DK175776B1 - Varianter af human vævsplasminogenaktivator og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 175776 B1 j

Den foreliggende opfindelse angår bestemte hidtil ukendte varianter af human vævsplasminogenaktivator (t-PA), fremgangsmåder til fremstilling af disse samt fremgangsmåder og præparater, der udnytter sådanne varianter til fremstilling af farmaceutisk aktive lægemiddelstoffer med overraskende forbedrede farmako-5 kinetiske og farmakologiske egenskaber, og endelig fremgangsmåder til modulering af de farmakokinetiske og farmakologiske egenskaber af t-PA og forskellige varianter deraf. Den foreliggende opfindelse angår mere specifikt midler og fremgangsmåder til modulering af fibrinbinding af t-PA i tilfælde, hvor den kan have været undertrykt som følge af visse modifikationer i andre områder af t-ΡΑΙΟ enheden.

Human vævsplasminogenaktivator er blevet identificeret og beskrevet som et særlig betydningsfuldt og potent nyt biologisk farmaceutisk middel, som har vist ekstraordinære resultater ved behandling af vaskulære sygdomme såsom myo-15 cardieinfarkt på grund af dens høje fibrinspecificitet og gode evne til at opløse blodkoageler in vivo.

Human vævsplasminogenaktivator har været genstand for talrige videnskabelige beskrivelser samt beskrivelser i patentlitteraturen. Selv om dens eksistens igang-20 satte mange undersøgelser blandt flere videnskabelige forskergrupper, blev den først identificeret som et i det væsentlige rent isolat fra en naturlig kilde og testet for den ønskede plasminogenaktivator-aktivitet in vivo af Collen et al., EP 41766, offentliggjort den 16. december 1981, indleveret den 11. juni 1980. Se også den tilsvarende videnskabelige publikation af Rijken et al., J. Biof. Chem. 256, 7035 25 (1981).

Derefter blev human vævsplasminogenaktivator fuldstændig identificeret og karakteriseret ved den tilgrundliggende DNA-sekvens og deducerede aminosyre-sekvens på basis af et vellykket arbejde under anvendelse af rekombinant DNA-30 teknologi, hvilket resulterede i store mængder t-PA i et afgrænset miljø. Dette arbejde er beskrevet i den videnskabelige litteratur (Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)) og i EP 93619, offentliggjort den 9. november 1983, indleveret den 5. maj 1982.

I DK 175776 B1 I

I 2 I

Under anvendelse af sidstnævnte publikation som basalt værktøj har flere andre I

H forskere beskrevet den således muliggjorte fremstilling af molekylet ved hjælp af I

rekombinant DNA-teknologi. Visse af disse forskere har også offentligt beskrevet I

potentialet hos varianter af den basale struktur og har forudset derivater, som kan I

H 5 variere med hensyn til de samlede biologiske eller farmakokinetiske virkninger. I

De resulterende offentlige beskrivelser har for størstedelens vedkommende være I

profetiske og tvivlsomme med hensyn til de faktiske samlede biologiske eller I

farmakologiske resultater. I

10 Tilsvarende bestræbelser i laboratorierne, ved hvilke det med held først lykkedes at I

producere t-PA rekombinant, er beskrevet faktuelt med hensyn til bekræftet mole- I

kylkarakterisering og iagttaget biologisk virkning, både i den videnskabelige litte- I

ratur og i forskellige patentansøgninger. I alle tilfælde synes tendensen at være, at I

I der foretrækkes forskning med henblik på at forsøge at modificere human vævs- I

I 15 plasminogenaktivators basale struktur for fuldt ud at udforske og udnytte dens I

kommercielle potentiale i overensstemmelse med forskellige biologisk baserede I

slutmål. I

I Baseret delvist på sådan forskning og sådanne beskrivelser ser det nu ud til at I

20 være klart, at human vævsplasminogenaktivator-molekylet indeholder fem om- I

I råder {strenge af aminosyresekvenser), som er blevet defineret under henvisning I

H til homologe eller på anden måde lignende strukturer, der er identificeret i forskel- I

lige andre proteiner såsom trypsin, chymotrypsin, plasminogen, protrombin, fibro- I

Pektin og epidermisvækstfaktor. Idet man starter ved N-terminalen af human I

25 vævsplasminogenaktivators aminosyresekvens, har disse områder fået følgende I

I betegnelser: 1) fingerområdet (F), som på forskellig måde er blevet defineret som I

I inkluderende aminosyre 1 op til ca. 44, 2) vækst-faktorområdet (G), som på for- I

I skellig måde er blevet defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 45 op til I

I aminosyre 91 (baseret på dets homologi med EGF), kringle 1 (Kl), som er blevet I

M 30 defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 92 til ca. 173, 4) kringle 2 (K2), I

I som er blevet defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 180 til ca. I

I aminosyre 261, og 5) det såkaldte serinproteaseområde (P), som generelt er I

blevet defineret som strækkende sig fra ca. aminosyre 264 til molekylets C- I

I terminale ende. Disse områder er generelt beliggende i forlængelse af hinanden I

3 DK 175776 B1 eller er adskilt af korte "linker"-ornråder og udgør hele aminosyresekvensen fra 1 til 527 aminosyrer i dens formodede, modne form.

Hvert område er på forskellig måde blevet beskrevet at bidrage med en bestemt 5 specifik aktivitet: fingerområdet er således pi forskellig måde blevet beskrevet som indeholdende en sekvens, der er essentiel eller i det mindste af væsentlig betydning for høj bindingsaffinitet for fibrin. (Denne aktivitet menes at være vigtig for den høje specificitet, human vævsplasminogenaktivator udviser med hensyn til koagellyse ved stedet for en fibrinrig trombe.) Det vækstfaktorlignende område er 10 på lignende måde blevet associeret med celleoverfladebindende aktivitet, i det mindste med hensyn til urokinase. Kringle 2-området har også været stærkt associeret med fibrinbinding og med fibrins evne til at stimulere t-PA's aktivitet.

