍＭヘペス、約５μｇ
／mlインシュリン、約１０μｇ／mlトランスフェリンを
含む１：２のハム−Ｆ１２／ＤＭＥＭの混合培地より成
る新鮮培地約１５００mlを約１．０mg／mlの仔牛血清ア
ルブミンを添加又は添加しないで加える。そして約２４
時間後に、この培地を新鮮培地と交換して、以後、４８
時間毎に培地を採集する。採集し調整した培地をワット
マン（Whatmen)＃１紙により濾過し、細胞片を除去した
後、約−２０℃に保存する。
【０００７】ＧＳ−９Ｌ培養培地を融解し、１ＭＨＣｌ
でpHを６．０にする。最初の精製段階は陽イオン交換ク
ロマトグラフィーより成り、種々のマトリックスを用い
た陽イオン交換が行なわれる。例えばＣＭセファデック
スＣ−５０、ファルマシアモノＳ（Pharmacia Mono S)
、ゼータクロムＳＰ（Zetachrom SP) 及びポリアスパ
ラギン酸ＷＣＸ（ネストグループ）なとがありなかでも
ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア）が好まし
い。ＶＥＧＦを含む培養培地を、培地約２０リッターに
対して約２gmのＣＭセファデックスＣ−５０で混合し、
約２４時間、４℃、低速で攪拌する。その樹脂を静置さ
せ過剰容量の溶液を除去する。樹脂懸濁液をカラムに充
填し、残っている培地を除去する。未結合タンパク質は
０．１５ＭNaCl を含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム溶
液、pH約６．０によりカラムから洗い流される。ＶＥＧ
ＦIIは約０．６Ｍ NaCl を含む０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウム溶液、pH約６．０により溶出される。
でpHを６．０にする。最初の精製段階は陽イオン交換ク
ロマトグラフィーより成り、種々のマトリックスを用い
た陽イオン交換が行なわれる。例えばＣＭセファデック
スＣ−５０、ファルマシアモノＳ（Pharmacia Mono S)
、ゼータクロムＳＰ（Zetachrom SP) 及びポリアスパ
ラギン酸ＷＣＸ（ネストグループ）なとがありなかでも
ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア）が好まし
い。ＶＥＧＦを含む培養培地を、培地約２０リッターに
対して約２gmのＣＭセファデックスＣ−５０で混合し、
約２４時間、４℃、低速で攪拌する。その樹脂を静置さ
せ過剰容量の溶液を除去する。樹脂懸濁液をカラムに充
填し、残っている培地を除去する。未結合タンパク質は
０．１５ＭNaCl を含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム溶
液、pH約６．０によりカラムから洗い流される。ＶＥＧ
ＦIIは約０．６Ｍ NaCl を含む０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウム溶液、pH約６．０により溶出される。
【０００８】ＣＭセファデックスＣ−５０カラムより集
めた活性画分を更にレクチンアフィニタィークロマトグ
ラフィーを用いて分画しＶＥＧＦIIの追加的精製法とし
た。ＶＥＧＦIIと結合しうるレクチンには、これらに限
定されるものではないが、マンノース残基と特異的に結
合するレクチンとして、コンカナバリンＡやレンズマメ
の凝集素あるいはＮ−アセチルグリコサミンと結合する
小麦胚凝集素あるいはガラクトースまたはガラクトサミ
ンと結合するレクチン及びシアル酸と結合するレクチン
があり、なかでもコンカナバリンＡ（コンＡ（Con A))
が好ましい。約５mlのＣonＡアガロース（ベクトル ラ
ボラトリーズ（Vector Laboratories))を充填した０．
９cm直径のカラムを約１ｍＭ CaCl2、約１ｍＭ MnCl2及
び約０．６Ｍ NaCl を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶
液、pH約６．０で洗浄し、平衡にする。未結合タンパク
質は平衡化緩衝液でカラムから洗い流される。ＶＥＧＦ
IIは約０．３２Ｍα−メチルマンノシド及び約０．２８
Ｍα−メチルグルコシドを含む約０．１Ｍ NaCl の緩衝
液により溶出される。
めた活性画分を更にレクチンアフィニタィークロマトグ
ラフィーを用いて分画しＶＥＧＦIIの追加的精製法とし
た。ＶＥＧＦIIと結合しうるレクチンには、これらに限
定されるものではないが、マンノース残基と特異的に結
合するレクチンとして、コンカナバリンＡやレンズマメ
の凝集素あるいはＮ−アセチルグリコサミンと結合する
小麦胚凝集素あるいはガラクトースまたはガラクトサミ
ンと結合するレクチン及びシアル酸と結合するレクチン
があり、なかでもコンカナバリンＡ（コンＡ（Con A))
が好ましい。約５mlのＣonＡアガロース（ベクトル ラ
ボラトリーズ（Vector Laboratories))を充填した０．
９cm直径のカラムを約１ｍＭ CaCl2、約１ｍＭ MnCl2及
び約０．６Ｍ NaCl を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム溶
液、pH約６．０で洗浄し、平衡にする。未結合タンパク
質は平衡化緩衝液でカラムから洗い流される。ＶＥＧＦ
IIは約０．３２Ｍα−メチルマンノシド及び約０．２８
Ｍα−メチルグルコシドを含む約０．１Ｍ NaCl の緩衝
液により溶出される。
【０００９】Ｃon−Ａカラムより溶出してきたＶＥＧＦ
II活性画分を、あらかじめ約０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液pH６．０で平衡にしておいた、４．６mm×２５
０mmのポリアスパラギン酸ＷＣＸ陽イオン交換体を用い
た高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムにか
ける。カラムの溶出は約０から０．７５Ｍの NaCl によ
るリン酸緩衝液の直線濃度勾配法で約６０分以上かけて
行なう。流速は約０．７５ml／分に保ち、０．７５mlず
つ分画する。図１に示す様に血管内皮成長因子の活性は
約２１．７から２８．５mlの分画中において認められ
た。
II活性画分を、あらかじめ約０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液pH６．０で平衡にしておいた、４．６mm×２５
０mmのポリアスパラギン酸ＷＣＸ陽イオン交換体を用い
た高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムにか
ける。カラムの溶出は約０から０．７５Ｍの NaCl によ
るリン酸緩衝液の直線濃度勾配法で約６０分以上かけて
行なう。流速は約０．７５ml／分に保ち、０．７５mlず
つ分画する。図１に示す様に血管内皮成長因子の活性は
約２１．７から２８．５mlの分画中において認められ
た。
【００１０】ＶＥＧＦIIを含むポリアスパラギン酸ＷＣ
Ｘカラムより溶出された活性画分を集め、pH約７．０に
調整した後、過剰の塩化銅で充填され、約２Ｍ NaCl 及
び約０．５ｍＭイミダゾールを含む約０．０５Ｍのリン
酸ナトリウム溶液pH約７．０（Ａ緩衝液）で平衡にされ
ている１×１０cmのファルマシアキレートアセァロース
（Pharmacia Chelating Sepharose)６Ｂのカラムに負荷
する。ＶＥＧＦIIはそのカラム中から０−２０％Ｂの勾
配で１０分かけて、２０−３５％Ｂの勾配で４５分かけ
て、及び３５−１００％Ｂの勾配で５分かけて溶出され
る。流速は０．３ml／分であり、Ｂ緩衝液とは約２Ｍ N
aCl 及び１００ｍＭイミダゾールを含む０．０５Ｍリン
酸ナトリウム溶液pH７．０のことである。図２に示す様
にＶＥＧＦII活性を示す活性画分は濃度勾配流出液の約
１２．６から２２．８ml中において認められた。
Ｘカラムより溶出された活性画分を集め、pH約７．０に
調整した後、過剰の塩化銅で充填され、約２Ｍ NaCl 及
び約０．５ｍＭイミダゾールを含む約０．０５Ｍのリン
酸ナトリウム溶液pH約７．０（Ａ緩衝液）で平衡にされ
ている１×１０cmのファルマシアキレートアセァロース
（Pharmacia Chelating Sepharose)６Ｂのカラムに負荷
する。ＶＥＧＦIIはそのカラム中から０−２０％Ｂの勾
配で１０分かけて、２０−３５％Ｂの勾配で４５分かけ
て、及び３５−１００％Ｂの勾配で５分かけて溶出され
る。流速は０．３ml／分であり、Ｂ緩衝液とは約２Ｍ N
aCl 及び１００ｍＭイミダゾールを含む０．０５Ｍリン
酸ナトリウム溶液pH７．０のことである。図２に示す様
にＶＥＧＦII活性を示す活性画分は濃度勾配流出液の約
１２．６から２２．８ml中において認められた。
【００１１】金属キレートカラムより溶出してきたＶＥ
ＧＦII活性を含む画分を集め、あらかじめ溶媒Ａ〔０．
１％トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）〕で平衡化しておいた
４．６mm×５cmのヴィダックＣ4 （Vydac C4）逆相ＨＰ
ＬＣカラム（５μｍ粒子サイズ）にのせる。そのカラム
は約０から３０％Ｂ溶媒の直線勾配で１５分かけて、３
０％Ｂでさらに１５分間、次に３０−４５％Ｂの直線勾
配で２２．５分かけて、そして最後に４５−１００％Ｂ
の直線勾配で５．５分かけて溶出される。溶媒Ｂは６７
％アセトニリトル（ｖ／ｖ）を含む溶媒Ａより成る。流
速は約０．７５ml／分を保ち、毎分ごとに分画を集めて
行く。（図３）に示す様に、この条件下で均一なＶＥＧ
ＦIIは濃度勾配流出液の約３２から約３８mlの間におい
てＣ4カラムから溶出される。
ＧＦII活性を含む画分を集め、あらかじめ溶媒Ａ〔０．
１％トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）〕で平衡化しておいた
４．６mm×５cmのヴィダックＣ4 （Vydac C4）逆相ＨＰ
ＬＣカラム（５μｍ粒子サイズ）にのせる。そのカラム
は約０から３０％Ｂ溶媒の直線勾配で１５分かけて、３
０％Ｂでさらに１５分間、次に３０−４５％Ｂの直線勾
配で２２．５分かけて、そして最後に４５−１００％Ｂ
の直線勾配で５．５分かけて溶出される。溶媒Ｂは６７
％アセトニリトル（ｖ／ｖ）を含む溶媒Ａより成る。流
速は約０．７５ml／分を保ち、毎分ごとに分画を集めて
行く。（図３）に示す様に、この条件下で均一なＶＥＧ
ＦIIは濃度勾配流出液の約３２から約３８mlの間におい
てＣ4カラムから溶出される。
【００１２】タンパク質の純度はラムリー（Laemmli)、
ネイチャー（Nature) 、第２２７巻、第６８０−６８４
頁（１９７０年）の方法を用いて、１２．５％で架橋し
たドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミ
ド ゲルの電気泳動により調べた。ゲルの銀着色法によ
り非還元条件下においてＶＥＧＦIIは約５８０００ダル
トンの分子質量を持つ１つのバンドとして検出された。
このＶＥＧＦIIの微小不均一形を含む試料を還元条件下
で泳動分離すると約２３キロダルトン（ＫＤa)のサブユ
ニットが２つ出現してくる。この精製過程によりタンパ
ク質などの他の哺乳動物細胞の産生物を実質的に含まな
いＶＥＧＦIIが得られる。同様に組み換え体由来のＶＥ
ＧＦIIも哺乳動物細胞の産生物を含まないであろう。
ネイチャー（Nature) 、第２２７巻、第６８０−６８４
頁（１９７０年）の方法を用いて、１２．５％で架橋し
たドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミ
ド ゲルの電気泳動により調べた。ゲルの銀着色法によ
り非還元条件下においてＶＥＧＦIIは約５８０００ダル
トンの分子質量を持つ１つのバンドとして検出された。
このＶＥＧＦIIの微小不均一形を含む試料を還元条件下
で泳動分離すると約２３キロダルトン（ＫＤa)のサブユ
ニットが２つ出現してくる。この精製過程によりタンパ
ク質などの他の哺乳動物細胞の産生物を実質的に含まな
いＶＥＧＦIIが得られる。同様に組み換え体由来のＶＥ
ＧＦIIも哺乳動物細胞の産生物を含まないであろう。
【００１３】生物学的活性の測定は哺乳動物の血管内皮
細胞を用いたマイトジェニックアッセイ（mitogenic as
say)により行なわれる。ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細
胞を約２０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含む培地１９９（Ｍ１９９）約５００μｌを用いて１
ウェルあたり約５０００個の細胞数でゼラチン−コート
されている皿において培養基で培養した。アッセイすべ
き検体を培養基で培養する時に加える。培養は約３７℃
で約１２時間、トリチウム化したチミジン（ＮＥＮ、２
０Ci／mmol) をアッセイ培地１mlにつき約２マイクロキ
ューリー加えて（１．０μCi／ウェル）行なった。更に
培養を６０時間続けた後、アッセイ培養液を除去し、プ
レートを約２０ｍＭヘペスpH約７．５、約０．５mg／ml
の仔牛血清アルブミンを含むハンクス（Hanks)平衡塩溶
液で洗浄する。約１００mlの水に約２gmの炭酸ナトリウ
ム、及び約４００mgの水酸化ナトリウムを含む溶液約２
００μｌで細胞を溶解させ、標識されたＤＮＡを可溶化
させる。取り込まれた放射活性を液体シンチレーター計
測機で測定する。ＨＵＶＥ細胞において半−最高マイト
ジェン応答を引き出すＶＥＧＦIIの濃度は約２±１ng／
mlであった。これらのアッセイにおいてポジティブコン
トロールの応答促進の為に必要である１０−１００μｇ
／mlの酸性繊維芽細胞成長因子のグリコサミノグリカン
ヘパリンはＶＥＧＦIIによるこれらの細胞に対するマ
イトジエン的な刺激を高めるものではない。
細胞を用いたマイトジェニックアッセイ（mitogenic as
say)により行なわれる。ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細
胞を約２０％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含む培地１９９（Ｍ１９９）約５００μｌを用いて１
ウェルあたり約５０００個の細胞数でゼラチン−コート
されている皿において培養基で培養した。アッセイすべ
き検体を培養基で培養する時に加える。培養は約３７℃
で約１２時間、トリチウム化したチミジン（ＮＥＮ、２
０Ci／mmol) をアッセイ培地１mlにつき約２マイクロキ
ューリー加えて（１．０μCi／ウェル）行なった。更に
培養を６０時間続けた後、アッセイ培養液を除去し、プ
レートを約２０ｍＭヘペスpH約７．５、約０．５mg／ml
の仔牛血清アルブミンを含むハンクス（Hanks)平衡塩溶
液で洗浄する。約１００mlの水に約２gmの炭酸ナトリウ
ム、及び約４００mgの水酸化ナトリウムを含む溶液約２
００μｌで細胞を溶解させ、標識されたＤＮＡを可溶化
させる。取り込まれた放射活性を液体シンチレーター計
測機で測定する。ＨＵＶＥ細胞において半−最高マイト
ジェン応答を引き出すＶＥＧＦIIの濃度は約２±１ng／
mlであった。これらのアッセイにおいてポジティブコン
トロールの応答促進の為に必要である１０−１００μｇ
／mlの酸性繊維芽細胞成長因子のグリコサミノグリカン
ヘパリンはＶＥＧＦIIによるこれらの細胞に対するマ
イトジエン的な刺激を高めるものではない。
【００１４】精製されたＶＥＧＦIIの検体約１−２μｇ
を約０．１％ＥＤＴＡ、約６Ｍグアニジウム クロリ
ド、及び約２０ｍＭジチオスレイトールを含む約０．１
Ｍトリス、pH約９．５で約２時間、約５０℃で還元す
る。この還元されたタンパク質を約０．１％ＥＤＴＡ及
び約６Ｍグアニジニウム クロリドそして約０．７Ｍト
リス、pH約７．８の溶液に非標識約９．２μＭ、２．８
μＭの14Ｃ−ヨード酢酸を加えた溶液中でカルボキシメ
チル化を約１時間行なった。タンパク質を約１時間、室
温においてカルボキシメチル化する。還元及びカルボキ
シメチル化後、このタンパク質を約４．６mm×５cmのヴ
ィダック（Vydac）Ｃ4 カラムの逆相ＨＰＬＣクロマト
グラフィーにより単離する。タンパク質をあらかじめ約
０．１％のＴＦＡで平衡化されているカラムに負荷した
後、流速約０．７５ml／分で、約０．１％ＴＦＡから
０．１％ＴＦＡ／６７％アセトニトリルの直線濃度勾配
を用いた４５mlの溶液で溶出される。還元及びカルボキ
シメチル化されたタンパク質はおよそ２５と２８mlにお
いて、２つのピークとして検出され、その割合は２１０
ｎｍの吸光をモニターすることによって測定されたとき
にほぼ等しかった。
を約０．１％ＥＤＴＡ、約６Ｍグアニジウム クロリ
ド、及び約２０ｍＭジチオスレイトールを含む約０．１
Ｍトリス、pH約９．５で約２時間、約５０℃で還元す
る。この還元されたタンパク質を約０．１％ＥＤＴＡ及
び約６Ｍグアニジニウム クロリドそして約０．７Ｍト
リス、pH約７．８の溶液に非標識約９．２μＭ、２．８
μＭの14Ｃ−ヨード酢酸を加えた溶液中でカルボキシメ
チル化を約１時間行なった。タンパク質を約１時間、室
温においてカルボキシメチル化する。還元及びカルボキ
シメチル化後、このタンパク質を約４．６mm×５cmのヴ
ィダック（Vydac）Ｃ4 カラムの逆相ＨＰＬＣクロマト
グラフィーにより単離する。タンパク質をあらかじめ約
０．１％のＴＦＡで平衡化されているカラムに負荷した
後、流速約０．７５ml／分で、約０．１％ＴＦＡから
０．１％ＴＦＡ／６７％アセトニトリルの直線濃度勾配
を用いた４５mlの溶液で溶出される。還元及びカルボキ
シメチル化されたタンパク質はおよそ２５と２８mlにお
いて、２つのピークとして検出され、その割合は２１０
ｎｍの吸光をモニターすることによって測定されたとき
にほぼ等しかった。
【００１５】還元及びカルボキシメチル化されたモノマ
ーの試料をポリブレン−コートされたガスラ繊維のフィ
ルターに通し、それらのＮ末端アミノ酸配列をエドマン
分解法により決定した。このときＡＢＩ１２０Ａオン
ラインフェニルチオヒダントインアナライザーと接続し
たガス相マイクロシークエンサーで、その機種の操作方
法に従がい行なった。およそ２８ml（Ａサブユニットあ
るいはモノマー）において溶出してきた吸光度ピークを
示すタンパク質は以下のアミノ酸末端配列を有してお
り、
ーの試料をポリブレン−コートされたガスラ繊維のフィ
ルターに通し、それらのＮ末端アミノ酸配列をエドマン
分解法により決定した。このときＡＢＩ１２０Ａオン
ラインフェニルチオヒダントインアナライザーと接続し
たガス相マイクロシークエンサーで、その機種の操作方
法に従がい行なった。およそ２８ml（Ａサブユニットあ
るいはモノマー）において溶出してきた吸光度ピークを
示すタンパク質は以下のアミノ酸末端配列を有してお
り、
【化１】 この配列はＶＥＧＦＩのモノマーと同一であった（コン
等（Conn et al.)、プロク. ナトル. アカド. サイ. ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第８７
巻、第２６２８−２６３２頁（１９９０年））。２５ml
（Ｂサブユニットあるいはモノマー）において溶出して
きた吸光度ピークを示すタンパク質は以下のＮ末端配列
を有しており
等（Conn et al.)、プロク. ナトル. アカド. サイ. ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第８７
巻、第２６２８−２６３２頁（１９９０年））。２５ml
（Ｂサブユニットあるいはモノマー）において溶出して
きた吸光度ピークを示すタンパク質は以下のＮ末端配列
を有しており
【化２】 加えて最初の３個のアミノ酸残基を欠失した、ほぼ等価
量の端を切り取った形のタンパク質も得られた。欠失Ｘ
xx残基はクローン化されたｃＤＮＡにおいて示されるＡ
sn残基に相当するものである、以下参照。この欠失Ａsn
は典型的なＡsnＸxxＳer／ＴhrのＮ−グリコシレーショ
ン配列中に見られるものなので、グリコシレーションさ
れたものと思われる。このＡサブユニットと両方のＢサ
ブユニットのトータルがほぼ等量で回収されたという事
は、ＶＥＧＦIIがこれら２種のペプチドが結合してＡＢ
ヘテロダイマーを形成しているという説明を支持するも
のである。
量の端を切り取った形のタンパク質も得られた。欠失Ｘ
xx残基はクローン化されたｃＤＮＡにおいて示されるＡ
sn残基に相当するものである、以下参照。この欠失Ａsn
は典型的なＡsnＸxxＳer／ＴhrのＮ−グリコシレーショ
ン配列中に見られるものなので、グリコシレーションさ
れたものと思われる。このＡサブユニットと両方のＢサ
ブユニットのトータルがほぼ等量で回収されたという事
は、ＶＥＧＦIIがこれら２種のペプチドが結合してＡＢ
ヘテロダイマーを形成しているという説明を支持するも
のである。
【００１６】Ａモノマーの試料をリジン及びアルギニン
残基のＣ末端側でそのポリペプチドを解裂しうる蛋白分
解酵素トリプシあるいはリジンのＣ末端側でそのポリペ
プチドを解裂しうるＬysＣにより、当業者においてよく
知られている方法を用いて処理した。ペプチドは逆相Ｈ
ＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により単離する。単離された
ペプチドのアミノ酸配列はエドマン分解を用いて決定し
た。ＡＢＩ１２０Ａオン ラインフェニルチオヒダント
インアナライザーと接続したＡＢＩガス相シークエンサ
ーで、その機種の操作方法に従がい行なった。得られた
アミノ酸配列を図４〜８に示す。
残基のＣ末端側でそのポリペプチドを解裂しうる蛋白分
解酵素トリプシあるいはリジンのＣ末端側でそのポリペ
プチドを解裂しうるＬysＣにより、当業者においてよく
知られている方法を用いて処理した。ペプチドは逆相Ｈ
ＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により単離する。単離された
ペプチドのアミノ酸配列はエドマン分解を用いて決定し
た。ＡＢＩ１２０Ａオン ラインフェニルチオヒダント
インアナライザーと接続したＡＢＩガス相シークエンサ
ーで、その機種の操作方法に従がい行なった。得られた
アミノ酸配列を図４〜８に示す。
【００１７】還元及びカルボキシメチル化されたＡモノ
マーを乾燥した後、約０．１％ＥＤＴＡを含む約６Ｍグ
アニジニウム クロリド、及び約０．７ＭトリスpH約
７．８で可溶化した。そこへＶ８蛋白分解酵素を０．１
Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液pH約８．０に加え、混合物
を約４８時間、約３７℃でインキュベーションを行う。
蛋白分解酵素は主にグルタミン酸残基のカルボキシル末
端側を解裂する。上記記載と同様に得られたポリペプチ
ドをＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣにかける。
マーを乾燥した後、約０．１％ＥＤＴＡを含む約６Ｍグ
アニジニウム クロリド、及び約０．７ＭトリスpH約
７．８で可溶化した。そこへＶ８蛋白分解酵素を０．１
Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液pH約８．０に加え、混合物
を約４８時間、約３７℃でインキュベーションを行う。
蛋白分解酵素は主にグルタミン酸残基のカルボキシル末
端側を解裂する。上記記載と同様に得られたポリペプチ
ドをＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣにかける。
【００１８】還元及びカルボキシメチル化されたＡサブ
ユニットのタンパク質溶液を６規定ＨＣｌでpH約６．８
に調整してジチオスレイトールを最終濃度２Ｍになる様
に加え、すべてのメチオニンスルフォキシドメチオニン
残基に還元する。約２０時間、約３９℃の還元反応後、
このタンパク質をＣ4 ＨＰＬＣで精製する。産生物を乾
燥した後、アルゴン気流下で約２０℃、約２４時間、暗
所において、４０ｍＭの臭化シアンを含む約７０％（ｖ
／ｖ）の蟻酸２００μｌを用いてメチオニン残基のカル
ボキシル末端側の解裂を行なった。解裂された産生物を
Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。図４〜８にそのアミノ酸
配列を示した。コーン等、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．ユーエスエー、第８７巻、第２６２８−２６３２頁
（１９９０年）参照。
ユニットのタンパク質溶液を６規定ＨＣｌでpH約６．８
に調整してジチオスレイトールを最終濃度２Ｍになる様
に加え、すべてのメチオニンスルフォキシドメチオニン
残基に還元する。約２０時間、約３９℃の還元反応後、
このタンパク質をＣ4 ＨＰＬＣで精製する。産生物を乾
燥した後、アルゴン気流下で約２０℃、約２４時間、暗
所において、４０ｍＭの臭化シアンを含む約７０％（ｖ
／ｖ）の蟻酸２００μｌを用いてメチオニン残基のカル
ボキシル末端側の解裂を行なった。解裂された産生物を
Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。図４〜８にそのアミノ酸
配列を示した。コーン等、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．ユーエスエー、第８７巻、第２６２８−２６３２頁
（１９９０年）参照。
【００１９】ＶＥＧＦIIのＡモノマーの翻訳産物である
完全長１９０アミノ酸残基から成るタンパク質は、現
在、ＶＥＧＦＩＡモノマーと同一であるとして知られて
おり、配列をコードするそのｃＤＮＡを図４〜８、図９
〜１２に示す。完全なアミノ酸末端は２７残基目から始
まり、代表的な疎水性分泌リーダー配列がすぐ続いてい
る。単一なＮ−グリコシレーション部位は１００番目の
Ａsnに存在している。アミノ酸末端及びトリプシン
（Ｔ）、Ｌys−Ｃ（Ｌ）、スタフィロコッカスアウレウ
スＶ８プロテアーゼ（Ｖ８）及び臭化シアン（ＣＢ）に
よる解裂物のＨＰＬＣ逆相−精製産物を含む還元及びカ
ルボキシメチル化完全サブユニットの１６４残基の内の
大部分（１４３アミノ酸残基）はダイレクト ミクロシ
ークエンス（direct microsequencing）（アプライド
バイオシステム（Applied Biosystems) ４７０Ａ）によ
り、総量５μｇのタンパク質を用いて決定された。アミ
ノ酸シークエンスにより同定されたすべての残基は、全
サブユニットのアミノ末端決定については２７残基目の
ブラケット（bracket）の後の成熟処理された配列直下
の右向きの矢印によってまた、ポリペプチドの解裂産物
から同定される残基については、特定のポリペプチドの
長さにかかっているダブルヘッドの矢印の上方の右向き
の矢印によって表示される。ポリペプチドの一つのペア
ーである、Ｖ１８Ａ及びＶ１８Ｂを混合物として配列決
定を行ない、それにより、ｃＤＮＡ−推定アミノ酸配列
の確認が出来る、図４〜８参照。
完全長１９０アミノ酸残基から成るタンパク質は、現
在、ＶＥＧＦＩＡモノマーと同一であるとして知られて
おり、配列をコードするそのｃＤＮＡを図４〜８、図９
〜１２に示す。完全なアミノ酸末端は２７残基目から始
まり、代表的な疎水性分泌リーダー配列がすぐ続いてい
る。単一なＮ−グリコシレーション部位は１００番目の
Ａsnに存在している。アミノ酸末端及びトリプシン
（Ｔ）、Ｌys−Ｃ（Ｌ）、スタフィロコッカスアウレウ
スＶ８プロテアーゼ（Ｖ８）及び臭化シアン（ＣＢ）に
よる解裂物のＨＰＬＣ逆相−精製産物を含む還元及びカ
ルボキシメチル化完全サブユニットの１６４残基の内の
大部分（１４３アミノ酸残基）はダイレクト ミクロシ
ークエンス（direct microsequencing）（アプライド
バイオシステム（Applied Biosystems) ４７０Ａ）によ
り、総量５μｇのタンパク質を用いて決定された。アミ
ノ酸シークエンスにより同定されたすべての残基は、全
サブユニットのアミノ末端決定については２７残基目の
ブラケット（bracket）の後の成熟処理された配列直下
の右向きの矢印によってまた、ポリペプチドの解裂産物
から同定される残基については、特定のポリペプチドの
長さにかかっているダブルヘッドの矢印の上方の右向き
の矢印によって表示される。ポリペプチドの一つのペア
ーである、Ｖ１８Ａ及びＶ１８Ｂを混合物として配列決
定を行ない、それにより、ｃＤＮＡ−推定アミノ酸配列
の確認が出来る、図４〜８参照。
【００２０】還元及びカルボキシメチル化された純ＶＥ
ＧＦIIのＡ及びＢ単量体の試料を、それぞれＬys−Ｃエ
ンドプロテネース（endoproteinase) で切断した。解裂
（切断）はリジン残基のＣ末端側で起きる。得られたペ
プチドを逆相ＨＰＬＣにより単離して、上記記載と同様
にそのアミノ酸配列を決定した。最終的なＶＥＧＦIIＡ
及びＢの配列中におけるそのペプチドの局在位置をそれ
ぞれ図９〜１２及び図１３〜１５に示した。
ＧＦIIのＡ及びＢ単量体の試料を、それぞれＬys−Ｃエ
ンドプロテネース（endoproteinase) で切断した。解裂
（切断）はリジン残基のＣ末端側で起きる。得られたペ
プチドを逆相ＨＰＬＣにより単離して、上記記載と同様
にそのアミノ酸配列を決定した。最終的なＶＥＧＦIIＡ
及びＢの配列中におけるそのペプチドの局在位置をそれ
ぞれ図９〜１２及び図１３〜１５に示した。
【００２１】Ａ単量体をコードしている領域の完全な配
列を３セットの部分的に重なるｃＤＮＡクローンより決
定した。ポリペプチドＬ４２（残基４２−４７）からの
アミノ酸配列Ｐhe−Ｍet−Ａsp−Ｖal−Ｔyr−Ｇln及び
ポリペプチドＴ３８（残基１６４−１６８）からのアミ
ノ酸配列Ｃys−Ｌys−Ａsn−Ｔhr−Ａspを基にした縮退
オリゴヌクレオチドプライマー（図４〜８及び図９〜１
２参照）を用いてＶＥＧＦ Ａ鎖の中心部分のｃＤＮＡ
をＰＣＲ増幅に用いた。方法はサイキ等（Saiki et a
l.) 、サイエンス（Science)、第２３０巻、１３５０−
１３５４（１９８５）に従がった。４２０bpに移動する
シングルバンドをゲル精製した後、ＳalＩで切断し、ｐ
ＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合後、配列を決定した。得られ
た塩基配列（ｐ４２３８）はｃＤＮＡの５′及び３′末
端を増幅する為のアンチセンス及びセンスＰＣＲプライ
マーをデザインするのに使用した。このとき方法はフロ
ーマン（Frohman)等、プロク．ナトル．アカド．サイ．
ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA) 、第８５
巻、８９９８−９００２（１９８８）記載に従がった。
５′及び３′クローンはそれぞれｐ５−１５及びｐＷ３
と表示される。プライマーは除き、各セットのクローン
について決定された完全なＤＮＡの塩基配列領域は、そ
の塩基配列の上方にダブルヘッドの矢印で示してある。
更にタンパク質配列決定により同定された１６４アミノ
酸分泌形をコードしているｃＤＮＡの他、１２０アミノ
酸をコードしているものと１８８アミノ酸をコードして
いるもの２種のｃＤＡＮをクローン化して塩基配列を決
定した。
列を３セットの部分的に重なるｃＤＮＡクローンより決
定した。ポリペプチドＬ４２（残基４２−４７）からの
アミノ酸配列Ｐhe−Ｍet−Ａsp−Ｖal−Ｔyr−Ｇln及び
ポリペプチドＴ３８（残基１６４−１６８）からのアミ
ノ酸配列Ｃys−Ｌys−Ａsn−Ｔhr−Ａspを基にした縮退
オリゴヌクレオチドプライマー（図４〜８及び図９〜１
２参照）を用いてＶＥＧＦ Ａ鎖の中心部分のｃＤＮＡ
をＰＣＲ増幅に用いた。方法はサイキ等（Saiki et a
l.) 、サイエンス（Science)、第２３０巻、１３５０−
１３５４（１９８５）に従がった。４２０bpに移動する
シングルバンドをゲル精製した後、ＳalＩで切断し、ｐ
ＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合後、配列を決定した。得られ
た塩基配列（ｐ４２３８）はｃＤＮＡの５′及び３′末
端を増幅する為のアンチセンス及びセンスＰＣＲプライ
マーをデザインするのに使用した。このとき方法はフロ
ーマン（Frohman)等、プロク．ナトル．アカド．サイ．
ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA) 、第８５
巻、８９９８−９００２（１９８８）記載に従がった。
５′及び３′クローンはそれぞれｐ５−１５及びｐＷ３
と表示される。プライマーは除き、各セットのクローン
について決定された完全なＤＮＡの塩基配列領域は、そ
の塩基配列の上方にダブルヘッドの矢印で示してある。
更にタンパク質配列決定により同定された１６４アミノ
酸分泌形をコードしているｃＤＮＡの他、１２０アミノ
酸をコードしているものと１８８アミノ酸をコードして
いるもの２種のｃＤＡＮをクローン化して塩基配列を決
定した。
【００２２】Ｂ単量体をコードしている領域の完全な配
列を４セットの部分的に重複しているｃＤＮＡクローン
より決定した。ポリペプチドＬ５０のアミノ酸配列を基
にした縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｖ
ＥＧＦIIＢ単量体の中心部分のｃＤＮＡをＰＣＲにより
増幅した。方法はサイキ等、サイエンス、第２３０巻、
１３５０−１３５４（１９８５）に従がった。１０８bp
に移動するシングルバンドをゲル精製した後、ＳalＩ切
断し、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した後に、塩基配列
を決定した。得られた塩基配列（ｐＹＧ）はｃＤＮＡの
５′及び３′末端を増幅する為のアンチセンス及びセン
スＰＣＲプライマーをデザインするのに使用した。この
とき方法はフローマン等、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．ユーエスエー、第８５巻８９９８−９００２（１９
８８）記載に従がった。５′及び３′クローンは、それ
ぞれｐ５Ｖ２及びｐ３Ｖ２と表示される。別の５′末端
配列はＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡから調製されたｃＤＮ
Ａライブラリーより単離されたクローン２０２によって
決定された。プライマーを除き、各セットのクローンに
ついて決定された完全なＤＮＡの塩基配列の領域は、そ
の塩基配列の上方にダブルヘッドの矢印で示してある。
１３５アミノ酸微小不均一性（microheterogeneous) Ｂ
サブユニット及び１１５アミノ微小不均一性Ｂサブユニ
ットに対する完全な塩基配列が図１３〜１５、及び図１
６〜１７に示されている。
列を４セットの部分的に重複しているｃＤＮＡクローン
より決定した。ポリペプチドＬ５０のアミノ酸配列を基
にした縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｖ
ＥＧＦIIＢ単量体の中心部分のｃＤＮＡをＰＣＲにより
増幅した。方法はサイキ等、サイエンス、第２３０巻、
１３５０−１３５４（１９８５）に従がった。１０８bp
に移動するシングルバンドをゲル精製した後、ＳalＩ切
断し、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した後に、塩基配列
を決定した。得られた塩基配列（ｐＹＧ）はｃＤＮＡの
５′及び３′末端を増幅する為のアンチセンス及びセン
スＰＣＲプライマーをデザインするのに使用した。この
とき方法はフローマン等、プロク．ナトル．アカド．サ
イ．ユーエスエー、第８５巻８９９８−９００２（１９
８８）記載に従がった。５′及び３′クローンは、それ
ぞれｐ５Ｖ２及びｐ３Ｖ２と表示される。別の５′末端
配列はＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡから調製されたｃＤＮ
Ａライブラリーより単離されたクローン２０２によって
決定された。プライマーを除き、各セットのクローンに
ついて決定された完全なＤＮＡの塩基配列の領域は、そ
の塩基配列の上方にダブルヘッドの矢印で示してある。
１３５アミノ酸微小不均一性（microheterogeneous) Ｂ
サブユニット及び１１５アミノ微小不均一性Ｂサブユニ
ットに対する完全な塩基配列が図１３〜１５、及び図１
６〜１７に示されている。
【００２３】血管内皮細胞成長因子IIはＡサブユニット
とＢサブユニットから成るヘテロダイマーとして存在し
ていると考えられる。更にＶＥＧホモダイマーは２つの
Ａサブユニットあるいは２つのＮサブユニットとして存
在していると考えられる。Ｂサブユニットは１３５アミ
ノ酸形あるいは１１５アミノ酸形であることができる。
Ａサブユニットは１８８アミノ酸形、１６４アミノ酸
形、あるいは１２０アミノ酸形であることができる。こ
れらヘテロダイマーあるいはヘテロダイマーの種類を表
示すると、Ａ188 ＋Ｂ135 、Ａ188 ＋Ｂ115 、Ａ164 ＋
Ｂ135、Ａ164 ＋Ｂ115 、Ａ120 ＋Ｂ135 、Ａ120 ＋Ｂ
115 、Ｂ135 ＋Ｂ115 、Ａ188 ＋Ａ164 、Ａ188 ＋Ａ
120 及びＡ164 ＋Ａ120 となる。ホモダイマーはＢ135
＋Ｂ135 、Ｂ11 5 ＋Ｂ115 、Ａ188 ＋Ａ188 及びＡ120
＋Ａ120 と表示される。本発明はＶＥＧＦIIのＡザフユ
ニット及びＢサブユニットの個々のサブユニット形すべ
てを含むと考えられる。
とＢサブユニットから成るヘテロダイマーとして存在し
ていると考えられる。更にＶＥＧホモダイマーは２つの
Ａサブユニットあるいは２つのＮサブユニットとして存
在していると考えられる。Ｂサブユニットは１３５アミ
ノ酸形あるいは１１５アミノ酸形であることができる。
Ａサブユニットは１８８アミノ酸形、１６４アミノ酸
形、あるいは１２０アミノ酸形であることができる。こ
れらヘテロダイマーあるいはヘテロダイマーの種類を表
示すると、Ａ188 ＋Ｂ135 、Ａ188 ＋Ｂ115 、Ａ164 ＋
Ｂ135、Ａ164 ＋Ｂ115 、Ａ120 ＋Ｂ135 、Ａ120 ＋Ｂ
115 、Ｂ135 ＋Ｂ115 、Ａ188 ＋Ａ164 、Ａ188 ＋Ａ
120 及びＡ164 ＋Ａ120 となる。ホモダイマーはＢ135
＋Ｂ135 、Ｂ11 5 ＋Ｂ115 、Ａ188 ＋Ａ188 及びＡ120
＋Ａ120 と表示される。本発明はＶＥＧＦIIのＡザフユ
ニット及びＢサブユニットの個々のサブユニット形すべ
てを含むと考えられる。
【００２４】更に遺伝子コードの縮退によって示されて
いる様に、血管内皮成長因子IIの塩基配列は、それぞれ
の血管内皮成長因子IIサブユニットの配列の適切なアミ
ノ酸をコードしているすべてのコドンを含んでいると考
えられる。更にまた血管内皮成長因子IIと類似の生物学
的活性を示すタンパクを誘導しうる一部切り取られた状
態の遺伝子あるいはタンパク質をも、このＶＥＧＦIIサ
ブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列に含まれるもの
と理解される。本発明の範囲には、配列が変化している
が血管内皮細胞の分裂を刺激しうる能力を測定して生物
学的に同等であるすべての自然に起こる変異及び対立遺
伝子変異株あるいはすべての人工的に引き起こされる変
異体が含まれると理解される。
いる様に、血管内皮成長因子IIの塩基配列は、それぞれ
の血管内皮成長因子IIサブユニットの配列の適切なアミ
ノ酸をコードしているすべてのコドンを含んでいると考
えられる。更にまた血管内皮成長因子IIと類似の生物学
的活性を示すタンパクを誘導しうる一部切り取られた状
態の遺伝子あるいはタンパク質をも、このＶＥＧＦIIサ
ブユニットの塩基配列及びアミノ酸配列に含まれるもの
と理解される。本発明の範囲には、配列が変化している
が血管内皮細胞の分裂を刺激しうる能力を測定して生物
学的に同等であるすべての自然に起こる変異及び対立遺
伝子変異株あるいはすべての人工的に引き起こされる変
異体が含まれると理解される。
【００２５】上記記載の血管内皮成長因子であるヘテロ
ダイマー、ホモダイマー、サブユニット及び単量体は、
化学的合成方法、あるいは本記載のＤＮＡ配列の原核あ
るいは真核宿主細胞中で発現されてくる産生物であるこ
とにより特徴づけられる。単量体とはオリゴマーのユニ
ットを形成し得えないサブユニットとして定義される。
組み換え体ＶＥＧＦII遺伝子（組み換え体ＤＮＡ）の発
現は多数ある発現ベクターのうちの少なくともどれか１
つを有する、数多くの異なった宿主細胞によって行なわ
れる。発現ベクターとは適切な宿主細胞中でクローン化
された組み換えＤＮＡ配列のコピーあるいは遺伝子を転
写し、さらにそれらのｍＲＮＡを翻訳するのに必要なＤ
ＮＡ配列として、ここでは定義されうるものである。こ
の様なベクターは、種々の宿主中の遺伝子を発現させる
ために用いられる。例えば、細菌、青−緑藻、酵母細
胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞があるが、哺乳
動物細胞が好ましい。また遺伝子は種々のウィルスシス
テム中で発現することができる。特別にデザインされた
ベクターは細菌−酵母、細菌−植物、あるいは細菌−動
物細胞間でＤＮＡをシャトルすることができる。適切な
る発現ベクターには以下のものが含まれる：宿主細胞中
での自己複製のための複製開始点、選択マーカー、限定
された数の有効な制限酵素部位、高いコピー数、強いプ
ロモーターが含まれている。プロモーターとはＲＮＡポ
リメラーゼをＤＮＡに結合させ、そしてＲＮＡ合成を開
始させるＤＮＡ配列として定義される。強いプロモータ
ーとは、高頻度にｍＲＮＡを伸長させうるものである。
発現ベクターには、これらに限定されるものではないけ
れどもクローニングベクター、改良クローニングベクタ
ー、特別にデザインされたプラスミドあるいはウィルス
及びコスミドがある。培養哺乳動物細胞中における哺乳
動物遺伝子の発現は当業者においてはよく知られるとこ
ろのものである。サムブルック（Sambrook et al.)等、
モレクュラー クローニング（MolecularCloning)、ア
ラボラトリー マニュアル（A Laboratory Manual) 、
第２版、ブック３、コールド スプリングス ハーバー
ラボラトリー プレス（Cold Springs Harbor Labora
toty Press) 、（１９８９）及びカレント プロトコー
ルズ イン モレクュラー バイオロジー（Current Pr
otocolsIn Molecular Biology) 、オースベル等（Ausub
el et al.) 著、グリーン パブリッシュング アソシ
エイツ アンド ウィリ−インターサイエンス（Green
Publishing Associates and Wiley-Interscience) 、１
９８７及び補追、において哺乳動物細胞中への組み換え
体ベクターの導入に関する方法と共に種々の哺乳動物発
現ベクター及びベクターシステムが記載されている。Ａ
及びＢサブユニットの単量体形についてのｃＤＮＡはリ
ネミヤー等（Linemeyer et al.) 、ヨーロッパ特許出
願、公開No. ２５９，９５３に記載されている様なシス
テムにおいて発現する事が出来る。ｃＤＮＡはリネミヤ
ー等が改良している様にｐＫＫ２２３−３（ファルマシ
ア）などの市販されているプラスミドに組み込まれて、
大腸菌中で発現される。他の発現系及び宿主細胞もよく
知られいる。
ダイマー、ホモダイマー、サブユニット及び単量体は、
化学的合成方法、あるいは本記載のＤＮＡ配列の原核あ
るいは真核宿主細胞中で発現されてくる産生物であるこ
とにより特徴づけられる。単量体とはオリゴマーのユニ
ットを形成し得えないサブユニットとして定義される。
組み換え体ＶＥＧＦII遺伝子（組み換え体ＤＮＡ）の発
現は多数ある発現ベクターのうちの少なくともどれか１
つを有する、数多くの異なった宿主細胞によって行なわ
れる。発現ベクターとは適切な宿主細胞中でクローン化
された組み換えＤＮＡ配列のコピーあるいは遺伝子を転
写し、さらにそれらのｍＲＮＡを翻訳するのに必要なＤ
ＮＡ配列として、ここでは定義されうるものである。こ
の様なベクターは、種々の宿主中の遺伝子を発現させる
ために用いられる。例えば、細菌、青−緑藻、酵母細
胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞があるが、哺乳
動物細胞が好ましい。また遺伝子は種々のウィルスシス
テム中で発現することができる。特別にデザインされた
ベクターは細菌−酵母、細菌−植物、あるいは細菌−動
物細胞間でＤＮＡをシャトルすることができる。適切な
る発現ベクターには以下のものが含まれる：宿主細胞中
での自己複製のための複製開始点、選択マーカー、限定
された数の有効な制限酵素部位、高いコピー数、強いプ
ロモーターが含まれている。プロモーターとはＲＮＡポ
リメラーゼをＤＮＡに結合させ、そしてＲＮＡ合成を開
始させるＤＮＡ配列として定義される。強いプロモータ
ーとは、高頻度にｍＲＮＡを伸長させうるものである。
発現ベクターには、これらに限定されるものではないけ
れどもクローニングベクター、改良クローニングベクタ
ー、特別にデザインされたプラスミドあるいはウィルス
及びコスミドがある。培養哺乳動物細胞中における哺乳
動物遺伝子の発現は当業者においてはよく知られるとこ
ろのものである。サムブルック（Sambrook et al.)等、
モレクュラー クローニング（MolecularCloning)、ア
ラボラトリー マニュアル（A Laboratory Manual) 、
第２版、ブック３、コールド スプリングス ハーバー
ラボラトリー プレス（Cold Springs Harbor Labora
toty Press) 、（１９８９）及びカレント プロトコー
ルズ イン モレクュラー バイオロジー（Current Pr
otocolsIn Molecular Biology) 、オースベル等（Ausub
el et al.) 著、グリーン パブリッシュング アソシ
エイツ アンド ウィリ−インターサイエンス（Green
Publishing Associates and Wiley-Interscience) 、１
９８７及び補追、において哺乳動物細胞中への組み換え
体ベクターの導入に関する方法と共に種々の哺乳動物発
現ベクター及びベクターシステムが記載されている。Ａ
及びＢサブユニットの単量体形についてのｃＤＮＡはリ
ネミヤー等（Linemeyer et al.) 、ヨーロッパ特許出
願、公開No. ２５９，９５３に記載されている様なシス
テムにおいて発現する事が出来る。ｃＤＮＡはリネミヤ
ー等が改良している様にｐＫＫ２２３−３（ファルマシ
ア）などの市販されているプラスミドに組み込まれて、
大腸菌中で発現される。他の発現系及び宿主細胞もよく
知られいる。
【００２６】ホモ−及び−ヘテロダイマーの構造と共に
Ａ及びＢサブユニットの高いＣys含量及びグリコシル化
は、生物学的に活性なタンパク質の発現が動物細胞にお
いて行なわれる事を示唆している。発現はdhfr−ＣＨＯ
（卵巣）へジヒドロ葉酸塩リダクターゼをコードしてい
る遺伝子を用いて共移入されたクローン化ＶＥＧＦIIＤ
ＮＡを有するチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞中で行
なわれる。サムブルック等参照。dhfrを発現するトラン
スホーマントをヌクレオシド欠損培地において選択し、
そしてメトトレキセートの濃度を増大させる。dhfr及び
ＶＥＧＦII遺伝子をこのように増幅して高いレベルのＶ
ＥＧＦIIが発現されうる様に安定な細胞系にする。プラ
スミドは１つのＡサブユニット及びＢサブユニットある
いは２つのＡあるいはＢサブユニットが含まれる様にデ
ザインされている。２つのｃＤＮＡは、タンパク産物が
二量体になり、ＶＥＧＦIIを生物学的活性を有する様に
機能的に取り付ける。“機能的に取り付ける”とは機能
的に取り付けられた遺伝子、ｃＤＮＡセグメントあるい
はヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞によって
所望のタンパク質が産生される様な核酸セグメント、ｃ
ＤＮＡセグメントあるいは遺伝子の適切な一連の配列を
いう。
Ａ及びＢサブユニットの高いＣys含量及びグリコシル化
は、生物学的に活性なタンパク質の発現が動物細胞にお
いて行なわれる事を示唆している。発現はdhfr−ＣＨＯ
（卵巣）へジヒドロ葉酸塩リダクターゼをコードしてい
る遺伝子を用いて共移入されたクローン化ＶＥＧＦIIＤ
ＮＡを有するチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞中で行
なわれる。サムブルック等参照。dhfrを発現するトラン
スホーマントをヌクレオシド欠損培地において選択し、
そしてメトトレキセートの濃度を増大させる。dhfr及び
ＶＥＧＦII遺伝子をこのように増幅して高いレベルのＶ
ＥＧＦIIが発現されうる様に安定な細胞系にする。プラ
スミドは１つのＡサブユニット及びＢサブユニットある
いは２つのＡあるいはＢサブユニットが含まれる様にデ
ザインされている。２つのｃＤＮＡは、タンパク産物が
二量体になり、ＶＥＧＦIIを生物学的活性を有する様に
機能的に取り付ける。“機能的に取り付ける”とは機能
的に取り付けられた遺伝子、ｃＤＮＡセグメントあるい
はヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞によって
所望のタンパク質が産生される様な核酸セグメント、ｃ
ＤＮＡセグメントあるいは遺伝子の適切な一連の配列を
いう。
【００２７】発現タンパク（単量体あるいは二量体）
は、一般的タンパク精製過程により単離、精製される。
ＶＥＧＦIIのヘテロダイマーを発現しうる発現ベクター
にはＡサブユニットをコードするＤＮＡ配列及びＢサブ
ユニットをコードするＤＮＡ配列が含まれていることが
理解される。ＶＥＧＦのホモダイマーを発現しうる発現
ベクターには２つのＡあるいは２つのＢサブユニットの
両者をコードする１つ、あるいは２つのＤＮＡ配列が含
まれる。血管内皮細胞の分裂を刺激する種々のＶＥＧＦ
IIの能力はこのタンパク質中の微小不均一形及び別のス
プライシング形を薬剤として有効にする。ここで用いら
れるタンパク質には先に記載した微小不均一形のすべて
が含まれる。本タンパク質は、ヒトを含めた哺乳動物の
けがを治療するために、その様な処置の必要な患者に本
新規タンパク質を投与することによって使用される。
は、一般的タンパク精製過程により単離、精製される。
ＶＥＧＦIIのヘテロダイマーを発現しうる発現ベクター
にはＡサブユニットをコードするＤＮＡ配列及びＢサブ
ユニットをコードするＤＮＡ配列が含まれていることが
理解される。ＶＥＧＦのホモダイマーを発現しうる発現
ベクターには２つのＡあるいは２つのＢサブユニットの
両者をコードする１つ、あるいは２つのＤＮＡ配列が含
まれる。血管内皮細胞の分裂を刺激する種々のＶＥＧＦ
IIの能力はこのタンパク質中の微小不均一形及び別のス
プライシング形を薬剤として有効にする。ここで用いら
れるタンパク質には先に記載した微小不均一形のすべて
が含まれる。本タンパク質は、ヒトを含めた哺乳動物の
けがを治療するために、その様な処置の必要な患者に本
新規タンパク質を投与することによって使用される。
【００２８】血管内皮細胞を刺激する新規方法は栄養培
地中の所望の血管内皮細胞のサンプルを哺乳動物（好ま
しくはヒトあるいはラット）ＶＥＧＦIIを濃度約１−１
０ng／mlで処理することを特徴とする。もし血管内皮細
胞の増殖がインビトロの系でコントロールできるのであ
れば、その行程には、ＤＭＥＭあるいは改良ＤＭＥＭな
どの栄養培地、及び低濃度のウシあるいは仔牛血清、例
えば約０から２％容量、が必要である。当該技術分野に
おいて周知の如く抗生物質などの保存薬も含むことがで
きる。
地中の所望の血管内皮細胞のサンプルを哺乳動物（好ま
しくはヒトあるいはラット）ＶＥＧＦIIを濃度約１−１
０ng／mlで処理することを特徴とする。もし血管内皮細
胞の増殖がインビトロの系でコントロールできるのであ
れば、その行程には、ＤＭＥＭあるいは改良ＤＭＥＭな
どの栄養培地、及び低濃度のウシあるいは仔牛血清、例
えば約０から２％容量、が必要である。当該技術分野に
おいて周知の如く抗生物質などの保存薬も含むことがで
きる。
【００２９】本発明の新規成長因子は人工血管を血管内
皮細胞で包み込む時に有効に用いられるものである。患
者由来の血管内皮細胞は抹消血管あるいは毛細管を含む
組織の小さな断片を取り出す事により得られ、この細胞
をＶＥＧＦII及び他の増殖に必要な添加物と伴に培養す
る。培養中の血管内皮細胞が合成ポリメリック血管を包
み込むに十分な細胞数にまで増殖したら、細胞を管の内
面に、例えば固定（臍静脈）の様に植え付け、患者に移
植するものである。別法としてはチュブラーサポート
（tubular support)を患者に移植する前にインビトロで
ＶＥＧＦIIでコートする方法がある。移植した後、内皮
細胞が人工物表面に移動しそこで増殖を始める。フィブ
リン、コラーゲン、フィブロネクチンあるいはラミニン
などのタンパク質を用いた。共有あるいは非共有結合的
な人工管の前コートは細胞の人工物表面への付着を促進
させるものである。このセルライン化された人工管は外
科的に患者へ移植され、患者自身の細胞で満たされてい
る為に免疫学的にも適合するものである。非−トロンボ
ジェニック内皮細胞により人工管の表面における凝塊形
成の傾向は減少し、それによりいかなる部位においても
血管のブロックや塞栓の起こる頻度が減少する。
皮細胞で包み込む時に有効に用いられるものである。患
者由来の血管内皮細胞は抹消血管あるいは毛細管を含む
組織の小さな断片を取り出す事により得られ、この細胞
をＶＥＧＦII及び他の増殖に必要な添加物と伴に培養す
る。培養中の血管内皮細胞が合成ポリメリック血管を包
み込むに十分な細胞数にまで増殖したら、細胞を管の内
面に、例えば固定（臍静脈）の様に植え付け、患者に移
植するものである。別法としてはチュブラーサポート
（tubular support)を患者に移植する前にインビトロで
ＶＥＧＦIIでコートする方法がある。移植した後、内皮
細胞が人工物表面に移動しそこで増殖を始める。フィブ
リン、コラーゲン、フィブロネクチンあるいはラミニン
などのタンパク質を用いた。共有あるいは非共有結合的
な人工管の前コートは細胞の人工物表面への付着を促進
させるものである。このセルライン化された人工管は外
科的に患者へ移植され、患者自身の細胞で満たされてい
る為に免疫学的にも適合するものである。非−トロンボ
ジェニック内皮細胞により人工管の表面における凝塊形
成の傾向は減少し、それによりいかなる部位においても
血管のブロックや塞栓の起こる頻度が減少する。
【００３０】新規タンパク質は人工血管の作成にも有用
である。血管内皮細胞及び平滑筋細胞は患者より得ら
れ、それらを別々に培養増殖させる。内皮細胞をＶＥＧ
ＦII存在下で上記記載にそって培養する。平滑筋の培養
は当業界で良く知られている方法で行なった。生物学的
に適合しうるポリマー（タンパク質によりコーティング
されているものあるいはされていない合成ポリマー、あ
るいは外科的縫合糸の様な非−免疫原性の生物学的ポリ
マー）のチュブラ−メッシュマトリックス（tubular me
sh matrix)が外面における平滑筋の培養増殖を及び内面
における血管内皮細胞の培養増殖をサポートしうるよう
に使用される。内皮細胞がその内面において十分に増殖
し、単層形成され、平滑筋の多重層が外側を包み込んで
いたら、その管を患者へ移植する。
である。血管内皮細胞及び平滑筋細胞は患者より得ら
れ、それらを別々に培養増殖させる。内皮細胞をＶＥＧ
ＦII存在下で上記記載にそって培養する。平滑筋の培養
は当業界で良く知られている方法で行なった。生物学的
に適合しうるポリマー（タンパク質によりコーティング
されているものあるいはされていない合成ポリマー、あ
るいは外科的縫合糸の様な非−免疫原性の生物学的ポリ
マー）のチュブラ−メッシュマトリックス（tubular me
sh matrix)が外面における平滑筋の培養増殖を及び内面
における血管内皮細胞の培養増殖をサポートしうるよう
に使用される。内皮細胞がその内面において十分に増殖
し、単層形成され、平滑筋の多重層が外側を包み込んで
いたら、その管を患者へ移植する。
【００３１】新規ペプチドはまた、組織の修復あるいは
成長の誘導にも使用することができる。純粋なＶＥＧＦ
IIは血管成長および／または修復を誘導することによっ
て組織の成長を誘発及び促進するものである。本ペプチ
ドは組織修復に際して局所的にあるいは血管修復に際し
て血管内投与として使用することができる。新血管新生
及び表面の傷の治療を含めた適用に際しては、その処方
は約１０ngから約１mg／cm2 ／day の割合で直接適用す
ることができる。血管修復に際しては、ＶＥＧＦIIや約
１μｇから約１００μｇ／kg体重／day の割合で静脈内
投与する。内部血管成長に際しては、新血管新生されう
る領域に徐放性ポリメリック物質を移植するか、徐放性
ポンプで流入するかあるいは繰り返し注射するかの方法
により直接的に投与される。いずれの場合においても放
出されうる割合は約１００ngから約１００μｇ／day ／
cm3 である。
成長の誘導にも使用することができる。純粋なＶＥＧＦ
IIは血管成長および／または修復を誘導することによっ
て組織の成長を誘発及び促進するものである。本ペプチ
ドは組織修復に際して局所的にあるいは血管修復に際し
て血管内投与として使用することができる。新血管新生
及び表面の傷の治療を含めた適用に際しては、その処方
は約１０ngから約１mg／cm2 ／day の割合で直接適用す
ることができる。血管修復に際しては、ＶＥＧＦIIや約
１μｇから約１００μｇ／kg体重／day の割合で静脈内
投与する。内部血管成長に際しては、新血管新生されう
る領域に徐放性ポリメリック物質を移植するか、徐放性
ポンプで流入するかあるいは繰り返し注射するかの方法
により直接的に投与される。いずれの場合においても放
出されうる割合は約１００ngから約１００μｇ／day ／
cm3 である。
【００３２】非局所的適用に際しては、ＶＥＧＦは薬学
的に許容しうる担体あるいは希釈液、例えば、リン酸緩
衝液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル
液、および、標準的な製薬的実施に対応する医薬組成物
中、組み合わせて投与されうるものである。局所的適用
に際しては、本発明の活性化合物を有効に投与する為に
種々の薬学的処方がとられる。その様な処方には、以下
のものが列挙されるが、それらに限定されるものではな
い。液性ワセリンあるいはポリエチレングリコール軟膏
の様な軟膏；キサンゴムの様なゴムを含むペースト；ア
ルコール性あるいは水性の溶液；水酸化アルミニウムあ
るいはアルギン酸ナトリウムゲルの様なゲル；ヒトある
いは動物のアルブミン；ヒトあるいは動物のコラーゲ
ン；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロー
ス及びアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えば
メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースなどのセ
ルロース；プルロニック（Pluronic（商標））で具体化
されるプルロニック（Pluronic（商標））ポリオールの
様なポリオキサマー；テトロニック１５０８の様なテト
ロニクス；及びアルギン酸ナトリウムの様なアルギン酸
塩などがある。
的に許容しうる担体あるいは希釈液、例えば、リン酸緩
衝液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル
液、および、標準的な製薬的実施に対応する医薬組成物
中、組み合わせて投与されうるものである。局所的適用
に際しては、本発明の活性化合物を有効に投与する為に
種々の薬学的処方がとられる。その様な処方には、以下
のものが列挙されるが、それらに限定されるものではな
い。液性ワセリンあるいはポリエチレングリコール軟膏
の様な軟膏；キサンゴムの様なゴムを含むペースト；ア
ルコール性あるいは水性の溶液；水酸化アルミニウムあ
るいはアルギン酸ナトリウムゲルの様なゲル；ヒトある
いは動物のアルブミン；ヒトあるいは動物のコラーゲ
ン；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロー
ス及びアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えば
メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースなどのセ
ルロース；プルロニック（Pluronic（商標））で具体化
されるプルロニック（Pluronic（商標））ポリオールの
様なポリオキサマー；テトロニック１５０８の様なテト
ロニクス；及びアルギン酸ナトリウムの様なアルギン酸
塩などがある。
【００３３】以下の実施例は本発明を説明するものであ
りそれによって限定されるものではない。
りそれによって限定されるものではない。
【００３４】実施例１ ＧＳ−９Ｌ細胞で条件づけた培地の調製 ＧＳ−９Ｌ細胞を、１７５cm2 組織培養フラスコ内のDu
lbecco修飾 Eagle培地／１０％新生ウシ血清（ＤＭＥＭ
／ＮＣＳ）中に全面成長させた。全面成長してから、培
地をフラスコからデカントして、カルシウム及びマグネ
シウム遊離のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でフラス
コを洗浄して、トリプシン／ＥＤＴＡの溶液で１回処理
して細胞をとり出した。細胞（１×１０8 個）は、遠心
分離によりペレットにして、１５００mlのＤＭＥＭ／５
％ＮＣＳに再懸濁して、１０レベル（表面積６０００cm
2 ）のセル・ファクトリー（ＮＵＮＣ）に広げた。５％
ＣＯ2 雰囲気中に３７℃で７２時間インキュべーション
した後に、培地をデカントして、セル・ファクトリーを
ＰＢＳで３回洗浄した。この細胞に、２５ｍＭヘペス、
５μｇ／mlインスリン、１０μｇ／mlトランスフェリン
及び１．０mg／mlウシ血清アルブミンを含んだ１５００
mlのハムＦ−１２／ＤＭＥＭの１：２混合液を与えた。
この培地を２４時間後に新たなＦ−１２／ＤＭＥＭと交
換して、以後４８時間ごとに回収した。この条件づけし
た培地を、Whatman ＃１ペーパーで濾過して細胞砕片を
とりのぞいて、−２０℃で凍結保存した。
lbecco修飾 Eagle培地／１０％新生ウシ血清（ＤＭＥＭ
／ＮＣＳ）中に全面成長させた。全面成長してから、培
地をフラスコからデカントして、カルシウム及びマグネ
シウム遊離のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でフラス
コを洗浄して、トリプシン／ＥＤＴＡの溶液で１回処理
して細胞をとり出した。細胞（１×１０8 個）は、遠心
分離によりペレットにして、１５００mlのＤＭＥＭ／５
％ＮＣＳに再懸濁して、１０レベル（表面積６０００cm
2 ）のセル・ファクトリー（ＮＵＮＣ）に広げた。５％
ＣＯ2 雰囲気中に３７℃で７２時間インキュべーション
した後に、培地をデカントして、セル・ファクトリーを
ＰＢＳで３回洗浄した。この細胞に、２５ｍＭヘペス、
５μｇ／mlインスリン、１０μｇ／mlトランスフェリン
及び１．０mg／mlウシ血清アルブミンを含んだ１５００
mlのハムＦ−１２／ＤＭＥＭの１：２混合液を与えた。
この培地を２４時間後に新たなＦ−１２／ＤＭＥＭと交
換して、以後４８時間ごとに回収した。この条件づけし
た培地を、Whatman ＃１ペーパーで濾過して細胞砕片を
とりのぞいて、−２０℃で凍結保存した。
【００３５】実施例２ カルボキシメチル−Sephadexクロマトグラフィー 実施例１のＧＳ−９Ｌで条件づけた培地を解凍して、１
ＭＨＣｌでｐＨ６．０とした。ＰＢＳで前もって平衡化
して１ＮＨＣｌでｐＨ６．０に調整した２グラムのＣＭ
SephadexＣ−５０陽イオン交換樹脂（Pharmacia)を、２
０リットルの条件づけた培地に加えた。混合物を４℃で
２４時間、低速で攪拌した。その後、樹脂を放置沈殿さ
せて、培地を吸い出してとりのぞいた。残った樹脂のス
ラリーを、直径３．０cmのカラムにつめて放置して、残
りの培地をすべて排出した。０．１５ＭＮａＣｌを含ん
だｐＨ６．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムで、結合し
ていないタンパク質をカラムから洗浄してとりのぞい
た。つづいて、０．６ＭＮａＣｌを含んだｐＨ６．０の
０．０５Ｍリン酸ナトリウムで洗浄して、カラムから、
血管内皮成長因子活性物を溶出した。実施例３ コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）レクチン・アフィニティ
ークロマトグラフィー 約５mlのＣｏｎＡアガロース（Vector Laboratories)を
つめた、直径０．９cmのカラムを、１ｍＭＣａ++、１ｍ
ＭＭｎ++及び０．６ＭＮａＣｌを含んだｐＨ６．０の
０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで平衡させた。実施例２のＣ
ＭSephadexＣ−５０カラムからとった活性溶出物をＣｏ
ｎＡアガロースにのせて、結合していないタンパク質を
平衡化バッファーでカラムから洗浄した。その後、１ｍ
ＭＣａ++、１ｍＭＭｎ++及び０．１ＭＮａＣｌを含んだ
ｐＨ６．０のカラム体積の３倍量の０．０５Ｍ酢酸ナト
リウムでカラムを洗浄した。つづいて、０．３２Ｍα−
メチルマンノシド及び０．２８Ｍα−メチルグルコシド
をおぎなったこのバッファーを加えて、カラムから結合
したタンパク質を溶出した。
ＭＨＣｌでｐＨ６．０とした。ＰＢＳで前もって平衡化
して１ＮＨＣｌでｐＨ６．０に調整した２グラムのＣＭ
SephadexＣ−５０陽イオン交換樹脂（Pharmacia)を、２
０リットルの条件づけた培地に加えた。混合物を４℃で
２４時間、低速で攪拌した。その後、樹脂を放置沈殿さ
せて、培地を吸い出してとりのぞいた。残った樹脂のス
ラリーを、直径３．０cmのカラムにつめて放置して、残
りの培地をすべて排出した。０．１５ＭＮａＣｌを含ん
だｐＨ６．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムで、結合し
ていないタンパク質をカラムから洗浄してとりのぞい
た。つづいて、０．６ＭＮａＣｌを含んだｐＨ６．０の
０．０５Ｍリン酸ナトリウムで洗浄して、カラムから、
血管内皮成長因子活性物を溶出した。実施例３ コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）レクチン・アフィニティ
ークロマトグラフィー 約５mlのＣｏｎＡアガロース（Vector Laboratories)を
つめた、直径０．９cmのカラムを、１ｍＭＣａ++、１ｍ
ＭＭｎ++及び０．６ＭＮａＣｌを含んだｐＨ６．０の
０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで平衡させた。実施例２のＣ
ＭSephadexＣ−５０カラムからとった活性溶出物をＣｏ
ｎＡアガロースにのせて、結合していないタンパク質を
平衡化バッファーでカラムから洗浄した。その後、１ｍ
ＭＣａ++、１ｍＭＭｎ++及び０．１ＭＮａＣｌを含んだ
ｐＨ６．０のカラム体積の３倍量の０．０５Ｍ酢酸ナト
リウムでカラムを洗浄した。つづいて、０．３２Ｍα−
メチルマンノシド及び０．２８Ｍα−メチルグルコシド
をおぎなったこのバッファーを加えて、カラムから結合
したタンパク質を溶出した。
【００３６】実施例４ ポリアスパラギン酸ＷＣＸ ＨＰＬＣ 陽イオン交換ク
ロマトグラフィー 実施例３のＣｏｎＡカラムからとった活性溶出物を、ｐ
Ｈ６．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムバッファーで前
もって平衡化した２５cm×４．６mmのポリ（アスパラギ
ン酸）ＷＣＸ陽イオン交換ＨＰＬＣカラム（Nest Grou
p）にかけた。このカラムを、０．７５mlの分画を回収
しながら、流速０．７５ml／分で、６０分にわたって、
０から０．７５Ｍまでの直線勾配のＮａＣｌバッファー
溶液を用いて溶出した。第１図の水平な実線で示すよう
に、およそ２１．７ないし２８．５mlの間に溶出した分
画中に存在するＶＥＧＦII活性物を与えた。
ロマトグラフィー 実施例３のＣｏｎＡカラムからとった活性溶出物を、ｐ
Ｈ６．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムバッファーで前
もって平衡化した２５cm×４．６mmのポリ（アスパラギ
ン酸）ＷＣＸ陽イオン交換ＨＰＬＣカラム（Nest Grou
p）にかけた。このカラムを、０．７５mlの分画を回収
しながら、流速０．７５ml／分で、６０分にわたって、
０から０．７５Ｍまでの直線勾配のＮａＣｌバッファー
溶液を用いて溶出した。第１図の水平な実線で示すよう
に、およそ２１．７ないし２８．５mlの間に溶出した分
画中に存在するＶＥＧＦII活性物を与えた。
【００３７】実施例５ 金属キレート・クロマトグラフィー 実施例４のポリ（アスパラギン酸）ＷＣＸカラムから溶
出した、ＶＥＧＦIIを含む活性分画を保存してｐＨを
７．０に調整してから、過剰の塩化銅をつめて２ＭＮａ
Ｃｌ及び０．５ｍＭイミダゾールを含んだｐＨ７．０の
０．０５Ｍリン酸ナトリウム（Ａバッファー）で平衡化
した１×１０cmのカラムのPharmacia Chelating Sephar
ose６Ｂにのせた。０〜２０％の勾配のＢで１０分にわ
たって、２０〜３５％の勾配のＢで４５分にわたって、
そして３５〜１００％のＢで５分にわたって、流速０．
３ml／分でＶＥＧＦIIをカラムから溶出した（ただし、
Ｂバッファーは、２ＭＮａＣｌと１００ｍＭイミダゾー
ルを含んだｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムで
ある）。第２図の水平な実線で示すように、勾配をつけ
た溶出液の体積が１２．６から２２．８mlの間に溶出し
たＶＥＧＦII活性物質を含む活性分画を保存した。
出した、ＶＥＧＦIIを含む活性分画を保存してｐＨを
７．０に調整してから、過剰の塩化銅をつめて２ＭＮａ
Ｃｌ及び０．５ｍＭイミダゾールを含んだｐＨ７．０の
０．０５Ｍリン酸ナトリウム（Ａバッファー）で平衡化
した１×１０cmのカラムのPharmacia Chelating Sephar
ose６Ｂにのせた。０〜２０％の勾配のＢで１０分にわ
たって、２０〜３５％の勾配のＢで４５分にわたって、
そして３５〜１００％のＢで５分にわたって、流速０．
３ml／分でＶＥＧＦIIをカラムから溶出した（ただし、
Ｂバッファーは、２ＭＮａＣｌと１００ｍＭイミダゾー
ルを含んだｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウムで
ある）。第２図の水平な実線で示すように、勾配をつけ
た溶出液の体積が１２．６から２２．８mlの間に溶出し
たＶＥＧＦII活性物質を含む活性分画を保存した。
【００３８】実施例６ 逆相クロマトグラフィー 実施例５の金属キレートカラムからとって保存したＶＥ
ＧＦII活性物質を含む分画を、溶媒Ａ（０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ））で平衡化した４．６mm×５cmの
Vydac Ｃ4 逆相ＨＰＬＣカラム（５μｍ粒子サイズ）に
かけた。このカラムを、０〜３０％の勾配の溶媒Ｂで１
５分にわたって、３０％のＢでさらに１５分間、その後
３０〜４５％の勾配のＢで２２．５分にわたって、最後
に４５〜１００％の勾配のＢで５．５分にわたって溶出
した（ただし溶媒Ｂは、６７％のアセトニトリルを含む
Ａである）。流速は０．７５ml／分に保った。第３図の
水平な実線が示すように、勾配をつけた溶出液の体積が
およそ３２．２から３７．５mlの間に溶出した活性ＶＥ
ＧＦIIの分画を保存した。
ＧＦII活性物質を含む分画を、溶媒Ａ（０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ））で平衡化した４．６mm×５cmの
Vydac Ｃ4 逆相ＨＰＬＣカラム（５μｍ粒子サイズ）に
かけた。このカラムを、０〜３０％の勾配の溶媒Ｂで１
５分にわたって、３０％のＢでさらに１５分間、その後
３０〜４５％の勾配のＢで２２．５分にわたって、最後
に４５〜１００％の勾配のＢで５．５分にわたって溶出
した（ただし溶媒Ｂは、６７％のアセトニトリルを含む
Ａである）。流速は０．７５ml／分に保った。第３図の
水平な実線が示すように、勾配をつけた溶出液の体積が
およそ３２．２から３７．５mlの間に溶出した活性ＶＥ
ＧＦIIの分画を保存した。
【００３９】実施例７ 分裂促進アッセイ ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥ）を、ゼラチンでコーテ
ィングした４８個の穴を有する組織を培養プレート上
に、加熱不活性化した胎児ウシ血清（ＦＣＳ）２０％を
含んだ５００μｌのメジウム１９９中に、５０００個／
穴の密度で植えた。アッセイされる試料は、このうえつ
け時に加えた。この組織培養プレートを３７℃で１２時
間インキュベートして、アッセイ培地１mlあたり２マイ
クロキューリーのトリチウム化チミジン（ＮＥＮ、２０
Ｃｉ／mmol）を加えた（１．０μＣｉ／穴）。プレート
をさらに６０時間インキュベートして、アッセイ培地を
とりのぞいて、２０ｍＭヘペスを含むｐＨ７．５のHank
s 平衡塩類溶液及び０．５mg／mlのウシ血清アルブミン
でプレートを洗浄した。水１００ml中に２グラムの炭酸
ナトリウムと４００mgの水酸化ナトリウムを含んだ溶液
２００μｌで、細胞を溶解して、標識したＤＮＡを可溶
化した。とりこまれた放射能は、液体シンチレーション
計数法で決定した。ＨＵＶＥ細胞に半最大値の分裂反応
をひきおこすＶＥＧＦIIの濃度は、およそ２±１ｎｇ／
mlであった。正のコントロールの酸性線維芽細胞成長因
子に対する反応を高めるためにこのアッセイで必要とす
る１０〜１００μｇ／ml程度のグリコサミノグリカン
は、ＶＥＧＦIIによるこれらの細胞の分裂促進作用を高
めない。
ィングした４８個の穴を有する組織を培養プレート上
に、加熱不活性化した胎児ウシ血清（ＦＣＳ）２０％を
含んだ５００μｌのメジウム１９９中に、５０００個／
穴の密度で植えた。アッセイされる試料は、このうえつ
け時に加えた。この組織培養プレートを３７℃で１２時
間インキュベートして、アッセイ培地１mlあたり２マイ
クロキューリーのトリチウム化チミジン（ＮＥＮ、２０
Ｃｉ／mmol）を加えた（１．０μＣｉ／穴）。プレート
をさらに６０時間インキュベートして、アッセイ培地を
とりのぞいて、２０ｍＭヘペスを含むｐＨ７．５のHank
s 平衡塩類溶液及び０．５mg／mlのウシ血清アルブミン
でプレートを洗浄した。水１００ml中に２グラムの炭酸
ナトリウムと４００mgの水酸化ナトリウムを含んだ溶液
２００μｌで、細胞を溶解して、標識したＤＮＡを可溶
化した。とりこまれた放射能は、液体シンチレーション
計数法で決定した。ＨＵＶＥ細胞に半最大値の分裂反応
をひきおこすＶＥＧＦIIの濃度は、およそ２±１ｎｇ／
mlであった。正のコントロールの酸性線維芽細胞成長因
子に対する反応を高めるためにこのアッセイで必要とす
る１０〜１００μｇ／ml程度のグリコサミノグリカン
は、ＶＥＧＦIIによるこれらの細胞の分裂促進作用を高
めない。
【００４０】実施例８ ＶＥＧＦIIの純度及びタンパク質構造の特徴づけ 非還元条件下におけるタンパク質の純度を、Laemmli
（Nature２２７：第６８０〜６８５頁（１９７０年））
の方法に従がって、１２．５％の架橋ゲル中のＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより決定した。銀染色したゲルは、約５８Ｋ
Ｄａの明瞭な質量を有する単一バンドを含んだ。ＶＥＧ
ＦIIは、１５％の架橋ゲル中で、還元条件下のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ中で、約２３ＫＤａの明瞭な質量を有する広い
銀染色のバンドとして移動した。ＶＥＧＦIIは、前述の
精製プロトコールの最終段階の逆相Ｃ4 ＨＰＬＣクロマ
トグラフィーにおいて相同のタンパク質を溶出するのに
用いた水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１アセトニトリ
ル混合液中に４℃で保存した。精製したタンパク質のア
リコート（１〜２μｇ）を、酸で洗浄した１０×７５mm
ガラス管内で減圧蒸発乾固して、そしてアルゴン雰囲気
下で、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のトリスバッファー１００
μｌ、及び０．１％ＥＤＴＡと２０ｍＭジチオスレイト
ールを含んだ６Ｍ塩化グアニジニウム（Calbiochem, Ul
trol grade）中で、５０℃、２時間還元した。還元した
タンパク質を、つづいて、０．１％ＥＤＴＡ、６Ｍ塩化
グアニジニウム、９．２μＭの標識化していないヨード
酢酸及び５０μＣｉのヨード〔２−14Ｃ〕酢酸（１７．
９ｍＣｉ／mmol、Amersham）を含んだ０．７ＭでｐＨ
７．８のトリス１００μｌを加えることによって、２０
℃で１時間、カルボキシメチル化した。カルボキシメチ
ル化が完了した後に、混合物をただちに、０．１％ＴＦ
Ａで前もって平衡化しておいた４．６mm×５．０cm Vyd
acＣ4 カラムにかけた。還元したカルボキシメチル化し
たタンパク質を、０．１％ＴＦＡ中の０〜６７％（ｖ／
ｖ）の直線的勾配のアセトニトリルを用いて、４５分に
わたって流速０．７５ml／min で溶出して精製し、この
溶出液中に４℃で保存した。この還元してカルボキシメ
チル化したタンパク質は、およそ２５mlと２８mlに２つ
のピークを示して溶出したが、これらは２１０ｎｍの吸
収をモニターすることにより決定したのとほぼ同じ領域
であった。
（Nature２２７：第６８０〜６８５頁（１９７０年））
の方法に従がって、１２．５％の架橋ゲル中のＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより決定した。銀染色したゲルは、約５８Ｋ
Ｄａの明瞭な質量を有する単一バンドを含んだ。ＶＥＧ
ＦIIは、１５％の架橋ゲル中で、還元条件下のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ中で、約２３ＫＤａの明瞭な質量を有する広い
銀染色のバンドとして移動した。ＶＥＧＦIIは、前述の
精製プロトコールの最終段階の逆相Ｃ4 ＨＰＬＣクロマ
トグラフィーにおいて相同のタンパク質を溶出するのに
用いた水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１アセトニトリ
ル混合液中に４℃で保存した。精製したタンパク質のア
リコート（１〜２μｇ）を、酸で洗浄した１０×７５mm
ガラス管内で減圧蒸発乾固して、そしてアルゴン雰囲気
下で、０．１Ｍ、ｐＨ９．５のトリスバッファー１００
μｌ、及び０．１％ＥＤＴＡと２０ｍＭジチオスレイト
ールを含んだ６Ｍ塩化グアニジニウム（Calbiochem, Ul
trol grade）中で、５０℃、２時間還元した。還元した
タンパク質を、つづいて、０．１％ＥＤＴＡ、６Ｍ塩化
グアニジニウム、９．２μＭの標識化していないヨード
酢酸及び５０μＣｉのヨード〔２−14Ｃ〕酢酸（１７．
９ｍＣｉ／mmol、Amersham）を含んだ０．７ＭでｐＨ
７．８のトリス１００μｌを加えることによって、２０
℃で１時間、カルボキシメチル化した。カルボキシメチ
ル化が完了した後に、混合物をただちに、０．１％ＴＦ
Ａで前もって平衡化しておいた４．６mm×５．０cm Vyd
acＣ4 カラムにかけた。還元したカルボキシメチル化し
たタンパク質を、０．１％ＴＦＡ中の０〜６７％（ｖ／
ｖ）の直線的勾配のアセトニトリルを用いて、４５分に
わたって流速０．７５ml／min で溶出して精製し、この
溶出液中に４℃で保存した。この還元してカルボキシメ
チル化したタンパク質は、およそ２５mlと２８mlに２つ
のピークを示して溶出したが、これらは２１０ｎｍの吸
収をモニターすることにより決定したのとほぼ同じ領域
であった。
【００４１】還元とカルボキシメチル化の後に分離した
２つのタンパク質サブユニットの各サンプルを、ポリブ
レンでコーティングしたグラスファイバーフィルターに
かけて、ＡＢＩ気相クロマトグラフィーを用いたEdman
分解法に、ＡＢＩ １２０Ａオン ライン フェニルチ
オヒダントイン アナライザーを併用して、製造元の指
示に従がって、それらのＮ末端の配列を決定した。ほぼ
２８mlにおいて溶出する吸収ピーク（Ａサブユニット）
は、ＶＥＧＦＩと同定されるアミノ末端配列ＡＰＴＴＥ
ＧＥＱＫＡＨＥＶＶを示した。ほぼ２５mlにおいて溶出
する吸収ピーク（Ｂサブユニット）は、Ｎ末端配列ＡＬ
ＳＡＧＮ（Ｘ）ＳＴＥＭＥＶＶＰＦＮＥＶ及びほぼ同量
の、最初の３つの残基のない末端の欠けた形の同じ配列
を示した。この欠けた残基はクローニングした配列のＡ
ｓｎに対応する。この欠けたＡｓｎが一般的なＡｓｎ−
Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒＮ−グリコシレーション配列に現わ
れることから、これはグリコシル化されると思われる。
Ａと、Ｂ鎖ペプチドの合計が、ほぼ同量回収されたとい
うことは、ＶＥＧＦII中でこの２つのペプチドが結合し
てＡＢといヘテロダイマーを形成しているという考え方
を支持する。還元してカルボキシメチル化したＡ及びＢ
サブユニット（各６５０ｎｇ）を、それぞれ酸で洗浄し
た１０×７５mmガラス管内で真空蒸発して乾燥した。リ
ジン残基のカルボキシル末端側を切断する酵素であるＬ
ｙｓＣプロテアーゼ（５０ｎｇ、Boehringer Mannheim
）を、各ガラス管の０．１％ＥＤＴＡを含んだｐＨ
８．５の２５ｍＭトリス１００μｌに加えた。基質タン
パク質サブユニットを別々に３７℃で８時間分解して、
得られたポリペプチドを、０．１％ＴＦＡで平衡化した
４．６mm×２５cm VydacＣ18カラムの逆相ＨＰＬＣクロ
マトグラフィーで分離した。ポリペプチドは、２時間に
わたって０．１％ＴＦＡ中の０〜６７％の直線的勾配の
アセトニトリルにより、流速０．７５ml／min で２０℃
で溶出して分画にわけた。個々のピークをそのつど回収
して、その溶出液中に４℃で保存した。その後、分離し
たペプチドのアミノ酸配列を、ＡＢＩ気相シークエネイ
ターを用いたEdman 分解法に、ＡＢＩ １２０Ａ オン
ライン フェニルチオヒダントインアナライザー（Ap
plied Biosystems Int. ）を併用して決定した。ペプチ
ド配列を以下の図９〜１２及び図１３〜１５に示す。Ｌ
ｙｓＣフラグメントＬ２０のアミノ酸配列（図９〜１
２）は、ヘテロダイマー中のＶＥＧＦIIＡサブユニット
の形態が１６４個のアミノ酸形態であることを示してい
る。ＬｙｓＣフラグメントＬ２６のアミノ酸配列（図１
３〜１５）は、ヘテロダイマー中のＶＥＧＦIIＢサブユ
ニットの形態が１３５個のアミノ酸であることを示して
いる。
２つのタンパク質サブユニットの各サンプルを、ポリブ
レンでコーティングしたグラスファイバーフィルターに
かけて、ＡＢＩ気相クロマトグラフィーを用いたEdman
分解法に、ＡＢＩ １２０Ａオン ライン フェニルチ
オヒダントイン アナライザーを併用して、製造元の指
示に従がって、それらのＮ末端の配列を決定した。ほぼ
２８mlにおいて溶出する吸収ピーク（Ａサブユニット）
は、ＶＥＧＦＩと同定されるアミノ末端配列ＡＰＴＴＥ
ＧＥＱＫＡＨＥＶＶを示した。ほぼ２５mlにおいて溶出
する吸収ピーク（Ｂサブユニット）は、Ｎ末端配列ＡＬ
ＳＡＧＮ（Ｘ）ＳＴＥＭＥＶＶＰＦＮＥＶ及びほぼ同量
の、最初の３つの残基のない末端の欠けた形の同じ配列
を示した。この欠けた残基はクローニングした配列のＡ
ｓｎに対応する。この欠けたＡｓｎが一般的なＡｓｎ−
Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒＮ−グリコシレーション配列に現わ
れることから、これはグリコシル化されると思われる。
Ａと、Ｂ鎖ペプチドの合計が、ほぼ同量回収されたとい
うことは、ＶＥＧＦII中でこの２つのペプチドが結合し
てＡＢといヘテロダイマーを形成しているという考え方
を支持する。還元してカルボキシメチル化したＡ及びＢ
サブユニット（各６５０ｎｇ）を、それぞれ酸で洗浄し
た１０×７５mmガラス管内で真空蒸発して乾燥した。リ
ジン残基のカルボキシル末端側を切断する酵素であるＬ
ｙｓＣプロテアーゼ（５０ｎｇ、Boehringer Mannheim
）を、各ガラス管の０．１％ＥＤＴＡを含んだｐＨ
８．５の２５ｍＭトリス１００μｌに加えた。基質タン
パク質サブユニットを別々に３７℃で８時間分解して、
得られたポリペプチドを、０．１％ＴＦＡで平衡化した
４．６mm×２５cm VydacＣ18カラムの逆相ＨＰＬＣクロ
マトグラフィーで分離した。ポリペプチドは、２時間に
わたって０．１％ＴＦＡ中の０〜６７％の直線的勾配の
アセトニトリルにより、流速０．７５ml／min で２０℃
で溶出して分画にわけた。個々のピークをそのつど回収
して、その溶出液中に４℃で保存した。その後、分離し
たペプチドのアミノ酸配列を、ＡＢＩ気相シークエネイ
ターを用いたEdman 分解法に、ＡＢＩ １２０Ａ オン
ライン フェニルチオヒダントインアナライザー（Ap
plied Biosystems Int. ）を併用して決定した。ペプチ
ド配列を以下の図９〜１２及び図１３〜１５に示す。Ｌ
ｙｓＣフラグメントＬ２０のアミノ酸配列（図９〜１
２）は、ヘテロダイマー中のＶＥＧＦIIＡサブユニット
の形態が１６４個のアミノ酸形態であることを示してい
る。ＬｙｓＣフラグメントＬ２６のアミノ酸配列（図１
３〜１５）は、ヘテロダイマー中のＶＥＧＦIIＢサブユ
ニットの形態が１３５個のアミノ酸であることを示して
いる。
【００４２】実施例９ ＶＥＧＦIIＡモノマーのクローニングと配列決定 Ｐ４２３８のＰＣＲ増幅、クローニング及び配列決定 ＬｙｓＣフラグメントＬ４２とトリプチックフラグメン
トＴ３８間のＶＥＧＦＡサブユニットのペプチド配列を
エンコードするｃＤＮＡを増幅するために、２つの変性
したオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌ
クレオチドは以下のものである： L42.2 5′TTTGTCGACTT[TC]ATGGA[TC]GT[N]TA[TC]CA3′ T383′B ５ ′CAGAGAATTCGTCGACA[AG]TC[N]GT[AG]TT[TC]TT [AG]CA3 ′ ただしＮ＝ACGT InvitrogenのFirst Track ＲＮＡ分離キットを用いて、
与えられたプロトコールに従がって、ポリＡ+ ＲＮＡを
ＧＳ−９Ｌ細胞から分離した。第１鎖ｃＤＮＡの合成は
以下のように行なった：１μｇのＧＳ−９ＬＲＮＡを、
体積１０μｌで７０℃で５分間インキュベートした後室
温まで冷却して１μｇのアダプタープライマーＴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′へとアニールした。
この反応物に以下を加えた： ３．０μｌ水 ２．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣｌ
2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１００ｍＭＤＤＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ１５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ１５ユニット逆転写酵素 そしてこの反応物を４２℃で１時間インキュベートした
後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
７．５で１mlまで希釈した。
トＴ３８間のＶＥＧＦＡサブユニットのペプチド配列を
エンコードするｃＤＮＡを増幅するために、２つの変性
したオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌ
クレオチドは以下のものである： L42.2 5′TTTGTCGACTT[TC]ATGGA[TC]GT[N]TA[TC]CA3′ T383′B ５ ′CAGAGAATTCGTCGACA[AG]TC[N]GT[AG]TT[TC]TT [AG]CA3 ′ ただしＮ＝ACGT InvitrogenのFirst Track ＲＮＡ分離キットを用いて、
与えられたプロトコールに従がって、ポリＡ+ ＲＮＡを
ＧＳ−９Ｌ細胞から分離した。第１鎖ｃＤＮＡの合成は
以下のように行なった：１μｇのＧＳ−９ＬＲＮＡを、
体積１０μｌで７０℃で５分間インキュベートした後室
温まで冷却して１μｇのアダプタープライマーＴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′へとアニールした。
この反応物に以下を加えた： ３．０μｌ水 ２．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣｌ
2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１００ｍＭＤＤＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ１５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ１５ユニット逆転写酵素 そしてこの反応物を４２℃で１時間インキュベートした
後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
７．５で１mlまで希釈した。
【００４３】ＰＣＲ反応： 一次反応（１００μｌ） １０μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Ampキット
によるバッファー １６μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ２μｌ第１鎖ＧＳ９ＬｃＤＮＡ ２μｌ５０ピコモルＬ４２．２ ２μｌ５０ピコモルＴ３８３′Ｂ ０．５μｌ２．５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６７．５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５０℃，２′３０′′；７２
℃，２′を４０サイクル。 製造規模の二次反応： １００μｌ１０Ｘバッファー １６０μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ １０μｌ一次ＰＣＲ反応物 ２０μｌ、５００ｐピコモル、Ｌ４２．２ ２０μｌ５００ピコモルＴ３８３′Ｂ ５μｌ２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５５℃，２′；７２℃，２′
で３０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮し
て、１％アガロースゲル上で精製し、制限エンドヌクレ
アーゼＳａｌＩで分解した。その後、ＳａｌＩフラグメ
ントを、ＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合し
た。この結合物を用いて、Ｅ．coliＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換体から分
離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定した。
によるバッファー １６μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ２μｌ第１鎖ＧＳ９ＬｃＤＮＡ ２μｌ５０ピコモルＬ４２．２ ２μｌ５０ピコモルＴ３８３′Ｂ ０．５μｌ２．５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６７．５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５０℃，２′３０′′；７２
℃，２′を４０サイクル。 製造規模の二次反応： １００μｌ１０Ｘバッファー １６０μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ １０μｌ一次ＰＣＲ反応物 ２０μｌ、５００ｐピコモル、Ｌ４２．２ ２０μｌ５００ピコモルＴ３８３′Ｂ ５μｌ２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５５℃，２′；７２℃，２′
で３０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮し
て、１％アガロースゲル上で精製し、制限エンドヌクレ
アーゼＳａｌＩで分解した。その後、ＳａｌＩフラグメ
ントを、ＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合し
た。この結合物を用いて、Ｅ．coliＸＬ−１ブルーを形
質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質転換体から分
離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定した。
【００４４】ｐＷ−３のＰＣＲ増幅、クローニング及び
配列決定 ｐ４２３８クローンから得られた配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち：オ
リゴ３０７ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡ
ＧＣ３′及びオリゴ２８９ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡ
ＧＣ３′．である。これらのプライマーを、オリゴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とと
もに用いて、Frohman ら（ＰＮＡＳ８５：８９９８−９
００２（１９８８））の記述する３′ＲＡＣＥ法を用い
て、ＶＥＧＦ Ａサブユニットのカルボキシル末端をエ
ンコードするｃＤＮＡを増幅した。 ＰＣＲ反応： 一次反応１００μｌ １０μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Geue Ampキット
によるバッファー １８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ０．３５μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ ２μｌ５０ｐMoles オリゴ２８９ ０．５μｌ２．５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６７．１５μｌ水 反応条件９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′；
１０サイクル後５０ピコモルＡ１７、を加えて、その後
サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，４０′
を行なってさらに４０サイクル９４℃，１′；５８℃，
２′；７２℃，２′を行なう。 製造規模の二次反応 ６０μｌ１０Ｘバッファー １０８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ ２４μｌ一次ＰＣＲ反応物 １２μｌ３００ピコモルオリゴ３０７ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ３８１μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′
を３０サイクル。 ＰＣＲの生成物は１％アガロースゲル上で精製して、制
限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その後Ｓａ
ｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。結合体を用いて、Ｅ．coli、ＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖ターミネイション法
により配列決定した。
配列決定 ｐ４２３８クローンから得られた配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち：オ
リゴ３０７ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡ
ＧＣ３′及びオリゴ２８９ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡ
ＧＣ３′．である。これらのプライマーを、オリゴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とと
もに用いて、Frohman ら（ＰＮＡＳ８５：８９９８−９
００２（１９８８））の記述する３′ＲＡＣＥ法を用い
て、ＶＥＧＦ Ａサブユニットのカルボキシル末端をエ
ンコードするｃＤＮＡを増幅した。 ＰＣＲ反応： 一次反応１００μｌ １０μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Geue Ampキット
によるバッファー １８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ０．３５μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ ２μｌ５０ｐMoles オリゴ２８９ ０．５μｌ２．５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６７．１５μｌ水 反応条件９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′；
１０サイクル後５０ピコモルＡ１７、を加えて、その後
サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，４０′
を行なってさらに４０サイクル９４℃，１′；５８℃，
２′；７２℃，２′を行なう。 製造規模の二次反応 ６０μｌ１０Ｘバッファー １０８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ ２４μｌ一次ＰＣＲ反応物 １２μｌ３００ピコモルオリゴ３０７ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ３８１μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′
を３０サイクル。 ＰＣＲの生成物は１％アガロースゲル上で精製して、制
限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その後Ｓａ
ｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。結合体を用いて、Ｅ．coli、ＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖ターミネイション法
により配列決定した。
【００４５】ｐ５−１５のＰＣＲ増幅、クローニング及
び配列決定 ｐ４２３８クローンの配列にもとづいて、２つの特定の
ＰＣＲプライマーを合成した。すなわち；オリゴ１１３ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴ
ＴＧＡＡＧ３′及びオリゴ７４ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ
ＴＧＴＣＣ３′．である。これらのプライマーをオリゴ
Ａ１７ ５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′
とともに用いて、前出Frohman らの記述する５′ＲＡＣ
Ｅ法により、ＶＥＧＦ Ａサブユニットのアミノ末端を
エンコードするｃＤＮＡを増幅した。ＧＳ−９ＬＲＮＡ
からＶＥＧＦ ＡサブユニットｃＤＮＡを特定してプラ
イムするためにオリゴ１５１を合成した。オリゴ１５１
は５′ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣ３′であ
る。InvitrogenのFast TrackＲＮＡ分離キットを用い
て、与えられたプロトコールに従がって、ＧＳ−９Ｌ細
胞からＲＮＡを分離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は以下の
ように行なった。１μｇのＧＳ−９ＬＲＮＡを、体積６
μｌで７０℃で５分間インキュベートした後に室温まで
冷却して、１μｇのオリゴ１５１へとアニールした。こ
の反応物に以下を加えた。すなわち： １．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１０ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ ０．６μｌ２５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ２０ユニット希釈逆転写酵素 反応物を４２℃で１時間インキュベートした。Centrico
n １００スピンカラムにより過剰なオリゴ１５１をとり
のぞき、ｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼを加えて、
ｃＤＮＡの５′末端をつないだ。この末端をつないだｃ
ＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５で、最終体積１５０μｌに希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ ５μｌのオリゴ１５１で開始し、および末端をつないだ
第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １μｌ２５ピコモルオリゴ１１３ １μｌ２５ピコモルオリゴＡ１７ １μｌ１０ピコモルオリゴＴＡ１７ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラ
ーゼ ２８．７５μｌ水 反応条件；１サイクル９４℃１′；５０℃２′；７２℃
４０′ その後４０サイクル９４℃１′；５０℃１′３０′′；
７２℃２′ 製造規模の二次反応 ６０μｌ１０Ｘバッファー ９６μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ６μｌの一次ＰＣＲ反応物 １２μｌ３００ピコモルオリゴ７４ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４１１μｌ水 反応条件９４℃，１′；５５℃，２′；７２℃，２′３
０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon １００スピンカラムで濃縮
し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その
後ＳａｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚ
ｆ（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ
−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形
質転換体を分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。この塩基配列を図９〜１２に示す。
び配列決定 ｐ４２３８クローンの配列にもとづいて、２つの特定の
ＰＣＲプライマーを合成した。すなわち；オリゴ１１３ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴ
ＴＧＡＡＧ３′及びオリゴ７４ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡ
ＴＧＴＣＣ３′．である。これらのプライマーをオリゴ
Ａ１７ ５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′
とともに用いて、前出Frohman らの記述する５′ＲＡＣ
Ｅ法により、ＶＥＧＦ Ａサブユニットのアミノ末端を
エンコードするｃＤＮＡを増幅した。ＧＳ−９ＬＲＮＡ
からＶＥＧＦ ＡサブユニットｃＤＮＡを特定してプラ
イムするためにオリゴ１５１を合成した。オリゴ１５１
は５′ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣ３′であ
る。InvitrogenのFast TrackＲＮＡ分離キットを用い
て、与えられたプロトコールに従がって、ＧＳ−９Ｌ細
胞からＲＮＡを分離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は以下の
ように行なった。１μｇのＧＳ−９ＬＲＮＡを、体積６
μｌで７０℃で５分間インキュベートした後に室温まで
冷却して、１μｇのオリゴ１５１へとアニールした。こ
の反応物に以下を加えた。すなわち： １．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１０ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ ０．６μｌ２５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ２０ユニット希釈逆転写酵素 反応物を４２℃で１時間インキュベートした。Centrico
n １００スピンカラムにより過剰なオリゴ１５１をとり
のぞき、ｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼを加えて、
ｃＤＮＡの５′末端をつないだ。この末端をつないだｃ
ＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５で、最終体積１５０μｌに希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ ５μｌのオリゴ１５１で開始し、および末端をつないだ
第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １μｌ２５ピコモルオリゴ１１３ １μｌ２５ピコモルオリゴＡ１７ １μｌ１０ピコモルオリゴＴＡ１７ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラ
ーゼ ２８．７５μｌ水 反応条件；１サイクル９４℃１′；５０℃２′；７２℃
４０′ その後４０サイクル９４℃１′；５０℃１′３０′′；
７２℃２′ 製造規模の二次反応 ６０μｌ１０Ｘバッファー ９６μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ ６μｌの一次ＰＣＲ反応物 １２μｌ３００ピコモルオリゴ７４ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４１１μｌ水 反応条件９４℃，１′；５５℃，２′；７２℃，２′３
０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon １００スピンカラムで濃縮
し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その
後ＳａｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚ
ｆ（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ
−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形
質転換体を分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。この塩基配列を図９〜１２に示す。
【００４６】別形態のＶＥＧＦＡｃＤＮＡのクローニン
グと配列決定 ｐ５−１５及びｐＷ−３から得た配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち；オ
リゴ５′Ｃ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣ
ＴＧＣ３′及びオリゴ１８１ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＡＧ
ＴＴＣ３′である。これらのプライマーをともに用い
て、もう１つの形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットをエン
コードする多重ｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応： ５０μｌ１０Ｘバッファー ８０μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １０μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １０μｌ３００ピコモルオリゴ５′Ｃ １０μｌ３００ピコモルオリゴ１８１ ２．５μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ３３７．５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，３′
を４０サイクル。 ＰＣＲの生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
Centricon ３０スピンカラムで濃縮し、エタノールで沈
殿させて、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解し、
ＳａｌＩカットｐＧＥＭＺ３ｆ（＋）に結合した。この
結合体を用いて、Ｅ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換し
た。プラスミドＤＮＡを白色形質転換体より分離して、
ジデオキシ鎖終止法により配列決定した。３セットのク
ローンを同定した。クローン＃１２は、第４図に示すも
のと同じ１６４個のアミノ酸の分泌形態のＶＥＧＦ Ａ
サブユニットをエンコードした。この１６４個のアミノ
酸の形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットは、Ａｌａ27から
Ａｒｇ190 までのひとつながりのアミノ酸配列である。
クローン＃１４はＡｓｎ140 コドンの２番目の塩基とＡ
ｒｇ184 コドンの３番目の塩基の間に１３５個の塩基対
の欠失を持つ。したがって、このクローンは、Ａｓｎ
140 がＬｙｓ14 0 に変わった１２０個のアミノ酸の分泌
形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットをエンコードする。１
２０個のアミノ酸の形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットは
Ａｌａ27からＡｓｎ140 に至るが、ここがＬｙｓ140 に
なってＣｙｓ185 まで開始しない。又、この形態はＡｒ
ｇ190 で終わる。クローン＃１６はＡｓｎ140 コドンの
２番目と３番目の塩基の間に７２個の塩基の挿入を有す
る。したがって、このクローンは、Ａｓｎ140 がＬｙｓ
14 0 に変わっている１８８個のアミノ酸の分泌形態のＶ
ＥＧＦ Ａサブユニットをエンコードする。この挿入部
のヌクレオチド配列及びそれからわかるアミノ酸配列は
以下のようである：
グと配列決定 ｐ５−１５及びｐＷ−３から得た配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち；オ
リゴ５′Ｃ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣ
ＴＧＣ３′及びオリゴ１８１ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＡＧ
ＴＴＣ３′である。これらのプライマーをともに用い
て、もう１つの形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットをエン
コードする多重ｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応： ５０μｌ１０Ｘバッファー ８０μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １０μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １０μｌ３００ピコモルオリゴ５′Ｃ １０μｌ３００ピコモルオリゴ１８１ ２．５μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ３３７．５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，３′
を４０サイクル。 ＰＣＲの生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
Centricon ３０スピンカラムで濃縮し、エタノールで沈
殿させて、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解し、
ＳａｌＩカットｐＧＥＭＺ３ｆ（＋）に結合した。この
結合体を用いて、Ｅ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換し
た。プラスミドＤＮＡを白色形質転換体より分離して、
ジデオキシ鎖終止法により配列決定した。３セットのク
ローンを同定した。クローン＃１２は、第４図に示すも
のと同じ１６４個のアミノ酸の分泌形態のＶＥＧＦ Ａ
サブユニットをエンコードした。この１６４個のアミノ
酸の形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットは、Ａｌａ27から
Ａｒｇ190 までのひとつながりのアミノ酸配列である。
クローン＃１４はＡｓｎ140 コドンの２番目の塩基とＡ
ｒｇ184 コドンの３番目の塩基の間に１３５個の塩基対
の欠失を持つ。したがって、このクローンは、Ａｓｎ
140 がＬｙｓ14 0 に変わった１２０個のアミノ酸の分泌
形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットをエンコードする。１
２０個のアミノ酸の形態のＶＥＧＦ Ａサブユニットは
Ａｌａ27からＡｓｎ140 に至るが、ここがＬｙｓ140 に
なってＣｙｓ185 まで開始しない。又、この形態はＡｒ
ｇ190 で終わる。クローン＃１６はＡｓｎ140 コドンの
２番目と３番目の塩基の間に７２個の塩基の挿入を有す
る。したがって、このクローンは、Ａｓｎ140 がＬｙｓ
14 0 に変わっている１８８個のアミノ酸の分泌形態のＶ
ＥＧＦ Ａサブユニットをエンコードする。この挿入部
のヌクレオチド配列及びそれからわかるアミノ酸配列は
以下のようである：
【化３】
【００４７】実施例１０ ＶＥＧＦIIＢサブユニットのクローニングと配列決定 ｐＹＧのＰＣＲ増幅、クローニング及び配列決定 ＬｙｓＣフラグメントＬ５０上のＶＥＧＦIIＢのペプチ
ド配列をエンコードするｃＤＮＡを増幅するために、２
つの変性したオリゴヌクレオチドを合成した。これらの
オリゴヌクレオチドは、ＹＩ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＡ〔ＴＣ〕ＡＴ〔ＴＣＡ〕ＧＣ〔Ｎ〕ＧＡ〔ＴＣ〕
ＧＡ〔ＡＧ〕Ｃ３′ ＧＣ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣ〔ＡＧ〕ＴＣ〔Ａ
Ｇ〕ＴＴ〔ＡＧ〕ＣＡ〔ＡＧ〕ＣＡ〔Ｎ〕ＣＣ３′であ
る。 ただしＮ＝ＡＣＧＴ InvitrogenのFast TrackＲＮＡ分離キットを用いて、与
えられたプロトコールに従がって、ＲＮＡをＧＳ−９Ｌ
細胞から分離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、以下のよう
に行なった。すなわち： １μｇのＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡを、体積１０μｌで
７０℃で５分間インキュベートした後に、室温まで冷却
して、１μｇのアダプタープライマーＴＡ１７、５′Ｇ
ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′へとアニールした。この反応物
に以下を加えた： ３．０μｌ水 ２．５μｌ１０Ｘバッファ（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ１５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ１５ユニット逆転写酵素 この反応物を４２℃で１時間インキュベートした後、１
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
で１mlまで希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １μｌ５０pMolesオリゴＹＩ １μｌ５０pMolesオリゴＧＣ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラ
ーゼ ３３．７５μｌ水 反応条件、９４℃，１′；５０℃，２′；７２℃，２′
を４０サイクル。 製造規模の反応： ６０μｌ１０Ｘバッファ ９６μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １２μｌ第１鎖６５９ＬｃＤＮＡ １２μｌ５００ピコモルオリゴＹＩ １２μｌ５００ピコモルオリゴＧＣ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４０５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５０℃，２′：７２℃，２′
で４０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮し
て、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その
後ＳａｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚ
ｆ（＋）に結合した。こ結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖終止法により配列決
定した。
ド配列をエンコードするｃＤＮＡを増幅するために、２
つの変性したオリゴヌクレオチドを合成した。これらの
オリゴヌクレオチドは、ＹＩ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＡ〔ＴＣ〕ＡＴ〔ＴＣＡ〕ＧＣ〔Ｎ〕ＧＡ〔ＴＣ〕
ＧＡ〔ＡＧ〕Ｃ３′ ＧＣ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣ〔ＡＧ〕ＴＣ〔Ａ
Ｇ〕ＴＴ〔ＡＧ〕ＣＡ〔ＡＧ〕ＣＡ〔Ｎ〕ＣＣ３′であ
る。 ただしＮ＝ＡＣＧＴ InvitrogenのFast TrackＲＮＡ分離キットを用いて、与
えられたプロトコールに従がって、ＲＮＡをＧＳ−９Ｌ
細胞から分離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、以下のよう
に行なった。すなわち： １μｇのＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡを、体積１０μｌで
７０℃で５分間インキュベートした後に、室温まで冷却
して、１μｇのアダプタープライマーＴＡ１７、５′Ｇ
ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３′へとアニールした。この反応物
に以下を加えた： ３．０μｌ水 ２．５μｌ１０Ｘバッファ（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ１５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム １．５μｌ１５ユニット逆転写酵素 この反応物を４２℃で１時間インキュベートした後、１
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５
で１mlまで希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ １μｌ５０pMolesオリゴＹＩ １μｌ５０pMolesオリゴＧＣ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラ
ーゼ ３３．７５μｌ水 反応条件、９４℃，１′；５０℃，２′；７２℃，２′
を４０サイクル。 製造規模の反応： ６０μｌ１０Ｘバッファ ９６μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ １２μｌ第１鎖６５９ＬｃＤＮＡ １２μｌ５００ピコモルオリゴＹＩ １２μｌ５００ピコモルオリゴＧＣ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４０５μｌ水 反応条件：９４℃，１′；５０℃，２′：７２℃，２′
で４０サイクル。 ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮し
て、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで分解した。その
後ＳａｌＩフラグメントをＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚ
ｆ（＋）に結合した。こ結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖終止法により配列決
定した。
【００４８】ｐ３Ｖ２のＰＣＲ増幅、クローニング及び
配列決定 ｐＹＧクローンより得た配列にもとづいて特定のＰＣＲ
プライマーを合成した。すなわちオリゴＨＰ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧ
ＴＧＴＣ３′である。このプライマーをオリゴＡ１７、
５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とともに
用いて、Frohman ら（ＰＮＡＳ８５：８９９８−９００
２（１９８８）の記述する３′ＲＡＣＥ法を用いて、Ｖ
ＥＧＦIIＢサブユニットのカルボキシル末端をエンコー
ドするｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応 ６０μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Ampキット
によるバッファー １２μｌ第１鎖６５９ＬｃＤＮＡ ９６μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ １２μｌ３００ピコモルオリゴＨＰ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４０５μｌ水 反応条件１サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２
℃，２′； その後４０サイクル９４℃，１′，５８℃，２′及び７
２℃、 ２′ ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮
し、エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレアーゼ
ＳａｌＩで分解した。その後ＳａｌＩフラグメントをＳ
ａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この結
合体を用いてＥ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。
プラスミドＤＮＡを白色形質転換体から分離して、ジデ
オキシ鎖終止法で配列決定した。
配列決定 ｐＹＧクローンより得た配列にもとづいて特定のＰＣＲ
プライマーを合成した。すなわちオリゴＨＰ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧ
ＴＧＴＣ３′である。このプライマーをオリゴＡ１７、
５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とともに
用いて、Frohman ら（ＰＮＡＳ８５：８９９８−９００
２（１９８８）の記述する３′ＲＡＣＥ法を用いて、Ｖ
ＥＧＦIIＢサブユニットのカルボキシル末端をエンコー
ドするｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応 ６０μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Ampキット
によるバッファー １２μｌ第１鎖６５９ＬｃＤＮＡ ９６μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ １２μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ １２μｌ３００ピコモルオリゴＨＰ ３μｌ１５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ４０５μｌ水 反応条件１サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２
℃，２′； その後４０サイクル９４℃，１′，５８℃，２′及び７
２℃、 ２′ ＰＣＲの生成物をCentricon ３０スピンカラムで濃縮
し、エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレアーゼ
ＳａｌＩで分解した。その後ＳａｌＩフラグメントをＳ
ａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この結
合体を用いてＥ．coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。
プラスミドＤＮＡを白色形質転換体から分離して、ジデ
オキシ鎖終止法で配列決定した。
【００４９】ｐ５Ｖ２のＰＣＲ増幅、クローニング及び
配列決定 ｐＹＧクローンの配列にもとづいて、２つの特定なＰＣ
Ｒプライマーを合成した。すなわちオリゴＶＬ′ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡ
ＡＧＧ３′及びオリゴＶＳ′ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧ
ＡＣＡＣ３′である。これらのプライマーをオリゴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とと
もに用いて、前出のFrohman らの記述する５′ＲＡＣＥ
法を用いて、ＶＥＧＦIIＢサブユニットのアミノ末端を
エンコードするｃＤＮＡを増幅した。オリゴ１５１を、
ＧＳ−９ＬＲＮＡからｃＤＮＡをプライムするために合
成した。オリゴ１５１は５′ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣ
ＡＧＣＡＧＣ３′である。InvitrogenのFast TrackＲＮ
Ａ分離キットを用いて、与えられたプロトコールに従が
ってポリＡ+ ＲＮＡをＧＳ−９Ｌ細胞から分離した。第
一鎖ｃＤＮＡ合成は以下のように行なった：１μｇのＧ
Ｓ９ＬＲＮＡを、６μｌの体積で７０℃５分間インキュ
ベートした後、室温まで冷却して、オリゴ１５１へとア
ニールした。この反応物に以下を加えた： １．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１０ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ２５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ２０ユニット希釈逆転写酵素 反応物は４２℃で１時間インキュベートした。過剰なオ
リゴ１５１をCentricon １００スピンカラムでとりのぞ
いて、ｄＡＴＰとターミナルトランスフェラーゼを加え
て、ｃＤＮＡの５′末端をつないだ。この末端をつない
だｃＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．５で最終濃度１５０μｌに希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ ５μｌのオリゴ１５１でプライムされテイルされた第１
鎖ＧＳ９ＬｃＤＮＡ １μｌ２５ピコモルオリゴＶＬ′ １μｌ２５ピコモルオリゴＡ１７ １μｌ１０ピコモルオリゴＴＡ１７ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitq ＤＮＡポリメラ
ーゼ ２８．７５μｌ水 反応条件；１サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７
２℃，４０′ その後４０サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２
℃，２′ 製造規模の二次反応： １００μｌ１０Ｘバッファー １６０μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ １０μｌ一次ＰＣＲ反応物 ２０μｌ５００ピコモルオリゴＶＳ′ ２０μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ５μｌ２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ水 反応条件９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′３
０サイクル。ＰＣＲの生成物はフェノール／クロロホル
ムで抽出し、Centricon ３０スピンカラムで濃縮して、
エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｌＩで分解した。ＳａｌＩフラグメントを４％Ｎｕシー
ブアガロースゲル上で精製した後、ＳａｌＩカットｐＧ
ＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．
coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡ
を白色形質転換体から分離して、ジデオキシ鎖終止法に
よって配列決定した。
配列決定 ｐＹＧクローンの配列にもとづいて、２つの特定なＰＣ
Ｒプライマーを合成した。すなわちオリゴＶＬ′ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡ
ＡＧＧ３′及びオリゴＶＳ′ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＧＡＧ
ＡＣＡＣ３′である。これらのプライマーをオリゴＡ１
７、５′ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ３′とと
もに用いて、前出のFrohman らの記述する５′ＲＡＣＥ
法を用いて、ＶＥＧＦIIＢサブユニットのアミノ末端を
エンコードするｃＤＮＡを増幅した。オリゴ１５１を、
ＧＳ−９ＬＲＮＡからｃＤＮＡをプライムするために合
成した。オリゴ１５１は５′ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣ
ＡＧＣＡＧＣ３′である。InvitrogenのFast TrackＲＮ
Ａ分離キットを用いて、与えられたプロトコールに従が
ってポリＡ+ ＲＮＡをＧＳ−９Ｌ細胞から分離した。第
一鎖ｃＤＮＡ合成は以下のように行なった：１μｇのＧ
Ｓ９ＬＲＮＡを、６μｌの体積で７０℃５分間インキュ
ベートした後、室温まで冷却して、オリゴ１５１へとア
ニールした。この反応物に以下を加えた： １．５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３，７５０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 ，５ｍＭスペルミジン） ２．５μｌ１０ｍＭＤＴＴ ２．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，
ｄＴＴＰ ０．６μｌ２５ユニットＲＮａｓｉｎ ２．５μｌ４０ｍＭピロリン酸ナトリウム ９．５μｌ２０ユニット希釈逆転写酵素 反応物は４２℃で１時間インキュベートした。過剰なオ
リゴ１５１をCentricon １００スピンカラムでとりのぞ
いて、ｄＡＴＰとターミナルトランスフェラーゼを加え
て、ｃＤＮＡの５′末端をつないだ。この末端をつない
だｃＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．５で最終濃度１５０μｌに希釈した。 ＰＣＲ反応： 一次反応（５０μｌ） ５μｌ×１０のPerkin Elmer Cetus Gene Amp キットに
よるバッファー ８μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ ５μｌのオリゴ１５１でプライムされテイルされた第１
鎖ＧＳ９ＬｃＤＮＡ １μｌ２５ピコモルオリゴＶＬ′ １μｌ２５ピコモルオリゴＡ１７ １μｌ１０ピコモルオリゴＴＡ１７ ０．２５μｌ１．２５ユニットAmplitq ＤＮＡポリメラ
ーゼ ２８．７５μｌ水 反応条件；１サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７
２℃，４０′ その後４０サイクル９４℃，１′；５８℃，２′；７２
℃，２′ 製造規模の二次反応： １００μｌ１０Ｘバッファー １６０μｌ、１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ １０μｌ一次ＰＣＲ反応物 ２０μｌ５００ピコモルオリゴＶＳ′ ２０μｌ３００ピコモルオリゴＡ１７ ５μｌ２５ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ６８５μｌ水 反応条件９４℃，１′；５８℃，２′；７２℃，２′３
０サイクル。ＰＣＲの生成物はフェノール／クロロホル
ムで抽出し、Centricon ３０スピンカラムで濃縮して、
エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレアーゼＳａ
ｌＩで分解した。ＳａｌＩフラグメントを４％Ｎｕシー
ブアガロースゲル上で精製した後、ＳａｌＩカットｐＧ
ＥＭ３Ｚｆ（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．
coliＸＬ−１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡ
を白色形質転換体から分離して、ジデオキシ鎖終止法に
よって配列決定した。
【００５０】ｐＣＶ２とｐＣＶ２．１のＰＣＲ増幅、ク
ローニング及び配列決定 ｐ３Ｖ２とｐ５Ｖ２のクローンの配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち：オ
リゴ５′ＣＶ２．１ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ〔Ｎ〕〔Ｎ〕ＧＣＡＧＧＴＣＣ
ＴＡＧＣＴＧ３′及びオリゴ３′ＣＶ２ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ〔Ｎ〕〔Ｎ〕ＣＴＡＡＴＡＡＡ
ＴＡＧＡＧＧＧ３′である。これらのプライマーをとも
に用いて、ＶＥＧＦ Ｂサブユニットをエンコードする
ｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応： ４０μｌ１０Ｘバッファ ６４μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ ８μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ ８μｌ２００ピコモル５′ＣＶ２．１ ８μｌ２００ピコモル３′ＣＶ２ ２μｌ１０ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ２７０μｌ水 反応条件：９４℃，１′，５８℃，２′，７２℃，
２′；４０サイクル。ＰＣＲの生成物はフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、Centricon ３０スピンカラムで濃
縮して、エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレア
ーゼＳａｌＩで分解し、ＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体から分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。２セットのクローンを同定したが、一方は１３５個
のアミノ酸配列をエンコードし、他方は１１５個のアミ
ノ酸配列をエンコードした（それぞれ図１３〜１５、図
１６〜１７参照）。
ローニング及び配列決定 ｐ３Ｖ２とｐ５Ｖ２のクローンの配列にもとづいて、２
つの特定のＰＣＲプライマーを合成した。すなわち：オ
リゴ５′ＣＶ２．１ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ〔Ｎ〕〔Ｎ〕ＧＣＡＧＧＴＣＣ
ＴＡＧＣＴＧ３′及びオリゴ３′ＣＶ２ ５′ＴＴＴＧＴＣＧＡＣ〔Ｎ〕〔Ｎ〕ＣＴＡＡＴＡＡＡ
ＴＡＧＡＧＧＧ３′である。これらのプライマーをとも
に用いて、ＶＥＧＦ Ｂサブユニットをエンコードする
ｃＤＮＡを増幅した。 製造規模のＰＣＲ反応： ４０μｌ１０Ｘバッファ ６４μｌ１．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ ８μｌ第１鎖ＧＳ−９ＬｃＤＮＡ ８μｌ２００ピコモル５′ＣＶ２．１ ８μｌ２００ピコモル３′ＣＶ２ ２μｌ１０ユニットAmplitaqＤＮＡポリメラーゼ ２７０μｌ水 反応条件：９４℃，１′，５８℃，２′，７２℃，
２′；４０サイクル。ＰＣＲの生成物はフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、Centricon ３０スピンカラムで濃
縮して、エタノールで沈殿させて、制限エンドヌクレア
ーゼＳａｌＩで分解し、ＳａｌＩカットｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体から分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。２セットのクローンを同定したが、一方は１３５個
のアミノ酸配列をエンコードし、他方は１１５個のアミ
ノ酸配列をエンコードした（それぞれ図１３〜１５、図
１６〜１７参照）。
【００５１】ＶＥＧＦＢサブユニットのｃＤＮＡクロー
ニング ＶＥＧＦＢのシグナルペプチドのアミノ末端に対するＤ
ＮＡ及びタンパク質配列を、ＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡ
から構成したｃＤＮＡライブラリから分離したｃＤＮＡ
クローンによって決定した。 第一鎖合成：１５．６μｌ（５μｇ）のＧＳ−９Ｌポリ
Ａ+ ＲＮＡ及び２．５μｌ（２．５μｇ）のオリゴｄＴ
−ＸｂａＩプライマーを、７０℃で５分間加熱してゆっ
くりと室温に冷却してアニールした。これに以下を加え
た： ５．５μｌ１０Ｘバッファ（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３（４２℃），７５０ｍＭＫＣｌ，１００
ｍＭＭｇＣｌ2 ，５ｍＭスペルミジン ５．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ５．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ １．４μｌ（５５ユニット）ＲＮａｓｉｎ ５．５μｌ４０ｍＭＮａＰＰｉ １３．５μｌ５５ユニットＡＭＶ逆転写酵素 ４２℃で６０分間のインキュベーション。 第２鎖合成：以下のような反応混合物を集める ５０μｌ第１鎖反応物 ２５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．２，８５０ｍＭＫＣＬ，３０ｍＭＭｇＣｌ
2 １mg／mlＢＳＡ，１００ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ７．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ２５μｌ１ｍＭＮＡＤ ６．５μｌ（６５ユニット）Ｅ．coluＤＮＡポリメラー
ゼＩ ２．５μｌ（２．５ユニット）Ｅ．coluＤＮＡリガーゼ
Ｈ ２．５μｌ（２ユニット）Ｅ．coluリボヌクレアーゼ １３５μｌ水 １４℃で２時間、その後７０℃で１０分間インキュベー
トする。１μｌ（１０ユニット）のＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを加えて３７℃で１０分間インキュベートする。２
５μｌ０．２ＭＥＤＴＡを加えてフェノール／クロロホ
ルムで抽出した後、０．５体積の７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウムと３体積のエタノールを加えて沈殿させ、この沈殿
を回収して２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．
５、１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁する。
ニング ＶＥＧＦＢのシグナルペプチドのアミノ末端に対するＤ
ＮＡ及びタンパク質配列を、ＧＳ−９ＬポリＡ+ ＲＮＡ
から構成したｃＤＮＡライブラリから分離したｃＤＮＡ
クローンによって決定した。 第一鎖合成：１５．６μｌ（５μｇ）のＧＳ−９Ｌポリ
Ａ+ ＲＮＡ及び２．５μｌ（２．５μｇ）のオリゴｄＴ
−ＸｂａＩプライマーを、７０℃で５分間加熱してゆっ
くりと室温に冷却してアニールした。これに以下を加え
た： ５．５μｌ１０Ｘバッファ（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．３（４２℃），７５０ｍＭＫＣｌ，１００
ｍＭＭｇＣｌ2 ，５ｍＭスペルミジン ５．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ５．５μｌ１０ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ １．４μｌ（５５ユニット）ＲＮａｓｉｎ ５．５μｌ４０ｍＭＮａＰＰｉ １３．５μｌ５５ユニットＡＭＶ逆転写酵素 ４２℃で６０分間のインキュベーション。 第２鎖合成：以下のような反応混合物を集める ５０μｌ第１鎖反応物 ２５μｌ１０Ｘバッファー（５００ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．２，８５０ｍＭＫＣＬ，３０ｍＭＭｇＣｌ
2 １mg／mlＢＳＡ，１００ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ７．５μｌ１００ｍＭＤＴＴ ２５μｌ１ｍＭＮＡＤ ６．５μｌ（６５ユニット）Ｅ．coluＤＮＡポリメラー
ゼＩ ２．５μｌ（２．５ユニット）Ｅ．coluＤＮＡリガーゼ
Ｈ ２．５μｌ（２ユニット）Ｅ．coluリボヌクレアーゼ １３５μｌ水 １４℃で２時間、その後７０℃で１０分間インキュベー
トする。１μｌ（１０ユニット）のＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを加えて３７℃で１０分間インキュベートする。２
５μｌ０．２ＭＥＤＴＡを加えてフェノール／クロロホ
ルムで抽出した後、０．５体積の７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウムと３体積のエタノールを加えて沈殿させ、この沈殿
を回収して２０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．
５、１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁する。
【００５２】ｃＤＮＡライブラリの構成 前記ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩリンカーを加えてＥｃｏＲ
Ｉ及びＸｂａＩで分解した後ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ１分解
LambdaＧＥＭ−４（PromegaBiochemicols）と結合し
た。ｃＤＮＡライブラリは、約５０，０００の独立した
クローンから増幅した。 ラットＶＥＧＦ Ｂ ｃＤＮＡクローンの分離 前記ｃＤＮＡライブラリを、ｐＣＶ２をプローブとし
て、プラーク交雑によってスクリーニングした。交雑条
件は以下のようであった： ５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム，
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム ５０％ホルムアミド ５ＸDenhardt's溶液（１％フィコル１％ポリビニルピロ
リドン，１％ウシ血清アルブミン） ０．１５mg／mlサケ精子ＤＮＡ ４２℃一晩交雑。 フィルターを室温で５分間、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓで３回洗浄した後、５０℃で３０分間、１ＸＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。陽性のクローンを、オ
ートラジオグラフィーで同定した。ファージ＃２０２か
らのＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩで分解
し、１．１ｋｂバンドをＸｂａＩ分解ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。このｃＤＮＡ配列及びこれからわかるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列を図１３〜１５、図１６〜１７に示
す。１１５個のアミノ酸の形態の全ヌクレオチドとアミ
ノ酸配列を図１６〜１７に示す。分泌タンパク質はＡｌ
ａ24に始まってＡｒｇ138 に至る。１３５個のアミノ酸
の形態の全ヌクレオチドとアミノ酸配列を図１６〜１７
に示す。分泌タンパク質はＡｌａ24に始まってＬｅｎ
158 に至る。
Ｉ及びＸｂａＩで分解した後ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ１分解
LambdaＧＥＭ−４（PromegaBiochemicols）と結合し
た。ｃＤＮＡライブラリは、約５０，０００の独立した
クローンから増幅した。 ラットＶＥＧＦ Ｂ ｃＤＮＡクローンの分離 前記ｃＤＮＡライブラリを、ｐＣＶ２をプローブとし
て、プラーク交雑によってスクリーニングした。交雑条
件は以下のようであった： ５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム，
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム ５０％ホルムアミド ５ＸDenhardt's溶液（１％フィコル１％ポリビニルピロ
リドン，１％ウシ血清アルブミン） ０．１５mg／mlサケ精子ＤＮＡ ４２℃一晩交雑。 フィルターを室温で５分間、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓで３回洗浄した後、５０℃で３０分間、１ＸＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。陽性のクローンを、オ
ートラジオグラフィーで同定した。ファージ＃２０２か
らのＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩで分解
し、１．１ｋｂバンドをＸｂａＩ分解ｐＧＥＭ３Ｚｆ
（＋）に結合した。この結合体を用いてＥ．coliＸＬ−
１ブルーを形質転換した。プラスミドＤＮＡを白色形質
転換体より分離して、ジデオキシ鎖終止法で配列決定し
た。このｃＤＮＡ配列及びこれからわかるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列を図１３〜１５、図１６〜１７に示
す。１１５個のアミノ酸の形態の全ヌクレオチドとアミ
ノ酸配列を図１６〜１７に示す。分泌タンパク質はＡｌ
ａ24に始まってＡｒｇ138 に至る。１３５個のアミノ酸
の形態の全ヌクレオチドとアミノ酸配列を図１６〜１７
に示す。分泌タンパク質はＡｌａ24に始まってＬｅｎ
158 に至る。
【図１】ポリアスパラギン酸ＷＣＸ ＨＰＬＣカチオン
交換カラムから溶出するフラクションに存在するＶＥＧ
ＦIIの活性を示すグラフである。太線はプールされたフ
ラクションを示す。
交換カラムから溶出するフラクションに存在するＶＥＧ
ＦIIの活性を示すグラフである。太線はプールされたフ
ラクションを示す。
【図２】金属キレートカラムから溶出するフラクション
に存在するＶＥＧＦIIの活性を示すグラフである。
に存在するＶＥＧＦIIの活性を示すグラフである。
【図３】ＲＰ−ＨＰＬＣＣ4 カラムから溶出するフラク
ションに存在するＶＥＧＦIIの活性を示すグラフであ
る。
ションに存在するＶＥＧＦIIの活性を示すグラフであ
る。
【図４〜８】全長アミノ酸残基タンパク質翻訳産生物及
びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペプチ
ド切断生成物＋ＶＥＧＦ ＩＡサブユニットの配列をコ
ードしているｃＤＮＡを示す図である。
びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペプチ
ド切断生成物＋ＶＥＧＦ ＩＡサブユニットの配列をコ
ードしているｃＤＮＡを示す図である。
【図９〜１２】全長アミノ酸残基タンパク質翻訳産生物
及びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペプ
チド切断生成物＋ＶＥＧＦIIサブユニットの配列をコー
ドしているｃＤＮＡを示す図である。
及びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペプ
チド切断生成物＋ＶＥＧＦIIサブユニットの配列をコー
ドしているｃＤＮＡを示す図である。
【図１３〜１５】全長アミノ酸残基タンパク質翻訳産生
物及びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペ
プチド切断生成物＋ＶＥＧＦIIＢの１３５アミノ酸形の
配列をコードしているｃＤＮＡを示す図である。
物及びアミノ酸配列を決定するために使用されるポリペ
プチド切断生成物＋ＶＥＧＦIIＢの１３５アミノ酸形の
配列をコードしているｃＤＮＡを示す図である。
【図１６〜１７】全長アミノ酸残基タンパク質翻訳産生
物及びＶＥＧＦIIＢサブユニットの１１５アミノ酸形の
配列をコードしているｃＤＮＡを示す図である。
物及びＶＥＧＦIIＢサブユニットの１１５アミノ酸形の
配列をコードしているｃＤＮＡを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 グレゴリー エル． コン アメリカ合衆国，07065 ニュージャー シィ，ローウェイ，エセックス ストリ ート 1751 (72)発明者 ケネス エー． トマス，ジュニヤ アメリカ合衆国，07928 ニュージャー シィ，チャサム ボロー，ワシントン アヴェニュー 245
Claims (14)
- 【請求項１】 １３５アミノ酸形、 【化１】 及び１１５アミノ酸形、 【化２】 から成る群から選択されるＢサブユニットから成り、 １８８アミノ酸形、 【化３】 １６４アミノ酸形、 【化４】 及び１２０アミノ酸形 【化５】 から成る群から選択されるＡサブユニットを有するヘテ
ロダイマーの血管内皮細胞成長因子II。 - 【請求項２】 該成長因子を哺乳類細胞、細胞培地又は
組織から分離及び精製する請求項１記載の血管内皮成長
因子II。 - 【請求項３】 １３５アミノ酸形、 【化１】 及び１１５アミノ酸形、 【化２】 から成る群から選択されるＢサブユニットを有し、 １８８アミノ酸形、 【化３】 １６４アミノ酸形、 【化４】 及び１２０アミノ酸形 【化５】 から成る群から選択されるＡサブユニットを有する血管
内皮成長因子を有する血管内皮成長因子IIのアミノ酸配
列から成る蛋白質。 - 【請求項４】 哺乳類血管内皮細胞の分裂を誘起させ且
つ実質的に不純物を含まない少なくとも以下に示される
ヌクレオチド配列によりコ−ドされるアミノ酸配列を有
するＡサブユニット： 【化１５】 【化１６】 及び少なくとも以下に示されるヌクレオチド配列により
コ−ドされるアミノ酸配列を有するＢサブユニット： 【化１７】 を包含しているヘテロダイマ−の血管内皮成長因子。 - 【請求項５】 哺乳類血管内皮細胞の分裂を誘起させ且
つ実質的に不純物を含まない少なくとも以下に示される
ヌクレオチド配列によりコ−ドされるアミノ酸配列を有
するＡサブユニット： 【化１８】 【化１９】 及び少なくとも以下に示されるヌクレオチド配列により
コ−ドされるアミノ酸配列を有するＢサブユニット： 【化２０】 を包含しているヘテロダイマ−の血管内皮成長因子。 - 【請求項６】 ａ．血管内皮成長因子IIを含有する調整
増殖培地を濾過によって単離し ｂ．ｐＨ６．０のカルボキシメチルセファデックスＣ−
５０カチオン交換樹脂に吸着させ、次いで０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、０．１５ＭNaClで洗浄
し、０．６ＭNaClを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で溶離するカチオン交換クロマトグラフ
を行い ｃ．ｐＨ６．０のコンカナバリンＡアガロース樹脂に吸
着させ、次いで１ｍＭCaCl2 、１ｍＭMnCl2 、０．１Ｍ
NaClを含有する０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０
及び０．３２Ｍα−メチルマンノシド及び０．２８Ｍα
−メチルグルコシドで溶離するレクチンアフィニティー
クロマトグラフを行い ｄ．０．０５Ｍリン酸ナトリウムで平衡にしたポリアス
パラギン酸ＷＣＸ、ｐＨ６．０に吸着させ、次いで約０
〜０．７５ＭNaCl直線勾配で溶離するカチオン交換高性
能液体クロマトグラフを行い ｅ．過剰のＣｕ++を充填したファーマシアキレートティ
ングセファロース６Ｂに吸着させ、次いで約０．０５Ｍ
リン酸ナトリウム、約ｐＨ７．０、約２ＭNaClを含有す
る緩衝液中０．５ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾール勾配で
溶離して金属キレートクロマトグラフを行い ｆ．０．１％トリフルオロ酢酸で平衡にしたＣ4 カラム
に吸着させ次いで０．１％トリフルオロ酢酸中０〜６７
％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル勾配で溶離する逆相高性
能液体クロマトグラフを行い ｇ．実質的に純粋な血管内皮成長因子IIを収集する工程
から成る、 １３５アミノ酸形、 【化１】 及び１１５アミノ酸形、 【化２】 から成る群から選択されるＢサブユニットから成り、 １８８アミノ酸形、 【化３】 １６４アミノ酸形、 【化４】 及び１２０アミノ酸形 【化５】 から成る群から選択されるＡサブユニットを有するヘテ
ロダイマーの血管内皮細胞成長因子IIの単離方法。 - 【請求項７】 血管内皮成長因子IIをＧＳ−９Ｌ細胞培
養液から単離するための請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 医薬担体及び請求項１又は３乃至５記載
のいずれかの精製血管内皮成長因子IIの組織修復有効量
を含む組織修復医薬組成物。 - 【請求項９】 血管内皮成長因子IIの１３５アミノ酸Ｂ
サブユニット 【化１】 をコードする精製単離ＤＮＡ。 - 【請求項１０】 １６４アミノ酸形、 【化４】 をコードするＡサブユニットＤＮＡから成り、該Ａサブ
ユニットＤＮＡが１３５アミノ酸形、 【化１】 をコードするＢサブユニットＤＮＡに遺伝子が機能する
ように結合したヘテロダイマーの血管内皮成長因子IIＤ
ＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項１０記載のＤＮＡ配列を含むベ
クター。 - 【請求項１２】 血管内皮成長因子IIをコードするＤＮ
Ａ配列を含む請求項１１記載のベクターによって形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項１３】 請求項１２記載の形質転換宿主細胞を
血管内皮成長因子IIの発現に適した条件下で培養し、血
管内皮成長因子IIを回収することを特徴とする血管内皮
成長因子IIの調製方法。 - 【請求項１４】 請求項１３記載の方法によって製造さ
れた血管内皮成長因子II。
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