JPH09168387A - 新規なヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター変
異体の製造方法を提供する。 【解決手段】 フィンガードメインの一部分が除去され
てフィブリン結合能が減少した変異体は、１８４位グリ
コシル化部位、１本鎖から２本鎖への開裂部位、および
／またはクリングル２ドメインにおける２０５−２１５
位の推定リジン結合部位が分子改変されることにより、
減少したフィブリン結合能を回復する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーター(t-ＰＡ)の具体的な新規変異体、それを製造
する方法、および予想外の改良された薬物動態および薬
学的性質を有する医薬的に活性な主成分を製造するため
の、そのような変異体を利用する方法およびその組成
物、ならびにt-ＰＡおよびその各種の変異体の薬物動態
および薬学的性質を調整(調節)する方法に関するもので
ある。さらに具体的には、本発明は、t-ＰＡのフィブリ
ン結合性を調整する手段および方法、最も好ましくはt-
ＰＡ本体の他のドメインに、ある種の修飾を受けた結
果、フィブリン結合性が抑制されていることが見いださ
れたような場合にその結合性を増大させるための手段お
よび方法に関するものである。

【０００２】ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
は、インビボにおけるその高いフィブリン特異性と強力
な血餅溶解能のおかげで、心筋梗塞などの心疾患を並外
れて処置することができると示されている、特に重要か
つ強力な新規生物学的医薬物質として確定され、記載さ
れている。

【０００３】ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
は多くの科学雑誌および特許出願の標的となっている。
その存在は幾つかの研究グループに属す多くの研究者を
刺激したが、最初は、コーレン[Collen、1980年6月11日
の最初の出願に基づく1981年12月16日公開の欧州特許出
願公開第41766号]らにより、天然起源の実質的に純粋な
単離物として同定され、要件としてのプラスミノーゲン
アクチベーター活性がインビボにおいて試験された。さ
らに、リッケン(Rijken)らの対応する科学雑誌、J.Bio
l.Chem.256,7035(1981)も参照のこと。

【０００４】その後、ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターは、組換えＤＮＡ技術が使用されて独特の環境
下で大量のt-ＰＡを得ることに成功し、その研究に基づ
きＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列が明らかにされて
完全に同定および特性化がなされた。この実績は、科学
文献[ペニカ(Pennica)らのNature 301,214(1983)]およ
び欧州特許出願公開第93619号(1982年5月5日の最初の出
願に基づき、1983年11月9日に公開)に報告されている。

【０００５】多くの他の研究者が、基本的にこの後者の
開示を使用することにより組換えＤＮＡ技術によってt-
ＰＡ分子を調製できるようになり、それに基づく報告を
行っている。これらの研究者の中には、この基本的な構
造の将来可能な変異体を公に開示している者もあるが、
彼らは、生物学的または薬物動態的効果が全体として変
動し得る誘導体を、机上論として予測しているに過ぎな
い。これらの大部分の開示事項は、実際の生物学的また
は薬物動態的な全体の効果に関して予言的であり、不確
かなものである。

【０００６】最初のt-ＰＡの組換え工学的生産に続き、
分子特性の確定および生物学的効果の確認という研究所
における類似した試みが、科学文献および各種の特許出
願の両方に現実に報告されている。これらすべては、ヒ
ト組織プラスミノーゲンアクチベーターにおける生物学
に基づく種々の最終目的に応じ、その商業的可能性を完
全に探求し、開発するために、その基本構造を修飾しよ
うという試みに沿った研究が好まれる傾向にあったよう
である。

【０００７】このような研究および開示事項に部分的に
基づけば、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの
分子は、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲ
ン、プロトロンビン、フィブロネクチンおよび表皮性成
長因子などの他の種々のタンパク質中に同定される相同
的(ホモローガス)な、またはそうでなくてもそれらに類
似した構造に照らして規定される５つのドメイン(アミ
ノ酸配列の並び)を含有していることは、現在では明ら
かであると思われる。これらのドメインは、ヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸のＮ-末端か
ら開始して、(１)アミノ酸１から約４４を包含するもの
として種々規定されるフィンガー領域(Ｆ)、(２)アミノ
酸約４５からアミノ酸９１にまで伸長するものとして種
々規定される成長因子領域(Ｇ)[ＥＧＦとの相同性に基
づく]、(３)アミノ酸約９２から約１７３にまで伸長す
るものとして種々規定されるクリングル１(Ｋ１)、(４)
アミノ酸約１８０から約２６１にまで伸長するものとし
て種々規定されるクリングル２(Ｋ２)、および(５)アミ
ノ酸約２６４からt-ＰＡ分子のＣ-末端にまで伸長する
ものとして一般に規定される、いわゆるセリンプロテア
ーゼドメイン(Ｐ)、と命名されている。これらのドメイ
ンは一般に互いに隣接して配置しているか、または短い
「リンカー」領域によって分割され、その推定された成熟
型の１から５２７アミノ酸全体のアミノ酸配列を占めて
いる。

【０００８】各ドメインは、ある種の特定活性に関与す
るものとして種々記載されており、つまり、フィンガー
ドメインは、フィブリンとの高い結合親和性に必須の、
またはその親和性にとって少なくも主要な重要性を持つ
配列を含有しているものとして種々記載されている(こ
の活性は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターが
フィブリン豊富な血栓の病巣における血餅の溶解に対し
て顕す高い特異性にとって重要であると考えられてい
る)。同様に、成長因子様領域は、少なくともウロキナ
ーゼに関しては細胞表面結合活性に関係している。クリ
ングル２領域も、フィブリン結合性、およびt-ＰＡの活
性を刺激するフィブリンの刺激能に強く関係している。
セリンプロテアーゼドメインは、プラスミノーゲンを活
性化する活性のためによく働くt-ＰＡ分子のドメイン(w
orkhorse domain)であるという異議のない一致した意見
を持たれているようである。

【０００９】フィンガー領域に戻るが、この領域はＮ-
末端の１−４４アミノ酸にわたるものとして一般に見な
され、種々の研究者はこのドメインのセグメントを欠
失、またはその一部を欠失させた突然変異体または変異
体を生産しようとしていることに、注意すべきである。

【００１０】Ｎ-連結グリコシル化部位は、t-ＰＡ分子
内の１１７、１８４、２１８および４４８アミノ酸部位
に存在している。２１８アミノ酸部位はグリコシル化さ
れない。１１７アミノ酸のグリコシル化部位は、高いマ
ンノース型であると特性化されており、他の２つの部位
はいわゆる複合オリゴサッカライド構造を呈している。
t-ＰＡ分子をグリコシル化を行うことのできる宿主細胞
から誘導させた場合、１１７および４４８部位は常にグ
リコシル化されているようであるが、１８４部位は本分
子の約５０％でグリコシル化されると考えられる。この
１８４部位のグリコシル化／非グリコシル化現象は、Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥ分析によって証明されており、それによ
れば１つは１８４グリコシル化分子に関連し、他方は１
８４非グリコシル化分子に関連する２つのバンドを認め
ることのできる(これらはいわゆるI型およびII型t-ＰＡ
と呼ばれる)。この部分的グリコシル化のパターンは、
２つのクリングル構造間にある立体配座的(コンホーメ
ーション的)に保護された部位に１８４部位が配置して
いる結果であると考えられる。

【００１１】科学的に注目されている第３の場所は、ア
ミノ酸２７５から約２７９として規定される領域内にあ
る、いわゆるタンパク分解的開裂部位、より詳細には天
然分子の２７５および２７６アミノ酸の間のバンドであ
る。タンパク分解的崩壊を受け難くなるように、この部
位に突然変異を起こさせれば、生物学的および商業的に
何等かの利点を有すると考えられる、単一鎖すなわち１
本鎖形態を維持した分子が作成される。

【００１２】上記の規定されたドメイン、グリコシル化
部位、および１本鎖／２本鎖開裂部位はすべて、特定の
潜在的生物学的活性成分を有するものとして記載され、
規定されている。たとえば、フィンガードメインの実質
的部分またはそのすべてを除去すれば、得られた分子の
全体としてのクリアランス速度は低下するが、フィブリ
ン結合特性が実質的に減じられた分子が得られることに
なる。

【００１３】天然分子を修飾して１本鎖が２本鎖に開裂
する部位を破壊すると、若干改変された生物活性と、よ
り良好な安定性とを有しており、同時にフィブリン結合
性およびフィブリン刺激が２本鎖t-ＰＡと比較して増大
している分子が得られる。

【００１４】グリコシル化部位を改変、具体的には１１
７アミノ酸を改変すると、改変された半減期パターンお
よび／またはフィブリン結合特性を付加的に表す場合の
ある、溶解性に影響を受けた分子が常に得られるようで
ある。

【００１５】ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、および具体的には種々改変されたその誘導体または
変異体(たとえば、1987年9月2日公開の欧州特許出願公
開第234,051号を参照のこと)が備えるべき所望の効果
が、そのような改変種がクリアランス速度(clearance r
ate)を劇的に減少させるという驚くべき発見を除いた、
高いフィブリン特異性および結合性である場合、フィン
ガー領域を改変してはならないことが、当該技術から教
示されている。そしてまた、フィブリン結合性およびフ
ィブリン特異性が商業的に意義があるとすれば、研究者
の間で認識されている目標は、高いフィブリン結合活性
を有するとされるヒトプラスミノーゲンアクチベーター
の変異体または誘導体を、天然の物質に付随している他
のすべての所望の生物学的および薬物動態的性質を改変
することなく製造しようとするものである。しかし、こ
のようなヒトプラスミノーゲンアクチベーターの変異体
または誘導体を製造するための研究方針は、当業界の現
存する技術からでは全く明らかでない。たとえば、1987
年8月12日公開の欧州特許出願公開第231,624号を参照の
こと。

【００１６】認識される改良されたフィブリン分解性の
ために、t-ＰＡ本来の分子を改変すべきか否か、および
そのような改変場所については、未だ未確定であること
が、比較的最近の特許公開で強調されている[1987年8月
13日公開のWO 87/04722]。この公報は、t-ＰＡの潜在的
変異体の精巧に作り上げた紙製のモザイクを反映してい
る。この公開公報は３つの領域、すなわちアミノＮ-末
端、グリコシル化部位および１本鎖開裂部位に言及して
いるが、実際にt-ＰＡ種を製造した証拠はなく、生物活
性または他のデータも開示されていない。さらに、この
公開公報は、得られたタンパク質が天然のヒトt-ＰＡと
比較して改良されたフィブリン分解性プロフィルを有す
ると単に「予想」しているのみであり、そのことが定性
的または定量的に何を意味しているかについては特に言
及されていない。実際、一般に議論の的となり得る多く
の変異体は、より低いフィブリン分解活性を示す場合が
ある。このように、それは、実験したいと思わせる比較
的複雑なモザイクとしての役割を果たしているに過ぎな
い(それ以上のものでない)。

【００１７】本発明の根本的な目的は、フィブリン結合
活性が調整されたt-ＰＡ変異体の製造、同定および特性
化、ならびにそれらを行う方法および手段である。その
最も好ましい態様として本発明は、フィブリン結合性に
関与するものとして同定されているt-ＰＡ変異体のドメ
インを介してt-ＰＡ変異体に増大したフィブリン結合性
を施すことを目的とするものであり、具体的には、全体
としてフィブリン分解活性に関連する、半減期および／
またはクリアランス速度などの他の特性を増強させるた
めにt-ＰＡ分子に種々の修飾を施したことにより、天然
のt-ＰＡと比較してフィブリン結合性が低くなったと考
えられるt-ＰＡ変異体に関するものである。

【００１８】このように本発明は、調整されたフィブリ
ン結合性を有するt-ＰＡ変異体を目的とするものであ
り、さらに例えばそれをコードしているＤＮＡ単離物、
その単離物とハイブリダイズするＤＮＡ、そのようなＤ
ＮＡを有するクローニングベクター、その機能的な発現
ベクター、そのようなベクターでトランスフェクトされ
た宿主、周囲の培地中に分泌される発現産物としてt−
ＰＡ変異体を顕著に産生することのできる培養物など、
その製造法に関連するあらゆる組換え手段、およびこの
ようなすべてを実施することを包含する方法を目的とす
るものである。本発明はさらに、このようなt-ＰＡ変異
体の有効量を含有する医薬組成物、およびこのような組
成物をヒトに投与する方法を目的としている。

【００１９】また、本発明は、本明細書に記載のt-ＰＡ
変異体を使用する種々の方法を目的とする。このような
態様の１つとして、本発明は、天然t-ＰＡと比較して調
整されたフィブリン結合性を示すヒトt-ＰＡ変異体を製
造し、該t-ＰＡ変異体を治療学的に有効な濃縮物として
含有する医薬的に許容され得る組成物を製造し、そして
該組成物を患者に投与することを特徴とする、患者にお
ける血管疾患の処置方法を提供するものである。