Der synes at være almindelig enighed om, at serinproteaseområdet er molekylets vigtigste område med hensyn til plasminogenaktiverende aktivitet.

15

Det skal igen bemærkes, at fingerområdet generelt er blevet anset for at strække sig over aminosyrerne 1-44 i N-terminalen, og forskellige forskere har forsøgt at producere mutanter eller varianter ved at deletere eller delvist deletere segmenter af dette område.

20

Der findes N-bundne glycosyleringssteder i molekylet ved aminosyre-positionerne 117, 184, 218 og aminosyre 448. Stedet ved aminosyre 218 er ikke glycosyleret. Glycosyleringsstedet ved aminosyre 117 er blevet karakteriseret som en høj man-nosetype, mens de to øvrige steder udviser såkaldt komplekse oligosaccharidstruk-25 turer. Stederne 117 og 448 ser ud til altid at være glycosylerede, når molekylet stammer fra en værtscelle, der er i stand til at fremkalde glycosylering, mens sted 184 formodes at være glycosyleret i ca. 50% af molekylerne. Sidstnævnte fænomen med glycosylering/ikke-glycosylering af 184 er blevet påvist ved SDS-PAGE-analyse, hvor der kan ses to bånd, det ene forbundet med 184-glycosylerede 30 molekyler og det andet med 184-ikke-glycosylerede molekyler: såkaldt Type I og Type II t-PA. Dette delvise glycosyleringsmønster kan være en følge af, at sted 184 er beliggende i en konformationelt beskyttet position mellem de to kringlestrukturer.

DK 175776 B1 I

I

H Et tredje locus, som har flet videnskabelig opmærksomhed, er det såkaldte I

proteolytiske spaltningssted i det område, der er afgrænset af aminosyrerne 275 til I

H ca. 279 og mere specifikt bindingen mellem aminosyre 275 og 276 i det native I

molekyle. Mutagenese ved dette sted for at gøre det mindre modtageligt for I

5 proteolytisk nedbrydning danner et molekyle, som forbliver i en enkelt form eller I

énkædeform, som antages at have visse fordele i biologisk og kommerciel I

H henseende. I

Alle disse definerede områder, glycosyleringssteder og énkæde/tokæde-spaltnings- I

io sted er blevet beskrevet og defineret som havende specifikke komponenter med I

potentiel biologisk aktivitet. Fx resulterer fjernelse af en væsentlig del af eller hele I

fingerområdet i et molekyle med væsentligt formindskede fibrinbindende karakte- I

ristika, om end der til gengæld er et fald i den resulterende enheds samlede I

clearance-hastighed. I

I 15 I

I Modificering af det native molekyle for at ødelægge énkæde- til tokæde-spaltnings- I

stedet som sådant resulterer i et molekyle med noget ændret biologisk aktivitet og I

I øget stabilitet, mens fibrinbindingen og fibrinstimuleringen er forøget i forhold til I

I tokædet t-PA. I

I 20 I

I Ændring af glycosyleringsstederne og især ved aminosyre 117 ser uvægerligt ud til I

I at resultere i et molekyle, der har påvirkede solubilitetskarakteristika, som yder- I

I ligere kan resultere i et ændret mønster for halveringstid og/eller Fibrinbindende I

I karakteristika. I

25 I

I Idet høj fibrinspecificitet og fibrinbindende karakteristika er ønskede resultater, I

I som human vævsplasminogenaktivator og især på forskellig måde ændrede I

I derivater eller varianter deraf skal besidde (se fx EP 234.051 offentliggjort den 2. I

I september 1987), har den kendte teknik frarådet at ændre fingerområdet bortset I

I 30 fra den overraskende erkendelse, at en sådan ændret art har dramatisk nedsatte I

clearance-hastigheder. Under hensyntagen til den kommercielle betydning af I

I fibrinbinding og fibrinspecificitet er det alligevel et erklæret mål blandt forskere at I

I producere varianter eller derivater af human vævsplasminogenaktivator, som vil I

I have høj fibrinbindende aktivitet, uden at de andre ønskede biologiske og farma- I

I 35 kokinetiske egenskaber er ændrede, hvilke egenskaber ellers er forbundet med det I

5 DK 175776 B1 native materiale. Imidlertid er forskningen med henblik på at producere sådanne varianter eller derivater af human plasminogenaktivator ikke fuldstændig klar ud fra den foreliggende kendte teknik, se fx EP 231.624 offentliggjort den 12. august 1987.

5

Usikkerheden om, hvorvidt og hvor det native t-PA-moJekyle skal ændres for at opnå forbedrede fibrinolytiske egenskaber, understreges specielt af en relativt nyligt offentliggjort patentpublikation, WO 87/04722 (offentliggjort den 13. august 1987). Dette dokument afspejler en udførlig papirmosaik af potentielle t-PA-vari-10 anter. Selv om publikationen henviser til tre områder, nemlig amino-N-terminalen, glycosyleringsstederne og enkeltkæde-spaltningsstedet, er der ingen antydning af den faktiske fremstilling af t-PA-arter og ej heller bioaktivitet eller andre data; derfor "antager" publikationen blot, at proteinerne besidder forbedrede fibrinolytiske profiler i forhold til nativ human t-PA uden specifik henvisning til, hvad der 15 menes med dette, enten kvalitativt eller kvantitativt. Mange af de varianter, som nok er generisk omfattet, kan faktisk have lavere fibrinolytisk aktivitet. Som sådant tjener dokumentet bedst som en relativt kompleks mosaik, ud fra hvilken der kan I eksperimenteres, og ikke mere.

20 Et fundamentalt formål med den foreliggende opfindelse er fremstilling, identificering og karakterisering af t-PA-varianter, der har moduleret fibrinbindende aktivi-i tet, samt fremgangsmåder og midler til udførelse af dette. 1 opfindelsens mest foretrukne udførelsesformer er formålet at frembringe forøget fibrinbinding til t-PA-varianter via områder, der er identificeret som ansvarlige for en sådan fibrin-25 binding, og især t-PA-varianter, som kan have mindre fibrinbinding i sammenligning med nativ t-PA på grund af forskellige modifikationer i t-PA-molekylet med henblik på at fremme ét eller flere andre karakteristika, som er relevante for den samlede fibrinolytiske aktivitet, såsom halveringstid og/eJler clearance-hastighed.

30 Den foreliggende opfindelse angår således t-PA-varianter, der har moduleret fibrinbinding, samt alle rekombinante midler, der er forbundet med fremstilling deraf, fx DNA-isolater, der koder for dem, DNA, der hybridiserer med sådanne isolater, kloningsvektorer indeholdende sådant DNA, operable ekspressionsvektorer deraf, værter transficeret med sådanne vektorer, kulturer, der således er i stand til 35 at producere t-PA-varianterne, især i form af ekspressionsprodukter, der udskilles I DK 175776 B1 ! Η til det omgivende medium, samt de fremgangsmåder, der er involveret i udførelsen ; af ovenstående. Den foreliggende opfindelse angår også farmaceutiske præparater, som omfatter virksomme mængder af sådanne t-PA-varianter, samt metoder til I administration af sådanne præparater til mennesker.

H

H Den foreliggende opfindelse angår også forskellige metoder til anvendelse af de på- H gældende t-PA-varianter, hvilke varianter kan anvendes til behandling af vasku-lær H sygdom hos en patient, hvilken metode omfatter fremstilling af en human t-PA- H variant, der udviser moduleret fibrinbinding i forhold til nativ t-PA, fremstilling af et 10 farmaceutisk acceptabelt præparat, som omfatter t-PA-varianten i terapeutisk virk- somme koncentrationer, samt administration af dette præparat til patienten.

I en anden sådan udførelsesform tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af en human t-PA-proteinvariant, som udviser moduleret fibrinbinding i forhold til H 15 nativ t-PA, hvilken fremgangsmåde omfatter, at der opnås en t-PA-variant omfat- i tende en modificeret t-PA, denne variants fibrinbinding sammenlignes med nativ t- . PA's fibrinbinding, og der udvælges en således vundet t-PA-variant, der udviser en moduleret fibrinbinding i forhold til nativ t-PA.

20 I den samlede virkning genopretter den foreliggende opfindelse fibrinbinding og

fibrinstimulering, hvilket er et ønskværdigt træk, der er enestående for nativ t-PA

I som fibrinolytisk middel og specielt der, hvor dette træk viste sig at mangle som følge af modificering af nativ t-PA i andre henseender for at bibringe den ét eller I flere andre ønskværdige træk. Fx giver fjernelse af det hele eller en del af finger- I 25 området og/eller vækstfaktorområdet og/eller kringle 1-området således varianter, I der fx har det ønskede træk, at de har forøget halveringstid og formindsket clearance-hastighed i forhold til nativ t-PA. Imidlertid har disse varianter dermed I reducerede fibrinbindende egenskaber, hvilket er et træk, som i det væsentlige er essentielt for t-PA's enestående fibrinolytiske aktivitet. Ifølge ét aspekt genopretter I 30 den foreliggende opfindelse sidstnævnte, hvilket således giver varianter med sam- lede forbedrede egenskaber i forhold ti) nativ t-PA, fx fibrinbindende egenskaber, I der er beslægtede med nativ t-PA, og forøget halveringstid/formindsket clearance- I hastighed i forhold til nativ t-PA.

7 DK 175776 B1

Mere specifikt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en human t-PA-variant, der udviser moduleret fibrinbinding i forhold til nativ t-PA.

Ifølge et andet aspekt angår opfindelsen en human vævsplasminogen-aktivator-(t-5 PA)-variant som defineret i kravene, og som er modificeret ved funktionel fjernelse af i det mindste en del af et område, der er ansvarligt for fibrinbinding, men som har en genoprettet fibrinbinding, der er sammenlignelig med nativ t-PA’s fibrinbinding.

10 Den foreliggende opfindelse bygger bl.a. på specifik vellykket forskning, som viser, at større ændringer i fingerområdet, som selv i det væsentlige formindsker fibrin-bindende aktivitet, sammen med molekylære ændringer af 184-glycosylerings-stedet, énkæde- til tokædespaltningsstedet og/eller det formodede Kringle 2-lysinbindingssted resulterer i varianter af i human vævsplasminogen-aktivator-15 varianter, som overraskende bevarer nativ vævsplasminogenaktivators basale biologiske og farmakologiske egenskaber eller træk og omfatter en væsentlig genop-' rettelse af høje fibrinbindende egenskaber. Resultaterne er molekyler, som, selv om de er væsentligt forskellige fra nativt materiale i den samlede aminosyre-sekvens, bevarer det native materiales ønskelige fibrinolytiske træk i en art og i en 20 grad, der gør det muligt at udnytte dem i den kommercielle sektor, idet de kan konkurrere med nativt materiale. 1 overensstemmelse med denne udførelsesform er der her beskrevet (hvad enten de er omfattet af kravene eller ej) human vævsplasminogenaktivatorvarianter, som 25 mangler i det mindste en del af fingerområdet, mangler glycosyleringspotentiale i det glycosyleringssted, der omgiver aminosyre 184, og er modstandsdygtige over for proteolytisk spaltning ved det sted, der omgiver aminosyrerne 275 og 276, og/eller har aminosyre-modifikationer i det formodede lysinbindingssted i Kringle 2. Denne udførelsesform manifesterer sig specifikt i hidtil ukendte t-PA-variantarter: 30 fx et molekyle, der mangler aminosyrerne 1-44 (betegnet des 1-44), eventuelt har asparaginsyre i position 184 (betegnet D184) og har glutaminsyre i position 275 (betegnet E275), hvilke arter derfor har de samlede korte betegnelser des 1-44D184E275 t-PA og des 1-44E275 t-PA, og fx et molekyle, der mangler aminosyrerne 1-44 (betegnet des 1-44) og har glutaminsyre i position 275 og har RARR i

I DK 175776 B1 I

I I

aminosyrepositioneme 210-213, i nærværende sammenhæng betegnet des 1- I

44P210A211R212R213E275 t-PA. I

Med henblik pi en sådan kort betegnelse for t-PA-varianterne ifølge opfindelsen I

I 5 skal det bemærkes, at tal henviser til aminosyreresten/-positionen hen ad den 527 I

1 aminosyrer lange sekvens af formodet moden t-PA, jfr. EP 093619. Ved aminosyre- I

identificering anvendes enkeltbogstavs-alfabetet for aminosyrer, dvs.: I

^ Asp D Asparaginsyre Ile I Isoleucin I

Thr T Threonin Leu L Leucin I

I Ser S Serin Tyr Y Tyrosin I

H Glu E Glutaminsyre Phe F Phenylalanin I

Pro P Prolin His H Histidin I

15 Gly G Glycin Lys K Lysin I

I Ala A Alanin Arg R Arginin I

Cys C Cystein Trp W Tryptophan I

I Val V Valin Gin Q Glutamin I

Met M Methionin Asn N Asparagin I

I 20 I

og tallet efter sådanne enkelte bogstaver angiver aminosyrepositionen; fx betyder I

D184 en variant, der bl.a. har en asparaginsyre i position 184. I

I 25 I

Der beskrives især de t-PA-varianter, der mangler i det mindste en del af fingerom- I

rådet, fx des 1-44, og/eller er modstandsdygtige over for spaltning i 275/276- I

spaltningsstedet ved påførte modifikationer i 275-279-amino-syreomridet, fx E275 I

I og E275I277, og derfor er yderligere eksempler des 1-44E275, des 1-44E275I277; I

I 30 alle de ovenfor anførte er eventuelt modificerede i forskellige andre områder i I

I molekylet, fx I

I 1) Kringle 2-modifikationer, fx i området aminosyrerne ca. 205-215, især 210- I

I 213, og/eller I

I 35 I

DK 175776 B1 I

2) aminosyrerne ca. 244-255, især 252 eller dets sted, og/eller I

3) aminosyrerne ca. 233-242, især 236-238, og/eller

5 4) kendte eller nyindførte glycosyleringssteder, fx aminosyre 184, og/eller I I

5) andre modifikationer, der giver t-PA-varianter, som kan identificeres ved I

forøget fibrinbinding i forhold til nativ t-PA, eller en variant deraf, der ud- I

viser formindsket fibrinbinding i sammenligning med nativ t-PA, men har et I

10 andet forbedret biologisk træk, som i princippet forbliver upåvirket. I

I Særlige udførelsesformer af ovennævnte varianter er: I

des 1-44E275 t-PA I

15 des 1-44D184E275 t-PA I

des 1-44S184E275 t-PA I

des 1-44K213E275 t-PA

des 1-44R210A211R212R213E275 t-PA (en særligt foretrukken art - se ovenfor)

20 des 1-44R252E275 t-PA

des 1-44K210E275 t-PA des 1-44R210H211Q212K213E275 t-PA, idet alle de ovenstående yderligere har 1277-modifikationen, samt kombinationer 25 og permutationer deraf, fx des 1-44R212R252E275 t-PA, etc.

Yderligere udførelsesformer omfatter t-PA-varianter med eller uden et intakt (del af) fingerområde (fx aminosyrerne 1-44) og/eller med et deleteret (eller delvist) vækstfaktorområde (fx des ca. 44-84) og/eller et deleteret (eller delvist) Kringle 1-30 område (fx des ca. 92-179) og/eller et deleteret (eller delvist) Kringle 2-område (fx des ca. 174-261), der alle signifikant kan ændre clearance-hastigheder i forhold til nativ t-PA, alle ovenstående kombineret med de ovenfor nævnte foretrukne varianter, fx E275, E275I277, Q275I277, etc. Desuden kan t-PA's fibrinbinding moduleres, mest foretrukket genoprettes eller forøges, ved passende substitutioner af H DK 175776 B1 positivt eiier negativt ladede aminosyrerester på de modsatte kanter af det formodede ligandbindende sted på t-PA.

Følgende varianter er således også foretrukne: I 5

des 1-44D184R210A211R212R213R252E275 t-PA

I des 92-179D184R210A211R212R213R252E275 t-PA

des 44-84D184R210A211R212R213R252E275 t-PA eller N184- og H 5184-analogerne deraf.

Fig. 1 viser skematisk, hvorledes plasmidet pETPFR (pPADHFR-6) kan fremstilles, H og viser også et delvist restriktionskort derover.

Fig. 2 viser skematisk, hvorledes plasmidet pCVSVPA-N44D22 kan fremstilles, og 15 viser også et delvist restriktionskort derover.

Fig. 3 viser skematisk, hvorledes plasmidet pi 154 kan fremstilles, og viser også et delvist restriktionskort derover.

H 20 Fig. 4 viser skematisk, hvorledes plasmidet p652 kan fremstilles, og viser også et delvist restriktionskort derover.

Fig. 5 og 6 viser skematisk, hvorledes plasmidet pCISt-PA kan fremstilles, og viser I også et delvist restriktionskort derover.

Fig. 7 viser skematisk, hvorledes plasmidet pl060 kan fremstilles, og viser også et I delvist restriktionskort derover.

Fig. 8 viser skematisk, hvorledes plasmidet pll79 kan fremstilles, og viser også et 30 delvist restriktionskort derover.

I Fig. 9 viser sekvensen af des 1-44E275 t-PA-mutanten, der kodes af plasmidet I pll79.

DK 175776 B1 I

Fig. 10 viser de farmakokinetiske profiler i kaniner af de forskellige omride- I

deletionsmutanter: vækstfaktordeletion, des 44-84 ("d-GF"); Kringle 1-deletion, I

des 92-179 ("d-Kl"); Kringle 2-deletion, des 174-261 ("d-K2"); og nativ t-PA ("rt- I

PA") som kontrol. I

Fig. 11 viser de fibrinbindende karakteristika hos de forskellige område-deletions- I

mutanter (se fig. 10), herunder fingerdeletionen des 1-44, udtrykt som procent I

bundet i forhold til fibrin(ogen)-koncentration.

10 Fig. 12 viser fibrinbinding af følgende molekyler ved en t-PA-koncentration pi 30 ng/ml: tokædet nativ t-PA, des 1-44E275, des 1-44K210-E275, des 1-44R252E275, des 1-44D184E275, des 1-44N238E275, des 1- I44R210A211R212R213E275. Resultaterne viser gennemsnit af flere uafhængige iagttagelser (antal gange i parenteser). (Alle undtagen den native udtrykt flygtigt i 15 293-celler.)

Fig. 13 viser fibrinbinding af følgende molekyler ved en t-PA-koncentration på 100 ng/ml: des 1-44E275, des 1-44K210E275, des 1-44K213-E275, des 1-44R252E275, des 1-44D184E275, des 1-44N238E275, des 1-20 44R210A211R212R213E275. Resultaterne viser gennemsnit af flere uafhængige iagttagelser (antal gange i parenteser). (Alle var fra materiale, der blev udtrykt . flygtigt i 293-celler.)

Fig. 14 viser fibrinbinding af følgende molekyler ved en t-PA-koncentration på 500 25 ng/ml: tokædet des 1-44, des 1-44E275, des 1-44K210-E275, des 1-44K213E275, des 1-44D184E275. Resultaterne viser gennemsnit af flere uafhængige iagttagelser (antal gange i parenteser).

(Alle undtagen nativ og des 1-44 var fra materiale udtrykt flygtigt i 293-celler.) 30 Fig. 15 viser fibrinbinding af følgende molekyler ved en t-PA-koncentration på 100 ng/ml: rt-PA, tokædet nativ rt-PA, des 1-44E275 og des 1-44D184E275. Alle molekyler var produceret i stabile CHO-cellelinjer.

Fig. 16 viser resultater af in v/tro-koagellyse, udtrykt som en procentdel af nativ j 35 specifik aktivitet, for følgende molekyler: des 1-44, des 1-44E275, des 1- ί i I DK 175776 B1 Η H 44S184E275, des 1-44Ε253Ε275, des 1-44D184-E275, des 1-44N238E275, des 1- 44R252E275, des 1-44K2X0E275, des 1-44K213-.E275, des 1- H 44R210A211R212R213E275, des 1-44R210Q211Q212-K213E275. Resultaterne viser gennemsnit af flere uafhængige iagttagelser (antal gange i parenteser). (Alle 5 undtagen des 1-44 var fra materiale udtrykt flygtigt i 293-celler og kvantificeret ved ELISA.)

Fig. 17 viser resultater af in vitro-koagellyse, udtrykt som en procentdel af nativ H specifik aktivitet, for følgende molekyler: 10 rt-PA, des 1-44, des 1-44E275, des 1-44D184E275. (Alle molekyler var produceret i stabile CHO-cellelinjer.) H Fig. 18 viser de farmakokinetiske profiler i kaniner af følgende molekyler (alle produceret i stabile CHO-cellelinjer): nativ t-PA ("rt-PA"), des 1-44 ("IM44"), des 1- 15 44E275 f’N44-EIK”), des 1-44D184-E275 ("N44-EIL-D184").

H Det følgende er en detaljeret beskrivelse af metoder, der kan benyttes til mere specifikt at udøve den foreliggende opfindelse, og omfatter detaljer, der for tiden anses for at være den bedste tilgængelige måde. Hvor detaljeret følgende end kan 20 forekomme i teksten, bør det ikke opfattes som en begrænsning af opfindelsens i samlede omfang; omfanget af den foreliggende opfindelse er kun begrænset af indholdet i nedenstående patentkrav.

I A. Definitioner/generelle metoder I 1. Stedspecifik mutagenese

Fremstilling af t-PA-varianter ifølge opfindelsen udføres fortrinsvis ved stedspecifik mutagenese af DNA, som koder for en tidligere fremstillet variant eller en ikke- 30 variantversion af proteinet. Stedspecifik mutagenese muliggør fremstilling af t-PA- varianter under anvendelse af specifikke oligonukleotidsekvenser, som koder for I den ønskede mutations DNA-sekvens, samt et tilstrækkeligt antal tilstødende nukleotider til at tilvejebringe en primersekvens med tilstrækkelig størrelse og I sekvenskompleksitet til at danne en stabil dobbeltstreng pi begge sider af det I 35 deletionsforbindelsespunkt, der gennemskæres. Der foretrækkes typisk en primer

DK 175776 B1 I

med en længde på ca. 20-25 nukleotider, hvor ca. 5-10 rester på begge sider af ; I

forbindelsespunktet i sekvensen er ændrede. Generelt er teknikken med stedspeci- I

fik mutagenese velkendt på området, hvilket eksemplificeres af publikationer så-

som Adelman et al., DNA 2, 183 (1983). Det er klart, at der ved teknikken typisk I

5 benyttes en fagvektor, som forekommer i både en enkeltstrenget og en dobbelt- I

strenget form. Typiske vektorer, der kan anvendes til steddirigeret mutagenese, I

omfatter vektorer såsom M13-fagen, der fx er beskrevet af Messing et al., Third I

Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, red. A. Walton, I

Elsevier, Amsterdam (1981). Disse fager er lettilgængelige i handelen, og deres I

10 anvendelse er generelt velkendt for fagfolk på området. Alternativt kan der anven- ι I

des plasmidvektorer, som indeholder et enkeltstrenget fag-replikationsinitierings- I

sted (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)) til opnåelse af enkeltstrenget ’ I

115 Generelt udføres steddirigeret mutagenese i forbindelse med opfindelsen ved først I

at opnå en enkeltstrenget vektor, som i sin sekvens omfatter en DNA-sekvens, der I

koder for vævsplasminogenaktivator. En oligonukleotidprimer, der bærer den øn- I

skede muterede sekvens, fremstilles generelt syntetisk, fx ved fremgangsmåden I

beskrevet af Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5765 (1978). Denne 20 primer sammenføjes derefter med den enkeltstrengede, t-PA-sekvensholdige vektor og udsættes for DNA-polymerisationsenzymer såsom E. coli polymerase I Klenow-fragment for at udføre syntese af den mutations-bærende streng. Der dannes således et heteroduplex, i hvilket den ene streng koder for den oprindelige ikke-muterede sekvens, og den anden streng bærer den ønskede mutation. Denne 25 heteroduplex-vektor anvendes derpå til transformation af egnede celler såsom JMlOl-celler, og der selekteres kloner, der omfatter rekombinante vektorer, som bærer det muterede sekvensarrangement.

Efter at en sådan klon er selekteret, kan det muterede t-PA-område fjernes og 30 anbringes i en egnet vektor med henblik på t-PA-produktion, generelt en ekspressionsvektor af den type, der kan anvendes til transformation af en egnet eukaryot vært. I forbindelse med den foreliggende opfindelse foretrækkes CHO-celler eller 293-celler til fremstilling af langtidsstabile t-PA-producenter. Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til CHO-produktion, da det er kendt, at der kan anvendes 35 flere andre celletyper, især hvis der kun ønskes flygtig produktion af enzymet til H DK 175776 B1 ] testformål. I det følgende er der fx beskrevet et flygtigt system, hvor der anvendes 293-celler {Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)), hvilket udgør et hensigts-mæssigt system til fremstilling af t-PA-varianter til analytiske formål.

I 5 2. Værtscellekulturer 09 vektorer H Selv om CHO-ekspression i sidste ende foretrækkes til t-PA-produktion, er de i nærværende sammenhæng beskrevne vektorer og metoder egnede til anvendelse i H værtsceller i et bredt område af prokaryote og eukaryote organismer.

H Generelt foretrækkes naturligvis prokaryoter til indledende kloning af DNA-sekven- i H ser og konstruktioner af de vektorer, der kan anvendes i forbindelse med opfindel- H sen. Fx er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) specielt anvendelig, Andre

H mikrobielle stammer, som kan anvendes, omfatter E. co//*stammer såsom E. coli B

H 15 og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537). Disse eksempler er naturligvis kun en illustra- tion og ikke en begrænsning.

Prokaryoter kan også anvendes til ekspression. Der kan anvendes de ovenfor nævnte stammer samt E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrof, ATCC nr. 27325), 20 bacilli såsom Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskellige pseudomonas-arter.

I forbindelse med disse værter anvendes generelt plasmidvektorer, som indeholder | replikon- og kontrolsekvenser, der stammer fra arter, som er kompatible med 25 værtscellen. Vektoren bærer almindeligvis et replikationssted samt markørsekven- ser, som er i stand til at tilvejebringe fænotypisk selektion i transformerede celler.

I Fx transformeres E. coli typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid fra en E. I

I coli-art (se fx Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for I ampicillin- og tetracyclinresistens og gør det således let at identificere transfor- I 30 merede celler. pBR322-plasmidet eller et andet mikrobielt plasmid eller fag skal I også indeholde eller modificeres til at indeholde promotorer, som den mikrobielle organisme kan udnytte til ekspression af sine egne proteiner.

I De promotorer, der mest almindeligt anvendes til rekombinant DNA-konstruktion, 35 omfatter β-lactamase- (penicillinase) og lactose-promotor-systemerne (Chang et DK 175776 B1 15 al., Nature 375, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) og et tryptophan-(trp)-promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 0036776). Om end disse er de mest almindeligt anvendte, er der opdaget og benyttet andre mikrobielle promotorer, og 5 nærmere oplysninger om deres nukleotidsekvenser er offentliggjort, hvilket gør det muligt for fagfolk at ligere dem funktionelt med plasmidvektorer (se fx Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)).

Ud over prokaryoter kan der også anvendes eukaryote mikrober såsom gærkultu-10 rer. Saccharomyces cerevisiae eller almindeligt bagegær er den mest almindeligt anvendte blandt de eukaryote mikroorganismer, selv om en række andre stammer er almindeligt tilgængelige. Til ekspression i Saccharomyces anvendes almindeligvis fx plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al.,

Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Dette plasmid inde-15 holder allerede trpl-genet, som udgør en selektionsmarkør for en muteret gærstamme, som mangler evnen til at vokse i tryptophan, fx ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som et træk hos gærværtscellens genom tilvejebringer da et effektivt miljø til detektion af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

20

Egnede promotorsekvenser i gærvektorer omfatter promotorerne for 3-phospho-glyceratkinase (Hitzeman et al., 3. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)) såsom enolase, glyceraldehyd-3-phosphat-25 dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose- 6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphat-isomerase, phosphoglucose-isomerase og glucokinase. Ved konstruktion af egnede ekspressionsplasmider ligeres de terminationssekvenser, der er associerede med disse gener, også ind i ekspressionsvektoren 3' i forhold til den sekvens, der 30 ønskes udtrykt, til opnåelse af polyadenylering af mRNA'et og termination. Andre promotorer, der har den yderligere fordel, at deres transkription reguleres af vækstbetingelser, er promotoromårdet for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, syrephosphatase, nedbrydende enzymer associeret med nitrogenmetabolisme og ovennævnte glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase samt enzymer, der er 35 ansvarlige for maltose- og galactose-udnyttelse. En hvilken som helst plasmid- I DK 175776 B1 vektor, der indeholder gærkompatibel promotor, replikationsinitieringssted og terminationssekvenser, er egnet.

Ud over mikroorganismer kan der som værter også anvendes kulturer af celler H 5 stammende fra flercellede organismer. I princippet kan der anvendes en hvilken H som helst sådan cellekultur, både fra vertebrat- og invertebrat-kultur. Imidlertid H har interessen været størst omkring vertebrat-celler, og opformering af vertebrat- H celler i kultur (vævs-kultur) er blevet en rutinemæssig procedure i de senere år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, red. (1973)]. Eksempler 10 på sådanne anvendelige værtscellelinjer er VERO- og HeLa-celler, kinesisk hamsterovarie-cellelinjer (CHO) og W138-, BHK-, COS-7-, 293- og MDCK- cellelinjer. Ékspressionsvektorer til sådanne celler omfatter almindeligvis (om H nødvendigt) et replikationsinitieringssted, en promotor anbragt foran det gen, der skal udtrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA- H 15 splejsningssteder, polyadenyleringssteder og transkriptionelle terminatorsekvenser.

Til anvendelse i pattedyrceller tilvejebringes kontrolfunktionerne på ekspressions- vektorerne ofte af viralt materiale. Almindeligt anvendte promotorer stammer fx fra polyom, Adenovirus 2 og hyppigst Simian Virus 40 (SV40). De tidlige og sene 20 SV40-viruspromotorer er særligt anvendelige, da begge let kan fås fra viruset i form af et fragment, som også indeholder SV40-virusreplikationsinitieringsstedet I (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, når blot der er inkluderet den ca. 250 bp lange sekvens, som strækker sig fra Hindlll-stedet mod Bgll-stedet, der findes i det virale replika- I 25 tionsinitieringssted. Det er endvidere også muligt og ofte ønskværdigt at anvende I promotor- eller kontrolsekvenser, der normalt er associeret med den ønskede gen- sekvens, forudsat at sådanne kontrolsekvenser er kompatible med værtscelle- I systemerne.

I 30 Et replikationsinitieringssted kan enten tilvejebringes ved konstruktion af vektoren I til at omfatte et eksogent initeringssted, således som det kan fås fra SV40 eller en I anden viral (fx polyom, Adeno, VSV, BPV) kilde, eller det kan tilvejebringes af I værtscellens kromosomale replikationsmekanisme. Hvis vektoren er integreret i værtscellens kromosom, er sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.

I 35 DK 175776 B1 | i 17 i ; i j

Ved valget af en foretrukken værtscelle til transfektion med vektorerne ifølge opfindelsen, hvilke vektorer omfatter DNA-sekvenser, der både koder for variant t-PA og DHFR-protein, er det relevant at vælge værten afhængigt af den anvendte type DHFR-protein. Hvis der anvendes vildtype-DHFR-protein, foretrækkes det at · 5 vælge en værtscelle, som mangler DHFR, hvorved det bliver muligt at anvende den DHFR-kodende sekvens som markør for vellykket transfektion i selektivt medium, i som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En egnet værtscelle er i dette tilfælde kinesisk hamsterovarie-cellelinjen (CHO), der mangler DHFR-aktivitet og fremstilles og opformeres som beskrevet af Urlaub og Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.

10 (USA) 77, 4216 (1980).

i i

Hvis DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for methotrexat (MTX) anvendes som | kontrollerende sekvens, er det på den anden side ikke nødvendigt at anvende i

DHFR-defekte celler. Da DHFR-mutanten er modstandsdygtig over for methotrexat, I

j 15 kan MTX-holdige medier anvendes som selektionsmiddel, forudsat at værtscellerne selv er methotrexatfølsomme. De fleste eukaryote celler, som er i stand til at absorbere MTX, ser ud til at være methotrexatfølsomme. Én sådan anvendelig cellelinje er en CHO-linje, CHO-K1 (ATCC nr. CCL 61).

20 Der produceres tilfredsstillende mængder human t-PA af cellekulturer; imidlertid tjener forbedringer under anvendelse af en sekundær kodende sekvens til at forøge produktionsniveauerne endnu mere. Den sekundære kodende sekvens omfatter dihydrofolatreduktase (DHFR), som påvirkes af en eksternt kontrolleret parameter såsom methotrexat, hvilket muliggør ekspressionskontrol ved regulering af MTX-25 koncentrationen.

3. Typisk metodologi, der kan anvendes

Hvis der som værtsceller anvendes celler uden vældige cellemembran-barrierer, 30 udføres transfektioner ved calciumphosphat-præcipitations-metoden som beskrevet af Graham og Van der Eb, Virology 52, 546 (1978). Der kan imidlertid også anvendes andre metoder til indføring af DIMA i celler såsom ved kemeinjektion eller ved protoplastfusion.

I DK 175776 B1 I

η

i. I

I

Hvis der anvendes prokaryote celler eller celler, som indeholder betydelige cel- I

levægskonstruktioner, er den foretrukne transfektionsmetode calciumbehandling I

under anvendelse af calcium som beskrevet af Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. I

I (USA) 69, 2110 (1972). I

5 I

Ved konstruktion af egnede vektorer, der indeholder de ønskede kodende sekven- I

ser og kontrolsekvenser, anvendes der standardmæssige ligeringsteknikker. Iso- I

lerede plasmider eller DNA-fragmenter skæres, skræddersys ("tailored") og relige- I

res i den form, der ønskes til dannelse af de pågældende plasmider. I

i I

Skæring udføres ved behandling med restriktionsenzym (eller -enzymer) i en egnet I

buffer. Generelt anvendes der ca. 1 ug plasmid eller DNA-fragmenter med ca. 1 en- I

H hed enzym i ca, 20 μΙ bufferopløsning. (Egnede buffere og substratmængder til I

bestemte restriktionsenzymer er angivet af producenten.) Der kan benyttes inku- I

15 bationstider på ca. 1 time ved 37°C. Efter inkubation fjernes proteinet ved ekstrak- I

tion med phenol og chloroform, og nukleinsyren isoleres fra den vandige fraktion I

ved præcipitation med ethanol. I

Hvis der kræves stumpe ender, kan præparationen behandles i 15 minutter ved I

20 15°C med 10 enheder polymerase I (Klenow), ekstraheres med phenolchloroform I

I og præcipiteres med ethanol. I

I Størrelsesseparation af de skårne fragmenter udføres under anvendelse af 6% I

I polyacrylamidgel som beskrevet af Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 I

25 (1980). I

I Til ligering behandles omtrent ækvimolære mængder af de ønskede bestanddele, I

der er ende-skræddersyet på hensigtsmæssig måde for at tilvejebringe korrekt I

matching, med ca. 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 Mg DNA. (Nar der anvendes I

30 skårne vektorer som bestanddele, kan det være nyttigt at forhindre religering af I

den skårne vektor ved forbehandling med bakteriel alkalisk phosphatase.) I

Som nævnt ovenfor fremstilles t-PA-varianter fortrinsvis ved hjælp af specifik I

mutation. Mutanter, der kan anvendes til udøvelse af den foreliggende opfindelse, I

35 dannes lettest ved anvendelse af specifikke oligonukleotidsekvenser, som koder for I

DK 175776 B1 19 de ønskede deletionsforbindelsespunkters DNA-sekvens, samt et tilstrækkeligt antal tilgrænsende nukteotider til at opnå en sekvens med tilstrækkelig størrelse og sekvenskompleksitet til at danne en stabil dobbeltstreng på begge sider af det deletionsforbindelsespunkt, der gennemskæres.

i 5

Med henblik på analyse for at bekræfte korrekte sekvenser i de konstruerede plasmider anvendes ligeringsblandingerne typisk til at transformere E. coli K12 stamme 294 (ATCC 31446) eller andre hensigtsmæssige E. co//'-stammer, og vellykkede transformanter selekteres ved ampicillin- eller tetracydinresistens, hvis 10 det er hensigtsmæssigt. Plasmider fra transformanterne fremstilles og analyseres ved restriktionskortlægning og/eller DNA-sekventering ifølge metoden beskrevet af Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) eller ifølge metoden beskrevet af Maxam et al., Methods of Enzymofogy 65, 499 (1980).

15 Efter indføring af DNA'et i pattedyrværtscellen og selektion i medium for stabile transfektanter. udføres der amplifikation af DHFR-prdtein-kodende sekvenser ved dyrkning af værtscellekulturer i nærværelse af ca. 20-500.000 nM-koncentrationer af MTX, der er en kompetitiv inhibitor af DHFR-aktivitet. Det virksomme koncentrationsområde er naturligvis i høj grad afhængigt af arten af DHFR-genet, proteinet 20 og værtens karakteristika. Det er klart, at der ikke kan angives generelt definerede øvre og nedre grænser. Der kan også anvendes egnede koncentrationer af andre folinsyreanaloger eller andre forbindelser, der inhiberer DHFR. MTX er imidlertid selv hensigtsmæssigt, let tilgængeligt og effektivt.

25 B. Fremstilling af sammenligningsvarianter af t-PA

Konstruktionen af plasmidet pCVSVPA-N44 D22 er beskrevet i detaljer nedenfor i forbindelse med beskrivelsen af fremstillingen af plasmidet pi 154.

30 Ligeledes er forsøg med steddirigeret mutagenese beskrevet i detaljer nedenfor i forbindelse med fremstillingen af plasmidet pPADHFR-6 2C9.

des 44-84-vækstfaktorområde-deletionen, des 92-179-Kringle 1-område-dele-tionen og des 174-261-Kringle 2-område-deletionen blev også udført ved sted-35 dirigeret mutagenese under anvendelse af følgende oligonukleotider:

I DK 175776 B1 I

I

H des 44-86 GCAGGCCACAGTcXaAATAGATACTCGACCCACCTCCTACG I

H 5 des 92-179 TCTCAAATACATACTCCAGCCAc3tCCTACTTTCCGAATCCA I

TCCCCCTACCCTCGC I

I des 176-261 TTCTCCACCACCCCTCCCTC?rCCACCTCCCCCCT C I

I i

(delta-mærkerne angiver stedet for den deleterede sekvens), og disse blev an- I

vendt til fremstilling af ekspressionsplasmider pi analog mide som des 1-44- I

konstruktionen nedenfor bortset fra, at mutagenese blev udført pi det 1,4 kb lange I

15 Bglll/Apal-fragment (i en enkeltstrenget vektor) indeholdende hovedparten af de I

t-PA-kodende sekvenser (se fig. 3). