NO176921B - Genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av et tPA-lignende protein, samt vertscelle som er i stand til å uttrykke et slikt protein - Google Patents

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Oppfinnelsesområde.

Oppfinnelsen vedrører en genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser som er analoge med human vevsplasminogenaktivator (tPA). De analoge forbindelsene er tPA-lignende molekyler hvor de naturlig forekommende doméneområder enten er omordnet, fjernet, tilført eller en kombinasjon derav. De analoge forbindelsene er produktet av ekspresjonen av rekombinant deoxyribonuclein-syre (DNA) som også er beskrevet her. I tillegg beskrives det replikasjons- og ekspresjonsplasmider som inneholder de tPA-kodende DNA-sekvenser nevnt ovenfor. Oppfinnelsen vedrører også vertsceller som er i stand til å uttrykke tPA-analogene etter å være blitt transformert med et passende plasmid.

Bakgrunn.

TPA har terapeutisk verdi når det gjelder å behandle blodpropper ved å hjelpe til å løse opp proppene etter hvert som de dannes. Trombolyse er fremgangsmåten for oppløsning av fibrinpropp. For det formål dannes serinproteaseplas-minet fra sitt inaktive zymogen, plasminogen. Aktivering av plasminogen oppnås gjennom proteolyttisk spalting ved hjelp av en klasse serinproteaser kalt plasminogenaktivatorer. Disse aktivatorene er til stede i de fleste kroppsvæsker og setter i gang aktiveringen av plasminogen til plasmin.

Dette medfører en kaskade hvorved en liten mengde plasminogenaktivator kan starte opp aktiveringen av en stor mengde plasminogen. In vivo aktiverer plasminogenaktivatoren plasminogen til plasmin som deretter virker til å bryte ned fibrinproppen. Den plasminogenaktivator som er fysiologisk viktig for propp-lysis, er TPA.

TPA er en serinprotease med en molekylvekt på omtrent 66.000 dalton som dannes av de vaskulære endotelceller.

Den glycosyleres, og dens eneste kjente proteinsubstrat er plasminogen. TPA har fem doméner: fibronectin-finger-doménet (F), vekstfaktordoménet (G), "kringle 1"-domenet (Kl), "kringle 2"-doménet (K2) og domenet til det aktive sete (A). Ett eller flere av disse domenene er ansvarlige for den

unike fibrinbindende virkning av TPA.

I tillegg til sin fibrinaffinitet forøkes TPA-aktivering av plasminogen i nærvær av fibrin. Disse egen-skapene gjør TPA til et verdifullt terapeutisk middel ettersom andre propp-oppløsende legemidler, slik som urokinase eller streptokinase, ikke har noen spesifisitet for fibrinproppen.

Ved å manipulere doménene er det mulig å forbedre

det naturlig forekommende enzyms affinitet for fibrinet, og å øke dets in vivo halveringstid. Nærmere bestemt vil for-dobling av "kringle 2"- eller finger-doménet øke fibrin-affiniteten. Eliminering av vekstfaktordoménet vil øke in vivo halveringstid og plasserer fingerområde-doménet ved siden av "kringle"-områdene 1 eller 2 for å øke fibrin-af f initet.

Informasjonsbeskrivelse.

Human TPA er blitt renset, og dens fysikalske karak-teristika er blitt undersøkt. Rijken et al. "Purification and Characterization of the Plasminogen Activator Secreted by Human Melanoma Cells in Culture", J. Biol. Chem., vol. 256, nr. 13, s. 7035-41 (10. juli 1981). Eksperimentelle mengder av human TPA lar seg oppnå fra dyrkningsmediet til humane melanomceller. Kluft, C. et al., "Large-scale production of extrinsic (tissue-type) plasminogen activator from human melanoma cells" i Advances in Biotechnological Processes,

red. Mizrahi, A. og Wezel, A.L. 2:97-110 (1983). Den bio-logiske aktivitet av human TPA er blitt undersøkt, og den er blitt påvist å ha terapeutisk verdi i dyremodeller og hos mennesker gjennom sin evne til å oppløse livstruende blodpropper. Korninger et al., "Thrombolysis with Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator in Dogs with Femoral Vein Thromobis", J. Clin. Invest., vol. 69, s. 573-580 (mars, 1982); Weimar et al., "Specific Lysis of an Ilio-femoral Thrombus by Administration of Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator", The Lancet, s. 1018-20

(7. november 1981) og Van De Werf, F. et al., "Coronary Thrombolysis with Tissue-type Plasminogen Activator in Patients with Evolving Myocardial Infarction", J. og N. Eng.

Med.,.310:609-613 (1984). Halveringstiden til TPA er be-regnet til 2-3 minutter, noe som gjør den upassende, om ikke uanvendelig, å bruke som et terapeutisk middel. Coilen, D. et al., "Clot-selective Coronary Thrombolysis with Tissue-type Plasminogen Activator", Science, 220:1181-1183 (1983).

Enzymkinetikken til TPA er blitt undersøkt. Rijken et al., "Fibrinolytic Properties of One-Chain and Two-Chain Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator", J. Biol. Chem., vol. 257:2920-2925 (1982). Human TPA's bindings- og fibrolyseaffinitet til humane blodpropper i forhold til blodproppene hos andre dyr, er kjent. Korninger et al., "Studies on the Specific Fibrinolytic Effect of Human Extrinsic (Tissue-type) Plasminogen Activator in Human Blood and in Various Animal Species in Vitro", Thrombos. Haemostas., 46(2):561-565 (1981). Den strukturelle forbindelse mellom damener med den fibrinolyttiske aktivitet og affinitet er også blitt skissert. Banyai, L. et al., "Common evolutionary origin of the fibrin-binding structures of fibronectin and tissue-type plasminogen activator",

FEBS Lett. 163(1):37-41 (1983) og Ny, T. et al., "The Structure of the Human Tissue-type Plasminogen Activator Gene: Correlation of Intron and Exon Structures to Functional and Structural Domains", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:5355-5359 (1984) .

Ekspresjonen av TPA ved hjelp av transformerte bakterier og gjær er også kjent. Budbærer-ribonucleinsyren (RNA) for human TPA ble isolert for første gang i 1982. Opdenakker et al., "Messenger RNA for Human Tissue Plasminogen Activator", Eur. J. Biol., s. 269-74 (1982). Bakterier ble transformert for ekspresjon av TPA av Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli", Nature, 301:214-21 (1983). Fremgangsmåter for å transformere gjær slik at den uttrykker human TPA, er blitt beskrevet i US patentsøknad nr. 6 6 3.025 og i publisert europeisk patentsøknad EP 143.081.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen vedrører en genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av et tPA-lignende protein med en molekylvekt som er mindre enn 90.000 dalton, og som ved sammenligning med tPA hvis naturlig forekommende rekkefølge er FGK1K2A, har rekkefølgen FK2A, FK2K2A eller FGK2A, hvor F er fingerdomenet, G er vekstfaktordomenet, Kl og K2 er "kringle l"-og "kringle 2"-domenene, og A er et aktivt sete, hvor det tPA-lignende protein har forøkt fibrinaffinitet og forøkt halveringstid in vivo sammenlignet med naturlig forekommende tPA, kjennetegnet ved at cDNA for naturlig forekommende tPA erholdes, det syntetiseres blokker av oligonucleotider som inneholder den kodende sekvens for de forskjellige tPA-domenene med utvalgte restriksjonsseter i interdomeneområdene, domenene klones og replikeres i E. coli som den modifiserte DNA vist i nedre linje i figur 1, hvoretter det tPA-lignende protein uttrykkes fra celler av en egnet vert som inneholder DNA som gjør verten i stand til å opprettholde den modifiserte DNA og uttrykke proteinet, og proteinet isoleres fra vertscellekulturen.

Nærmere bestemt er det beskrevet forbindelser av

den ovenfor nevnte tPA-kodende DNA hvor et Xba-sete er innføyd mellom nucleotidbaser 187 til 198, hvor et Hpal-eller Sphl-sete, eller en kombinasjon derav, er innføyd mellom nucleotidbaser 328 til 342, hvor et EcoRV-, Clal-eller Smal-sete eller en kombinasjon derav er innføyd mellom nucleotidbaser 442 til 462, hvor et BamHI- eller Hpal-sete eller en kombinasjon derav er innføyd mellom nucleotidbaser 709 til 726, og hvor et Mstl-, SphI- eller Xmalll-sete eller en kombinasjon derav er innføyd mellom nucleotidbaser 973 til 997.

Blant de TPA-kodende DNA-sekvenser som er beskrevet ovenfor, er de hvor sekvensen av nucleotider som koder for doméneområder, er blitt endret fra den naturlige orden når det gjelder rekkefølgen, opptreden eller begge deler. Nærmere bestemt er det her beskrevet TPA-kodende DNA-sekvenser hvor DNA koder for TPA-lignende proteiner hvor doménene forekommer i følgende rekkefølge fra aminoenden:

(a) FA, (b) FGK1A, (c) FGK2A, (d) FK2A, (e) FK1K2A,

(f) FK2K2A og (g) FGK1K2A.

Dertil er det forbindelser av TPA-kodende DNA-sekvenser som beskrevet ovenfor, hvor sekvensene av nucleotider både oppstrøms og nedstrøms fra sekvensene som koder for TPA-lignende protein, gjør forbindelsen i stand til å bli opprettholdt i en egnet vertcelle. Nærmere bestemt er det her beskrevet slike forbindelser som også er i stand til å gjøre det mulig for en egnet vertcelle å uttrykke TPA-lignende proteiner, spesielt de analoger hvor doméneområdene er blitt endret med hensyn til rekkefølge, opptreden eller begge deler, forutsatt at den totale molekylvekt av det uttrykte protein ikke overskrider 90.000 dalton, og at ikke noe domene opptrer mer enn to ganger. Enda mer spesielt er det her beskrevet ekspresjons- og replikasjons-plasmider (vektorer) som inneholder DNA som koder for TPA-lignende proteiner hvor doménene forekommer i følgende rekke-følge fra aminoenden: (a) FA, (b) FGK1A, (c) FGK2A, (d) FK2A, (e) FK1K2A, (f) FK2K2A, (g) FK1A eller (h) FGK1K2A.

Oppfinnelsen vedrører også en vertscelle som er kjennetegnet ved at den er i stand til å uttrykke et tPA-lignende protein fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1, hvor cellen er avledet fra følgende gruppe av eukaryot-og prokaryotceller:

a. E. coli,

b. gjær,

c. celler fra kinesisk hamster,

d. insektceller,

e. Spodoptera frugiperda,

f. Bombyx mori og

g. pattedyrceller.

Endelig er det her beskrevet forbindelser av tPA-lignende proteiner bestående av et aktivt sete (A) og ett eller flere doméner valgt fra gruppen bestående av finger-doménet (F), vekstfaktordoménet (G), "kringle l"-doménet (Kl) og "kringle 2"-doménet (K2), hvor doméneområdene er blitt endret fra den naturlige orden når det gjelder rekke-følge, opptreden eller begge deler, forutsatt at dens totale molekylvekt til det uttrykte protein ikke overskrider 90.000 dalton, og at ikke noe domene opptrer mer enn to ganger. Følgende ordning av TPA-doméner er foretrukket:

(a) FA, (b) FGK1A, (c) FGK2A, (d) FK2A, (e) FK1K2A,

(f) FK2K2A og (g) FK1A.

NÆRMERE BESKRIVELSE

Oppfinnelsen omfatter en serie molekylærgenetiske manipulasjoner som kan utføres på en rekke kjente måter.

To prototypegener med unike endonucleaserestriksjonsseter mellom doménene til TPA er blitt deponert i overensstemmelse med Budapest-konvensjonen. Vertmikroorganismene er E. coli-stammer som inneholder plasmider betegnet pTPA-Bl,2,3,4(a) og pTPA-Bl,2,3,4 og illustrert i hhv. skjema 10 og 11. Deponeringen av pTPA-Bl,2,3,4(a) ble gjort ved Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, 29. august 1986 og fikk deponeringsnr. NRRL B-18106. Deponeringen av pTPA-Bl,2,3,4 ble gjort ved Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, 28. november 1986 og fikk deponeringsnr. NRRL B-18142.

Det deponerte plasmid må ikke på noen måte betraktes som en begrensning av oppfinnelsen. Selv om det er et passende utgangsmateriale, vil det nedenunder bli beskrevet nærmere forskjellige fremgangsmåter som er tilgjengelige for å danne TPA-analogene ut fra alternative utgangsmateri-aler, og dette etterfølges av spesifikke eksempler på foretrukne fremgangsmåter.

Som en oppsummering kan de nødvendige genetiske manipuleringer beskrives som oppnåelse av en cDNA av TPA, syntetisering av blokker av oligonucleotider som inneholder den kodende sekvens for de forskjellige TPA-doménene med utvalgte restriksjonsseter i interdoméneområdene, kloning og replikasjon av doménene i E. coli og ekspresjon av den ønskede TPA-analog.

A. Figurer

Figur 1 viser den spesifikke sekvens og base-nummereringsposisjonene for syntetisk TPA-DNA sammenlignet med den naturlig forekommende cDNA. De naturlig forekommende doméner er alle til stede i sin naturlige rekkefølge i figur 1. Figur 2 sammenligner aminosyresekvensen til den naturlig forekommende TPA med en TPA-analog som har alle de naturlig forekommende doméner i den normale rekkefølge (se skjema 11). I begge figurene utgjør toppsekvensene den naturlig forekommende sekvens til enten nucleotider eller aminosyrer, mens de nedre sekvenser gjenspeiler den modifiserte TPA. Figur 3 viser oligonucleotidene som brukes til å bygge TPA-analogene syntetisk. Figur 4 sammenligner det naturlig forekommende TPA-protein med analogen beskrevet i skjema 11 som inneholder den naturlige rekkefølge av TPA-doméner, ved å illustrere aminosyrene og nucleotidene som befinner seg i doméneområdene. Interdoméneområdene er de aminosyrene som ligger mellom doménene slik som skissert i figur 4 (se definisjoner). Utover i denne beskrivelse refererer de nummererte henvisninger til enten nucleotider eller aminosyrer, til disse figurene.

B. Generelle fremgangsmåter

Generelt kan nomenklaturen og de generelle labora-toriefremgangsmåter som her er påkrevet, finnes i Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982. Håndboken er heretter henvist til som Maniatis.

Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria næringsmedium (LB) med glucose, Difco's "Antibiotic Medium #2" og M9-medium supplert med glucose og syrehydrolysert kasein-aminosyrer. Stammer med resistens mot antibiotika ble opprettholdt ved legemiddelkonsentrasjonene beskrevet i Maniatis. Transformasjoner ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Morrison, D.A. (1977), J. of Bact., 132:349-351 eller av Clark-Curtiss, J.E. og Curtiss, R., 1983, i Methods in Enzymology, 101:347-362, Wu, R., Gross-

man, L. og Moldave, K., red., Academic Press, New York.

Alle enzymer ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kolonihybridisering ble utført slik som generelt beskrevet i Grunstein, M. et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 72, vol. 72, s. 3961-5 (1975), men modifisert til å

gi følgende fremgangsmåte:

Det ble laget nitrocellulosefiltere som inneholder kolonier av cellene fremstilt ovenfor. Filtrene ble deretter lagt med kolonisiden opp på et lag med tykkelse 5-8 av Whatman 3 mm papir gjennomfuktet i denatureringsoppløsning bestående av 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH. Denatureringsmidlet fikk diffundere oppover og inn i koloniene i 1,5-2 minutter, hvoretter filtrene ble overført til et andre lag av 3 mm papirer gjennombløtet i nøytraliseringsoppløsning som inne-holdt 0,5 M Tris-HCl pH 7,4, 2 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrat, pH 7,1) og 25 mM EDTA i 1-3 minutter. Filtrene ble deretter grundig lufttørket og oppvarmet under vakuum i 2-4 timer ved 80°C.

Hybridiseringsbetingelser for oligonucleotid-søkere er tidligere beskrevet av Goeddel, D.V. et al., Nature,

vol. 290, s. 20-26 (1981).

Etter hybridisering ble den søkerholdige oppløsning fjernet og tatt vare på, og filtrene ble vasket i 0,1% SDS, 0,2 x SSC i tilsammen 3 timer med 5 skiftinger av 400 ml hver. Filtrene ble grundig lufttørket, montert og auto-radiografert under anvendelse av Kodak X-OMAT AR film og Dupont "Cronex Lightening Plus" forsterkingsskjerm i

16 timer ved -70°C.

For sekvensering av plasmider ble minipreparater av plasmid-DNA fremstilt ifølge fremgangsmåten til Holmes, D. S. et al., Analyt. Biochem., vol. 114, s. 193 (1981). Dideoxy-sekvensering ble utført ifølge Sanger F. et al., "Cloning in single stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing", J. Mol. Biol. 143:161-178 (1977). De dideoxy-holdige reaksjonsblandinger ble fremstilt for elektroforese-behandling ved oppvarming til 90°C i 2 minutter og avkjøling på is. 2-3 vil pr. felt ble fylt på en 8% sekvenserende, denaturerende polyacrylamidgel fremstilt og anvendt ifølge Sanger og Coulson, "The use of thin acrylamide gels for

DNA sequencing", FEBS Lett. 87:107-110 (1978). Gelene ble eksponert ved værelsetemperatur i 2-4 dager, og filter (Kodak XAR-5) ble fremkalt etter produsentens anbefalinger.

Nucleotidstørrelser er angitt enten i kilobaser (kb) eller basepar (bp). Disse er beregnede verdier avledet fra agarosegelelektroforese.

C. TPA-cDNA

TPA-cDNA var en vanlig kilde for den delen av nuclein-syresekvensen som inneholder det aktive sete. Det var derfor unødvendig å syntetisere det aktive sete kjemisk. TPA-cDNA er tilgjengelig fra en rekke kilder. Forskere har rapportert fremstilling av deler av TPA-cDNA fra budbærer-RNA isolert fra cellekulturer som danner store mengder TPA, særlig Bowes melanomceller. Edlund et al., "Isolation of cDNA Sequences Coding for a Part of Human Tissue Plasminogen Activator" vol. 80, s. 349-352 (jan. 1983); Gronow et al., "Production of Human Plasminogen Activators by Cell Culture", Trends in Biotechnology, vol. 1, nr. 1, s. 26-29 (1983), og Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli", Nature,

vol. 301, s. 214-21 (20. jan. 1983).

Nærmere bestemt innleverte Genentech, Inc. en europeisk patentsøknad nr. 0093619 4. mai 1983, som var basert på prioritetssøknadene med US nr. 374.860, 398.003 og 483.052, med respektive innleveringsdatoer 5. mai 1982,

14. juli 1982 og 7. april 1983, og som nedenunder er henvist til som Genentech-søknaden. Genentech-søknaden beskriver E. coli K12 stamme 294 med ATCC nr. 31446 som er en trans-formant med en rekombinant DNA-forbindelse som koder for TPA. Dertil er E. coli K12 stamme W3110 transformert ved hjelp av rDNA beskrevet i Genentech-søknaden som ATCC nr. 27325 hvorfra også ekstrakter av TPA er fremstilt for analyse av fibrinolyttisk aktivitet. Beskrivelsen omfatter således en rekombinant DNA-forbindelse som her kan anvendes. Likeledes tilveiebringer beskrivelsen i Genentech-søknaden DHFR<+> CHO-KI (ATCC CL 61)-celler transformert for forsterk-ning som også uttrykker TPA. Igjen åpenbarer således deponeringen, ATCC CL61, rekombinante DNA-nucleotider som koder for TPA og som kan anvendes her.

Den foreliggende beskrivelse av "preparat 2" tilveiebringer for fagfolk en isoleringsfremgangsmåte blant de fremgangsmåter som er kjent innen teknikken og som er an-vendelig på Bowes melanomcelle for å oppnå den rekombinante DNA-forbindelse som koder for en TPA. Bowes melanomcellen er ålment tilgjengelig.

D. Syntetisering av TPA-doméner.

Som angitt ovenfor, ble deler av de TPA-analoge DNA-sekvenser fremstilt fra cDNA; mesteparten av sekvensen og til og med hele sekvensen kunne imidlertid være blitt dannet syntetisk. Kostnad og lettvinthet er de avgjørende parametre når det gjelder å avgjøre hvordan en bestemt TPA-analog sekvens skal dannes. Ved å velge restriksjonsseter som ikke er å finne i TPA-doménene i den ønskede analog, og ved å innføre disse restriksjonssetene i interdoméneområdene til TPA, unngår man kløyving av en ønsket del av TPA-DNA-sekvensen og muliggjør lettvint fjerning og innfør-ing av hvert enkelt doméne.

Ved å syntetisere kjemisk en del av TPA-genet kan man ved en base-til-base-fremgangsmåte avgjøre hvilke nucleotider som skal brukes. De følgende fordeler oppstår ved denne fremgangsmåten: (1) minimalisering av sekundærstruktur i transkripsjonsproduktet, (2) minimalisering av AT-GC-områder ved selv-komplementaritet, og (3) plasseringen av unike restriksjonsseter på ønskede steder langs cDNA-sekvensen.

Oligonucleotider syntetiseres kjemisk ifølge fosfor-amiditt-triester-metoden i fast fase som først ble beskrevet av Beaucage S.L. og Caruthers, M.H. Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862 (1981) under anvendelse av et automatisert synteseapparat som beskrevet i Needham-VanDevanter, D.R.,

et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984). Rensing av oligonucleotider skjedde enten ved naturlig acrylamidgelelektroforese, eller ved anionbytter-HPLC som beskrevet i

Pearson, J.D. og Regnier, F.E., J. Chrom., 255:137-149

(1983) .

Oligodeoxynucleotider syntetiseres kjemisk i lengder på mindre enn 40 nucleotider. Hvert fragment utformes slik at det er komplementært til den tilsvarende komplementære kjede, og hvert dobbeltkjedet segment inneholder "klebrige" ender for å optimalisere ligering. De følgende kriterier betraktes ved inndelingen av DNA for syntese av fragmentene: 1) Lengden av oligonucleotidfragmentene bør være mindre enn 40 baser i lengde for at den kjemiske syntese og rensing skal skje lett. 2) Et minimum på 6 baser som "stikker frem" fra de komplementerende "topp"- og "bunn"-oligonucleotid-fragmenter, synes å gi optimal innretting og ligering av segmentene. 3) Områder med fire baser eller mer som kan binde seg enten til den primære sekvens eller komplement-sekvens, bør unngås.

Sekvensen til de syntetiske oligonucleotider kan bekreftes ved å bruke den kjemiske nedbrytningsmetode til Maxam, A.M. og Gilbert, W., Grossman, L. og Moldave, D., red., Academic Press, New York, Metods in Enzymology, 65:499.-560 (1980). Alternativt kan sekvensen bekreftes etter sammenføringen av oligonucleotidfragmentene til den dobbeltkjedede DNA-sekvens ved å bruke fremgangsmåten til Maxam og Gilbert nevnt ovenfor, eller kjedeterminerings-metoden for sekvensering av dobbeltkjedede templater til Wallace, R.B., et al., Gene, 16:21-26 (1981). 87 separate oligonucleotider (figur 3) ble syntetis-ert. Den bestemte sammensetningsstrategi som her er beskrevet, var å sette sammen de første 1099 basepar som koder for 5'-delen av TPA-analogen med de utvalgte restriksjonsseter angitt i plansje (11). Dette syntetiske oligonucleotid knyttes så til 3'-delen av TPA-cDNA i EcoRI-setet i posisjon 1287 som inneholder det aktive sete.

For å sette sammen oligonucleotidfragmentene til den dobbeltkjedede DNA, kan man blande alle de 87 fragmentene sammen for herding og ligering. For mer effektiv ligering er det bedre å fordele oligonucleotidene i fire grupper. Etter ligering og rensing av hver gruppe kan de fire gruppene så herdes og ligeres hvorved man får sluttproduktet. Rensing av de sammensatte grupper og sluttproduktet kan utføres ved hjelp av acrylamidgelelektroforese som beskrevet i Maniatis. For å utføre herdingen og ligeringen brukes også de generelle metodene beskrevet i Maniatis.

Det kan være nødvendig å tilveiebringe et initieringskodon for de syntetiske TPA-gener. Når det gjelder E. coli-systemet, er det påkrevet med initieringskodonet ATG for koding av F-met. Initieringskodonet kan inkorporeres i det syntetiske genet eller tilveiebringes ved hjelp av det ønskede ekspresjonsplasmid. I tillegg til et initieringskodon, er det for E. coli passende å inkorporere i det syntetiske genet for TPA en sekvens som gir passende mellomrom mellom Shine-Dalgarno-området og initieringskodonet.

Passende utvelgelse av sekvensen vil minimalisere sekundærstruktur som ellers ville virke inn på transkripsjon og translasjon, inkorporere maksimal kodonbruk (Grosjean H. og Fiers, W., Gene, 18:199-209, 1982), og tilfredsstille de statistiske uregelmessigheter som finnes i sekvensen rundt ribosombindingssetet (Gold, L., et al., Ann. Rev. Microbiol., 35:365-403, 1981). Den spesifikke sekvensen

for denne oppfinnelse er her beskrevet med sin faktiske rekkefølge. Imidlertid skal det forstås at alternative sekvenser kan brukes for å optimalisere ekspresjonen av TPA-analoger i forskjellige vertceller.

E. Kloning av cDNA og syntetiske deler av TPA-genet.

Fremgangsmåter som brukes for å klone cDNA og de syntetiske delene av TPA for replikasjon av de rekombinante fragmenter som koder for deler av TPA, er standardfrem-gangsmåter som er kjent innen teknikken. Maniatis-håndboken inneholder tilstrekkelig metodikk til å utføre alle klon-inger beskrevet nedenunder. Alle kloningene ble utført i transformert E. coli, idet hvilken som helst godt karakterisert stamme er anvendbar. Stamme HB101 er foretrukket med mindre annet er angitt.

Kloningsvektorer som kan anvendes for transformering av E. coli, omfatter pBR322 og pKC7.

F. Innføring av unike restriksjonsseter i den DNA

som koder for TPA.

De spesifikke restriksjonssetene valgt for interdoméneområdene til TPA, er illustrert i plansje 10 og 11. Disse er ikke de eneste restriksjonsseter som ville være anvendbare i denne oppfinnelse. Restriksjonsseter er valgt på grunnlag av at de er unike i TPA-cDNA. Seter som vil gi minimale aminosyreendringer i interdoméneområdene, er foretrukket, og de som er hvilende når det gjelder aminosyreendringer, er mest foretrukket (se figurene 1 og 2). Flere seter med forskjellige avlesningsrammer innenfor et interdoméne er nyttige for å sikre at doménene er i fase etter ligering til andre doméner for ekspresjonsformål. Doble restriksjonsseter kan elimineres ganske enkelt ved å løse opp setet og ligere etter å ha gjort endene butte. Innfør-ingen av et unikt sete kan bygges inn ved hjelp av kjemisk syntese, kommersielt tilgjengelige bindere eller ved enkel setemutasjon.

Den naturlig forekommende TPA-cDNA inneholder ikke seter som gjenkjennes av følgende endonucleaserestriksjons-enzymer i tillegg til de setene som er bygd inn i de to prototype-cDNA for TPA illustrert i plansjene 10 og 11:

G. Ekspresjon av TPA-analoger i E. coli.

For å oppnå ekspresjon av et klonet gen på høyt nivå, f.eks. det modifiserte TPA-gen, i et prokaryot system, er det vesentlig å konstruere ekspresjonsvektorer som i det minste inneholder en sterk promoter for å styre mRNA-transkripsjon, et ribosom-bindende sete for translasjonsinitiering og transkripsjonsterminator. Ettersom akkumuler-ingen av store mengder av et genprodukt ofte inhiberer celle-vekst og noen ganger forårsaker celledød, må promoteren valgt til å styre syntesen av produktet, reguleres på en slik måte at celleveksten kan få nå høye densiteter før induksjonen av promoter. Eksempler på regulatorområder egnet for dette formål, er promoter- og operatorområdet i biosyntesesporet for tryptofan hos E. coli, slik som beskrevet av Yanofsky, C., Kelley, R.L. og Horn, V., J. Bacteriol., 158:1018-1024 (1984), og promotoren lengst til venstre hos fag-lambda (P J-t) slik som beskrevet av Herskowitz, I. og Hagen, D., Annu. Rev. Genet., 14:399-445 (1980). TPA dannet

i E. coli, folder seg ikke sammen på riktig måte på grunn av det store antallet cysteinrester. Den E. coli-dannede TPA må først denatureres og deretter renatureres. Dette kan utføres ved å oppløseliggjøre den E. coli-dannede TPA i guanidin«HCl og redusere alle cystinrestene med |3-mercaptoethanol. Proteinet renatureres så enten ved en sakte dia-lyse eller ved gelfiltrering. US patentskrift nr. 4.511.503.

H. Ekspresjon av TPA-analoger i gjær.

Ekspresjonen av heterologe proteiner i gjær er vel kjent. Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), er et godt anerkjent arbeide som beskriver de forskjellige metodene som kan brukes for å danne TPA-analoger i gjær.

For ekspresjon på høyt nivå av et gen i gjær, er

det vesentlig å knytte genet til et sterkt promotersystem, slik som i prokaryoten, og også tilveiebringe effektive transkripsjonsterminering/polyadenylering-sekvenser fra et gjærgen. Eksempler på anvendbare promoterer omfatter GALI,10 (Johnston M., og Davis, R.W., Mol. and Cell. Biol., 4:1440-48, 1984), ADH2 (Russell, D., et al., J. Biol. Chem. 258:2674-2682, 1983), PH05 (EMB0J. 6:675-680, 1982) og MFotl. Et flerkopi-plasmid med en selektiv markør, slik som Lue-2, URA-3, Trp-1 og His-3, er også ønskelig.

Når celler dyrkes på glucose, undertrykkes GAL- og ADH2-promoterer og gjør det derved mulig for celler å bli dyrket til en høy densitet. Mens GAL-promoterne kan slås på ved å overføre celler til galactosemedium, vil ADH2 bli slått på etter at all glucosen er blitt utnyttet av cellene. PH05-promoteren kan bli slått på eller av ved manipuleringer av fosfatkonsentrasjonen i mediet. MFal-promoteren i en vert av a-paringstype er på hele tiden, men er av i diploider eller celler med a-paringstypen. Den kan imidlertid reguleres ved å øke eller senke temperaturen i verter som har en ts-mutasjon i et av SIR-stedene. Virkningen av en slik mutasjon ved 35°C på en celle av a-type, er å slå på det vanligvis hvilende gen som koder for a-paringstypen. Ekspresjonen av det hvilende a-paringstype-gen slår igjen av MFal-promoteren. Ved å senke dyrkningstemperaturen til

27°C reverseres hele prosessen og slår av a-paringstypen og slår på MFocl (Herskowitz, I. & Oshima, Y. (1982) i The molecular biology of the yeast saccharomyces, (red. Strathern, J.N., Jones, E.W., & Broach, J.R., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, s. 181-209).

Polyadenyleringssekvensene tilveiebringes ved hjelp av 3'-endesekvensene til hvilke som helst av genene med høy uttrykningsgrad, slik som ADH1, MFotl eller TPI (Alber, T. og Kawasaki, G., J. of Mol. & Appl. Genet. 1:419-434, 1982).

En rekke gjærekspresjonsplasmider, slik som YEp6, YEpl3 og YEp24, kan brukes som vektorer. Et gen av inter-esse, slik som TPA, kan smeltes sammen med hvilken som helst av promoterne som er nevnt ovenfor, og deretter ligeres til plasmidene for ekspresjon i forskjellige gjær-verter. De ovenfor nevnte plasmider er fullstendig beskrevet i litteraturen (Botstein, et al., Gene, 8:17-24, 1979; Broach, et al., Gene, 8:121-133, 1979).

Selv om de ovenfor nevnte plasmider kan brukes, og er blitt brukt, til å uttrykke fremmede gener i gjær, er det her beskrevet vektorer som muliggjør betydelig fleksi-bilitet når det gjelder innføring og/eller fjerning av forskjellige bestanddeler i ekspresjonsvektorene. Et slikt

eksempel er vektoren pal-ADHt illustrert i plansje 18.

To fremgangsmåter brukes til transformering av gjærceller. I ett tilfelle omdannes gjærceller først til proto-plaster ved å bruke zymolyase, lyticase eller glusulase, etterfulgt av addisjon av DNA og polyethylenglycol (PEG).

De PEG-behandlede protoplastere regenereres så i et 3% agar-medium under selektive betingelser. Detaljer vedrørende denne fremgangsmåte er gitt i litteraturen av J. D. Beggs, Nature (London), 275:104-109 (1978) og Hinnen, A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75:1929-1933 (1978). Den

andre fremgangsmåten involverer ikke fjerning av celleveggen. I stedet behandles cellene med lithium-klorid eller -acetat og PEG, og plasseres på selektive plater (Ito, H., et al.,

J. Bact., 153:163-168, 1983).

TPA-analogene kan isoleres ved lyse av cellene og anvendelse av standard proteinisoleringsteknikker på lysatene. TPA-analoger kan påvises ved å bruke Western flekk-teknikker eller radioimmunologiske prøver.

I. Ekspresjon i cellekulturer.

Den TPA-analog-kodende DNA kan ligeres til forskjellige ekspresjonsvektorer for bruk ved transformering av vertcellekulturer. Vektorene inneholder alle gensekvenser for å initiere transkripsjon og translasjon av TPA-analogene som er forenlige med vertcellen som skal transformeres. Når vertcellen er en høyere dyrecelle, f.eks. en pattedyrcelle, kan den naturlig forekommende transkripsjons- og translasjonsgensekvens i TPA-genet anvendes, eller den naturlig forekommende gensekvens kan anvendes sammen med en heterolog promotersekvens. I tillegg inneholder vektorene fortrinnsvis en markør for å gi et fenotypespor for utvelgelse av transformerte vertceller. Dertil kan en replikerende vektor inneholde et replikon.

Illustrerende for cellekulturer som kan brukes til produksjonen av TPA-analoger, er celler av insekt- eller pattedyropprinnelse. Pattedyrcellesystemer vil ofte være i form av monolag av celler selv om pattedyrcellesuspensjoner også kan brukes. Illustrerende eksempler på pattedyr-cellelinjer omfatter VERO- og HeLa-celler, cellelinjer fra eggstokk hos kinesisk hamster (CHO), WI38-, BHK-, C0S-7-eller MDCK-cellelinjer. Illustrerende insektcellelinjer omfatter Spodoptera frugiperda (høsthærmugg) og Bombyx mori (silkeorm).

Som angitt ovenfor, inneholder vektoren, f.eks. et plasmid, som bruktes til å transformere vertcellen, fortrinnsvis gensekvenser som initierer transkripsjonen og translasjonen av TPA-gensekvensen. Disse sekvenser er henvist til som kontrollsekvenser for ekspresjon. Når vertcellen er av insekt- eller pattedyropprinnelse, fås illustrerende anvendbare ekspresjonskontrollsekvenser fra SV-40-promoteren (Science, 222, 524-527, (1983)), CMV I.E. promoteren (Proe. Nat'l. Acad. Sei., 81:659-663, 1984) eller metallothioneinpromoteren (Nature, 296, 39-42 (1982)). Når vertcellen er en pattedyrcelle, kan man som angitt ovenfor, bruke ekspresjonskontrollsekvensene for TPA-genet, men det er foretrukket å kombinere TPA-analogen med et heterologt transkripsjonsinitieringssete. Plasmidet eller replikerende eller integrerende DNA-materiale som inneholder ekspresjonskontrollsekvensene, spaltes ved å bruke restriksjons-enzymer og reguleres i størrelse etter behov eller ønske, og ligeres med cDNA som koder for TPA-analogene ved hjelp av midler som er velkjente innen teknikken.

Som ved gjær, må polyadenylerings- eller terminator-sekvenser fra kjente pattedyrgener inkorporeres i vektoren når det anvendes vertceller fra høyere dyr. Et eksempel på en terminatorsekvens er polyadenyleringssekvensen fra genet for bovint veksthormon.

I tillegg kan gensekvenser for å kontrollere replikasjon i vertcellen inkorporeres i vektoren, slik som de som finnes i vektorer av bovin papillom-virustype. Saveria-Campo, M., "Bovine papilloma virus DNA: a eukaryotic cloning vector" i DNA Cloning Vol. II a practical approach. Red. D.M. Glover, IRL Press, Arlington, Virginia, s. 213-238

(1985) .

Vertcellene er kompetente eller gjort kompetente for transformasjon ved hjelp av forskjellige måter. Det finnes flere velkjente metoder for å innføre DNA i dyre-celler. Disse omfatter: calciumfosfatutfelling, fusjon av mottagercellene med bakterieprotoplastere som inneholder den aktuelle DNA, behandling av mottagercellene med liposomer som inneholder den aktuelle DNA og mikroinjeksjon av den aktuelle DNA direkte i cellene.

De transformerte cellene oppdyrkes ved hjelp av midler som er velkjente innen teknikken, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R. J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977), og de uttrykte TPA-analoger innhøstes fra cellemediet i de systemene hvor proteinet utskilles fra vertcellen, eller fra cellesuspensjonen etter oppbrytning av vertcellesystemet ved hjelp av f.eks. mekaniske eller enzymatiske midler som er velkjente innen teknikken.

J. Evaluering av TPA-analoger.

TPA og dens analoger kan evalueres på en av to måter. Den relative evne til å spalte plasminogen til plasmin kan fastlegges, og den relative evne hos inhibitorer til å for-hindre dannelse av plasmin kan fastlegges. Nedenunder beskrives fremgangsmåtene for slike evalueringer nærmere.

Amidolyttisk analyse. TPA-analogenes funksjonelle aktivitet måles ved å bruke den koblede amidolyttiske analyse beskrevet av Verheijen, J.H., et al., en enkel, følsom spektrofotometrisk analyse for ekstrinsik (vevtype) plasminogenaktivator anvendbar på målinger i plasma. Thromb. Haemostas., 48:266-269 (1982). I korte trekk blandes prøver som inneholder TPA-analogene, med plasminogen og CNBr-oppløste fibrinogenfragmenter. Det således dannede plasmin spalter så et exogent tilsatt kromogent substrat, S-2251 (H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid-dihydroklorid; KABI, Stockholm, Sverige) og frembringer et farget produkt som undersøkes spektrofotometrisk. Virkningen av protease-inhibitorer på aktiviteten til TPA-analogene fastlegges ved å bruke en modifikasjon av denne analyse beskrevet av Verheijen, J.H., et al., Evidence for the occurrence of a fast-acting inhibitor for tissue-type plasminogen activator in human plasma, Thromb. Haemostas., 51:392-395 (1984).

Den tilsatte inhibitor bindes til TPA, danner et irreversi-belt kompleks og forhindrer derved TPA fra å aktivere plasminogenet. F.eks. titreres renset, naturlig forekommende TPA med økende mengder av en inhibitorholdig prøve, og den resterende TPA-aktivitet måles som redegjort for ovenfor. En standardkurve utvikles så ved å gjengi rest-TPA-aktiviteten grafisk som en funksjon av mengden av inhibitorholdig prøve tilsatt. På lignende måte titreres TPA-analogene med inhibitoren. De resulterende kurver sammenlignes med kurven for TPA-standarden. Graden av likhet mellom kurvene står i direkte forhold til den bestemte analogs ømfintlighet overfor inhibering.

Fibrinautografi. Molekylvektene til TPA-analogene bestemmes ved å utsette prøver som inneholder analogene, for natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og deretter plassere acrylamidgelen på en plasminogenholdig fibrinindikatorfilm. Etter hvert som analogproteinene diffunderer fra acylamidgelen og inn i indikatorfilmen, omdanner de plasminogenet til plasmin som forårsaker dannelsen av en klar fibrinolysesone i den ellers opake fibrinindikator. Fremkomsten av denne sone indikerer tilstedeværelse av en aktiv TPA-analog i en tilsvarende posisjon i acrylamidgelen. Denne teknikken brukes også for å fastlegge reaksjonen mellom TPA-analoger og protease-inhibitorer. Som nevnt ovenfor, resulterer denne reaksjon i dannelse av et enzym-inhibitor-kompleks som har en høyere molekylvekt enn den analoge forbindelse selv. Etter SDS-PAGE oppviser komplekset rest-TPA-aktivitet som kan synlig-gjøres i fibrinindikatorfilmen. Detaljene ved denne teknikk ble først beskrevet av Granelli-Piperno, A. og E. Reich, A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids, J. Exp. Med., 148:223-234 (1978).

Fastleggelse av antigenet i TPA-analoger. Enzymbundne immunsorbentanalyser av sandwich-type (S-ELISA-er). Antigenet i TPA-analogene måles immunolog-isk ved hjelp av to forskjellige S-ELISA-er. Ved den første anvendes polyklonale antistoffer fra geit som er spesifikke for human livmor-TPA. Ved den andre anvendes et murint monoklonalt antistoff. Dette monoklonale antistoff er rettet spesifikt mot en epitop som er påkrevet for aktiviteten av TPA. Bruken av et antistoff som er spesifikt for aktivt-sete-doménet til TPA, gir en effektiv måte å måle antigenet i enhver TPA-analog hvor den primære struktur er blitt endret i et annet domene enn domenet for det aktive sete. Denne analyse er lik en beskrevet av Korninger, C.,

et al., Sandwich ELISA for TPA antigen employing a mono-clonal antibody, Thromb. Res., 41:527-535 (1986). Følsom-hetsgrensen for begge analysene er omtrent 1 ng TPA pr. ml.

Western immunflekkteknikk. TPA-analogenes evne til

å danne komplekser med inhibitorer kan også fastlegges ved å bruke SDS-PAGE og Western immunflekkteknikker som først beskrevet av Towbin, H., et al., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, 76:4350-4354 (1979). I korte trekk tillates TPA-analogen å reagere med inhibitoren, blandingen underkastes SDS-PAGE, og proteinene elektrooverføres til nitrocellulose-papir. Både ikke-kompleksdannet, fritt TPA og TPA i kompleks med inhibitoren påvises ved å bruke renset polyklonalt geit-IgG som er spesifikt for TPA, og et kanin-antiserum rettet mot geit-IgG-et. De TPA-holdige immunkomplekser synliggjøres så ved å bruke I 125-merket protein A og auto-radiografi .

DEFINISJONER

Uttrykket "cellekultur" henviser til oppbevaringen

av voksende celler avledet enten fra en flercellet plante eller et flercellet dyr som gjør det mulig for cellene å forbli levedyktige utenfor den opprinnelige plante eller det opprinnelige dyr.

Uttrykket "domene" henviser til en adskilt sammen-hengende del av en aminosyresekvens som ekvivalerer med en bestemt funksjon. Når det gjelder TPA, er doméneområdene definert i de ovenfor anførte litteraturhenvisninger, og figur 4 angir den omtrentlige lokalisering av midtpunktene til interdoméneområdene som ligger mellom doménene.

Uttrykket "nedstrøms" identifiserer sekvenser som følger lengre utover i ekspresjonsretningen, f.eks. er det kodende område nedstrøms fra initieringskodonet.

Uttrykket "interdoméne" henviser til områdene i et proteins aminosyresekvens som ligger mellom doménene. I denne søknad er interdoméneområdene pluss eller minus fem aminosyrerester fra midtpunktene illustrert i figur 4. Interdoméneområdene mellom finger- og vekstfaktordoménene ligger således mellom, og omfatter, aminosyrene 44 til 55; interdoménet mellom vekstfaktor- og "kringle l"-doménene ligger mellom, og omfatter, aminosyrene 86 til 97; interdoménet mellom "kringle 1"- og "kringle 2"-doménene ligger mellom, og omfatter, aminosyrene 169 til 180; interdoménet mellom "kringle 2" og det aktive sete ligger mellom, og omfatter, aminosyrene 257 til 268.

Uttrykket "opprettholdt" henviser til den stabile tilstedeværelse av et plasmid i en transformert vert hvor plasmidet er til stede som et autonomt replikerende legeme eller som en integrert del av vertens genom.

Uttrykket "mikroorganisme" omfatter både éncellede prokaryote og eukaryote organismer slik som bakterier, actinomycetes og gjær.

Uttrykket "ikke-naturlige endonuclease-restriksjonsseter" henviser til endonuclease-restriksjonsseter som ikke finnes i den tilsvarende posisjon i den naturlig forekommende cDNA-sekvens. Disse omfatter både unike og ikke-unike seter.

Uttrykket "operon" er en fullstendig enhet for gen-ekspresjon og regulering, og omfatter strukturgener, regulatorgener og kontrollelementer i DNA som gjenkjennes av regulatorgenprodukt.

Uttrykket "plasmid" henviser til en autonomt selv-replikerende ektrakromosomal, ringformet DNA og omfatter både ekspresjons- og ikke-ekspresjonstypene. Der hvor en rekombinant mikroorganisme eller cellekultur er angitt som vert for et ekspresjonsplasmid, omfatter uttrykket "ekspresjonsplasmid" både ekstrakromosomal, ringformet DNA og DNA som er blitt inkorporert i vertkromosomet eller vert-kromosomene.

Uttrykket "promoter" er et område i DNA som er involvert i binding av RNA-polymerasen for å initiere transkripsjon.

Uttrykket "DNA-sekvens" henviser til et én- eller dobbeltkjedet DNA-molekyl bestående av nucleotidbaser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin.

Uttrykket "egnet vert" henviser til en cellekultur eller mikroorganisme som er forenlig med et rekombinant plasmid og vil la plasmidet replikere, bli inkorporert i genomet eller bli uttrykt.

Uttrykket "oppstrøms" identifiserer sekvenser som kommer forut i den motsatte retning fra ekspresjon; f.eks.

er bakteriepromoteren oppstrøms fra transkripsjonsenheten, initieringskodonet er oppstrøms fra det kodende område.

De regler som er brukt for å angi plasmider og fragmenter i plansjene 1-27, er ment, selv om de er unike for denne søknad, å være synonyme med vanlig brukte angivelser av plasmider og fragmenter av disse. I motsetning til de vanlig brukte ringformede figurer, representerer de én-linjede figurer på plansjene både ringformet og lineær dobbeltkjedet DNA, idet initiering eller transkripsjon skjer fra venstre mot høyre (5' til 3'). Stjernene (<*>) angir bro-dannelsen mellom nucleotider for å fullstendiggjøre plas-midenes ringform. Fragmenter har ikke stjernetegn etter som de er lineære stykker av dobbeltkjedet DNA. Endonuclease-restriks jonsseter er angitt over linjen. Genmarkører er angitt under linjen. Streker som er angitt under diagrammene som representerer plasmidet eller fragmentene, brukes til å indikere antallet basepar mellom to punkter på DNA-molekylet. De relative mellomrom mellom markører indikerer ikke virke-lige avstander, men er bare ment å indikere de relative posisjoner på den illustrerte DNA-sekvens.

FREMSTILLINGER

Fremstilling 1. Vektor - pSK4 - plansjene 1-3.

Plasmid pSK4 er en ekspresjonsvektor som er i stand til å styre ekspresjon av heterologe proteiner i E. coli. Det har en sterk, regulerbar promoter for å mediere transkripsjon og et sterkt ribosombindende sete for translasjonsinitiering. Nærmere bestemt bruker pSK4 promoteren og ribosombindingssetet (RBS) fra tryptofanoperonet (trp). Et unikt Clal-sete umiddelbart nedstrøms fra RBS-et er tilgjengelig for innføring av ønskelige gener, slik som TPA.

(Plansje 3) .

For å lage plasmid pSK4 er det nødvendig å klone

nytt pTRZl (plansje 1) med pKC7 som er kjent (plansje 2). Rao, R.N. og Rogers, S.G., Gene, 7:79-82 (1979). Plasmid pTRZl inneholder en del av trp-operonet som omfatter promoter/operator-området, ribosombindingssetet og eh trpLE-fusjon ALE1413, samt strukturgenene for galactosidase (lacZ) og lactosepermease (lacY). Plasmid pKC7 er et derivat av pBR322 som angir resistens mot ampicillin og kanamycin, og som har mange unike restriksjonsendonucleaseseter.

Det rekombinante plasmid av pTRZl og pKC7 gir pSK3 med trp-promoter, RBS og LE i pKC7. Plasmid pSK3 modifiseres for å eliminere den sammensmeltede peptidsekvens trpLE, hvorved man får den generelle ekspresjonsvektor pSK4.

(1) Konstruksjon av pTRZl. Plansje 1.

Plasmid pTRZl er en klon av kjente plasmider pMC1403 og pWl.

Plasmid pMC1403 gir lacZ-genet fra pTRZl minus de åtte N-terminale aminosyrer og er fullstendig beskrevet av Casadaban, M.J., et al., J. Bacteriol., 1980, 143:971-980. Plasmid pMC1403 har tre unike restriksjonsenzym-spaltings-seter. Det kuttes med EcoRI, defosforyleres med bakteriell alkalisk fosfatase, og endene gjøres butte med Klenow-fragment fra E. coli DNA-polymerase I. Plasmid pWl gir trp-promoteren og operatorsekvensen og er fullstendig beskrevet av Nichols, B.P. og Yanofsky, C., 1983, Methods in Enzymology, red. L. Grossman og K. Moldave, 101:155-164, Academic Press, N.Y. Plasmid pWl, inneholder trp-operonet, med en 952 basepar-strykning (ALE1413) som binder trp-ledersekvensen til trpE-genet som danner trpLE. Plasmid pWl kuttes med PvuII og Bglll, hvorved man får fragment 2 (323 bp) som isoleres ved preparativ agarosegelelektroforese. Bglll-setet fylles igjen ved hjelp av Klenow-enzym. Fragment 2 ligeres så med pMC1403 hvorved man får pTRZl.

(2) Konstruksjon av pSK3

Strukturgenene LacY og LacZ i pTRZl er unødvendige for konstruksjonen av pSK4, og strykningen av disse vil gi et mindre plasmid med mer unike kloningsseter. Dertil vil strykningen av LacY føre til at man unngår de skadelige virkningene av overproduksjon av et membranbundet protein. Som vist i plansje 2, skjæres trp-sekvensene (fragment 3) bort fra pTRZl ved hjelp av EcoRI/BamHI-oppløsning, behandles med alkalisk fosfatase for å minimalisere reinnfør-ing, og innføres så i EcoRI/BamHI-området, fragment 4, i pKC7 som, som et resultat av oppløsningen, ikke lengre angir resistens mot kanamycin. Klonene med ampicillinresistens (AmpR) og kanamycinsensitivitet (KanS) gjennomsøkes med hensyn på forventede restriksjonsfragmenter for innføring av trp-promoter/operator-sekvensen. Dette plasmidet kalles pSK3, og dets ekvivalenter er som beskrevet i plansje 2.

(3) Konstruksjon av pSK4.

trp-promoteren til pSK3 opprettholder fortsatt trpLE-peptidet som er unødvendig for konstruksjonen av en direkte ekspresjonsvektor. trpLE-segmentet skjæres ut ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Som beskrevet i plansje 3, kuttes EcoRI/BamH-fragmentet 5 som bærer trp-sekvensene, fra pSK3 og renses ved elektroeluering fra polyacrylamid-geler. Som vist, inneholder dette fragmentet tre Taql-seter, hvorav ett er i promoter/operator-området, (Taql<1>'), og ett er mellom ribosombindingssetet og starten for trpLE-translasjon (Taql<1>''). Fragmentet løses delvis opp ved hjelp av Taql, og hele utvalget av fragmenter brukes i en ligeringsreaksjon med pBR322 som på forhånd er spaltet med både EcoRI og Clal.

Taql gjenkjenner TiCGA (piler angir punkt for kjede-spalting), mens Clal gjenkjenner ATICGAT. Etter som disse to enzymene frembringer forenlige kohesive ender, og basen 5' til Taql<11>'-setet mellom ribosombindingssetet og trpLE er en A (J. of Bact., 133:1457-1466), regenererer ligering av denne Taql-ende til Clal-enden Clal-setet. Legg merke til at dette kloningsskjerna selekterer for enkle Taql-kutt og også sikrer at transkripsjon fra promoteren vil skje i retning med urviseren. Kloner som oppviser et 278 bp EcoRI/Clal-innskudd, og restriksjonsmønstre som er karakteristiske for trp-promoteren, velges ut og vil være ekvivalenten til pSK4. Klonene kan brukes til ekspresjon av proteinsekvenser som er i stand til translasjonsinitiering når de innføres i Clal-setet.

Fremstilling 2. Isolering av en full lengde-cDNA som koder for human vevplasminogenaktivator.

A. Materialer og fremgangsmåter

(1) Dyrking av Bowes melanomceller

Bowes utgjør en etablert cellelinje avledet fra et humant spontant melanom og er en gave fra dr. Daniel Rifkin ved New York University School of Medicine. Celler dyrkes i Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) supplert med 10% kalvefostermedium (Gibco) og 50 ug/ml gentamycin (Sigma) i en fuktet atmosfære ved 37°C under anvendelse av 95% luft/5% C0„. Celler innhøstet for RNA-fremstilling, dyrkes inntil sammenflyting i 150 cm 2 Falcon-kolber.

(2) Fremstilling av TPA-mRNA

RNA fra Bowes melanomceller isoleres hovedsakelig som beskrevet av Lizardi, et al., Anal. Biochem., vol. 98, s. 116-122 (1979).

DNA polyA<+->anriket ved passering over en kolonne av oligodeoxythymidin-cellulose (OdT-cellulose, Collaborative Research) som beskrevet av Aviv, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 69, s. 1408-12 (1972). Typisk utbytte fra 10 kolber å 150 cm selektert to ganger på separate OdT-kolonner, er omtrent 50 ug polyA<+->mRNA.

PolyA<+->mRNA-en fraksjoneres ved sentrifugering gjennom 15-30% lineære sucrosegradienter. PolyA<+->mRNA (~300 ug) oppløst i 200-400 ul sterilt, destillert H20, fylles på en gradient og sentrifugeres i en Beckman SW41 Ti-sentrifuge ved 35.000 omdreininger pr. minutt i 18 timer, 0,5 ml fraksjoner samles opp under anvendelse av Buchler Auto Densi-Flow Model IIC for å innhøste fra topp til bunn, knyttet til et Gilson mikrofraksjoneringsapparat (modell FC80-K). Aliquoter fra hver fraksjon injiseres i Xenopus-oocytter, og translasjonsprodukter analyseres med hensyn på plasminogenaktivatoraktivitet ved hjelp av kasein-agar-plate-metoden som er analog med den som er beskrevet av Miskin, R. et al., Nuc. Acids Res., vol. 9, s. 3355-63. TPA-aktivitet ytes av mRNA som migrerer ved ca. 19S.

Nærmere bestemt analyseres vevplasminogenaktivatoren, TPA, ved å iaktta omdannelsen av plasminogen til plasmin,

en ikke-spesifikk protease, som løser opp kasein. Analysen utføres på følgende måte. 0,5 ml 8% kokt kasein blandes med 1 ml 2 x MBS og varmes opp til 50°C. 3% agarose smeltes og avkjøles til 50°C. 0,5 ml av 3%-agarosen tilsettes til kasein/MBS og blandes ved pipettering. 100 vil av 1 mg/ml human plasminogen tilsettes (sluttkonsentrasjon er 50 ug/ml) under omrøring, og materialet helles over i en petriskål av plast med diameter 3,5 cm. Agaroseoppløsningen avkjøles til væreIsetemperatur (ca. 30 minutter). Det skjæres ut hull med 2 mm i diameter i agarosen med "Biorad" utstansings-verktøy for gel. Hullene lages like før bruk, og brønnene fylles med MBS. En eller to oocytter som er blitt injisert med TPA-RNA minst 6 timer før analyse, tilsettes hver brønn. Inkubasjon skjer i en fuktet skål i 12-24 timer. Klare soner med kaseinhydrolyse iakttas lett.

Fraksjoner anriket med hensyn på TPA-mRNA, utfelles ved tilsetning av 2 volumdeler ethanol og inkubering på tørris i 1 time. Utfellinger samles opp ved sentrifugering ved værelsetemperatur i en Eppendorf bordmikrosentrifuge, oppløses i sterilt, destillert H„0, slås sammen og utfelles på nytt. Denne t-PA-anrikede polyA -mRNA brukes til å frembringe cDNA for kloning.

(3) cDNA-syntese

Alle disse reaksjonene utføres på is.

(A) Syntese av den første kjede ved bruk av 0dT12-18-primer+

10 ug anriket, polyA —utvalgt Bowes-mRNA (i pl

R^O) inkuberes ved væreIsetemperatur i 10 minutter i nærvær av 10 mM MeHgOH (Alfa) for å hjelpe til med utfoldingen av sekundærstruktur. Deretter tilsettes følgende bestanddeler:

(3-mercaptoethanol inntil 28 mM; RNasin (Biotec Inc.)

1 enhet/pl sluttreaksjonsvolum; 75 mM Tris-base pH 8,3; 6 mM MgCl2; 50 mM KC1; 10 ug oligodeoxythymidin (°dTi2~18'

Collaborative Research); 100 uCi a-<32>P-dCTP (Amersham);

dGTP, dTTP og dATP inntil 500 pm hver; dCTP inntil 250 um (alle nucleotider fra P. L. Biochemicals, oppløst til 20 mM i 10 mM Tris-base pH 8 og nøytralisert med 1,0 M NaOH) og revers-transkriptase (Life Sciences Inc.) 1 enhet/ug input-RNA, i et sluttreaksjonsvolum på 50 ul. Reaksjonsbland-

•<>> ingen fikk inkubere i 60 minutter ved 42 oC.

(B) Syntese av første kjede ved å bruke spesifikke 15-mer-oligonucleotider som primere (se Panabieres, F. et

al., Gene, vol. 19, s. 321-6 (1982) med hensyn på generelt analoge fremgangsmåter).

Oppnåelse av en fullstendig cDNA-kjede som koder for TPA fra mRNA med oppstarting fra 3'-polyA-halen, er ikke alltid mulig under anvendelse av fremgangsmåten ovenfor. Ved å starte opp med en sekvens oppstrøms fra polyA-halen er det mer sannsynlig at man får en sekvens av 5<1->TPA-kodende cDNA som kan knyttes sammen med en ufullstendig cDNA som ble initiert i polyA-halesekvensen.

Tre pentadecamerer er foretrukket for bruk enten som søkere eller som primere for cDNA-syntese. Sekvensene til disse er:

De syntetiseres og renses ved hjelp av tidligere beskrevne fremgangsmåter.

25 ug polyA<+->selektert RNA inkuberes med 1 ug primer (5-10 ganger picomolart overskudd av primer i forhold til templat) og 1,5 mM EDTA i 58 ul ved 90°C. Blandingen fikk ekvilibrere sakte til -værelsetemperatur ved nedsenkning i et 5 ml vannbad oppvarmet til 90°C ved start. Etter herding av pentadecameren til RNA-templatet tilsettes følgende reagenser: dithiothreitol (DTT) inntil 2 mM; RNasin inntil 1 enhet/pl endelig reaksjonsvolum; 100 mM Tris-base,

pH 8,3; 11 mM MgCl2; 50 mM KC1; 100 pCi oc-<32>P-dCTP; 500 pm hver av dGTP, dTTP og dATP; 250 pM dCTP; revers-transkriptase (Life Sciences, Inc.) inntil 1 enhet/ug RNA. Inkubasjon skjer ved 20°C i 3 timer, hvoretter en like stor mengde ytterligere revers-transkriptase tilsettes og reaksjonen får fortsette ved 50°C i 30 minutter. Reaksjonen avsluttes ved hjelp av fenolekstraksjon, og RNA-templatet fjernes ved alkalisk hydrolyse slik som fullstendig beskrevet i Maniatis.

(C) Syntese av den andre kjede.

Den andre kjede syntetiseres i en reaksjonsblanding

bestående av 40 mM KP04 (K-fosfat) pH.7,5; 6,6 mM MgCl2; 1 mM DTT; 500 pm hver av dGTP, dTTP, dATP; 250 pm dCTP;

100 pCi 3H-dCTP (Amersham) og 1 enhet/ug input-RNA av DNA-polymerase Klenow-fragment (BRL) i et sluttvolum på 100 ul. Reaksjonsblandingen inkuberes ved 15°C i 4 timer og kan følges ved overvåking av innlemmingen av <3>H-dCTP. Reaksjonen avsluttes ved fenolekstraksjon, og dobbeltkjedet cDNA feltes ut som beskrevet ovenfor for syntesen av den første kjede med unntak av at NH^Ac tilsettes inntil 2,5 M (i stedet for NaCl inntil 0,3 M) for den første ethanolutfell-ing.

S^ brukes for å fjerne "hårnål"-strukturer. Spa-reaksjonene utføres i henhold til Maniatis. Vellykket eliminering av "hårnåler" bestemmes ved en økning i tellinger av TCA-oppløselig stoff. Reaksjonen avsluttes ved fenol-ekstraks jon slik at utfellingene unngås. De vandige faser slås sammen og fylles direkte på sucrosegradienter som er identiske med de som brukes for fraksjonering av polyA<+->mRNA. Fraksjoner samles opp og analyseres ved oppløsning av 5 pl aliquoter i 10 ml "Aquafluor" scintillasjonsvæske

(New England Nuclear) og måling av både 32 P og 3H. cDNA fra relevante fraksjoner utfelles ved tilsetning av 2 volumdeler ethanol og inkubasjon på tørris i 30 minutter. Bunnfallene pelleteres ved sentrifugering i 15 minutter ved værelsetemperatur i en Eppendorf mikrosentrifuge. Pellets oppløses i steril 0,3 M NaCl, slås sammen og utfelles på nytt. Utfellingene pelleteres og tørkes.

(D) Påhenging av hale og herding av cDNA til vektor-DNA. Homopolymerområder av dCTP tilføyes enzymatisk til

3<1->endene av cDNA-molekylene i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis. Ideelt sett bør 10-30 dCTP-rester adderes for å maksimere kloningseffektivitet.

Vektor-DNA (fremstilt ved fullstendig oppløsning av pBR322 med Pstl og tilsetning av homopolymerområder fra dGTP-rester) er kommersielt tilgjengelig fra New England Nuclear. Vektor-DNA kan også lages ifølge fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis. Fremgangsmåten for herding av cDNA med vektor-DNA er også beskrevet av Maniatis. I korte trekk blandes halepåhengt cDNA med vektor i et 1:1 molart forhold i en 50 ul reaksjonsblanding som inneholder 10 mM Tris pH 7,4; 0,4 M NaCl og 1 mM EDTA. Sluttkonsentrasjoner av DNA varierte mellom 20 og 60 ug/ml. Herding ble utført enten ved: 1) å følge en bestemt fremgangsmåte med inkuba-sjoner bestående av 65°C i 10 minutter, 42°C i 60 minutter og 37°C i 2 timer, og deretter værelsetemperatur i 2 timer, eller 2) inkubasjon ved 65°C i 10 minutter hvoretter vann-badet slås av, og blandingen sakte får ekvilibrere til værelsetemperatur over natten. (E) Kloning og sekvensbekreftelse av full-lengde TPA-cDNA.

Plansjer 4-5.

De cDNA-holdige vektorer innføres i E. coli under anvendelse av transformasjonsfremgangsmåter som allerede er beskrevet. Bakteriene sorteres in situ ved å bruke hybri-diseringsfremgangsmåtene som er beskrevet tidligere.

Ved de kolonihybridiseringene som her er beskrevet, brukes pentadecamerene som også er beskrevet ovenfor, som søkere. For bruk som en hybridiseringssøker fosforyleres

1 ug 15-mer i 50 ul reaksjonsvolum bestående av 70 mM Tris-base (pH 7,6), 100 mM KC1; 10 mM MgCl», 5 mM dithio-

32

threitol og 50 uCi ^ P dATP (P. L. Biochemicals), og 1 U T^ polynucleotidkinase (New England Biolabs). Inkubasjon skjer ved 37°C i 60 minutter. På denne måte kan 15-meren merkes til spesifikk aktivitet på 1 x 10 o cpm pr. ug.

Kloner som oppviser komplementære sekvenser til søkerne, velges ut for sekundær-screening under anvendelse av Pstl-restriksjonsanalyse av klonene for å bestemme om opp-løsningsproduktene er i overensstemmelse med Pstl-restrik-sjonskartet som kan fås fra sekvensen angitt i figur 1, eller Pennica et al., "Cloning and Expression of Human Tissue-type Plasminogen Activator cDNA in E. coli", Nature, vol. 301, s. 214-21 (20. jan. 1983). De ønskelige kloner vil ha en stor del av 3'-delen fra TPA-cDNA. Oppløsning gir 4 fragmenter: den opprinnelige pBR322-vektor, et fragment med 1150 bp, et fragment med 80 bp og et fragment med 78 bp. Disse resultater antyder et innskudd som spenner over ca. 1300 bp av genets 3<1->ende (nucleotider 1250-2550). For å bekrefte denne antagelse dobbeltoppløses klonen med Pstl og Ddel. Det sistnevnte enzymet bør kutte fragmentet med

1150 bp i et fragment med 926 bp og et fragment med 229 bp, mens fragmentene med 78 eller 80 bp forblir intakte. Resultatene av en slik dobbeltoppløsning vil understøtte den konklusjon at klonen virkelig utgjør 3'-enden av TPA-genet.

Som et endelig bevis isoleres et miniprepatat av DNA fra klonen og sekvensbestemmes ved hjelp av dideoxy-kjedeterminering. Minipreparater av plasmid-DNA fremstilles som beskrevet i avsnittet vedrørende generelle metoder. Dideoxy-sekvensering utføres som beskrevet i avsnittet vedrørende generelle metoder under anvendelse av pentadeca-mer nr. 1 som en primer i et 20:1 molart overskudd i forhold til templatet. Sekvensdataene avledet fra denne klon, betegnet pTPA H, er identiske med sekvensdata fremlagt av Pennica et al., Nature, vol. 301, s. 214-21 (1983) for

human vevplasminogenaktivator (plansje 4).

Herfra skal det fokuseres på isolering av 5'-enden til genet. For å gjøre dette syntetiseres cDNA fra dobbelt-selektert polyA<+->mRNA med primer som stikker ut fra penta-decamer nr. li stedet for O^ fl ±2~ 18' Den f°rc^el som oppnås ved denne fremgangsmåten, er dobbel. Etter som priming er spesifikk for TPA, bør for det første en høyere prosent-andel cDNA fremstilt, gi seg utslag i TPA-spesifikke sekvenser. Priming skjer for det andre ca. 800 bp 5' fra polyA-halen, setet som benyttes av odTi2~18 ^or a starte °PP syntese av den første kjede. Dette sikrer praktisk talt at den cDNA som avledes fra denne fremgangsmåte, vil omfatte transkripter som strekker seg lengre 5' enn pTPA H.

Transformasjonseffektivitet med denne TPA-oppstartede cDNA er 2,5 x 10 5 transformanter pr. ug cDNA. To samlinger med tilsammen 25.000 transformanter genereres. Konseptet med "gen-vandring" anvendes for med hvilke å gi en skjevhet i screeningen. Det pTPA H 5'-terminale 80 bp Pstl-fragment gelisoleres og brukes til å søke gjennom 28.000 kolonier avledet fra de primerforlengede samlinger. Dette selekterer spesifikt for kloner som er forlenget minst så langt 5' som pTPA H, og som et resultat av fremgangsmåten med primer-forlengelse, også kloner som inneholder ytterligere 5'-sekvenser.

Screeningen ved hjelp av in situ hybridisering gir

et antall positive resultater. Det lengste TPA-innskudd påvises i sekundær screening med Pstl og Ddel. I denne oppfinnelse omfattet klonen betegnet pTPA80-l, et innskudd som spente over nucleotidene 550-1600 (plansje 4).

Restriksjonsdataene gjør det mulig å bestemme ganske nøyaktig (+/- ~10%) posisjonen til 3'-enden. Dersom priming begynner ved nucleotid 175 9 og pTPA80-l har en 3'-ende omtrent ved posisjon 1600, oppstår det et tap på omtrent 160 basepar et eller annet sted under kloningen. S1~endo-nucleasen er den mest sannsynlige årsak til tapet.

Orienteringen av pTPAH og pTPA80-l bestemmes. Plasmider pTPAH og pTPH80-l kuttes med SacI og Pvul, hvorved man får fragmentene 7 (1251 bp) og 8 (5,1 kb) som gelisoleres. Fragmentene behandles med bakteriell alkalisk fosfatase og ligeres under anvendelse av T4-polymerase, hvorved man får pTPA3'-cDNA (6,3 kb) med posisjonene 550 til 2230 baser av TPA-cDNA-en. Den nye konstruksjonen verifiseres ved hjelp

av Pstl-oppløsning.

Ettersom pTPA80-l representerer det lengste TPA-innskudd blant de positive resultatene påvist i de første primerforlengede samlinger, brukes et andre oligonucleotid som er komplementært med den kodende sekvens for aminosyre-restene 233-237 (nucleotider 886-900; 15-mer nr. 2), til å generere en annen cDNA-samling for å komplettere 5'-enden. Dette bestemte område av genet velges slik at dersom S^ skulle fjerne til og med så mye som 200 bp fra 3<1->enden av transkriptet, vil likevel tilstrekkelig overlapping med pTPA3'-cDNA foreligge til å muliggjøre sammensetning av fragmentene.

Den cDNA som inneholder 5'-basene, ble ligert til Pstl-spaltet pBR322 og transformert inn i E. coli som beskrevet ovenfor. Transformasjonseffektivitet med denne cDNA er i størrelsesorden 3,6x10 4 transformanter/ug cDNA.

Kolonier fra denne samling undersøkes med et oligonucleotid som er komplementært til kodende sekvens som strekker seg fra nucleotidene 645-660 (15-mer nr. 3), og utvetydige, positive kolonier velges ut. Sekundærscreening utføres ved Pstl- og Bglll-spalting, og en klon, betegnet pTPA5'cDNA,

ble påvist å inneholde de gjenværende 5'-sekvenser 1-750. Igjen er virkningene av S.^ på innskuddslengde åpenbar med pTPA5'cDNA. Mens priming initieres ved nucleotid 886, strekker pTPA5<1>cDNA seg bare til ca. nucleotid 750; vårt arbeide viste et tap på ca. 136 bp.

Med hele TPA-sekvensen tilgjengelig på to kloner (pTPA3'cDNA og pTPA5<1>cDNA) gjenstår sluttoppgaven med sammensetning. Strategien er skissert i plansje 5.

Plasmid pTPA5'cDNA kuttes med Taql hvorved man får fragment 9 (2194 bp). Et Taql-sete i TPA-sekvensen i pTPA5'cDNA (posisjon 634) er svært enzymresistent. Fragment 9 kuttes med Bglll og Hgal hvorved man får fragment 10

(405 kb) med baser 188 til 593 fra TPA-cDNA som utgjør den

ferdige del av proteinet.

Midtdelen av TPA-cDNA fås ved først å kutte pTPA3'cDNA med PuvII og EcoRI slik at fragment 11 (1748 bp) isoleres. Fragment 11 kuttes så med Hgal hvorved man får fragment 12 (209 bp) som inneholder basene 594 til 802.

For å oppnå 3<*->delen av cDNA oppløses pTPA3'cDNA

med Pvul og det 6,3 kb store fragmentet isoleres, behandles med T4-polymerase og oppløses delvis med EcoRI hvorved man får fragment 13 (1871 bp) som inneholder basene 802 til 2230.

Ligeringen av de tre delene av cDNA omfatter bruken av pKC7 som er ålment tilgjengelig og fullstendig beskrevet i Rao, R.N., og Rogers, S.G., Plasmid pKC7: a vector containing ten restriction sites suitable for cloning DNA segments, Gene 7:79-82 (1979). Plasmid pKC7 oppløses med Bglll og Smal og behandles med bakteriell alkalisk fosfatase hvorved man får fragment 14 (4,8 kb) som gelisoleres.

Fragmentene 10, 12, 13 og 14 ligeres i en eneste ligeringsblanding. Et aspekt ved denne strategi som er verdt å legge merke til, er midlene hvorved behovet for behandling av det indre fragment med alkalisk fosfatase unngås .

Typisk gir ligeringer med flere stykker (> 4 fragmenter) den ønskede konstruksjon med svært lav effektivitet på grunn av sammenkjeding av fragmentene. Behandling med alkalisk fosfatase på passende måte minimaliserer dette problem, noe som resulterer i en sterk økning i effektivitet av korrekt sammensetning av flere stykker. Ved sammensetning av TPA-fragmentene trakk vi fordel av den unike måte som restriksjonsendonucleasen, Hgal, kutter DNA på. Enzymets gjenkjenningssekvens (bindende sekvens) er GACGC, men enzymet kutter i et punkt utenfor denne gjenkjenningssekvens. Som et resultat av dette vil fragmenter kuttet med Hgal, ligere bare med sin opprinnelig tilgrensende motpart. Selv-ligering fremmet ved hjelp av Hgal-overhenget, kan ikke skje. TPA-ligeringen av 4 stykker inneholder to fragmenter som bærer en Hgal-ende. Det i tillegg til behandling av vektoren med alkalisk fosfatase (for å minimalisere selv-lukning), resulterer i de fleste av transformantene som bærer det korrekt sammensatte TPA-gen. Korrekt sammensetning verifiseres ved restriksjonsoppløsningene. Plasmidet som inneholder den fullstendige cDNA-sekvens for TPA, betegnes pTPAcDNA (7,4 kb).

EKSEMPLER

Eksempel 1. Fremstilling av syntetiske oligonucleotider. 87 separate oligonucleotider (figur 3) ble syn-tetisert i henhold til fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor. Den beskrevne strategi vil sette sammen de 1084 basepar med syntetisk DNA mellom Bglll-setet i posisjon 187 og EcoRI-setet i posisjon 1287 til pTPA-Bl,2,3 (plansje 9). De spesifikke restriksjonsseter valgt for innføring i interdoméneområdene, er vist i plansjene 10 og 11. Hver blokk rekombineres med en egnet kloningsvektor for replikasjon i E. coli, og for verifisering av sekvensen. All anvendt ligerings- og kloningsmetodikk er som beskrevet av Maniatis et al. supra. Alle klonede sekvenser sekvenseres ved å bruke dideoxy-sekvenseringsteknikken til Sanger for å verifisere sekvensen.

Blokk 1. Oligonucleotidene P1-P4, P8-P11 ble herdet og ligert, hvorved det ble dannet et dobbeltkjedet segment som ligeres til et andre segment bestående av oligonucleotidene P5-P7 og P12-P14. Den resulterende blokk 1 inneholder sekvensen som koder for finger-doménet. Blokk 1 klones inn i Bglll- og Sphl-setene til pSK4 beskrevet i fremstilling 1.

Blokk 2. Oligonucleotidene P15-P18 og P19-P23 som inneholder sekvensen som koder for finger-doménet, ligeres sammen i en éntrinns herding og ligering til blokk 2 og klones inn i SphI- og Clal-setet til pBR322.

Blokk 3. Oligonucleotidene P24-P28, P34-P38 herdes og ligeres til et dobbeltkjedet segment som ligeres til et andre segment bestående av oligonucleotidene P29-P33 og P39-P43. Den resulterende blokk 3 inneholder sekvensen som koder for "kringle l"-doménet. Blokk 3 klones inn i Clal-og BamHI-setene til pBR322.

Blokk 4. Oligonucleotidene P44-P47 og P67-P70; P48-P51 og P71-P74; P52, P53, P92, P93 og P75, P76, P94, P95; P57-P61 og P80-P84; og P62-P66 og P85-P89 ble hver herdet i 5 separate rør til dobbeltkjedede segmenter som deretter slås sammen og ligeres slik at blokk 4 dannes.

Blokk 4 inneholder DNA-sekvensen som koder for "kringle 2"-doménet. Blokk 4 klones inn i BamHI- og EcoRI-setene til pBR322.

Eksempel 2. Sammensetning av blokkene 1-4 med det aktive setet til TPAcDNA. Plansjene 6-11.

Følgende eksempler gir en oppsummering av trinnene som trengs til å sette sammen de forskjellige syntetiske blokkene ifølge eksempel 1 til et gen som er i stand til å kode for en biologisk aktiv TPA. To prototypegener er beskrevet. Plasmidet pTPA-Bl,2,3,4(a) har et gen som koder for TPA og som ikke har noen kunstig innførte endonuclease-seter mellom "kringle 2"-doménet og det aktive setet. Plasmid pTPA-Bl,2,3,4 har et gen som koder for TPA og som har kunstig innførte endonuclease-restriksjonsseter mellom "kringle 2" og det aktive setet.

A. Konstruksjon av pTPA-Bl. Plansje 6.

Plasmid pSK4 oppløses med Clal og SphI, og det store 4,1 kb fragment 15 isoleres og ligeres til "blokk ^'-fragmentet ved å bruke en Clal/Xbal-kobler. Ligeringsblandingen transformeres inn i HB101 ved å bruke calciumklorid-transformasjonsfremgangsmåten beskrevet av Maniatis. Transformantene undersøkes med "nick"-translaterte "blokk 1"-fragmenter under anvendelse av "nick"-translasjonsfremgangs-måten beskrevet av Maniatis et al. Transformantene som hybridiserte til søkeren, ble deretter sekvensbestemt ved å bruke dideoxy-sekvenseringsteknikken til Sanger for å verifisere den korrekte sekvens og orientering. Denne nye trans-formant er betegnet pTPA-Bl (4,25 kb).

B. Konstruksjon av pTPA-Bl,2. Plansje 7.

Plasmid pTPA-Bl oppløses med EcoRI og SphI, og fragment 16 (450 bp) isoleres. Plasmid pBR 322 oppløses med EcoRI og Clal, og det store fragment 17 (4,35 kb) gelisoleres. Fragmentene 16 og 17 ligeres så til den syntetiske SphI/ClaI-"blokk 2". Ligeringsblandingen transformeres inn

i HB101, og transformantene undersøkes med "nick"-translatert blokk 2. Transformanter som hybridiserer til søkeren, sekvensbestemmes for å bekrefte at de inneholder blokk 2 i dens korrekte orientering. Denne konstruksjon betegnes pTPA-Bl,2 (4,8 kb).

C. Konstruksjon av pTPA-Bl,2(a). Plansje 8.

Plasmid pTPA-Bl,2(a) inneholder Hindlll- og Bglll-restriksjonsseter oppstrøms fra finger- og vekstfaktordoménene. Plasmid pTPA-Bl,2 oppløses med Xbal og EcoRI, og det store 4,5 kb fragment 18 gelisoleres og ligeres til en oligonucleotidkobler som inneholder et Hindlll- og Bglll-sete. Ligeringsblandingen transformeres inn i HB101, og transformantene undersøkes med hensyn på tilstedevær-

else av Hindlll/Bglll-setene. Den nye konstruksjon betegnes pTPA-Bl,2(a) (4,5 kg).

D. Konstruksjon av pTPA-Bl,2,3. Plansje 9.

Plasmid pTPA-Bl,2(a) oppløses med Clal og BamHI, og det store 4,0 kb fragment 19 isoleres. Dette fragment ligeres til det syntetiske ClaI/BamHI-"kringle l"-området som omfatter blokk 3 (270 bp) og transformeres inn i HB101. Transformantene ble undersøkt med "nick"-translatert

blokk 3. Transformantene som hybridiserer til blokk 3, ble sekvensbestemt for å bekrefte sekvensen og orienteringen. Denne nye konstruksjon betegnes pTPA-Bl,2,3 (4,3 kb).

E. Konstruksjon av pTPA-Bl,2,3,4a. Plansje 10.

Dette plasmid inneholder et helt prototype-TPA-gen som koder for en TPA-analog med enzymatisk aktivitet. I dette genet er det ingen endringer i interdoméne-området mellom "kringle 2" og det aktive sete. Konstruksjon av pTPA-Bl,2,3,4a (4,2 kb) krever flere trinn. Plasmid pTPAcDNA (plansje 5) kuttes med Seal, og fragment 20 (6,0 bp) som koder for 3'-enden til TPA-genet, gelisoleres.

Plasmid pTPA-Bl,2,3 (plansje 9) kuttes med Seal og BamHI, hvorved det fås fragment 21 (1100 bp) som inneholder finger-, vekstfaktor- og "kringle l"-doménene. Et tredje fragment 4a

(230 bp) fås ved å kutte blokk 4 med BamHI og Seal. De tre fragmentene ligeres ved å bruke T4-ligase hvorved det fås pTPA-Bl,2,3,4<*>. TPA-genet kuttes ut fra pBR322 ved å bruke Hindlll og Aatll, hvorved det fås et 2,2 kb fragment som subklones inn i pUC-19. Plasmid pUC-19 er kommersielt tilgjengelig fra en rekke kilder og inneholder et utvalg av restriksjonsseter i DNA-sekvensen som gjør TPA-doméne-manipulering mindre brysom.

F. Konstruksjon av pTPA-Bl,2,3,4. Plansje 11.

Dette plasmid inneholder et helt prototype-TPA-gen som koder for en enzymatisk aktiv TPA-analog. I denne analogen er alle 4 doménene og det aktive setet til stede med unike restriksjonsseter bygd inn i alle interdoméneområdene, inkludert området mellom "kringle 2" og det aktive setet. Plasmidet konstrueres ved først å kutte pTPA-Bl,2,3,4a med EcoRI og BamHI og isolere det store 3,7 kb fragment som inneholder finger-, vekstfaktor, og "kringle 1"-doménene. Den syntetisk dannede blokk 4 fås fra sin klon gjennom en oppløsning med BamHI og delvis oppløsning med EcoRI, hvorved man får intakt blokk 4 med 560 kb. De to fragmentene ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pTPA-Bl,2,3,4.

Plasmid pTPA-Bl,2,3,4a og pTPA-Bl,2,3,4 kan brukes til å konstruere en rekke syntetiske TPA-analoger.

Eksempel 3. Konstruksjon av TPA-analoger.

A. Konstruksjon av pFKlK2A (fjerning av vekstfaktor-doménet).

Plasmid pTPA-Bl,2,3,4a oppløses med EcoRV og delvis med Hpal for å oppløse setet ved 334, men ikke ved 724.

Det store fragment (4,1 kb) isoleres og religeres, hvorved pFKlK2A dannes. Plasmid pFKlK2A transformeres så inn i HB101 eller en eller annen egnet vert. Plasmidet undersøkes så med hensyn på korrekt orientering og sekvens.

B. Konstruksjon av pFK2A (fjerning av vekstfaktor-og "kringle l"-doménet).

Plasmid pTPA-Bl,2,3,4 oppløses med Hpal. Det store 3,9 kb fragment isoleres og religeres, hvorved pFK2A dannes. Plasmidet transformeres inn i HB101 eller en eller annen egnet vert og undersøkes med hensyn på korrekt orientering

og sekvens.

C. Konstruksjon av pFK2K2A. Plansje 12 (fjerning av vekstfaktor- og "kringle l"-doménet og duplisering av "kringle 2").

Plasmid pTPA-Bl,2,3,4 (plansje 11) oppløses med Hpal, hvorved det fås fragment 22 (3,9 kb) som isoleres. En andre prøve av pTPA-Bl,2,3,4 oppløses med Hpal og Mstl, og det resulterende 250 bp fragment 23 som inneholder "kringle 2"-domenet, isoleres. Det Hpal-oppløste FK2A-fragment butt-ende-ligeres til Hpal/Mstl-fragmentet, hvorved pFK2K2A fås (4,1 kb). Plasmid pFK2K2A transformeres så til HB101

og undersøkes med hensyn på korrekt orientering og korrekt sekvens.

D. Ekspresjon i E. coli. Plasmid pTPAExpl.

Plansje 13.

Ekspresjon av TPA-analoger kan utføres i E. coli

ved å bruke ekspresjonsplasmidet pTPA-Bl,2 illustrert i plansje 7, pTPA-Bl illustrert i plansje 6, eller ekvivalenter derav. Hvilken som helst av analogene kan plasseres i Xbal- og BamHI-setene for ekspresjon. For å uttrykke pFK2K2A i E. coli, kuttes både pTPA-Bl,2 (plansje 7) og pFK2K2A (plansje 12) med Xbal og BamHI, og fragmentene 24 (4,2 kb) og 25 (2,0 kb) gelisoleres. Fragmentene 24 og 25 ligeres slik at ekspresjonsplasmid pTPAExpl (6,2 kb) dannes.

Plasmid pTPAExpl inneholder en Trp-promoter og -operator, og ekspresjonen er vesentlig. Dyrking av E. coli skjer i henhold til Maniatis (ovenfor). E. coli-kulturene vil ikke danne aktiv TPA. Den TPA som dannes av E. coli,

må refoldes til sin naturlige tilstand. Ved å følge kjente fremgangsmåter for cystein-rekonstruksjon kan man oppnå aktiv TPA. Se US patentskrift nr. 4.511.502.

Eksempel 4. Ekspresjon i eukaryoter.

A. Ekspresjon av human TPA i gjær.

Dette eksempel illustrerer konstruksjonen av gjær-ekspresjonsplasmid pal-FK2K2A som har en MFocl-promoter og pre-pro-sekvenser. Dyrkingsbetingelser og foretrukne vert-stammer tilveiebringes også for ekspresjon av TPA-analoger i gjær. (1) Konstruksjon av pal-ADHt, en gjærekspresjonsvektor.

Plasmid, pal-ADHt, er en flerformåls ekspresjonsvektor for gjær. Restriksjonssetene i passende punkter er blitt bygd inn i strukturen dens, og kontroll under MFal-promoteren er vanligvis forenlig med høye nivåer av ekspresjon. De følgende trinn beskriver konstruksjonen av pal-ADHt. (Plansjene 14-18).

a. Konstruksjon av pYRep3'b. Plansje 14.

Plasmid pYRep3'B konstrueres ved å plassere REP III og replikasjonsopprinnelsessekvensene til 2u-plasmidet inn i Smal-setet til URA3-genet fra pYIP31, hvorved en passende kassett dannes. Begge plasmidene, 2u og pYIP31, er ålment tilgjengelige og fullstendig beskrevet i litteraturen. 2u-plasmidet ble fullstendig beskrevet av J.R. Broach i Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae [Life cycle and inheritance], s. 445-470 og RepIII-området er beskrevet i Cell, 34:95-104 (1983) og Cell, 35:487-493

(1983). Plasmid pYIP31 ble beskrevet i Gene, 18:17-24

(1979) .

Plasmid pYIP31 kuttes først med Smal og behandles med bakteriell alkalisk fosfatase, hvorved det fås fragment 26 (5,4 kb) som isoleres. 2u-plasmidet fra gjær kuttes med Pstl og Xbal, fylles igjen med Klenow, og fragment 27

(1,3 kb) isoleres. Fragmentene 26 og 27 ligeres ved å bruke T4-DNA-ligase, hvorved det fås pYRep3'B (6,7 kb).

b. Konstruksjon av pADHt. Plansjene 15-16.

Plasmid pADHt (3,86 kb) kan anvendes fordi det gir nyttige restriksjonsseter til å sette sammen en gjæreks-pres jonsvektor .

Utgangsplasmidet for konstruksjon av pADHt er pGG400 (4,0 kb). Plasmid pGG400 konstrueres fra plasmidene pBR322 og pML21 som er lett tilgjengelige for publikum.

J. Bacter., 126:447-453 (1976). Nærmere bestemt erstattes genet i pBR322 som koder for tetracyclinresistens, med et avsnitt av pML21 som koder for kanamycinresistens. Plasmid pBR322 kuttes først med EcoRI og PvuII, og EcoRI-overhenget fylles igjen med Klenow-enzym og isoleres fra en agarosegel, hvorved fragment 28 (2,3 kb) fås. Plasmid pML21 kuttes med PvuII, hvorved man får fragment 29 (1,7 kb) som bærer genet for resistens mot kanamycin. Ligeringen av et PvuII-kuttet sete med et igjenfylt EcoRI-sete vil regenerere EcoRI-setet etter ligering. Ligeringen av fragmentene 2 8

og 29 gir pGG400 som brukes til å konstruere pADHt (plansje 15).

Plasmid pADHt konstrueres ved å kutte pGG400 med PvuII og Xhol og behandle med Klenow-enzym, hvorved man får fragment 30 (3,5 kb) som isoleres. 3'-enden til gjær-alkoholdehydrogenase I (ADHI) fås fra pADHBC ved først å kutte med HincII og BamHI, behandle med T4-polymerase og isolere fragment 31 (0,36 kb). Plasmid pADHBC er ålment tilgjengelig og fullstendig beskrevet i J. Biol. Chem. 257:3018-1025 (1982). Fragmentene 30 og 31 ligeres for å få pADHt blant andre og transformeres inn i E. coli. De transformantene som bærer pADHt, vil ha regenerte BamHI- og Xhol-seter i plasmidene sine. Disse transformantene velges ut, og autentisiteten til den klonede ADHI 3<1->ende bekreftes ved restriksjonsenzymanalyse og ved sekvensering (plansje 16). C. Konstruksjon av pADHt-REPIII. Plansje 17.

Plasmid pADHt-REPIII (6,2 kb) er en konstruksjon av pADHt og pYRep31B hvor URA3-REPIII-ori-kassetten er plassert inn i pADHt for å lette ekspresjon og replikasjon i gjær. Plasmid pADHt-REPIII kan anvendes til konstruksjon av ekspresjonsvektorer i gjær ettersom EcoRI-Hindlll-

eller EcoRI-Smal-fragmentene kan erstattes med et ønsket DNA-fragment som bærer passende gjærpromoterer, eller det

kan brukes til å tilveiebringe et Sall-XhoI-fragment som bærer et opprinnelsessted for replikasjon, en selekterbar markør og 3<1->enden til gjær-URA3-genet.

Plasmid pADHt modifiseres ved å kutte med BamHI, fylle igjen endene med Klenow-enzym og innføre en 8-mer Sall-kobler i det igjenfylte BamHI-sete. Plasmid pADHt (modifisert) kuttes med SphI, og endene fylles igjen med T4-polymerase, hvorved man får fragment 32 (3,8 kb). Plasmid pYRep3lB kuttes med Hindlll, og fragment 33 (2,4 kb) isoleres og inneholder 3<1->enden til URA3 og 2u-RepIII-området som antas å øke stabiliteten og replikasjonsopp-rinnelsen. Fragmentene 32 og 33 ligeres, og E. coli-transformantene med plasmider med en orientering av URA3-genet som muliggjør transkripsjon i retning med urviseren, under-søkes for å oppnå pADHt-REPIII.

d. Konstruksjon av pal-ADHt. Plansje 18. Konstruksjon av pal-ADHt (6,5 kb) fullføres ved å erstatte EcoRI-HindIII-fragmentet i pADHt-REPIII med EcoRI-HindIII-fragmentet fra pal som inneholder promoteren og pre-pro-sekvensen til MFal-genet. Plasmid pal er fullstendig beskrevet av A.singh, et al., Nucleic Acid Research, 11:4049-63 (1983) og J. Kurjan, et al., Cell, 30:933-943

(1983). Plasmid pADHt-REPIII kuttes først med EcoRI og

Hindlll, hvorved man får fragment 34 (5,3 kb) som isoleres. Plasmid pal kuttes også med EcoRI og Hindlll, hvorved

man får fragment 35 (1,2 kb) som isoleres. Fragmentene 34 og 35 ligeres så ved å bruke T4 DNA-ligase, hvorved man får pal-ADHt. (2) Konstruksjon av pal-FK2K2A. Innføring av den TPA-analoge cDNA i en gjærekspresjonsvektor. Plansje 19.

Den foretrukne ekspresjonsvektor for fremstilling av TPA-analoger i gjær betegnes pal-FK2K2A som har en MFal-promoter. Plasmid pFK2K2A (plansje 12) kuttes med Bglll, hvorved man får fragment 36 (2,0 kb) som gelisoleres. Plasmid pal-ADHt kuttes med Hindlll og Xhol, hvorved man får fragment 37 (5,6 kb) og tilveiebringer transkripsjons-, polyadenylerings- og translasjonssetene. Systemet som her er beskrevet, vil terminere nedstrøms fra det fullstendige TPA-protein, og det resulterende produkt vil ha noen få ytterligere aminosyrer av gjæropprinnelse. For å avslutte translasjon nøyaktig ved enden av TPA-genet, kan man tilveiebringe et termineringskodon.

For å sikre at analogen er i fase med avlesningsrammen til MFa-pre-pro-sekvensene, er 5'- og 3'-endene til analogene uendret. Bglll-setet i 5'-enden kan manipuleres enten ved å innføre en annen kobler eller ved en kombinasjon av Klenow (Pol I) og mangobønnenuclease for å danne et Hindlll-sete mens avlesningsrammen opprettholdes i fase med MFal-'pre-pro'-sekvensene. For dette eksempel igjenfylles Bglll-setet i fragment 37 delvis ved å bruke Klenow sammen med adenosin og guanosin. Det delvis igjenfylte sete gjøres deretter butt med mangobønnenuclease og ligeres til Hindlll-setet i pal-ADHt. Fragmentene 36 og 37 (med den delvis igjenfylte ende) ligeres, hvorved man får pFK2K2A (7,6 kb). Andre analoge TPA-gener kan også innføres med butt ende i ekspresjonsvektoren så lenge avlesningsrammen holdes i fase med gjærsekvensene.

(3) Ekspresjon av TPA-analog fra plasmid pal-FK2K2A

i gjær.

Gjærstamme YNN277 (a,ura3-52 trpl-289) transformeres med pal-FK2K2A. Transformantene dyrkes i glucoseminimal-medium (2% glucose, 0,7% gjær-nitrogenbase, 1% casamino-syrer, 40 ug/ml adenin, 50 ug/ml tryptofan) i 10 timer. Cellene pelleteres så ut ved sentrifugering. Cellene lyseres ved vortex-behandling med glasskuler. TPA-mengder kan påvises ved å bruke Western flekkteknikker eller radioimmunologisk analyse, eller den enzymatiske analyse med kasein i agar beskrevet tidligere for xenopus-oocytter.

TPA kan isoleres fra gjærceller ved først å lysere cellene med 0,5 mm glasskuler etterfulgt av rensing på en affinitetskolonne. Standard proteinrensingsfremgangsmåter kan brukes for å bevirke ytterligere rensing.

B. Ekspresjon av TPA-analoger i livmorceller fra

kinesisk hamster. Plansjene 20-22.

Følgende eksempel illustrerer den foretrukne fremgangsmåte for å uttrykke pFK2K2A i livmorceller fra kinesisk hamster (CHO). I korte trekk er det her beskrevet en "ferge"-vektor pSVC0W7 som replikerer både i CHO- og E. coli-celler, idet ampicillinresistens og -dehydrofolat-reduktasegener benyttes som markører i hhv. E. coli- og CHO-celler. Plasmid pSVC0W7 tilveiebringer også polyadenyleringssekvensen fra bovint veksthormon som er nødvendig for ekspresjon i CHO-celler. Plasmid pSVC0W7 spaltes først, og en viruspromoter og TPA-analogen innføres. Transforma-sjonskulturbetingelser og ekstraksjonsfremgangsmåter for TPA uttrykt i CHO-celler, er også beskrevet nedenunder. (1) Konstruksjon av pSVC0W7. Plansje 20.

Utgangsplasmidet pSV2dhfr (tilgjengelig fra American Type Culture Collection eller fremstilt ifølge fremgangsmåten til S. Subramani, et al., "Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology, 2:854-864 (sept. 1981), oppløses med BamHI og EcoRI, hvorved man får fragmentet 38 (5,0 kb) som inneholder ampicillin-resistensgenet, SV40-opprinnelsesstedet og dhfr-genet.

Den andre delen av pSVC0W7 fås fra plasmid pAGH2R2 som oppløses med de samme restriksjonsendonucleasene som brukes til å spalte pSV2dhfr for å oppnå fragment 39 som inneholder 3'-enden av bovint genom-veksthormongen, dvs. BGH-gDNA. Plasmid pAGH2R2 er ålment tilgjengelig fra en E. coli HB101-vert som er deponert ved Northern Regional Research Labor-tories i Peoria, Illinois (NRRL B-15154). Fragmentene 38 og 39 ligeres, hvorved man får pSVC0W7 (7,1 kb). (2) Konstruksjon av pTPA-cDNA,BamHI. Plansje 21.

For på en lettvint måte å innføre en TPA-analog i PSVC0W7, er det nødvendig å innføre et passende BamHI-sete

i ledersekvensen til TPA som er oppstrøms fra den fullstendige proteinsekvens. For å oppnå dette kuttes pTPA5<1>cDNA

(plansje 5) med Hgal, og fragment 40 (517 bp) som inneholder basene 78 til 593, jevnes ut med Klenow-enzym. De jevne endene ligeres til en 10-mer BamHI-kobler, og fragment 40 kuttes med Narl, hvorved man får fragment 41 med basene 68 til 521 fra TPA-cDNA-en.

Plasmid pTPA-cDNA (plansje 5) kuttes med Narl og Bglll, og fragment 42 (1644 bp) som inneholder 3'-delen av TPA-cDNA, gelisoleres. Fragmentene 41 og 42 ligeres til fragment 43 (4,3 kb) som skriver seg fra en BamHI- og Bglll-oppløsning av pKC7, hvorved man får pTPA-cDNA,BamHI (6,5 kb).

(3) Konstruksjon av pTPA-IE-PA. Plansje 22. Plasmid pTPA-IE-PA som inneholder en TPA-modifisert cDNA med det naturlig forekommende arrangement av TPA-doméner, er i stand til å bli uttrykt ved hjelp av CHO-celler, eller er i stand til å bli brukt til å lette konstruksjonen av alternativt ekspresjonsplasmid som inneholder TPA-analoger. Sammensetningen av pTPA-IE-PA utføres i to trinn. Først innføres TPA-cDNA-en fra pTPA-cDNA i pSVC0W7, og deretter innføres den nærmeste tidligere promoter til cytomegalovirus for å initiere transkripsjon av TPA-analogen. TRINN 1. Plasmid pSVC0W7 kuttes med EcoRI og PvuII, og fragment 44 (600 bp) fås som inneholder polyadenyleringssekvensen til bovint veksthormon som strekker seg fra PvuII-setet i exonet nærmest 3'-enden i BGH-genet, til EcoRI-setet nedstrøms fra 3'-enden. For en fullstendig om-tale av BGH-polyadenyleringssekvensen vises det til følg-ende litteraturreferanser: (1) europeisk patentsøknad nr. 0112012, publisert 27. juni 1984, hvor identifikasjonen og karakteriseringen av bGH-genom-DNA er beskrevet, (2) Woychik, R.P. et al., "Requirement for the 3' Flanking Region of the Bovine Grbwth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:3944-3948 (juli 1984) og D.R. Higgs, et al., Nature 306:398-400 (24. november 1983), samt henvisninger angitt i disse.

En andre prøve av pSVC0W7 kuttes med EcoRI og

BamHI, hvorved man får fragment 45. Fragment 45 kan alternativt avledes fra EcoRI/BamHI-fragmentet fra opphavsplasmid pSV2dhfr som er tilgjengelig fra Bethesda Research Labora-tories. Fragment 45 inneholder opprinnelsesstedet for replikasjon fra pBR322 og et ampicillinresistensgen uttrykt i E. coli som muliggjør seleksjon av plasmidet i E. coli. Fragmentet inneholder også dehydrofolatreduktase-cDNA fra

mus i en konstruksjon som muliggjør ekspresjon i pattedyrceller. Subramani, et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864

(1981).

TPA-cDNA fås fra fragment 46 (1,9 kb) som fås fra kutting av pTPA-cDNA,BamHI med BamHI og Ball. Fragment 46 inneholder hele det kodende område fra tPA-cDNA. BamHI-kuttet er i cDNA som koder for de 5<1->utranslaterte sekvenser i mRNA-en, og Ball-kuttet er i cDNA som koder for det 3'-utranslaterte område i cDNA-en.

Fragmentene 44, 45 og 46 ligeres under dannelse av pTPA-PA (8,4 kb) som er en replikasjonsvektor med evne til å pendle mellom E. coli- og CHO-celler. Plasmid pTPA-PA transformeres inn i E. coli.

TRINN 2. I trinn 2 omdannes pTPA-PA til ekspresjonsplasmid pTPA-IE-PA ved innføring av den nærmeste tidlig-gen-promoter fra humant cytomegalovirus (CMV-I.E.-promoter). CMV-I.E.-promoteren fås fra Pstl-oppløsningen av CMV-genomet. Res-triks jonsendonuclease-spaltningskartene for området i det humane cytomegalovirusgenom som inneholder det viktigste nærmeste tidlig-gen (CMV-I.E.), er blitt inngående beskrevet (Stinski, et al., J. Virol. 46:1-14, 1983; Stenberg, et al., J. Virol. 49:190-199, 1984, og Thomsen, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:659-663, 1984).

Disse litteraturhenvisninger beskriver et 2,0 kilobaser Pstl-fragment som inneholder promoteren for det viktigste, nærmeste tidlig-gen blant sine sekvenser. CMV-I.E.-promoteren kan videre isoleres ved isoleringsoppløsning av dette 2,0 kb Pstl-fragment med Sau3AI, hvorved det fås et ønsket 760 basepar fragment blant produktene. Dette fragment med 760 basepar kan skjelnes fra de øvrige produktene ved sin størrelse og ved tilstedeværelsen av et Sacl-spaltningssete og et Ball-spaltningssete i fragmentet. På grunn av dets lettvinte identifisering er anvendelse av dette Sau3AI-fragment den foretrukne fremgangsmåte å bruke CMV-I.E.-promoteren, slik som beskrevet i foreliggende beskrivelse .

Plasmid pTPA-PA, konstruert i trinn 1, spaltes med BamHI, og et Sau3AI-fragment som inneholder den nærmeste tidlige promoter fra DMV, ligeres inn i BamHI-setet. Plasmider som inneholder CMV-promoterfragmentet i en slik orientering at transkripsjon fra promoteren vil syntetisere en mRNA for TPA, identifiseres ved spalting av plasmidene med Sacl. Det resulterende plasmid betegnes pTPA-IE-PA med CMV-I.E.-promoteren i 5'-enden til TPA-cDNA-en og bGH-polyadenyleringssignalet i sin 3'-ende. (4) Konstruksjon av pTPA-IE-FK2K2A. Plansje 23.

Konstruksjonen av pTPA-IE-FK2K2A er en totrinns-fremgangsmåte. Trinn 1 omfatter dannelsen av pTPA-FK2K2A

som inneholder den ønskede TPA-analog, polyadenylerings-signalsekvensen fra BGH og selekterbare markører og repli-koner fra pSVC0W7, og trinn 2 omfatter innføringen av CMV-I.E.-promoteren omtalt tidligere. Selv om eksemplet nedenunder beskriver innføringen av TPA-analog FK2K2A, kan andre analoger innføres ved å bruke de samme enzymene og fremgangsmåtene.

Trinn 1. Plasmid pTPA-IE-PA (plansje 22) kuttes med BamHI og Bglll, hvorved man får fragment 47 som inneholder basene 1-188 i TPA-ledersekvensen. Polyadenyleringssignal-sekvensen for BGH fås ved å kutte pSVC0W7 (plansje 20) med EcoRI og PvuII, hvorved man får fragment 48 (600 bp). TPA-analogsekvensen fås fra kutting av pFK2K2A (plansje 12)

med Bglll og Ball, hvorved man får fragment 49 (2,0 kb). En andre prøve av pSVC0W7 kuttes med EcoRI og BamHI, hvorved man får fragment 50 (5,8 kb) som inneholder markørene og replikonene fra pSVCOW-7. De fire fragmentene gelisoleres og ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pTPA-FK2K2A (8,3 kb).

Trinn 2. Plasmid pTPA-FK2K2A kuttes med BamHI, og den Sau3A-oppløste CMV-IE-promotersekvens innføres for

å danne pTPA-IE-FK2K2A som oppbevares i E. coli inntil transfeksjon i CHO-celler.

(5) Transfeksjon og dyrking av CHO-celler.

Plasmid pTPA-IE-FK2K2A transfiseres inn i livmorceller fra kinesisk hamster (CHO) som mangler dehydrofolat-reduktase (dhfr) ved å bruke calciumfosfatmetoden for transfeksjon av DNA inn i celler som er beskrevet utførlig av Graham, et al., (i Introduction of Macromolecules into

Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980,

s. 3-25). Den anvendte cellelinje er den mutante DXB-11 opprinnelig tilgjengelig fra L. Chasin, Columbia University

og fullstendig beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216-4220,(1980). Fremgangsmåtene ovenfor for transfeksjon beror på det faktum at celler som innlemmer de trans-fiserte plasmider, ikke lengre er dhfr-fattige og vil vokse i Dulbeccos modifiserte Eagles medium pluss prolin.

Fra cellene som er transfisert med pTPA-IE-FK2K2A, isoleres kloner som, når de dyrkes i et monolag i 2 dager, syntetiserer minst 10 ng TPA pr. million celler. Fra celler med pIETPA-IPA-dhfr isoleres kloner som syntetiserer minst 100 ng TPA pr. million celler. Ekspresjon av TPA-analog kan påvises ved hjelp av radioimmunologisk analyse eller ved Western flekk-teknikker.

TPA-analoger renses ifølge fremgangsmåten til Rijken og Coilen, Jornal of Biological Chemistry 256:7035-7041 (1979). CHO-cellene som inneholder de rekombinante TPA-analoger, dyrkes i serumfrie media. Dyrknings-mediene innhøstes etter 7 2 timer og tilføres en sink-chelat-agarosekolonne ekvilibrert med 0,02 M Tris-HCl pH 7,5 som inneholder 1,0 M NaCl og 0,01% Tween<®> 80. Kolonnen vaskes med den samme buffer, og TPA-analogene elueres med en lineær gradient fra 0 til 0,05 M imidazol i den samme buffer. Fraksjonene som inneholder TPA-analoger, slås sammen og tilføres en kolonne med concanavalin A-agarose ekvilibrert med 0,01 M fosfatbuffer pH 7,5 som inneholder 1,0 M NaCl og 0,01% Tween<®> 80. Etter vasking av kolonnen med den samme buffer elueres TPA-analogene med en lineær gradient av ekvilibreringsbufferen til 0,01 M fosfatbuffer pH 7,5 som inneholder 0,01% Tween<®> 80, 0,4 M D-methylmannosid og 2 M kaliumthiocyanat. Fraksjonene som inneholder TPA-aktivitet, slås sammen, og fast KSCN tilsettes for å øke KSCN-konsen-trasjonen til 1,6 M. Fraksjonene oppkonsentreres omtrent 10 ganger og tilføres en kolonne med Sephadex<®> G-150 ekvilibrert med 0,01 M fosfatbuffer pH 7,5 som inneholder 1,6 M KSCN og 0,01% Tween<®> 80. Fraksjonene som inneholder TPA-aktiviteten, slås sammen, dialyseres mot 0,15 M NaCl og 0,01% Tween<®> 80 og lagres ved -80°C.

C. Ekspresjon i Spodoptera frugiperda.

Det følgende eksempel vedrører ekspresjon av TPA i insektcellekulturer. Alle fremgangsmåter er utførlig beskrevet i Summers, M.D. og Smith, G.E., A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, publisert av College of Agriculture, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. Utgangsplasmidet pAc373

(7,1 kb) er en generell baculovirus-ekspresjonsvektor med

et unikt BamHI-sete umiddelbart nedstrøms fra polyhedron-promoteren for Autographa californica kjerne-polyhedrose-virus (AcNPV). Polyhedronproteinet er et matriksprotein som er ikke-essensielt for virusinfeksjon og replikasjon in vitro. Plasmidet er tilgjengelig fra professor Max Summers ved Department of Entomology, Texas A&M University, College Station, Texas 77843, og er fullstendig beskrevet i Molecular and Cell. Biology, 3(12):2156-2165 (1983). (1) Konstruksjon av pAcTPA. Plansje 24. Utgangsplasmid pAc373 modifiseres for å akseptere TPA-analogene ved innføring i det unike BamHI-setet av et Bglll-sete som også er unikt. Plasmid pAc373 kuttes først med BamHI og behandles deretter med mangobønnenuclease for å danne butte ender. Bglll-koblere ligeres så til endene, og endene knyttes på nytt sammen, hvorved man får pAc373,Bglll. Plasmid pTPAcDNA,BamHI fra plansje 21 oppløses fullstendig med BamHI og oppløses delvis med Bglll, hvorved man får fragment 51 (1,95 kb) som koder for en intakt TPA-cDNA. Fragment 51 gelisoleres og innføres i Bglll-setet til pAc373,Bglll, hvorved man får pAcTPA som er i stand til å uttrykke naturlig forekommende TPA i S. frugiperda.

(2) Konstruksjon av pAcFK2K2A. Plansje 25.

For dette ekspresjonsplasmid kuttes den TPA-analoge FK2K2A fra pFK2K2A (plansje 12) ved å bruke Bglll, og

cDNA-en som koder for TPA-analogen, gelisoleres som fragment 53 (2,0 kb). Plasmid pAcTPA (plansje 24) kuttes med Bglll, hvorved man får fragment 52 (7,15 kb). Fragmentene 52 og

53 ligeres, hvorved man får pAcFK2K2A (9,15 kb) som oppbevares i E. coli inntil det transfiseres inn i S. frugiperda. (3) Transfeksjon og dyrking av S. frugiperda. TPA-analogene rekombineres med naturlig forekommende ACNPV-DNA ved kotransfeksjon i S. frugiperda. S. frugiperda (SF9, ATCC CRL 1711) dyrkes i Grace-medier (Gibco Lab. Livonia, MI 48150), 10% kalvefosterserum og supplert med Difco lactalbuminhydrolysat og "yeastolate". Cellene kotransfiseres med AcNPV-DNA og pAcTPAFK2K2A ved hhv. 1 u/ml og 2 u/ml. Resulterende viruspartikler fås ved å samle opp mediene og fjerne cellulært materiale ved sentri-fuger ing ved lav hastighet. De virusholdige medier brukes så til å infisere S. frugiperda. Etterfølgende infeksjon av S. frugiperda ved å bruke disse viruspartiklene som omfatter både naturlig virus-DNA og DNA rekombinert med den cDNA som koder for FK2K2A-TPA-analogen, vil resultere i noen celler som uttrykker TPA-analogen i stedet for polyhedronproteinet. Påvisning av infiserte cellekolonier som produserer TPA-analoger, bestemmes ved å tildekke et monolag av S. frugiperda som tidligere er blitt infisert i 1 time med serie-fortynninger av de virusholdilge medier (10 — 1 -10 — 6). Cellene tildekkes så med Grace-medier med 0,7% agar med lavt smeltepunkt som inneholder 6 mg/ml fibrinogen og 0,5 enheter trombin. De celler som produserer aktiv TPA, vil danne klare plakker rundt infeksjonsstedene.

Eksempel 5.

Følgende analoger er blitt isolert fra CHO-celler og evaluert med hensyn på aktivitet og antigenisitet: FGK1K2A, FK1K2A og FK2A.

I tabell 1 er resultatene fra to forskjellige tester in vitro, aktivitet og antistoff-gjenkjenning, oppsummert. Analogene FGK1K2A og FK2A danner komplekser med en plasmino-genaktivatorinhibitor fra blodplater (trombin-indusert blodplate-"releasat"). Molekylvekten til analogene er hhv. ca. 62.000 og 40.000 dalton. Molekylvektene til enzym-inhibitorkompleksene er omtrent hhv. 110.000 og 85.000 dalton.

Eksempel 6. Terapeutisk anvendelse av TPA-analoger.

TPA er kjent for å være terapeutisk anvendbar for

oppløsning av blodpropper. The Lancet, s. 1018-20

(7. november 1981), Science, 220:1181 (1983) og N. Eng. J. Med., 310:609 (1984). Administrasjon av TPA-analoger til pasienter med koronare tromber kan skje på intrakoronar eller intravenøs måte i henhold til de generelle fremgangsmåter beskrevet i de to litteraturhenvisningene ovenfor.

PLANSJE 1. KONSTRUKSJON AV pTRZl.

(a) pMC1403 behandles med EcoRI, Klenow-enzym

og bakteriell alkalisk fosfatase, hvorved man får fragment 1.

(b) pWl behandles med PvuII, Bglll og Klenow-enzym etterfulgt av rensing av fragment 2 (323 bp) som.inneholder trp-promoteren og en del av TrpLE. (c) Fragmentene 1 og 2 ligeres ved å bruke T4 DNA-ligase, hvorved man får pTRZl (10 kb) .

AmpR = Ampicillinresistens.

LacZ, LacY, LacA = Gener i lactose-operonet. Ptrp = Trp-promoter/operator.

trpLE = Fusjon mellom trpL og trpE.

PLANSJE 2. KONSTRUKSJON AV pSK3 (4,3 kb).

(a) pTRZl (10 kb) behandles med BamHI og EcoRI og alkalisk fosfatase, hvorved man får fragment 3 (350 bp). (b) pKC7 (5,8 kb) behandles med BamHI og EcoRI, hvorved man får fragment 4 (4,0 kb). (c) Fragmentene 3 og 4 ligeres, hvorved pSK3 (4,3 kb) dannes.

D = Trp-promoter/operator.

E = TrpL-ribosombindingssete.

F = trpLE- og restriksjonsseter. AmpR = Ampicillinresistens.

PLANSJE 3. KONSTRUKSJON AV pSK4.

(a) pSK3 kuttes med EcoRI og BamHI, hvorved fragment 5 (322 bp) isoleres. (b) En partiell Taql-oppløsning gir det 278 bp fragment 6 EcoRI til Taql<111> og andre fragmenter. (c) Fragment 6 klones inn i pBR322, kuttes med EcoRI og Clal, hvorved man får pSK4 (4,6 kb).

D = Trp-promoter/operator.

E = Shine-Dalgarno—område.

PLANSJE 4. KONSTRUKSJON AV pTPA 3<1->cDNA

(a) Plasmid pTPAH (5,7 kb) fås ved å kutte pBR322 med Pstl, henge på hale og innføre 3'-området fra TPAcDNA med posisjonene 1250-2530.*

(b) Plasmid pTPA80-l (5,4 kb) fås ved å kutte pBR322 med Pstl, henge på hale og innføre cDNA for TPA med posisjonene 550-1600. (c) Plasmid pTPAH og pTPA80-l kuttes med SacI og Pvul, og de respektive fragmenter 7 (1251 bp) og 8 (5,1 kb) gelisoleres. Fragmentene behandles med bakteriell alkalisk fosfatase og ligeres med T4, hvorved det dannes pTPA3<1->cDNA (6,3 kb) med baser 550-2530 fra TPAcDNA.

TetR = Tetracyklinresistens.

P = 550-802 baseposisjoner av TPAcDNA

A = 803-2530 baseposisjoner av TPAcDNA.

N = Ikke-translatert 3'-område av TPAcDNA.

PLANSJE 5. KONSTRUKSJON AV pTPAcDNA.

(a) Plasmid pTPA 5<1->cDNA fås ved å kutte pBR322 med Pstl, henge på hale og innføre 5'-området fra TPAcDNA, posisjonene 1-750. (b) Plasmid pTPA 5' kuttes med Taql, hvorved man får fragment 9 (2194 bp) som gelisoleres og kuttes med Bglll og Hgal, hvorved man får fragment 10 (405 bp) som inneholder basene 188-593 av TPAcDNA (det ferdige TPA-protein). (c) Plasmid pTPA 3'-cDNA (plansje 4) kuttes med PvuII og EcoRI, og fragment 11 (1748 bp) gelisoleres. Fragment 11 kuttes med Hgal, hvorved man får fragment 12 (209 bp) som gelisoleres og inneholder basene 594-802. (d) Plasmid pTPA 3'-cDNA kuttes med Pvul, det lineære 6,3 kb fragment behandles med T4-polymerase for å gjøre endene butte, og oppløses delvis med EcoRI, hvorved man får fragment 13 (1871 kb) som inneholder basene 802-2530 pluss 123 bp av pBR322.

PLANSJE 5. (Forts.)

(e) Plasmid pKC7 kuttes med Bglll og Smal, behandles med bakteriell alkalisk fosfatase, og fragment 14 (4,8 kb) gelisoleres. (f) Fragmentene 10, 12, 13 og 14 slås sammen og ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pTPAcDNA (7,4 kb) som inneholder den ferdige TPAcDNA.

AmpR = Ampicillinresistens.

T = 5'-del av TPA-cDNA.

P = Midtdel av TPA-cDNA.

A = 3'-del av TPA-cDNA.

N = Ikke-translatert 3'-del av TPA-cDNA.

PLANSJE 6. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl.

(a) Plasmid pSK4 kuttes med Clal og SphI, hvorved man får fragment 15 (4,1 kb) som isoleres og ligeres til blokk 1 som inneholder finger-doménet, gjennom en Clal/Xbal-kobler som inneholder ATG. (b) Fragmentene 15 og blokk 1 ligeres gjennom kobleren, hvorved man får pTPA-Bl (4,25 kb).

D = Trp-promoter/operator.

E = TrpL-ribosombindingssete.

F = Finger-doméne.

AmpR = Ampicillinresistens.

ATG = Initieringskodon.

PLANSJE 7. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl,2

(a) Plasmid pTPA-Bl kuttes med EcoRI og SphI, hvorved man får fragment 16 (450 bp) og blokk 2 (100 bp) som inneholder vekstfaktor-doménet, og isoleres fra den passende klon ved å bruke EcoRI og SphI. (b) Fragment 16 og blokk 2 ligeres til fragment 17 (4,35 kb) avledet fra en EcoRI/Clal-oppløsning av pBR322, hvorved man får pTPA-Bl,2 (4,8 kb).

P/0 = Trp-promoter/operator.

RbS = Trp-ribosombindingssete.

ATG = Initieringskodon.

F = Finger-doméne.

G = Vekstfaktor-doméne.

AmpR = Ampicillinresistens.

Ori = Replikasjonsopprinnelse for pBR322.

PLANSJE 8. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl,2(a)

(a) Plasmid pTPA-Bl,2 kuttes med Xbal og EcoRI, hvorved man får fragment 18 (4,5 kb) som isoleres og ligeres til en kobler som inneholder et Hindlll-sete og Bglll-sete, hvorved man får pTPA-Bl,2(a) (4,5 kb).

F = Finger.

G = Vekstfaktor-område.

AmpR = Ampicillinresistens.

PLANSJE 9. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl,2,3.

Plasmid pTPA-Bl,2(a) kuttes med Clal/BamHI, og fragment 19 (4,0 kb) isoleres og ligeres med blokk 3 (270 bp) som inneholder "kringle 1" og et Clal-sete oppstrøms og et BamHI-sete nedstrøms, hvorved man får pTPA3 (4,3 kb).

F = Finger-doméne.

G = Vekstfaktor-doméne.

K = "Kringle 1".

AmpR = Ampicillinresistens.

PLANSJE 10. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl,2,3,4(a)

(a) Plasmid pTPAcDNA (plansje 5) kuttes med Seal,

og fragment 20 (6,0 kb) som inneholder 3'-delen av TPA-genet, gelisoleres.

(b) Plasmid pTPA-Bl,2,3 (plansje 9) kuttes med Seal og BamHI, og fragment 21 (1100 bp) gelisoleres. (c) Fra klonen som inneholder blokk 4, isoleres et BamHI/Scal-fragment 4a (230 bp) som inneholder "kringle 2"-området. (d) Fragmentene 20, 21 og 4a ligeres, hvorved pTPA-Bl,2,3,4a dannes. (e) Plasmid pTPA-Bl,2,3,4<*> kuttes med Hindlll og Aatll, og det 2,2 kb prototype TPA-gen subklones inn i pUC19 som likeledes er oppløst med Hindlll . og Aatll, hvorved man får pTPA-Bl,2,3,4a (4,2 kb). Plasmid pTPA-Bl,2,3,4a er symbolsk lik med pTPA-Bl,2,3,4<*>, men har et mer passende arrangement av restriksjonsseter.

AmpR = Ampicillinresistens.

F = Finger-doméne.

G = Vekstfaktor-doméne.

K = "Kringle 1"-domene,

k = "Kringle 2"-domene,

a = Aktivt sete.

N = Ikke-translatert 3'-del av TPAcDNA.

PLANSJE 11. KONSTRUKSJON AV pTPA-Bl,2,3 , 4

(a) Plasmid pTPA-Bl,2,3,4a kuttes med EcoRI og BamHI. Det store fragment (3,7 kb) ligeres til blokk 4 (560 bp) erholdt fra den passende klon som også er kuttet med EcoRI (delvis oppløsning) og BamHI, hvorved man får pTPA-Bl,2,3,4.

AmpR = Ampicillinresistens.

F = Finger-doméne.

G = Vekstfaktor-doméne.

K = "Kringle l"-doméne.

k = "Kringle 2"-doméne.

A = 3'-del av TPAcDNA.

N = Ikke-translatert 3'-del av TPAcDNA.

PLANSJE 12. KONSTRUKSJON AV pFK2K2A

(a) Plasmid pTPA-Bl,2,3,4a kuttes med Hpal, hvorved man får fragment 22 (3,9 kb) som isoleres fra en gel. (b) Plasmid pTPA-Bl,2,3,4 kuttes med Hpal og Mstl, hvorved man får fragment 23 (250 bp) som inneholder "kringle 2". (c) Fragmentene 22 og 23 ligeres sammen, hvorved man får pFK2K2A (4,1 kb).

Ori = Replikasjonsopprinnelse for pBR322. AmpR = Ampicillinresistens.

k = "Kringle 2"-domene

F = Finger-doméne.

A = Aktivt sete.

N = Ikke-kodende 3'-sekvens.

PLANSJE 13. KONSTRUKSJON AV pTPAExp 1

(a) Plasmid pTPA-Bl,2 (plansje 7) kuttes med Xbal og BamHI, og fragment 24 (4,2 kb) gelisoleres. (b) Plasmid pFK2K2A (plansje 12) kuttes med Xbal og Bglll, hvorved man får fragment 25 (2,0 kb) som gelisoleres. (c) Fragmentene 24 og 25 ligeres, hvorved pTPAExp 1 (6,2 kb) dannes; BamHI og Bglll er komplementære, men gjen-opprettes ikke.

trpP/0 = Tryptofan-promoter/operator.

RbS = Ribosombindingssete.

k = "Kringle 2".

F = Finger-doméne.

A = Aktivt sete.

N = Ikke-kodende 3'-sekvens.

AmpR = Ampicillinresistens.

ATG = Initieringskodon.

PLANSJE 14. KONSTRUKSJON AV pyRep3'B

(a) Plasmid pYIP31 kuttes med Smal og behandles med bakteriell alkalisk fosfatase, hvorved man får fragment 26. (b) 2u-plasmidet fra gjær kuttes med Pstl og Xbal og behandles med Klenow-enzym. Det resulterende fragment 27 (1,3 kb) isoleres. (c) Fragmentene 26 og 27 ligeres, hvorved man får pyRep3'B (6,7 kb) .

u = URA3.

R = Sekvens som spenner over RepIII og opprinnelsesstedet for replikasjon.

PLANSJE 15. KONSTRUKSJON AV PLASMID pGG400

(a) Plasmid pBR322 kuttes med EcoRI og PvuII, og endene fylles igjen med Klenow-enzym, hvorved man får fragment 28 (2,3 kb). (b) Plasmid pML21 kuttes med PvuII, hvorved man får fragment 29 (1,7 kb). (c) Fragmentene 28 og 29 ligeres ved å bruke T4, hvorved man får pGG400 (4,0 kb).

AmpR = Ampicillinresistens.

KmR = Kanamycinresistens.

PLANSJE 16. KONSTRUKSJON AV pADHt

(a) Plasmid pGG400 kuttes med Xhol og PvuII, behandles med Klenow-enzym, og det resulterende fragment 30 (3,5 kb) isoleres. (b) Plasmid pADHBC kuttes med HincII og BamHI, endene fylles igjen med T4-ligase, og det resulterende fragment 31 (0,36 kb) isoleres. (c) Fragmentene 30 og 31 ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved pADHt (3,86 kb) fås.

AmpR = Ampicillinresistens.

KmR = Kanamycinresistens.

H = ADHt 3'-ende.

PLANSJE 17. KONSTRUKSJON AV PLASMID pADHt-RepIII

(a) Plasmid pADHt modifiseres ved restriksjon med BamHI og ligering av 8-mer Sall-kobler til det igjenfylte BamHI-sete. (b) Plasmid pADHt (modifisert) kuttes med SphI, og endene fylles igjen med T4-ligase, hvorved man får fragment 32 (3,8 kb). (c) Plasmid pyRep31B (plansje 16) kuttes med Hindlll, og endene fylles igjen med T4-ligase, hvorved man får fragment 33 (2,4 kb). (d) Fragmentene 32 og 33 ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pADHt-RepIII (6,2 kb).

AmpR = Ampicillinresistens.

H = ADHt 3'-ende.

u = Ura3

R = RepIII og opprinnelse for replikasjon.

PLANSJE 18. KONSTRUKSJON AV pal-ADHt

(a) Plasmid pADHt-RepIII (plansje 15) kuttes med EcoRI og Hind III, og fragment 34 (5,3 kb) isoleres. (b) Plasmid pal begrenses med EcoRI og Hindlll, hvorved man får MFal-genet som inneholder fragment 35 med 1,2 kb. (c) Fragmentene 34 og 35 ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pal-ADHt (6,5 kb).

AmpR = Ampicillinresistens.

H = ADHt 3'-ende.

u = Ura3.

R = RepIII og opprinnelse for replikasjon. MFal = Promoter- og signalsekvens for MFal-gen.

PLANSJE 19. KONSTRUKSJON AV pal-FK2K2A

(a) Plasmid pFK2K2A (plansje 12) kuttes med Bglll, hvorved man får fragment 36 (2,0 kb) som gelisoleres. (b) Plasmid pal-ADHt kuttes med Hindlll og Xhol; endene fylles delvis igjen med Klenow-enzym i nærvær av basene adenosin og guanosin, og behandles med mangobønne-nuclease, hvorved man får fragment 37 (5,6 kb) som gelisoleres .

(c) Fragmentene 36 og 37 ligeres, hvorved pal-FK2K2A

(7,6 kb) dannes.

MFal = Promoter- og signalsekvens for MFal-gen. F = Finger.

k = "Kringle"-område 2.

A = Aktivt sete.

N = Ikke-translatert 3'-sekvens.

H = ADHt 3'-ende.

u = URA3

R = RepIII og opprinnelse for replikasjon.

PLANSJE 20. KONSTRUKSJON AV pSVC0W7

(a) Plasmid pSV2dhfr kuttes med BamHI og EcoRI, hvorved man får fragment 38 (5,0 kb). (b) Plasmid pAGH2R2 kuttes med BamHI og EcoRI, hvorved man får fragment 39 (2,1 kb). (c) Fragmentene 38 og 39 ligeres, hvorved man får pSVC0W7 (7,1 kb).

A = Bovint veksthormon poly A-hale.

G = Genomisk bovint veksthormon.

I = Intron

dhfr = Dehydrofolat-reduktase.

SV40 = SV40-promoter og opprinnelse for replikasjon. AmpR = Ampicillinresistens.

PLANSJE 21. KONSTRUKSJON AV pTPAcDNA, BamHI

(a) Plasmid pTPA5'cDNA (plansje 5, del a) kuttes med Hga, og fragment 40 (517 bp) gjøres jevnt med Klenow og ligeres til en 10-mer BamHI-kobler. Fragment 40 kuttes med Narl, hvorved man får fragment 41 (440 bp) med basene 78-518 av TPAcDNA-en.

Fragment 40

(b) Plasmid pTPAcDNA (plansje 5) kuttes med Narl og Bglll, og fragment 42 (1644 bp) som inneholder 3'-delen av TPAcDNA, gelisoleres.

(c) Plasmid pKC7 kuttes med BamHI og Bglll, hvorved man får fragment 43 (4,3 kb) som gelisoleres og ligeres med fragmentene 41 og 42, hvorved man får pTPAcDNA, BamHI

(6,5 kb).

L = Ledersekvens.

T = 5'-del av TPAcDNA.

P = Midtdel av TPAcDNA.

A = 3'-del av TPAcDNA.

N = Ikke-translatert 3'-del av TPAcDNA.

PLANSJE 22. KONSTRUKSJON AV pTPA-IE-PA

(a) Plasmid pSVCOW7 kuttes med EcoRI og PvuII, hvorved man får fragment 44 (600 bp) som inneholder polyadenyleringssekvensen til bovint veksthormon som gelisoleres. (b) Plasmid pSVC0W7 (plansje 20) kuttes med EcoRI og BamHI, hvorved man får fragment 45 (5,8 kb). (c) Plasmid pTPAcDNA, BamHI (plansje 21) kuttes med BamHI og Ball, hvorved man får fragment 46 (2,0 kb). (d) Fragmentene 44, 45 og 46 ligeres, hvorved pTPA-PA (8,4 kb) dannes.

PLANSJE 22. (Forts.)

Plasmid pTPA-PA kuttes med BamHI og CMV-IE-promoteren (760 bp) fra en Pstl- og Sau3AI-oppløsning av CMV-genomet innføres slik at pTPA-IE-PA dannes.

AmpR = Ampicillinresistens.

Ori = pBR322-opprinnelse for replikasjon. SV40/ori = Apevirus-opprinnelse for replikasjon Mo/dhfr = Mus-dehydrofolatreduktase-markør.

CMV/Prom = Cytomegalovirus-promoter.

L = TPA ledersekvens.

T = 5'-område i TPAcDNA.

P = Midtområde i TPAcDNA.

A = 3'-område i TPAcDNA.

N = Ikke-translatert 3'-område i TPAcDNA. a = Polyadenylering-signalsekvens.

PLANSJE 23. KONSTRUKSJON AV pTPA-IE-FK2K2A

(a) pTPA-IE-PA (plansje 22) kuttes med BamHI og Bglll, hvorved man får fragment 47 (120 bp) som gelisoleres. (b) Plasmid pSVC0W7 kuttes med EcoRI og PvuII, hvorved man får fragment 48 (600 bp) som inneholder polyadenyleringssekvensen til bovint veksthormon som gelisoleres. (c) Plasmid pFK2K2A (plansje 12) kuttes med Bglll og Ball, hvorved man får fragment 49 (1,7 kb) som gelisoleres. (d) Plasmid pSVC0W7 (plansje 20) kuttes med EcoRI og BamHI, hvorved man får fragment 50. (e) Fragmentene 47, 48, 49 og 50 ligeres ved å bruke T4-ligase, hvorved man får pTPAFK2K2A (8,3 kb). PLANSJE 23. (Forts.) (f) Plasmid pTPAFK2K2A kuttes med BamHI, og CMV-IE-promoteren (7 60 bp) fra en Pstl- og Sau3AI-oppløsning av CMV-genomet innføres, hvorved pTPA-IE-FK2K2A dannes.

AmpR = Ampicillinresistens.

Ori = pBR322-opprinnelse for.replikasjon.

SV40 = Apevirus-opprinnelse for replikasjon. Mo/dhfr = Mus-dehydrofolatreduktase-markør.

CMV/Prom = Cytomegalovirus-promoter.

L = TPA ledersekvens.

T = 5'-område i TPAcDNA.

P = Midtområde i TPAcDNA.

F = Finger-doméne.

k = "Kringle 2".

A = Aktivt sete.

N = Ikke-translatert 3<1->område i TPAcDNA. a = Polyadenylering-signalsekvens.

PLANSJE 24. KONSTRUKSJON AV pAcTPA

(a) Plasmid pAc373 (7,1 kb) kuttes med BamHI og behandles med mangobønnenuclease, hvorved det dannes, butte ender hvori Bglll-koblere tilsettes. Endene knyttes på nytt sammen, hvorved man får pAc373, Bglll. (b) Plasmid pTPAcDNA, BamHI (plansje 21) kuttes med BamHI og oppløses partielt med Bglll, hvorved man får fragment 51 (1,95 kb) som inneholder et intakt TPAcDNA. (c) Fragment 51 innføres og ligeres til Bglll-setet i pAc373, Bglll, hvorved man får pAcTPA (9,05 kb)

L = Ledersekvens.

T = 5'-del i TPAcDNA.

P = Midtdel i TPAcDNA.

A = 3'-del i TPAcDNA.

N = Ikke-translatert 3'-del i TPAcDNA.

AmpR = Ampicillinresistens.

Poly = Polyhedrinproteingen.

PLANSJE 25. KONSTRUKSJON AV pAc FK2K2A

(a) pAcTPA (plansje 24) kuttes med Bglll, hvorved man får fragment 52 (7,15 kb). (b) Plasmid pFK2K2A (plansje 12) kuttes med Bglll, og den analoge cDNA gelisoleres som fragment 53 (2,0 kb). (c) Fragmentene 52 og 53 ligeres, hvorved pAcFK2K2A (9,15 kb) dannes.

L = Ledersekvens

F = Finger-doméne.

k = "Kringle 2"-doméne.

A = Aktivt sete-doméne.

N = Ikke-translatert 3"-del i TPAcDNA. AmpR = Ampicillinresistens.

Claims (13)

1. Genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av et tPA-lignende protein med en molekylvekt som er mindre enn 90.000 dalton, og som ved sammenligning med tPA hvis naturlig forekommende rekkefølge er FGK1K2A, har rekkefølgen FK2A, FK2K2A eller FGK2A, hvor F er fingerdomenet, G er vekstfaktordomenet, Kl og K2 er "kringle 1"- og "kringle 2"-domenene, og A er et aktivt sete, hvor det tPA-lignende protein har forøkt fibrinaffinitet og forøkt halveringstid in vivo sammenlignet med naturlig forekommende tPA, karakterisert ved at cDNA for naturlig forekommende tPA erholdes, det syntetiseres blokker av oligonucleotider som inneholder den kodende sekvens for de forskjellige tPA-domenene med utvalgte restriksjonsseter i interdoméneområdene, domenene klones og replikeres i E. coli som den modifiserte DNA vist i nedre linje i figur 1, hvoretter det tPA-lignende protein uttrykkes fra celler av en egnet vert som inneholder DNA som gjør verten i stand til å opprettholde den modifiserte DNA og uttrykke proteinet, og proteinet isoleres fra vertscellekulturen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at rekkefølgen er FK2A.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA-en inneholder i nucleotidsekvensene som koder for interdoméneområdene, ikke-naturlige endonucleaserestriksjonsseter som ikke er til stede i nucleotidsekvensene som koder for domeneområdene, som vist i figur 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at DNA-en omfatter et Xbal-sete mellom nucleotidbasene 187 og 198 i det naturlige arrangement.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller krav 4, karakterisert ved at DNA-en omfatter et Hpal- eller Sphl-sete eller en kombinasjon derav mellom nucleotidbasene 328 og 342 i det naturlige arrangement.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 3-5, karakterisert ved at DNA-en omfatter et EcoRV-, Clal- eller Smal-sete eller en kombinasjon derav mellom nucleotidbasene 442 og 462 i det naturlige arrangement.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 3-6, karakterisert ved at DNA-en omfatter et BamHI- eller Hpal-sete eller en kombinasjon derav mellom nucleotidbasene 709 og 726 i det naturlige arrangement.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 3-7, karakterisert ved at DNA-en omfatter et MstHI-, SphI- eller Xmalll-sete eller en kombinasjon derav mellom nucleotidbasene 973 og 997 i det naturlige arrangement.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at verten er gjær, eukaryot eller Escherichia sp.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at verten er eggstokk-celler fra kinesisk hamster.

11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at verten er et insekt.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at insektet er Bombyx mori eller Spodoptera frugiperda.

13. Vertscelle, karakterisert ved at den er i stand til å uttrykke et tPA-lignende protein fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1, hvor cellen er avledet fra følgende gruppe av eukaryot- og prokaryotceller: a. E. coli, b. gjær, c. celler fra kinesisk hamster, d. insektceller, e. Spodoptera frugiperda, f. Bombyx mori og g. pattedyrceller.