【００２０】このような態様の別のものとして、本発明
は、ある種の修飾t-ＰＡからなるt-ＰＡ変異体を入手
し、該変異型のフィブリン結合性を天然t-ＰＡのそれと
比較し、そのようにして得られた、天然t-ＰＡと比較し
て調整されたフィブリン結合性を示す変異型t-ＰＡを選
択することを特徴とする、天然t-ＰＡと比較してフィブ
リン結合性が調整されている変異型ヒトt-ＰＡタンパク
質を得る方法を提供するものである。

【００２１】本発明の全体としての効果は、天然t-ＰＡ
に独特のフィブリン分解性物質としての所望の特性、す
なわちフィブリン結合性およびフィブリン刺激性を回復
させることにあり、具体的には、他の所望の諸性質を付
与するために天然t-ＰＡを他の面について修飾したこと
により、上記の性質が欠失されたと認められる場合にお
ける、そのような修復である。すなわち、例えば、フィ
ンガードメインおよび／または成長ドメインおよび／ま
たはクリングル１ドメインのすべてまたは一部を除去す
ることにより、たとえば天然t-ＰＡと比較して増大した
半減期および減少したクリアランス速度などの所望の性
質を有する変異体が得られる。しかし、これらの変異体
は結局、t-ＰＡ独特のフィブリン分解活性にとって実質
的に必須の性質であるフィブリン結合性が減少されるこ
とになる。本発明の１つの態様は、天然のt-ＰＡと比較
し、全体として増強された性質、たとえば天然t-ＰＡに
類似したフィブリン結合性、および天然t-ＰＡと比較し
て増大した半減期／減少したクリアランス速度を有する
変異体を提供することにより、フィブリン分解活性を修
復することにある。

【００２２】より詳細には、本発明は、天然t-ＰＡと比
較して調整されたフィブリン結合性を示すヒトt-ＰＡ変
異体を提供する方法を目的とするものである。

【００２３】他の態様では、本発明は、フィブリン結合
性に関与しているドメインの少なくとも一部分を機能的
に除去することにより修飾されているが、天然t-ＰＡに
匹敵するフィブリン結合性に修復されているヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター(t-ＰＡ)変異体を目的と
するものである。

【００２４】本発明は、１８４グリコシル化部位、１本
鎖から２本鎖への開裂部位および／またはクリングル２
推定リジン結合部位における分子改変と共に、それ自身
実質的にフィブリン結合活性を減少させるフィンガード
メインにおける大部分の改変を行うことにより、天然の
組織プラスミノーゲンアクチベーターに基本的な生物学
的および薬学的性質または特性を驚くほどに保持してお
り、かつ高いフィブリン結合性が実質的に修復されてい
るヒトプラスミノーゲンアクチベーターの変異体が得ら
れること、を証明した、特定の成功を収めた研究を特に
基礎としている発明である。本発明の結果物は、アミノ
酸配列が全体としては実質的に天然物質と異なっている
が、商業的方面の開発において天然物質と競合できる程
に、かつ本質的にその所望のフィブリン分解性を保持し
ている分子である。

【００２５】この態様として本発明は、フィンガードメ
インの少なくとも一部分を欠いており、１８４アミノ酸
を取り巻くグリコシル化部位におけるグリコシル化能を
欠いており、そして２７５および２７６アミノ酸を取り
巻く部位におけるタンパク分解的開裂に対する耐性を有
しており、および／またはクリングル２の推定リジン結
合部位におけるアミノ酸修飾を有しているヒトプラスミ
ノーゲンアクチベーター変異体を提供するものである。
具体的には、この態様は、例えば次のような新規なt-Ｐ
Ａ変異体種によって明示される：１８４位にアスパラギ
ン酸(Ｄ１８４と呼ぶ)および２７５位にグルタミン酸
(Ｅ２７５と呼ぶ)を有していることある、アミノ酸１〜
４４を欠いている分子(デス１-４４と呼ぶ)であって、
本明細書ではデス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-ＰＡおよ
びデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡという簡略法によって全
体を命名することができる種、ならびに例えば１-４４
アミノ酸を欠き(デス１-４４と呼ぶ)、および２７５位
にグルタミン酸を有し、および２１０-３アミノ酸部位
にＲＡＲＲを有する分子であって、本明細書においては
デス１-４４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７
５t-ＰＡと命名される種。

【００２６】本発明のt-ＰＡ変異体をこのような簡略命
名法によって命名するため、数字は、推定の成熟t-ＰＡ
[EPA 093619]の５２７アミノ酸配列に沿ったアミノ酸残
基／位置を表していることに留意すべきである。アミノ
酸の特定には以下のようなアルファベットの１文字を使
用しており： Ａsp Ｄ アスパラギン酸 Ｉle Ｉ イソロイシン Ｔhr Ｔ スレオニン Ｌeu Ｌ ロイシン Ｓer Ｓ セリン Ｔyr Ｙ チロシン Ｇlu Ｅ グルタミン酸 Ｐhe Ｆ フェニルアラニン Ｐro Ｐ プロリン Ｈis Ｈ ヒスチジン Ｇly Ｇ グリシン Ｌys Ｋ リジン Ａla Ａ アラニン Ａrg Ｒ アルギニン Ｃys Ｃ システイン Ｔrp Ｗ トリプトファン Ｖal Ｖ バリン Ｇln Ｑ グルタミン Ｍet Ｍ メチオニン Ａsn Ｎ アスパラギン そして、このような１文字の後にある番号はアミノ酸の
位置を表しており、したがって例えばＤ１８４は、１８
４位にアスパラギン酸を有している変異体を意味してい
る。

【００２７】さらに具体的に好ましい本発明の態様とし
ては以下のものを挙げることができる：フィンガードメ
インの少なくとも一部分を欠いているt-ＰＡ変異体、例
えばデス１-４４、および／またはアミノ酸領域２７５
から２７９に修飾を施した、２７５／６開裂部位の開裂
に対して耐性になっている、例えばＥ２７５およびＥ２
７５Ｉ２７７、およびこのようにしてさらに例示すれ
ば、デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４Ｅ２７５Ｉ２７
７、ならびに以下に例示するような分子内の種々の他の
領域が修飾されていることある上記すべてのもの： −１ 例えばアミノ酸約２０５-２１５領域、特に２１
０-３におけるクリングル２修飾、および／または −２ アミノ酸約２４４-２５５、特に２５２またはそ
の部位、および／または −３ アミノ酸約２３３-２４２、特に２３６-８、およ
び／または −４ 既知のまたは新たに導入されたグリコシル化部
位、例えば１８４アミノ酸、および／または −５ 天然t-ＰＡ、または天然t-ＰＡと比較して減少し
たフィブリン結合性を示すが、他の幾つかの増大された
生物学的特性は基本的に影響を受けていないままのその
変異体、と比較して増大したフィブリン結合性によって
同定され得るt-ＰＡ変異体が得られる他の修飾。

【００２８】上記の変異体の具体例を以下に記載する：
デス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２
７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｓ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ、デ
ス１-４４Ｋ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｒ２１
０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ(既述して
いるように、これは特に好ましい種である)、テ゛ス 1-４４Ｒ２５２Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｋ２１
０Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｒ２１０Ｈ２１１Ｑ２
１２Ｋ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ、およびさらにＩ２７７修
飾、およびそれらの組合わせおよび入れ換えを有する上
記すべての種、例えば１-４４Ｒ２１２Ｒ２５２Ｅ２７
５t-ＰＡなど。

【００２９】さらなる態様には、無傷のフィンガードメ
イン(の部分)(例えば１-４４アミノ酸)を有するか、ま
たは有さない、および／または成長因子ドメイン(また
はその部分)を欠いている(例えばデス約４４−８４)、
および／またはクリングル１ドメイン(またはその部分)
を欠いている(例えばデス約９２-１７９)、および／ま
たはクリングル２ドメイン(またはその部分)を欠いてい
る(例えばデス約１７４-２６１)t-ＰＡ変異体を挙げる
ことができ、これらはすべて天然のt-ＰＡと比較して有
意にクリアランス速度が改変されている場合があり、ま
た上述した好ましい変異体、例えばＥ２７５、Ｅ２７５
Ｉ２７７、Ｑ２７５Ｉ２７７などと組み合わせた前記の
すべてのものがある。さらに、t-ＰＡのフィブリン結合
性は調整することができ、最も好ましくは、t-ＰＡの推
定リガンド結合ポケットの反対の端における陽性または
陰性に帯電したアミノ酸残基を適当に置換することによ
って、修復または増大させることができる。

【００３０】したがって、本発明の好ましい変異体には
さらに以下のものがある： デス１-４４Ｄ１８４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１
３Ｒ２５２Ｅ２７５ t-ＰＡ デス９２-１７９Ｄ１８４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ
２１３Ｒ２５２Ｅ２７５t-ＰＡデス４４-８ＤＤ１８４
Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｒ２５２Ｅ２７５ t
-ＰＡ、 またはそのＮ１８４およびＳ１８４同族体。

【００３１】本発明をより具体的に実施するために使用
することができる方法の詳細な説明、および現時点にお
いて実施し得る最良の方法と考えられる詳細について、
以下、さらに説明する。しかし、これらは本発明の範囲
を限定するものと解してはならず、むしろ本発明の範囲
は、現在の請求の範囲の法的構成によってのみ支配され
るものである。

【００３２】Ａ．定義／一般的方法 １．部位-特異的突然変異 本明細書に沿ってt-ＰＡ変異体を製造するに当たって
は、好ましくは、t-ＰＡタンパク質の初期に調製された
変異型または非変異型誘導体をコードしているＤＮＡに
部位-特異的突然変異を行う。部位-特異的突然変異によ
れば、十分な大きさのプライマー配列を得るため、所望
の突然変異のＤＮＡ配列をコードしている特定のオリゴ
ヌクレオチド配列および十分な数の隣接ヌクレオチドを
使用することによって、t-ＰＡ変異体を製造することが
でき、そうすれば欠失接合部の両側に安定な二重ラセン
(duplex)を形成させるための配列複雑性が回避(トラバ
ース)される。通常は、約２０-２５長のヌクレオチドの
プライマーが好ましく、配列の接合部の両側における約
５-１０残基を改変する。部位-特異的突然変異の技法
は、アデルマン(Adelman)らのDNA 2,183(1983)などの刊
行物によって例示されているように、一般には当業界周
知である。この技法は通常、１本鎖および２本鎖の両形
態で存在するファージベクターを使用することは理解さ
れているとおりである。部位-特異的および突然変異誘
発に有用である代表的なベクターにはＭ１３ファージな
どのベクターがあり、これは例えばメッシング(Messin
g)らの第３回クリーブランドにおける、巨大分子および
組換えＤＮＡについてのシンポジウム[Third Cleveland
Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA、
ウオルトン(A.Walton)編, エルセビア(Elsevier), アム
ステルダム(1981)]に開示されている。これらのファー
ジは市販されており容易に入手でき、それらの使用法は
一般に当業者には周知である。あるいは、１本鎖ＤＮＡ
を得るために、１本鎖ファージの複製起点を含有するプ
ラスミドベクター[ベイラ(Veira)らのMeth.Enzymol. 15
3,3(1987)]を使用することもできる。

【００３３】一般に、本発明にしたがった部位-特異的
突然変異は、組織プラスミノーゲンアクチベーターをコ
ードしているＤＮＡ配列をその配列内に含有する１本鎖
ベクターをまず入手することにより実施する。所望の突
然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、
一般には合成的に、例えばクレア[Crea,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.75,5765(1978)]らの方法によって調製す
る。次いで、このプライマーを１本鎖のt-ＰＡ配列含有
ベクターとアニーリングし、Ｅ.coli(大腸菌)ポリメラ
ーゼＩクレノーフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼ
酵素反応に供することにより、突然変異を含有する鎖
(ストランド)の合成を行う。このようにして、一方の鎖
が元の非突然変異配列をコードしており、他方の鎖が所
望の突然変異を有しているヘテロ二重ラセンを形成させ
る。次いで、このヘテロ二重ラセンベクターを使用し、
ＪＭ１０１細胞などの適当な細胞を形質転換することに
より、突然変異された配列の並びを有する組換えベクタ
ーを含有したクローンを選択する。

【００３４】このようなクローンを選択した後、t-ＰＡ
の産生に適当なベクター、一般には適当な真核生物宿主
の形質転換に使用することのできるタイプの発現ベクタ
ー内に、得られた突然変異t-ＰＡ領域を移動させ、配置
させればよい。本発明においては、長期に安定なt-ＰＡ
産生体を調製するために好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞ま
たは２９３細胞である。しかし、本発明はＣＨＯ生産に
限定されるものではなく、具体的に、試験目的として該
酵素を一時的にのみ生産させたい場合などは、多くの他
のタイプの細胞を使用することができることが分かって
いる。例えば、以下には、２９３細胞[グラハム(Graha
m)らのJ.Gen.Virol.36,59(1977)]を使用する一時的系を
記載しているが、これは分析用のt-ＰＡ変異体を生産す
るための簡便な系を提供するものである。

【００３５】２．宿主細胞培養およびベクター ＣＨＯ発現は結局はt-ＰＡ生産のために好ましいが、本
明細書に記載のベクターおよび方法は、原核生物および
真核生物という広範な範囲にわたる宿主細胞で使用する
のに適している。

【００３６】一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニング
および本発明に有用なベクターの構築には原核生物が好
ましいのは当然である。例えば、Ｅ.coli Ｋ１２ 株２
９４(ＡＴＣＣ Ｎo.３１４４６)は特に有用である。他
の使用することができる微生物株には、Ｅ.coli Ｂおよ
びＥ.coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎo.３１５３７)など
のＥ.coli 株がある。当然ながら、これらの例示した株
は限定的なものではなく、単なる説明のためのものであ
る。

【００３７】発現のためにも原核生物を使用することが
できる。上記の株、およびＥ.coliＷ３１１０(Ｆ-、ラ
ムダ-、原栄養株、ＡＴＣＣ Ｎo.２７３２５)、バシラ
ス・ズブチリス(Bacillus subtilus)などのバシラス
属、およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella ty
phimurium)またはセラチア・マルセサンス(Serratia ma
rcesans)などの他の腸内細菌属、および種々のシュード
モナス種を使用することができる。

【００３８】一般には、これらの宿主細胞と共に、その
宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび制御配列
を含有するプラスミドベクターを使用する。そのベクタ
ーは普通は、複製部位、および形質転換された細胞内に
おいて表現型の選択性を付与することのできるマーキン
グ配列を含有する。例えば、Ｅ.coli は、Ｅ.coli 種由
来のプラスミドであるpＢＲ３２２によって通常形質転
換される[例えばボリバー(Bolivar)らのGene 2,95(197
7)を参照のこと]。pＢＲ３２２はアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含有しており、
したがって形質転換された細胞を同定するための容易な
手段を提供するものである。pＢＲ３２２プラスミド、
または他の微生物プラスミドもしくはファージはさら
に、自身のタンパク質を発現するためにその微生物が使
用することのできるプロモーターを含有していなければ
ならず、または含有するように修飾しなければならな
い。

【００３９】組換えＤＮＡの構築で最も普通に使用され
るプロモーターには、β−ラクターゼ(ペニシリナーゼ)
およびラクトースプロモーター系[チェンジ(Chang)らの
Nature 375,615(1978)、イタクラ(Itakura)らのScience
198,1056(1977)；(ゴーデル(Goeddel)らのNature 281,
544(1979))]、およびトリプトファン(trp)プロモーター
系ゴーデルらのNucleic Acids Res.8,4057(1980)；EPO
出願公開第0036776号がある。これらは最も普通に使用
されるものであるが、他の微生物プロモーターも発見さ
れており、使用され、それらのヌクレオチド配列に関す
る詳細が開示され、当業者ならば、それらをプラスミド
ベクターに機能的に連結することができる[例えば、シ
ーベンリスト(Siebenlist)らのCell 20,269(1980)を参
照]。

【００４０】原核生物に加えて、酵母などの真核微生物
培養物を使用することもできる。サッカロマイセス・セ
レビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、または普通の
パン酵母が真核微生物の中でも最も普通に使用されてい
るが、他の多くの株も普通に利用することができる。サ
ッカロマイセスにおいて発現させるためには通常、例え
ばプラスミドＹＲp７が使用される[スチンコム(Stinchc
omb)らのNature 282,39(1979)、キングスマン(Kingsma
n)らのGene 7,141(1979)、シェンパー(Tschemper)らのG
ene 10,157(1980)]。このプラスミドは、トリプトファ
ン環境下での増殖能を欠いている酵母の突然変異株に選
択マーカーを付与するtrp１遺伝子を既に含有している
[例えば、ＡＴＣＣ Ｎo.４４０７６またはＰＥＰ４-１
(ジョーンズ(Jones)のGenetics 85,12(1977))]。次い
で、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてtrp１欠損が存在
することにより、トリプトファン不存在下における増殖
によって形質転換を検出するために有効な環境が提供さ
れる。

【００４１】酵母ベクターにおける適当なプロモーター
配列には、３-ホスホグリセレートキナーゼにかかるプ
ロモーター[ヒッツェマン(Hitzeman)らのJ.Biol.Chem.2
55,2073(1980)]、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒ
ド-３-ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース-６-ホスフェートイソメラーゼ、３-ホスホ
グリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセ
ホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ
ーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖系酵素[ヘ
ス(Hess)らのJ.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)、ホーラン
ド(Holland)らのBiochemistry 17,4900(1978)]にかかる
プロモーターがある。適当な発現プラスミドを構築する
に当たっては、これらの遺伝子に付随する終止配列も、
発現させようとする配列の３'側で発現ベクターに連結
させ、mＲＮＡのポリアデニル化および終止を行わせ
る。増殖条件によって制御される転写という付加的な利
点を有している他のプロモーターには、アルコール脱水
素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒
素代謝に関与する分解酵素、および上記のグリセルアル
デヒド-３-ホスフェート脱水素酵素、およびマルトース
とガラクトースの利用に関与する酵素、にかかるプロモ
ーター領域がある。酵母適合性のプロモーター、複製起
点および終止配列を含有するプラスミドベクターが適当
である。

【００４２】微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培
養物も宿主として使用することができる。具体的には、
脊椎動物または非脊椎動物のいずれであっても、このよ
うな細胞培養物を使用することができる。しかし、脊椎
動物細胞への関心が高まっており、培養物(組織培養物)
中における脊椎動物細胞の増殖は最近では常法になって
来ている[Tissue Culture、アカデミック・プレス、ク
ルスら(Kruse and Patterson)編集]。このような有用な
宿主セルラインとしては例えば、ＶＥＲＯおよびＨeＬa
細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)セルライ
ン、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ-７、２９３およ
びＭＤＣＫセルラインが挙げられる。このような細胞の
ための発現ベクターは通常、(要すれば)複製起点、発現
すべき遺伝子の前に位置するプロモーターを、必須のリ
ボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位、および転写終止配列と共に含有している。

【００４３】哺乳動物細胞を使用するには、ウイルス物
質によって発現ベクター上の制御機能を付与することが
多い。例えば、普通使用されるプロモーターは、ポリオ
ーマ、アデノウイルス２、および最も頻繁にはサルウイ
ルス４０(ＳＶ４０)から誘導される。ＳＶ４０ウイルス
における初期および後期プロモーターは、両者共にＳＶ
４０ウイルスの複製起点をも含有するフラグメントとし
て該ウイルスから容易に入手されるので、特に有用であ
る[フィールズ(Fiers)らのNature 273,113(1978)]。ま
た、このウイルスの複製起点内に位置するＨindIII部位
からＢglI部位に伸長する約２５０bp配列を含有してい
る限りは、それよりも小さく、または大きなＳＶ４０フ
ラグメントを使用することもできる。さらに、所望の遺
伝子配列に通常伴われたプロモーターまたは制御配列
も、そのような制御配列が宿主細胞系に受け入れられる
限りは利用することができ、それは望ましいことが多
い。

【００４４】複製起点を付与するには、ＳＶ４０または
他のウイルス(例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、
ＢＰＶ)起源から誘導され得るような外来性の起点を含
有するようベクターを構築するか、または宿主細胞の染
色体における複製メカニズムに拠ればよい。後者の場
合、ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれれば、十
分である場合が多い。

【００４５】変異型t-ＰＡおよびＤＨＦＲタンパク質の
両方をコードしているＤＮＡ配列を含有する本発明のベ
クターによってトランスフェクトするための、好ましい
宿主細胞を選択するに当たっては、使用するＤＨＦＲタ
ンパク質のタイプに応じて宿主を選択するのが適当であ
る。野生型ＤＨＦＲタンパク質を使用する場合、ＤＨＦ
Ｒに欠損がある宿主細胞を選択することが好ましく、そ
れによりヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠
く選択培地中でトランスフェクションを成功させるため
のマーカーとして、ＤＨＦＲをコードしている配列が使
用できるようにする。この場合の適当な宿主細胞は、ウ
ルローブおよびチャシン(Urlaub and Chasin)のProc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.77,4216(1980)に記載されているよ
うに調製され、増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイ
ニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)セルラインである。

【００４６】他方、メトトレキサート(ＭＴＸ)に対する
低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンパク質を制御配列
として使用する場合、必ずしもＤＨＦＲ欠損細胞を使用
する必要はない。突然変異ＤＨＦＲはメトトレキサート
に対して耐性であるので、宿主細胞自身がメトトレキサ
ートに感受性である限り、ＭＴＸ-含有培地を選択手段
として使用することができる。ＭＴＸを吸収することの
できる殆どの真核生物細胞がメトトレキサートに感受性
であるようである。このような有用なセルラインの１例
としてＣＨＯライン、ＣＨＯ-Ｋ１(ＡＴＣＣ Ｎo.ＣＣ
Ｌ６１)が挙げられる。

【００４７】細胞培養物から満足のいく量のヒトt-ＰＡ
が生産される。しかし、ある第２のコード化配列を使用
して純化すれば、さらに生産レベルを向上させることが
できる。この第２のコード化配列は、メトトレキサート
などの外部的に制御されたパラメーターによって影響を
受けるジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)を含有してお
り、したがってＭＴＸ濃度の制御によって発現を制御す
ることができる。

【００４８】３．使用し得る代表的な方法 強靭な細胞膜バリアーの無い細胞を宿主細胞として使用
する場合は、グラハム(Graham)およびフォン・デル(Van
der)編のVirology 52,546(1978)に記載されているリン
酸カルシウム沈降法によってトランスフェクションを行
う。しかし、核注入(核インジェクション)またはプロト
プラスト融合法などのＤＮＡを細胞に導入するための他
の方法も使用することができる。

【００４９】原核生物細胞、または実際に細胞壁構築物
を含有する細胞を使用する場合、トランスフェクション
の好ましい方法は、コーエン(Cohen)らのProc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.69,2110(1972)に記載されているような、
カルシウムを使用するカルシウム処置である。

【００５０】所望のコード化および制御配列を含有する
適当なベクターの構築には、標準的な連結法を使用す
る。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開
裂し、仕立て、必要なプラスミドを得るのに望ましい形
態に再連結する。

【００５１】開裂は、適当な緩衝液中において制限酵素
(または酵素群)で処理することによって行う。一般に
は、緩衝溶液約２０μl中、酵素１単位と共に、プラス
ミドまたはＤＮＡフラグメント約１μｇを使用する(個
々の酵素に対応する適当な緩衝液および基質の量は、取
り扱い説明書に指示されている)。３７℃において約１
時間インキュベートする。インキュベート後、フェノー
ルおよびクロロホルムによってタンパク質を除去し、次
いでエタノールによる沈殿によって、その水性フラクシ
ョンから核酸を回収する。

【００５２】平滑末端が必要な場合は、１５℃におい
て、ポリメラーゼＩ(クレノー)１０単位で１５分間処理
し、フェノール-クロロホルム抽出し、次いでエタノー
ル沈殿すればよい。

【００５３】開裂させたフラグメントのサイズ分離は、
６％ポリアクリルアミドゲルを使用して行う[ゴーデル
(Goeddel)らのNucleic Acids Res. 8,4057(1980)]。

【００５４】約等モル量の所望の成分を連結するために
は、正しい適合が行われるよう仕立てた適当な末端を、
ＤＮＡ０.５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ約１０単位
で処理する(開裂させたベクターを成分として使用する
場合は、細菌アルカリホスファターゼで前処理して開裂
ベクターの再連結を防止するのが有用であろう)。

【００５５】上述のように、t-ＰＡ変異体は特異的突然
変異の方法によって好ましく生産される。本発明を実施
する上で有用である突然変異体は、所望の欠失接合部の
ＤＮＡ配列をコードしている特定のオリゴヌクレオチド
配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドを使用するこ
とによって最も容易に作成することができ、それにより
充分な大きさの配列が得られ、欠失接合部の両側に安定
な二重ラセンを作成するための配列複雑性が回避され
る。

【００５６】構築されたプラスミドが正しい配列である
ことを確認するための分析には通常、連結混合物(ライ
ゲーション混合物)により、Ｅ.coli Ｋ１２ 株２９４
(ＡＴＣＣ ３１４４６)または他の適当なＥ.coli 株を
形質転換し、その場に適当であるアンピシリンまたはテ
トラサイクリン耐性によって、成功した形質転換体を選
択する。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、
メッシング(Messing)らのNucleic Acids Res. 9,309(19
81)の方法またはマキサム(Maxam)らのMethods of Enzym
ology 65,499(1980)の方法に基づく制限マッピングおよ
び／またはＤＮＡ配列決定法によって分析する。

【００５７】ＤＮＡを哺乳動物細胞宿主に導入し、安定
なトランスフェクト体のための培地中で選択した後、宿
主細胞培養物を、ＤＨＦＲ活性の競合インヒビターであ
るＭＴＸ約２０-５００,０００nＭ濃度の存在下に増殖
させ、それによりＤＨＦＲタンパク質をコードしている
配列の増幅を行う。当然ながら、この有効濃度の範囲
は、ＤＨＦＲ遺伝子の本質、タンパク質、宿主の特性に
非常に左右される。明らかに一般に規定される上限およ
び下限は、確認することができない。他の葉酸同族体ま
たはＤＨＦＲを阻害する他の化合物、における適当な濃
縮物も使用することができる。しかし、ＭＴＸが簡便で
あり、容易に入手でき、有効である。

【００５８】Ｂ．t-ＰＡの比較変異体の製造 以下に、プラスミドpＣＶＳＶＰＡ-Ｎ４４ Ｄ２２の構
築を、プラスミドp１１５４の調製の説明と共に詳細に
説明する。

【００５９】同様に、プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６ ２
Ｃ９の調製の説明と共に、部位特異的突然変異の実験に
ついても詳細に説明する。

【００６０】以下に記載のオリゴヌクレオチドを使用す
る部位特異的突然変異によって、デス４４-８４の成長
因子ドメイン欠失、デス９２-１７９のクリングル１ド
メイン欠失、およびデス１７４-２６１のクリングル２
ドメイン欠失も作成し(下記参照)：

【化１】 (上記デルタ印は、欠失させた配列の部位を示している)
(図３参照)、これらを使用し、t-ＰＡのコード化配列の
バルクを含有する１.４kb ＢglII／ＡpaＩフラグメント
(１本鎖のベクター形態)で突然変異を起こさせる以外
は、以下のようなデス１-４４の構築に類似した方法に
よって発現プラスミドを調製した。さらに、デス１-４
４構築と類似した方法によって、デス４４-８４および
デス９２-１７９突然変異物も基本的にＢglII／ＳcaＩ
フラグメント上に単離し、０.６３kb ＳcaＩ／ＡpaＩフ
ラグメント上のＧlu２７５突然変異物およびt-ＰＡ Ｃ-
末端コード化配列と結合し、それにより以下に記載のよ
うなp１１５４に類似したプラスミドを作成した。

【００６１】Ｃ．本発明のt-ＰＡ変異体の組換え的生産
のための発現ベクターの調製および利用 １．プラスミドの構築 ａ．プラスミドp１１５４ １）プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６ プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６(pＥＴＰＦＲとも呼ぶ)
を、例えば欧州特許出願公開第93619号(前掲)に記載の
ように調製した。模式図的な詳細は図１を参照のこと。
さらに付言すれば、このプラスミド自身、およびＣＨＯ
細胞におけるトランスフェクト体としてのこのプラスミ
ドは、それぞれＡＴＣＣ Ｎo.４０４０３およびＧＲＬ
９６０６の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション[米国、メリーランド、ロックビル]に寄託され
ている(寄託日：１９８７年１２月１５日)。

【００６２】２）プラスミドpＣＶＳＶＰＡ-Ｎ４４ Ｄ
２２ プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６(前掲)をＳtuＩおよびＥco
ＲＩで消化し、アミノ酸２０３までのt-ＰＡプレ配列を
コードしている配列を含有する８２６塩基対のフラグメ
ントを遊離させる。このフラグメントを、ＳmaＩ／Ｅco
ＲＩで消化した、複製形態のＭ１３ファージベクターで
あるＭ１３mplＯＲＦのベクターフラグメント[例えば、
メッシングらの巨大分子組換えＤＮＡに関する第３回ク
リーブランドシンポジウム、A.Walton編、アムステルダ
ム、エリセビア(1981)を参照のこと]と連結させた。し
たがって、この中間プラスミド、pＰＡ-Ｎ４４intＡ
は、部位特異的欠失突然変異によってアミノ酸１-４４
のコドンが除去されるはずのt-ＰＡ遺伝子の部分を含有
するＭ１３ファージの複製形態であった。

【００６３】この突然変異を行うため、クレア(Crea)ら
のProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75,5765(1978)に記載の
ホスホトリエステル法などの方法によって、オリゴヌク
レオチドプライマーを調製した。デス(１-４４)の突然
変異体を調製するために使用したプライマーは、以下の
プレ配列を有していた：

【化２】

【００６４】このプライマーの１０個の５'ヌクレオチ
ドは−３から−１アミノ酸のプレ配列(gly-ala-arg)を
コードしており、１７個の３'ヌクレオチドは、アミノ
酸４５から４９(ＳＥＲ-ＶＡＬ-ＰＲＯ-ＶＡＬ-ＬＹＳ)
をコードしていることは、理解されよう。ＢglII部位を
保持させるため、セリン-４５としては「ＴＣＴ」コドン
を使用していることに注意願いたい。

【００６５】この合成オリゴヌクレオチド約２００mｇ
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ約８Ｕを含有する５
０mＭ トリス-ＨＣlpＨ７.５、１０mＭ ＭgＣl₂、１０m
Ｍジチオトレイトール、１mＭ ＡＴＰ３０μl中、３７
℃で３０分間、リン酸化した。得られたリン酸化プライ
マー１００μｇを含有する１０mＭ トリス−ＨＣlｐＨ
７.５、１０mＭ ＭgＣl₂、１mＭ ジチオトレイトール約
４０μl中で、ヘテロ二重ラセンを形成させるため、１
本鎖pＰＡ-Ｎ４４intＡ約５０nｇを９５℃に加熱(１０
分間)し、ゆっくりと室温にまで冷却させ(３０分間)、
次いで４℃に冷却した。２mＭ ＡＴＰ、各０.２５mＭ
のdＧＴＰ、dＣＴＰ、dＡＴＰ、dＴＴＰ、Ｅ.coli ポリ
メラーゼＩ大きい(クレノー)フラグメント５Ｕ、および
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００Ｕを含有するリガーゼ緩衝液
約１０μlを添加することによって、プライマー延長を
開始させた。１５℃において１時間反応させた後、得ら
れた混合物を使用してＪＭ１０１細胞を形質転換した。

【００６６】形質転換は、すべての連結混合物(ライゲ
ーション混合物)を受容性ＪＭ１０１細胞２００μlと混
合し、次いで氷上で３０分、および３７℃で５分間イン
キュベートすることによって行った。次いで、５５℃の
２ＹＴトップ寒天３.５mlを、ファージ飽和細胞２００
μl、ＩＰＴＧ(２００mＭ)１０μlおよびＸガル５０μl
と混合し、添加後、得られた細胞を、薬物を何等含ま
ず、２ＹＴを含有するペトリ皿上にプレートした。

【００６７】無色のプラークを取り上げ、２ＹＴ培地１
００μlを含有するマイクロタイター皿に移した。この
接種したマイクロタイターの液を、２ＹＴトップ寒天８
ml中、ＪＭ１０１細胞６００μlの芝を重層した直径１
５cmの１Ｂ寒天平板の上にスタンプし、３７℃で一晩イ
ンキュベートした。生成したプラークを、ニトロセルロ
ースディスクに１分間物理的に接触させ、それに移し
た。得られたニトロセルロースディスクを０.５Ｍ Ｎa
ＯＨ、１.５Ｍ ＮaＣlで３分間処理し、３Ｍ ＮaＣl-
０.５Ｍ トリス-ＨＣlpＨ７.５で１５分間２回洗浄し、
次いで２Ｘ ＳＳＣで１５分間洗浄した。プレハイブリ
ダイゼーション混合物(ミックス)は、１０mＭ トリス-p
Ｈ７.５、５mＭ ＥＤＴＡ、０.９Ｍ ＮaＣl、１×デン
ハート(Denhardt)０.５パーセントＮＰ４０、１００μ
Ｍ ＡＴＰ、１mＭ ピロリン酸ナトリウム、１mＭ リン
酸ナトリウムおよび５０μｇ/mlＥ.coli tＲＮＡを含有
している。１×デンハートのそれは、１リットル当たり
フィコール(Ficoll)２００mｇ、ポリビニルピロリドン
２００mｇ、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ；フラクション
V)２００mｇを含有している。得られたディスクを真空
下で９０分間、８０℃で焼いた(bake)。次いで、そのデ
ィスクをペトリ皿中でプレハイブリダイゼーション液６
mlと共に３時間インキュベートした後、５×１０⁶cpmに
標識したプライマーを添加し、一晩ハイブリダイズし
た。そのディスクを、４９℃において０.４ＸＳＳＣで
選択的に洗浄し、そして風乾した後、Ｘ-線フィルムに
照射した。陽性にハイブリダイズしたクローンをさらに
ジデオキシ配列決定法によって分析した[アルデマン(前
掲)を参照]。これらの陽性コロニーから、適切な欠失部
を含有する組換えプラスミドを選択し、それをpＰＡ-Ｎ
４４intＡデルタと命名した。

【００６８】適切な発現という関係からＭ１３ファージ
由来の突然変異遺伝子配列をＤＨＦＲ含有発現ベクター
中に置換させるため、プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６をＢ
glII／ＫpnＩで別々に消化することによりＤＨＦＲ遺伝
子をコードしている大きなフラグメントを単離し、また
ＢstXI／ＫpnＩで消化することにより天然t-ＰＡの３'
末端(アミノ酸４５-５２７)をコードしている２２４０
塩基のフラグメントを単離した。Ｎ４４を担う４００塩
基フラグメント(デス１-４４)突然変異体をpＰＡ-Ｎ４
４intＡデルタからＢglII／ＢstXIによる消化によって
単離し、pＰＡＤＨＦＲ-６から誘導した上記２つのフラ
グメントと互いに連結した。したがって、この連結反応
による生成物(ＣＶＳＶＰＡ-Ｎ４４ Ｄ２２と命名)は、
１-４４アミノ酸をコードしているコドンが除去されて
いる点を除いて、親のプラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６の複
製物(コピー)であった。その透視画法的な詳細は図２を
参照のこと。

【００６９】３）プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６ ２Ｃ９ プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６(pＥＴＰＦＲとも呼ばれ
る)およびpＡ２５Ｅ１０から、ヒトt-ＰＡのＤＮＡを得
た。これら２つのt-ＰＡプラスミドの調製法は、欧州特
許出願公開第093619号(前掲)に記載されている。

【００７０】プラスミドpＡ２５Ｅ１０は、t-ＰＡ遺伝
子の最後の５０８アミノ酸をコードしている配列、およ
び３'非翻訳領域の７７２塩基対を含有している。この
プラスミドをＳacＩおよびＢglIIで消化し、７４４塩基
対のフラグメントを得、それを既述のような常法によっ
て単離した。このフラグメントは、４１１から５２７ま
でのt-ＰＡアミノ酸をコードしているコドンを含有して
おり、また３'非翻訳領域の部分を包含している。

【００７１】プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６は、t-ＰＡの
構造遺伝子全体、および３'非翻訳領域の部分を含有し
ている。このプラスミドをＳacＩおよびＢglIIで消化
し、１,２３０塩基対のフラグメントを得、それを単離
した。このフラグメントは、成熟型のt-ＰＡの最初の４
１０アミノ酸をコードしているコドンを含有している。

【００７２】これらのフラグメントを常法により互いに
連結させ、ＢglIIで消化した。成熟型のt-ＰＡ配列全体
と３'非翻訳領域の部分とをコードしているコドンを含
有する１,９７４塩基対のフラグメントを単離した。２
本鎖のＭ１３mp８(メッシング、前掲)をＢamＨＩで消化
し、ＢglII消化t-ＰＡとアニーリングしてＭ１３mp８Ｐ
ＡＢglIIを作成した。Ｅ.coli ＪＭ１０１細胞(ＡＴＣ
Ｃ Ｎo.３３８７６)をこの２本鎖の複製形態のＭ１３mp
８ＰＡＢglIIで形質転換した。１本鎖および２本鎖(Ｒ
Ｆ)形態のＭ１３mp８ＰＡＢglIIは、このファージに感
染されたＥ.coliＪＭ１０１細胞から単離することがで
きる。t-ＰＡの部位-特異的突然変異には、１本鎖型の
ものを使用した。

【００７３】部位特異的突然変異によってヒトt-ＰＡの
構造遺伝子を修飾し、適当な種々の位置にアミノ酸置換
を有するt-ＰＡを発現させた。合成オリゴヌクレオチド
は、クレアのＥ.coli(前掲)の固相ホスホトリエステル
法などの方法によって調製した。このような部位特異的
突然変異のために調製し、使用した合成プライマーの中
には、以下のものがあった：

【化３】

【００７４】以下に記載の操作法を使用し、合成プライ
マーの突然変異配列を含有する種々のt-ＰＡクローンを
作成した。使用した一般的方法はアデルマン(前掲)のそ
れである。例えば、上記のプライマーを使用することに
より、３Ｍ１３ＲＦ２Ｃ９を作成した。突然変異t-ＰＡ
遺伝子由来の精製Ｍ１３ ＲＦ ＤＮＡをＥ.coli ＪＭ１
０１細胞から調製した。次いで、突然変異t-ＰＡ ＤＮ
Ａ配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用し、突然変
異t-ＰＡのための発現ベクターを構築した。

【００７５】合成オリゴヌクレオチド５０nｇを、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ８Ｕを含有する５０mＭ トリ
ス-ＨＣlpＨ７.５、１０mＭ ＭgＣl₂、１０mＭ ジチオ
トレイトール、１mＭ ＡＴＰ１０μl中、３７℃で３０
分間、リン酸化した。プローブとして使用するため、Ａ
ＴＰの替わりに６０mＣi[γ３２-Ｐ]-ＡＴＰ(３０００
μＣi/mmol)を使用する以外は上記のようにして、リン
酸化し、約５０−６０×１０⁶cpm/４００nｇの２４-mer
を得た。ヘテロ二重ラセンを生成させるため、リン酸化
したプライマー１０nｇおよびＥcoＲＩ-消化Ｍ１３mp８
ＰＡＢglIIＲＦの大きなフラグメント５０nｇを含有す
る１０mＭ トリス-ＨＣlpＨ７.５、１０mＭ ＭgＣl₂、
１mＭ ジチオトレイトール４０μl中において、１本鎖
Ｍ１３mp８ＰＡＢglII１０nｇを９５℃に加熱(１０分
間)し、ゆっくりと室温にまで冷却させた(３０分間)。
２mＭ ＡＴＰ、各０.２５mＭ のdＧＴＰ、dＴＴＰ、dＣ
ＴＰ、およびdＡＴＰ、Ｅ.coli ポリメラーゼＩ大きな
フラグメント５Ｕ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ４００Ｕ
を含有するリガーゼ緩衝液１０μlを添加することによ
って、プライマー延長を開始させた。１２℃において１
時間反応させた後、得られた混合物を使用してＪＭ１０
１細胞を形質転換した。

【００７６】形質転換は、ライゲーション混合物１０μ
lを受容性ＪＭ１０１細胞２００μlと混合し、次いで氷
上で３０分、および３７℃で５分間インキュベートする
ことによって行った。次いで、５５℃の２ＹＴトップ寒
天３.５mlを、飽和ＪＭ１０１細胞２００μl、ＩＰＴＧ
(２００mＭ)１０μlおよびＸガル５０μlと混合し、形
質転換細胞の添加後、薬物を何等含まず、ＬＢを含有す
る９cmペトリ皿上にプレートした。

【００７７】無色のプラークを取り上げ、２ＹＴ培地１
００μlを含有するマイクロタイター皿に移した。この
接種したマイクロタイターの液を、２ＹＴトップ寒天８
ml中、ＪＭ１０１細胞６００μlの芝を重層した直径１
５cmのＬＢ寒天平板上にスタンプし、３７℃で一晩イン
キュベートした。１分間物理的に接触させて、生成した
プラークをニトロセルロースディスクに移した。得られ
たニトロセルロースディスクを０.５Ｍ ＮaＯＨ、１.５
Ｍ ＮaＣlで３分間処理し、３Ｍ ＮaＣl-０.５Ｍ トリ
ス-ＨＣlpＨ７.５で１５分間２回洗浄し、次いで２Ｘ
ＳＳＣで１５分間洗浄した。プレハイブリダイゼーショ
ン混合物(ミックス)は、１０mＭ トリス pＨ７.５、５m
Ｍ ＥＤＴＡ、０.９Ｍ ＮaＣl、１×デンハート(Denhar
dt)０.５パーセントＮＰ４０、１００μＭ ＡＴＰ、１m
Ｍ ピロリン酸ナトリウム、１mＭリン酸ナトリウムおよ
び５０μｇ/mlＥ.coli tＲＮＡを含有している。１×デ
ンハートのそれは、１リットル当たりフィコール(Ficol
l)２００mｇ、ポリビニルピロリドン２００mｇ、ウシ血
清アルブミン(ＢＳＡ；フラクションV)２００mｇを含有
している。得られたディスクを真空下で９０分間、８０
℃で焼いた(bake)。次いで、そのディスクをペトリ皿中
でプレハイブリダイゼーション液６mlと共に３時間イン
キュベートした後、５×１０⁶cpmに標識したプライマー
を添加し、一晩ハイブリダイズした。そのディスクを、
４９℃において０.４Ｘ ＳＳＣで選択的に洗浄し、そし
て風乾した後、Ｘ-線フィルムに照射した。陽性にハイ
ブリダイズしたクローンをさらにジデオキシ配列決定法
によって分析した[アルデマン(前掲)を参照]。

【００７８】ＢglIIおよびＢstＥIIでpＰＡＤＨＦＲ-６
を消化することにより生成される大きなフラグメントを
単離し、フラグメント１と命名されるベクターフラグメ
ントを得た。pＰＡＤＨＦＲ-６をＢglIIおよびＢstXIで
消化して得られる４００塩基対のt-ＰＡフラグメントを
単離することにより、フラグメント２と命名されるフラ
グメントを得た。突然変異t-ＰＡクローン(前掲)由来の
ＲＦ ＤＮＡをＢstXIおよびＢstＥIIで消化することに
より、所望の突然変異を含有する１,１４１塩基対t-Ｐ
Ａフラグメント(フラグメント３)を得た。フラグメント
１および２をそれぞれフラグメント３と連結させた。得
られたＤＮＡ混合物を使用し、Ｅ.coliを形質転換し
た。形質転換体各々から、それぞれ真核生物発現ベクタ
ー、例えばpＰＡＤＨＦＲ-６ ２Ｃ９を得た。

【００７９】４）p１１５４の最終的構築 プラスミドpＥＴＰＦＲを制限酵素ＢglIIおよびＡpaＩ
で消化し、得られたフラグメントをアガロースゲル電気
泳動によって分画化した。t-ＰＡプレプロコード化領
域、ＳＶ４０初期プロモーター、β−ラクタマーゼ、お
よびＤＨＦＲ遺伝子を含有する６.０kb フラグメントを
そのゲルから切除し、電気溶離(electroelut)した。

【００８０】プラスミドpＣＶＳＶＰＡ-Ｎ４４ Ｄ２２
をＢglIIおよびＳcaＩで消化し、得られたフラグメント
をアクリルアミドゲル電気泳動によって分画化し、そし
て０.６３kb フラグメント(t-ＰＡの成長因子、クリン
グル１およびクリングル２(部分的)ドメインにかかるコ
ード化配列である)を含有するバンドを切除し、電気溶
離した。

【００８１】プラスミドpＰＡＤＨＦＲ-６ ２Ｃ９をＳc
aＩおよびＡpaＩで消化し、クリングル２(部分的)およ
びプロテアーゼ(Ｇlu２７５突然変異を含有)ドメインの
コード化配列を含有する０.６３kb フラグメントをアク
リルアミドゲル電気泳動によって精製し、電気溶離し
た。

【００８２】このようにして単離した３つの精製フラグ
メントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびrＡＴＰの存在下
にインキュベートし、１-４４残基が欠失し(フィンガー
ドメイン欠失)、Ａrg２７５--＞Ｇlu突然変異が組み込
まれたt-ＰＡ分子をコードしている配列(１本鎖突然変
異体)を含有するプラスミドp１１５４を調製した。図３
参照。

【００８３】ｂ．プラスミドp６５２ ファージｆ1 ＲＦＩ ＤＮＡ[ジンダー(Zinder)らのMicr
obiol.Rev.49,101(1985)]をＲsaＩおよびＡhaIIIで消化
し、ＤＮＡ複製の＋鎖起点を含有する０.４kbフラグメ
ントを単離した。ＢamＨＩリンカーをこのフラグメント
と連結させ、次いでＢamＨＩ消化を行い、ＢamＨＩ粘着
末端を生成させた。次いで、これをプラスミドpＢＲ３
２２[ボリバー(Bolivar)らのGene 2,95(1977)]のＢamＨ
Ｉ部位に挿入し、プラスミドpＢＲfloriを得た。プラス
ミドpＢＲfloriをＢamＨＩで消化し、Ｅ.coli ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノーフラグメントおよびデオキシヌ
クレオシド三リン酸で処理し、平滑末端を生成させ、ｆ
1＋鎖起点を含有する０.４kb フラグメントを単離し
た。次いで、これをpＢＲ３２２のＰvuII部位に挿入
し、プラスミドp６５２を作成した。図４を参照のこ
と。

【００８４】ｃ．プラスミドp１０６０ １）プラスミドpＣＩＳt-ＰＡ サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモータ
ー、サイトメガロウイルスのスプライス・ドナー部位お
よびイントロン、Ｉg可変領域スプライス・アクセプタ
ー部位、t-ＰＡをコードしているcＤＮＡ[ペニカ(Penni
ca)らのNature301,214(1983)]、ならびに肝炎表面抗原
のポリアデニル化および転写終止部位を含有するpＣＩ
Ｈt-ＰＡベクターをまず始めに構築した：

【００８５】サイトメガロウイルスのエンハンサー[ボ
シャート(Boshart)らのCell 41,520(1985)]およびプロ
モーター[トムソン(Thomsen)らのProc.Natl.Acad.Sci.,
U.S.A.86,659(1984)]、サイトメガロウイルスのスプラ
イス・ドナー部位およびイントロンの部分[スターンベ
ルグ(Sternberg)らのJ.of Virol.49 190(1984)]、Ｉg可
変領域イントロンおよびスプライス・アクセプター部
位、第VIII因子をコードしているcＤＮＡおよびＳＶ４
０ポリアデニル化部位を含有するpＦ８ＣＩＳベクター
を構築した。この構築法の３つの部分を以下に詳細に説
明する。

【００８６】１．この最終ベクターのアンピシリン耐性
マーカーおよび複製起点を、プラスミドpＭＬ[ルスキー
(Lusky)らのNature 293,79(1981)]の変異体である、出
発プラスミドpＵＣ１３pＭＬから誘導した。pＵＣ１３
[ベイラ(Veira)らのGene 19,259(1982)]のポリリンカー
をpＭＬのＥcoＲＩおよびＨindIII部位に移すことによ
ってpＵＣ１３pＭＬを構築した。別の出発プラスミドで
あるpＵＣ８ＣＭＶはＣＭＶエンハンサー、プロモータ
ーおよびスプライス・ドナー配列の供給源であった。p
ＵＣ８ＣＭＶは、ＣＭＶエンハンサー、プロモーターお
よびスプライス・ドナー配列にかかる１から７３２のヌ
クレオチドをpＵＣ８の平滑化ＰstＩおよびＳphＩ部位
に挿入することによって構築した(ベイラら、前掲)。こ
の粘着ＢamＨＩ末端に、合成ＢamＨＩ-ＨindIIIリンカ
ー[ニュー・イングランド・バイオラブス(New England
Biolabs)から市販されている]を連結し、ＨindIII部位
を作成した。この連結の後、ＨindIII-ＨincII消化を行
った。この消化により、ＣＭＶエンハンサー、プロモー
ターおよびスプライス・ドナー部位を含有する約８００
bp のフラグメントを得た。ゲル単離した後、この８０
０bp フラグメントをpＵＣ１３pＭＬの２９００bp 片に
連結した。pＦ８ＣＩＳの構築に必要とされるこのフラ
グメントは、上記の中間プラスミドをＳalＩおよびＨin
dIIIで消化することによって得た。この３１２３bp 片
は、アンピシリンについての耐性マーカー、pＵＣ１３p
ＭＬ由来の複製起点ならびにエンハンサー、プロモータ
ーおよびスプライス・ドナー部位を包含するＣＭＶに関
する制御配列を含有していた。

【００８７】２．Ｉg可変領域イントロンおよびスプラ
イス・アクセプター配列は、合成オリゴマーを使用して
構築した。ＩgＧイントロンおよびスプライス・アクセ
プター部位にかかる以下の配列を有する９９-merおよび
３０-merを、化学的に合成した[ボスウェル(Bothwell)
らのCell 24,625(1981)]：

【化４】

【００８８】ＤＮＡポリメラーゼＩ(クレノーフラグメ
ント)により、合成した片を充填し、２本鎖フラグメン
トを作成した[ワーテル(Wartell)らのGene 9,307(198
0)]。次いで、ＰstＩおよびＨindIIIで２回消化した。
この合成リンカーをpＵＣ１３(ベイラら、前掲)のＰst
ＩおよびＨindIII部位にクローンした。この合成オリゴ
ヌクレオチドを含有するクローン(これをpＵＣＩg.１０
と命名する)をＰstＩで消化した。ＰstＩ-ＣlaＩリンカ
ーを使用して、ＣlaＩ部位をこのフラグメントに付加し
た。ＨindIIIで消化した後、ＩgイントロンおよびＩg可
変領域スプライス・アクセプターの部分を含有する１１
８bp 片をゲル単離した。

【００８９】３．本構築手順の第３番目は、肝炎表面抗
原の３'末端をＳＶ４０初期領域のポリアデニル化部位
および転写終止部位と置き換えることである。ＳＶ４０
配列を含有するpＵＣ.ＳＶ４０ベクターをpＵＣ８のＢa
mＨＩ部位[ベリラら、前掲]に挿入し、次いでpＵＣ.Ｓ
Ｖ４０をＥcoＲＩおよびＨpaＩで消化した。ＳＶ４０ポ
リアデニル化部位のみを含有する１４３bp フラグメン
トをこの消化物からゲル単離した。pＳＶＥ.８clＤ[欧
州特許出願公開第160457号]の消化後、さらに２つのフ
ラグメントをゲル単離した。ＥcoＲＩおよびＣlaＩ消化
によって生成される４.８kb フラグメントは、ＳＶ４０
-ＤＨＦＲ転写単位、pＭＬの複製起点およびアンピシリ
ン耐性マーカーを含有している。ＣlaＩおよびＨpaＩ消
化後に得られる７.５kb フラグメントは、第VIII因子の
cＤＮＡを含有している。スリー・パート連結(three-pa
rt ligation)により、pＳＶＥ.８c２４Ｄが得られる。
この中間プラスミドをＣlaＩおよびＳalＩで消化するこ
とにより、ＳＶ４０ポリアデニル化および転写終止部
位、次にＳＶ４０ ＤＨＦＲ転写単位を有する第VIII因
子のcＤＮＡを含有する９６１１bp フラグメントを得
た。

【００９０】pＦ８ＣＩＳを得るための最終的スリー・
パート連結では、a）複製起点、アンピシリン耐性マー
カーおよびＣＭＶエンハンサー、プロモーターおよびス
プライス・ドナーを含有する３１２３bp ＳalＩ-ＨindI
IIフラグメント、b）Ｉgイントロンおよびスプライス・
アクセプターを含有する１１８bp ＨindIII-ＣlaＩフラ
グメント、ならびにc）第VIII因子のcＤＮＡ、ＳＶ４０
ポリアデニル化部位およびＳＶ４０ ＤＨＦＲ転写単位
を含有する９６１１bp ＣlaＩ-ＳalＩフラグメントを使
用した。

【００９１】次に、中間プラスミドpＣla t-ＰＡおよび
プラスミドpＦ８ＣＩＳ(上述)からプラスミドpＣＩＨ t
-ＰＡを構築した：

【００９２】まず始めにt-ＰＡ cＤＮＡをpＭＬにクロ
ーンし、その遺伝子の５'末端をＣlaＩ部位とした。こ
れを行うため、pＳＶpa-ＤＨＦＲ(あるいは、pＥＴＰＦ
Ｒとも称する、前掲)由来の３２３８bp ＨindIIIフラグ
メントをpＭＬのＨindIII部位に挿入した[ラスキー(Lus
ky)ら、前掲]。ＣlaＩ部位に接して並ぶ(juxtaposed)c
ＤＮＡの５'末端を有するクローンについて、コロニー
をスクリーニングした。得られた中間プラスミドをpＣ
ＬＡt-ＰＡと命名した。３'ポリアデニル化領域が後続
するt-ＰＡ cＤＮＡを２８７０bp のＣlaＩ-ＫpnＩフラ
グメントとして単離した。このフラグメントをpＦ８Ｃ
ＩＳの５１４６bp フラグメントと連結した。ＣＩＳベ
クターのこのＣlaＩ-ＫpnＩフラグメントは、pＭＬ由来
の５'制御領域、ＳＶ４０-ＤＨＦＲ転写単位、アンピシ
リン耐性遺伝子および複製起点を提示した。図５および
図６参照。

【００９３】t-ＰＡの発現レベルは、それ自体一般に既
知であり上述した方法にしたがって、ＣＨＯおよび２９
３細胞をpＣＩＨt-ＰＡでトランスフェクトすることに
よって得られた。例えば、トランスフェクトされた２９
３細胞由来の培地を検定することにより、pＣＩＨ t-Ｐ
Ａが４２０nｇ／mlでt-ＰＡを産生したことが証明され
た。

【００９４】サイトメガロウイルスのエンハンサーおよ
びプロモーター、サイトメガロウイルスのスプライス・
ドナー部位およびイントロン、Ｉg可変領域のスプライ
ス・アクセプター部位、t-ＰＡをコードしているcＤＮ
ＡならびにpＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有するpＣ
ＩＳt-ＰＡベクターを最後に構築した：

【００９５】この構築のための出発ベクターはpＣＩＨt
-ＰＡおよびpＦ８ＣＩＳ(上述)であった。この後者のベ
クターは、pＣＩＨt-ＰＡと同じ５'制御を有している
が、第VIII因子のcＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル
化部位を含有している。ＳacIIを使用し、t-ＰＡ cＤＮ
Ａの３'を開裂した。得られた３'突出部をＴ４ポリメラ
ーゼによって平滑末端化した。次いで、pＣＩＨt-ＰＡ
をＣlaＩで切断した。この部位は、ＣＭＶイントロン性
配列とＩg可変領域イントロンとに開裂するキメラ性イ
ントロンを分割している。このＣlaＩ処理物から２８７
０bp フラグメントをゲル単離した。ＳＶ４０ポリアデ
ニル化部位、ＤＨＦＲ、転写制御、細菌性複製起点およ
びamp^r遺伝子、ならびにＣＭＶエンハンサーおよびプロ
モーターおよびスプライス・ドナーをpＦ８ＣＩＳから
単離した。これらの要素を、２５２５bp Ｓal-ＢamＨＩ
フラグメントおよび３１１３bp ＨpaＩ-Ｓalフラグメン
トとしてフラグメント内に分離した。ＫpnＩ(平滑)-Ｃl
aＩフラグメントを、ＨpaＩ-ＳalフラグメントおよびＳ
alからＢamＨＩフラグメントとスリー・パート連結する
ことにより、pＣＩＳt-ＰＡを得、これを、pＣＩＨt-Ｐ
Ａプラスミドについて上述したようにＣＨＯおよび２９
３の両細胞において発現させて、それぞれt-ＰＡを５５
および３０００nｇ／mlで得た。図７および図８参照の
こと。

【００９６】２）p１０６０の最終的構築 プラスミドpＣＩＳ t-ＰＡをＫpnＩで消化し、Ｅ.coli
ＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメントおよびデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸で処理することにより、
平滑末端を作成し、分子内連結によって再環状化させ
た。この処理によりＫpnＩ部位が破壊され、pＣＩＳ t-
ＰＡ △Ｋpnと命名されるプラスミドが得られた。プラ
スミドpＣＩＨ t-ＰＡ △ＫpnをＳalＩおよびＳstIIで
消化し、４.６kb フラグメントを単離した。さらにプラ
スミドpＣＩＳt-ＰＡをＰstＩおよびＳstIIで消化し、
１.４kb フラグメントを単離した。プラスミドp６５２
をＰstＩおよびＳalＩで消化し、３.４kb フラグメント
を単離した。これら３つのフラグメントをスリー・ウエ
イ連結(three-way ligation)によって結合し、プラスミ
ドp１０６０を作成した。図９参照のこと。

【００９７】ｄ．プラスミドp１１７９ プラスミドp１０６０をＢglII(部分)およびＡpaＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動および電気溶離によって
８.０kb フラグメントを精製した。同様に、プラスミド
p１１５４をＢglIIおよびＡpaＩで消化し、１.３kb フ
ラグメントを単離した。これら２つのフラグメントをＴ
４ ＤＮＡリガーゼおよびrＡＴＰを使用して結合させ、
プラスミドp１１７９を得た。図１０参照。プラスミドp
１１７９は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるデス
(１-４４)/Ｇlu２７５t-ＰＡ突然変異体(デス１-４４Ｅ
２７５ t-ＰＡ)、ならびにβ-ラクタマーゼ遺伝子、Ｄ
ＨＦＲ遺伝子およびＤＮＡ複製のｆ1起点を含有してい
た。このデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡのコード化領域の
配列は、図１１〜図１４に示している。

【００９８】２．突然変異実験 ａ．鋳型の調製 プラスミドp１１７９をＣaＣl₂-媒介性形質転換によっ
てＥ.coli 株ＪＭ１０１(ＡＴＣＣ Ｎo.３３８７６)に
導入した。次いで、ベリアらのMeth.Enzymol.153,3(198
7)に記載のように、これらの細胞をヘルパーウイルスＭ
１３Ｋ０７で感染させ、１本鎖p１１７９ＤＮＡを調製
した。簡単に説明すれば、２ＹＴブロス中、形質転換細
胞の飽和培養物０.３mlに１０⁹−１０¹⁰pfuのＭ１３Ｋ
０７を加え、得られた混合物を３７℃で１５分間インキ
ュベートした。５０μｇ/mlカルベニシリン(carbenicil
lin)を含有する新鮮な２ＹＴブロス１.５mlを加え、培
養物を３７℃で１６時間穏やかに振盪させた。細胞をペ
レット化した後、ファージおよびパッケージング化プラ
スミドＤＮＡを採取し、アンダーソン(Anderson)のNuc
l.Acids.Res. 9,3015(1981)に記載のように１本鎖ＤＮ
Ａを調製した。

【００９９】ｂ．部位特異的インビトロ突然変異 プラークハイブリダイゼーションではなく、コロニーハ
イブリダイゼーションによって突然変異体を同定する以
外は、ゾラー(Zoller)らのMeth.Enzymol. 100,468(198
3)に実質的に記載されているオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを使用し、p１１７９の突然変異を行った。ジデ
オキシヌクレオチド鎖成長停止法を使用し、１本鎖プラ
スミドＤＮＡを直接ＤＮＡ配列決定することにより、突
然変異を確認した[サンガー(Sanger)らのProc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A.74,5463(1977)]。

【０１００】ｃ．プラスミド、突然変異体およびプライ
マー 上述の方法(具体的には２ｂ部を参照のこと)により、下
記右欄に示すプラスミドを使用し、中欄に記載する修飾
を有しているプラスミド(下記左欄)を得た。

【化５】

【０１０１】３．発現および精製 ａ．プラスミドの調製 ５０μｇ/mlカルベニシリンを含有するＬＢブロス５０
０ml中で、形質転換した細胞を飽和状態にまで増殖させ
た。遠心により細胞をペレット化し、５０mlmＭ グルコ
ース、１０mＭ ＥＤＴＡ、２５mＭ トリス-ＨＣl(pＨ
８.０)４０ml中に再懸濁した。この懸濁液に１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム、０.１Ｍ 水酸化ナトリウム６０mlを
加え、得られた混合物を２５℃で２分間インキュベート
し、次いで０℃で１０分間インキュベートした。これ
に、４Ｍ 酢酸、３Ｍ 酢酸ナトリウム５２mlを加え、得
られた混合物を０℃で３０分間インキュベートした。次
いで、２０,０００rpmで２０分間遠心し、得られた上清
を２容量の１００％冷エタノールと混合し、遠心によっ
て得られた沈澱物を採取した。プラスミドＤＮＡおよび
ＲＮＡを含有するペレットを乾燥させ、１００mＭ トリ
ス(pＨ８.０)、１０mＭ ＥＤＴＡ、１μｇ/mlＲＮase
Ａに再溶解した。遠心により清澄化した後、臭化エチジ
ウム中０.５mｇ/mlに調節し、同重量の塩化セシウムを
加えた。次いで、得られたＤＮＡをベックマンＶＴＩ６
５ローターにより遠心にかけた(１８℃、５５,０００rp
m、１６時間)。側面注射によりＤＮＡバンドを採取し、
n-ブタノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、水で
希釈し、エタノールにより沈澱させた。ＤＮＡを１０m
Ｍ トリス(pＨ８.０)、１mＭ ＥＤＴＡ中に再溶解し、
終濃度１mｇ/mlとした。

【０１０２】ｂ．トランスフェクションおよび発現 ２９３細胞を全面成長させた。t-ＰＡプラスミドＤＮＡ
(例えば、上記のようにして調製したp１１７９およびそ
の誘導体)１０μｇをＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードしてい
るＤＮＡ[チンマッパヤ(Thimmappaya)らのCell 31,543
(1982)]１μｇと混合し、１mＭ トリス-ＨＣl、０.１m
Ｍ ＥＤＴＡ、０.２２７Ｍ ＣaＣl₂５００μl中に溶解
した。これに５０mＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.３５)、２８
０mＭ ＮaＣl、１.５mＭ ＮaＰＯ_４５００μlを加え(旋
回(ボルテックス)下に滴加した)、２５℃で２０分間沈
澱を生成させた。次いで、懸濁した沈澱物を細胞(１０
０mＭプレート中)に加え、インキュベーター中に４時間
放置した。次いで、培地を吸引除去し、リン酸緩衝化食
塩水中２０％グリセロール２mlを３０秒間で加えた。得
られた細胞を血清不含の培地１０mlで２回洗浄した後、
新鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベートした。

【０１０３】t-ＰＡ変異体を発現する安定なＣＨＯセル
ラインを作成するため、t-ＰＡのコード化配列のバルク
を含有するＢglII/ＡpaＩフラグメント(図９および図１
０)をpＰＡＤＨＦＲ.６由来の６.５kb ＢglII/ＡpaＩフ
ラグメント(図３)と連結させた。次いで、得られたプラ
スミドをＣＨＯ細胞に導入し、メトトレキサート含有培
地中で選択することにより、コード化配列を増幅させ、
それによりt-ＰＡ変異体を過剰に発現させた。

【０１０４】ｃ．精製 抗-t-ＰＡヤギポリクローナルＡ６抗体(それ自体は常法
によって調製した)をカップリングさせた制御化ガラス
ビーズのカラム(１mlベッド容量)にならし培地(conditi
oned medium)を通すことによって、t-ＰＡ生成物を精製
した。培地を入れる前に、カラムをリン酸緩衝化食塩水
で平衡化させ、入れた後は、カラムを０.１Ｍ トリス-
ＨＣlpＨ７.５、１Ｍ ＮaＣlで平衡化させた。t-ＰＡ
は、０.１Ｍ酢酸、０.１５Ｍ ＮaＣl、０.０２Ｍ アル
ギニン(ｐＨ２.０)で溶出させ、得られた分画をトリス-
塩基で素早く中和した。プールする前に、分画を０.０
１％Ｔween８０に調節した。ある場合には、抗-t-ＰＡ
ヤギポリクローナル抗体カラムで最終的に精製する前
に、t-ＰＡ変異体をリジン-セファロースで精製した。

【０１０５】Ｄ．生物学的および薬物動態検定 １．t-ＰＡの定量 天然のt-ＰＡ配列に標準化したＥＬＩＳＡによって、タ
ンパク質濃度を常法とおり測定した[EPA 93619(前掲)参
照のこと]。タンパク質の純度および均質性は、レムリ
(Laemmli)のNature 227,680(1970)の緩衝系を使用し
た、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ-ＳＤＳ)によって分析し
た。通常は、７-１７％グラジエントゲルを使用し、モ
リッセイ(Morrissey)のAnal.Biochem.117,307(1981)の
銀-染色法によりタンパク質を視覚化した。

【０１０６】２．血餅溶解 t-ＰＡ変異体のフィブリン溶解能を検定するに当たり、
カールセン(Carlsen)らのAnal.Biochem.168,428(1988)
の方法にしたがい、飽和濃度のプラスミノーゲンの存在
下に行った。インビトロ血餅溶解検定は、マイクロ遠心
分析器を使用する比濁分析により、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターの活性を測定するものである。トロン
ビンおよびt-ＰＡ試験試料の混合物をフィブリノーゲン
およびプラスミノーゲンの混合物中に遠心することによ
り、血餅形成を開始させ、その後に血餅溶解を開始し
た。得られた吸光度と時間とのプロフィルを分析し、検
定の終点を決定した。t-ＰＡ変異体の活性を、rt-ＰＡ
の標準曲線(EPA 093619)と比較した。この検定の全体に
わたって使用する緩衝液は、０.０１％(v/v)Ｔween８０
および０.０１％(w/v)アジ化ナトリウムを含有する０.
０６Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７.４であった。ヒトトロ
ンビンは濃度３３単位／mlであった。フィブリノーゲン
(２.０mｇ/ml凝固し得るタンパク質)を湿氷上で冷し、
フィブロネクチンを沈殿させ、次いで重力濾過した。Ｇ
lu-プラスミノーゲンは濃度１mｇ/mlであった。分析器
の容器内温度は３７℃に設定する。充填器は、標準曲線
にかかる試料としてのrt-ＰＡ２０μl(-５００nｇ／ml
から１.５μｇ/ml)、または標準曲線の範囲内で溶解を
起こす濃度の変異型rt-ＰＡ２０μl、第２の試薬として
のトロンビン２０μl、および第１の試薬としてのフィ
ブリノーゲン：プラスミノーゲン５０：１(v/v)混合物
２００μlが分散するよう設定する。５分間のインキュ
ベート時間、３４０-nm-フィルターおよび９０-間隔の
判読によって、吸光度／時間プログラムを行った。

【０１０７】３．フィブリン結合性 フィブリン結合性に関する方法は、リーケン(Rijken)ら
のJ.Biol.Chem.257,2920(1982)に記載されている方法の
改変法である。試験するt-ＰＡ試料を、０.０５Ｍ トリ
ス(ｐＨ７.４)、０.１２Ｍ ＮaＣl、０.０１％Ｔween８
０、１mｇ/mlヒト血清アルブミン、および種々の濃度の
プラスミノーゲン不含のフィブリン(０、０.０５、０.
１、０.２５および０.５mｇ/ml)を含有する溶液に加え
る。この反応混合物の最終容量は１mlであった。得られ
た試料を３７℃で５分間インキュベートした後、トロン
ビン１単位を加えた。次いで、得られた試料を３７℃で
１時間インキュベートした。生成した血餅を遠心によっ
て除去し、未結合のままの上清中t-ＰＡの量をＥＬＩＳ
Ａによって測定した。結合したt-ＰＡ変異体 対フィブ
リン(フィブリノーゲン)濃度の％としてデータをプロッ
トした。

【０１０８】４．薬物動態 ａ．目的 ¹²⁵ Ｉ-標識したrt-ＰＡとt-ＰＡ変異体とのターミナル
半減期(terminal half-lives)およびクリアランス(消失
度)を比較するための試験である。

【０１０９】ｂ．方法 ２０匹のウサギを無作為に４つの処置グループに分け
た：rt-ＰＡ、デス１-４４t-ＰＡ、デス１-４４Ｅ２７
５t-ＰＡ、およびデス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-Ｐ
Ａ。これらのタンパク質を¹²⁵Ｉで約１０μＣi／ｋｇま
で標識し、標識化タンパク質の非特異的吸着を減少させ
るため０.１mｇ／ｋｇ rt-ＰＡと混合した。ＴＣＡを沈
殿し得る¹²⁵Ｉ-タンパク質の線量は、名目上５μＣi/ｋ
ｇであった。

【０１１０】各ウサギは両耳にヘパリン・ロックを有す
るカテーテルを有していた。薬物を１つのカテーテル中
IVボーラスとして投与し、次いで食塩水を流し込んだ。
反対の耳から全血試料を採取した。血液試料１mlを以下
の時点に入手した：０(投与前)、および投与後２、５、
１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５
０、および１８０分。食塩水を使用して、各時間毎にカ
テーテルを洗い(フラッシュし)、血液容量と置き換え
た。採取した血液試料を、４.２mＭ ＥＤＴＡおよび１m
Ｍ ＰＰＡＣＫを含有する１.５mlエッペンドルフ遠心管
に注いだ。各遠心管は遠心するまで氷上で維持した。遠
心後、血漿を素早く除去し、エッペンドルフ遠心管に入
れ、試験が終わるまで氷上で保存した。各血漿試料１０
０μl中のタンパク質をトリクロロ酢酸で沈降させた。
各沈降物のガンマ放射線をカウントすることにより、タ
ンパク質に結合した¹²⁵Ｉを定量した。得られた結果は
ＣＰＭ／試料１００μl基準であるので、各データ解析
毎にＣＰＭ／mlに変換した。

【０１１１】ｃ．データ解析 血中濃度-時間曲線下面積(ＡＵＣ)操作を使用する台形
法によって、各ウサギのＡＵＣを２から１８０分で電算
機計算した。クリアランスは、等式ＣＬ＝投与量／ＡＵ
Ｃから計算した。rt-ＰＡと比較した各タンパク質のク
リアランスは、以下のようである。 比 較 クリアランス率 デス１-４４t-ＰＡ ０.１２ デス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ ０.１１ デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ ０.３８ ｄ．まとめ

【０１１２】上記¹²⁵Ｉ-標識化タンパク質にかかるター
ミナル半減期の順番は以下のようである： rt-ＰＡ、
デス１-４４t-ＰＡ、デス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス
１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ。実際の半減期の値を
決定するには、非標識化タンパク質を使用して薬物動態
試験を行わなければならない。¹²⁵Ｉ-標識化デス１-４
４t-ＰＡおよびデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡのクリアラ
ンスは同等であり、¹²⁵Ｉ-標識化rt-ＰＡにより得られ
た値の約１／９であった。３重突然変異体であるデス１
-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-ＰＡのクリアランスは、他の
突然変異体のそれよりも３倍高く、¹²⁵Ｉ-rt-ＰＡより
も約２.５倍低かった。

【０１１３】Ｅ．医薬組成物 本発明の化合物は、本発明ヒト組織型プラスミノーゲン
アクチベーター産物を医薬的に許容され得る担体ビヒク
ルとの混合物中で混合することにより、医薬的に有用な
組成物を製造するための既知の方法によって製剤化する
ことができる。適当なビヒクル、および他のヒトタンパ
ク質、例えばヒト血清アルブミンを含んだそれらの製剤
は、例えばマーチン(E.W.Martin)によるRemingron's Ph
armaceutical Sciencesに記載されている。このような
組成物は、ヒトに効果的に投与するのに適した医薬的に
許容され得る組成物に調製されるよう、有効量のタンパ
ク質を適量のビヒクルと共に含有しているものである。

【０１１４】例えば、本発明のヒト組織型プラスミノー
ゲンアクチベーターは、心臓血管の疾患および症状に罹
患した患者に非経口的に投与することができる。投与量
および投与速度は、他の心臓血管薬、血栓溶解薬が臨床
試験で通常使用されてるものと同様であり得、例えば心
筋梗塞、肺塞栓症などに罹患した患者では、約１-２mｇ
／ｋｇ体重で、１.５-１２時間かけて静脈内または動脈
内投与を行う。

【０１１５】適当な投与剤形の１例としては、ヒト組織
型プラスミノーゲンアクチベーター５０mｇ、アルギニ
ン、リン酸およびポリソルベート８０を含有するバイア
ルを滅菌水５０mlにより注射用に再構成し、それを適量
の０.９％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げ
られる。

【０１１６】半減期が延長され、または短縮されたヒト
組織型プラスミノーゲンアクチベーターは、急速静脈内
注射、特に例えばボーラスとして適当であり得る。これ
は、複雑な投与操作を行う必要性を減少させるであろう
し、例えば人員が診療補助者である救急車内におけるよ
うに、限定された医療器具により対処する上で、t-ＰＡ
を使用する機会を増大させ得るものである。延長された
半減期を有するヒト組織型プラスミノーゲンアクチベー
ターによればさらに、より安全かつ低い初期投与量で行
うことができ、４５分またはそれ以上、血栓溶解に活性
である有効なプラスミンレベルを維持させることができ
るであろう。そして、より長い半減期のヒト組織型プラ
スミノーゲンアクチベーターは、成功した急性血栓溶解
に続く閉塞の再発を回避するのに必須である場合がある
低容量の長期療法、または末梢の血管が閉塞した場合に
必要であり得る長期血栓溶解、にとって有用であり得
る。短縮された半減期のヒト組織型プラスミノーゲンア
クチベーターは、短期間有効レベルのプラスミンを提供
するので、ある特定の患者には望ましいタイプの血栓溶
解療法である場合がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、プラスミドpＥＴＰＦＲ(pＰＡＤＨ
ＦＲ-６)の製造方法を説明し、その部分的な制限地図を
示す模式図である。

【図２】 図２は、プラスミドpＣＶＳＶＰＡ-Ｎ４４Ｄ
２２の製造方法を説明し、その部分的な制限地図を示す
模式図である。

【図３】 図３は、プラスミドp１１５４の製造方法を
説明し、その部分的な制限地図を示す模式図である。

【図４】 図４は、プラスミドp６５２の製造方法を説
明し、その部分的な制限地図を示す模式図である。

【図５】 図５は、プラスミドpＣＩＳt-ＰＡの製造方
法を説明し、その部分的な制限地図を示す模式図であ
る。

【図６】 図６は、プラスミドpＣＩＳt-ＰＡの製造方
法を説明し、その部分的な制限地図を示す模式図であ
る。

【図７】 図７は、プラスミドpＣＩＳt-ＰＡの製造方
法を説明し、その部分的な制限地図を示す模式図であ
る。

【図８】 図８は、プラスミドpＣＩＳt-ＰＡの製造方
法を説明し、その部分的な制限地図を示す模式図であ
る。

【図９】 図９は、プラスミドp１０６０の製造方法を
説明し、その部分的な制限地図を示す模式図である。

【図１０】 図１０は、プラスミドp１１７９の製造方
法を説明し、その部分的な制限地図を示す模式図であ
る。

【図１１】 図１１は、プラスミドp１１７９によって
コードされているデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ突然変異
体の配列式である。

【図１２】 図１２は、プラスミドp１１７９によって
コードされているデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ突然変異
体の配列式である。

【図１３】 図１３は、プラスミドp１１７９によって
コードされているデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ突然変異
体の配列式である。

【図１４】 図１４は、プラスミドp１１７９によって
コードされているデス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ突然変異
体の配列式である。

【図１５】 図１５は、種々のドメイン欠失突然変異
体、すなわち成長因子欠失のデス４４-８４(d-ＧＦ)、
クリングル１欠失のデス９２-１７９(d-Ｋ１)、クリン
グル２欠失のデス１７４-２６１(d-Ｋ２)、および対照
としての天然t-ＰＡ(rt-ＰＡ)の、ウサギにおける薬物
動態プロフィルを示すグラフである。

【図１６】 図１６は、フィンガー欠失デス１-４４な
どの種々のドメイン欠失突然変異体(第１０図参照)にお
けるフィブリン結合性を、フィブリン(フィブリノーゲ
ン)濃度に対する結合率(％)で表したグラフである。

【図１７】 図１７は、t-ＰＡ濃度３０ng/mlにおける
以下の分子のフィブリン結合性を示すグラフである：２
本鎖天然t-ＰＡ、デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４Ｋ
２１０Ｅ２７５、デス１-４４Ｒ２５２Ｅ２７５、デス
１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５、デス１-４４Ｎ２３８Ｅ２７
５、デス１-４４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ
２７５。結果は、幾つかの独立した観察値(括弧内は回
数)の平均で示している(天然のものを除きすべて、２９
３細胞において一時的に発現させた)。

【図１８】 図１８は、t-ＰＡ濃度１００ng／mlにおけ
る以下に記載の分子のフィブリン結合性を示すグラフで
ある：デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４Ｋ２１０Ｅ２
７５、デス１-４４Ｋ２１３Ｅ２７５、デス１-４４Ｒ２
５２Ｅ２７５、デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５、デス１-
４４Ｎ２３８Ｅ２７５、デス１-４４Ｒ２１０Ａ２１１
Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５。結果は、幾つかの独立した
観察値(括弧内は回数)の平均で示している。(すべて、
２９３細胞において一時的に発現された物質由来であっ
た)

【図１９】 図１９は、t-ＰＡ濃度５００ng/mlにおける
以下の分子のフィブリン結合性を示すグラフである：２
本鎖デス１-４４、デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４
Ｋ２１０Ｅ２７５、デス１-４４Ｋ２１３Ｅ２７５、デ
ス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５。結果は、幾つかの独立し
た観察値(括弧内は回数)の平均で示している。(天然お
よびデス１-４４を除きすべて、２９３細胞において一
時的に発現された物質由来であった)

【図２０】 図２０は、t-ＰＡ濃度１００ng/mlにおけ
る以下の分子のフィブリン結合性を示すグラフである：
rt-ＰＡ、２本鎖天然rt-ＰＡ、デス１-４４Ｅ２７５、
およびデス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５。すべての分子は
安定なＣＨＯセルラインから産生された。

【図２１】 図２１は、天然の比活性に対する百分率
(％)として表している、以下に記載の分子におけるイン
ビトロ血餅溶解の結果を示すグラフである：デス１-４
４、デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４Ｓ１８４,Ｅ２
７５、デス１-４４Ｅ２５３Ｅ２７５、デス１-４４Ｄ１
８４Ｅ２７５、デス１-４４Ｎ２３８Ｅ２７５、デス１-
４４Ｒ２５２Ｅ２７５、デス１-４４Ｋ２１０Ｅ２７
５、デス１-４４Ｋ２１３Ｅ２７５、デス１-４４Ｒ２１
０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５、デス１-４４Ｒ
２１０Ｑ２１１Ｑ２１２Ｋ２１２３Ｅ２７５。結果は、
幾つかの独立した観察値(括弧内は回数)の平均で示して
いる。(デス１-４４を除きすべて、２９３細胞において
一時的に発現された物質由来であり、ＥＬＩＳＡによっ
て定量した）

【図２２】 図２２は、天然の比活性に対する百分率
（％)として表している、以下に記載の分子におけるイ
ンビトロ血餅溶解の結果を示すグラフである：rt-Ｐ
Ａ、デス１-４４、デス１-４４Ｅ２７５、デス１-４４
Ｄ１８４Ｅ２７５。すべての分子は安定なＣＨＯセルラ
インから産生された。

【図２３】 図２３は、以下の分子のウサギにおける薬
物動態プロフィルを示すグラフである(すべて安定なＣ
ＨＯセルラインから産生)：天然t-ＰＡ(rt-ＰＡ)、デス
１-４４(Ｎ４４)、デス１-４４Ｅ２７５(Ｎ４４-ＥＩ
Ｋ)、デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５(Ｎ４４-ＥＩＬ-Ｄ
１８４)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アデァー・ジェイ・ホッチキス アメリカ合衆国カリフォルニア94037、ハ ーフ・ムーン・ベイ，パーム・ビーチ・ア ベニュー230番 (72)発明者 カラ・ビィー・マークス アメリカ合衆国カリフォルニア94117、サ ン・フランシスコ，ページ・ストリート 971番

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (ａ) 少なくともフィンガードメインの
   一部分が機能的に除去されてフィブリン結合能が減少す
   るよう修飾されたt-ＰＡからなるt-ＰＡ変異体を得、 (ｂ) 工程(ａ)にしたがって得られたt-ＰＡ変異体をさ
   らに修飾して、１８４位グリコシル化部位、１本鎖から
   ２本鎖への開裂部位、および／またはクリングル２ドメ
   インにおける２０５−２１５位の推定リジン結合部位、
   における分子改変を有している第２のt-ＰＡ変異体を製
   造し、 (ｃ) 該第２のt-ＰＡ変異体のフィブリン結合性を天然
   t-ＰＡのそれと比較し、そして (ｄ) 工程(ａ)の変異体と比較して回復されたフィブリ
   ン結合性を示す第２のt-ＰＡ変異体を選択する、ことを
   特徴とする、ヒトt-ＰＡ変異体を得るための方法。
2. 【請求項２】 工程(ｂ)の第２のt-ＰＡ変異体がアミノ
   酸２７５位と２７６位の間および／または２７７位と２
   ７８位の間における酵素的開裂に対して耐性である請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 工程(ｂ)の第２のt-ＰＡ変異体がアミノ
   酸２７５位と２７６位の間および／または２７７位と２
   ７８位の間における酵素的開裂に対して耐性であり、さ
   らにアミノ酸１８４位における機能的な炭水化物構造を
   欠いている請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 工程(ｂ)の第２のt-ＰＡ変異体がアミノ
   酸２７５位と２７６位の間および／または２７７位２７
   ８位の間における酵素的開裂に対して耐性であり、さら
   にアミノ酸２１０から２１３領域が天然t-ＰＡと比較し
   て修飾されている請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 該第２のt-ＰＡ変異体産物が、デス１-
   ４４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-
   ＰＡ、デス１-４４Ｓ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４
   ４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ、
   デス１-４４Ｒ２５２Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｋ２
   １０Ｅ２７５t-ＰＡ、およびデス１-４４Ｋ２１３Ｅ２
   ７５t-ＰＡの中から選ばれる、請求項１から請求項４ま
   でのいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 該第２のt-ＰＡ変異体が、 (ａ) 該変異体をコードしている組換えベクターを調製
   し、 (ｂ) 得られた組換えプラスミドを適当な宿主内で発現
   させ、 (ｃ) 発現されたt-ＰＡ変異体を採取する工程からなる
   方法によって得られる請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 組換えベクターが細菌ベクターであり、
   宿主が細菌宿主である請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 組換えベクターが真核生物ベクターであ
   り、宿主が真核生物宿主である請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 宿主がＣＨＯ細胞である請求項８に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 (ａ) 少なくともフィンガードメイン
    の一部分が機能的に除去されてフィブリン結合能が減少
    するよう修飾されたt-ＰＡからなるt-ＰＡ変異体を得、 (ｂ) 工程(ａ)にしたがって得られたt-ＰＡ変異体をさ
    らに修飾して、１８４位グリコシル化部位、１本鎖から
    ２本鎖への開裂部位、および／またはクリングル２ドメ
    インにおける２０５−２１５位の推定リジン結合部位、
    における分子改変を有している第２のt-ＰＡ変異体を製
    造し、 (ｃ) 該第２のt-ＰＡ変異体のフィブリン結合性を天然
    t-ＰＡのそれと比較し、 (ｄ) 工程(ａ)の変異体と比較して回復されたフィブ
    リン結合性を示す第２のt-ＰＡ変異体を選択し、そして (ｅ) 選択した第２のt-ＰＡ変異体を治療学的に有効な
    濃度で含有する、医薬的に許容される組成物を製造する
    こと、を特徴とする、t-ＰＡ変異体を含有する医薬組成
    物を製造する方法。
11. 【請求項１１】 工程(ｄ)の該第２の変異体が天然t-Ｐ
    Ａと同様のフィブリン結合性を有している請求項１０に
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 該第２の変異体が天然t-ＰＡよりも長
    い血漿半減期を有し、および／または天然t-ＰＡよりも
    遅いクリアランス速度を有している請求項１０に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 該第２のt-ＰＡ変異体がアミノ酸１８
    ４位における機能的な炭水化物構造を欠いており、アミ
    ノ酸２７５位と２７６位の間および／または２７７位と
    ２７８位の間における酵素的開裂に対して耐性である請
    求項１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 該第１のt-ＰＡ変異体がアミノ酸１-
    ４４を欠いている請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該第２のt-ＰＡ変異体産物が、デス１
    -４４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-
    ＰＡ、デス１-４４Ｓ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４
    ４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ、
    デス１-４４Ｒ２５２Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｋ２
    １０Ｅ２７５t-ＰＡ、およびデス１-４４Ｋ２１３Ｅ２
    ７５t-ＰＡの中から選ばれる、請求項１０から１４まで
    のいずれかに記載の方法。
16. 【請求項１６】 該第２のt-ＰＡ変異体が、 (ａ) 該変異体をコードしている組換えベクターを調製
    し、 (ｂ) 得られた組換えプラスミドを適当な宿主内で発現
    させ、 (ｃ) 発現されたt-ＰＡ変異体を採取する工程からなる
    方法によって得られる請求項１０に記載の方法。
17. 【請求項１７】 組換えベクターが細菌ベクターであ
    り、宿主が細菌宿主である請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 組換えベクターが真核生物ベクターで
    あり、宿主が真核生物宿主である請求項１７に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 宿主がＣＨＯ細胞である請求項１８に
    記載の方法。
20. 【請求項２０】 フィブリン結合能を減少させる少なく
    ともフィンガードメインの一部分の機能的な除去を包含
    する第１の修飾、ならびに１本鎖から２本鎖への開裂部
    位における酵素的開裂に対する耐性を有し、１８４位に
    おける機能的な炭水化物構造を欠いており、および／ま
    たはクリングル２ドメインにおける２０５−２１５位の
    推定リジン結合部位での分子改変を有するt-ＰＡ変異体
    を与えるさらなる修飾、を有しているt-ＰＡ変異体であ
    って、Ｇドメインが欠失されている場合、Ｋ₁ドメイン
    は存在している該t-ＰＡ変異体。
21. 【請求項２１】 天然t-ＰＡと比較して、１)２４４-２
    ５５アミノ酸領域、または２)２３３-２４２アミノ酸領
    域内がさらに修飾されている請求項２０に記載のt-ＰＡ
    変異体。
22. 【請求項２２】 デス１-４４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-
    ４４Ｄ１８４Ｅ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｓ１８４Ｅ
    ２７５t-ＰＡ、デス１-４４Ｋ２１３Ｅ２７５t-ＰＡ、
    デス１-４４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７
    ５t-ＰＡ、デス１-４４Ｒ２５２Ｅ２７５t-ＰＡ、およ
    びデス１-４４Ｋ２１０Ｅ２７５t-ＰＡの中から選ばれ
    る請求項２０に記載のt-ＰＡ変異体。
23. 【請求項２３】 クリングル２ドメインにおける推定リ
    ジン結合部位での分子改変が、アミノ酸２１０−２１３
    位での改変である請求項２０に記載のt-ＰＡ変異体。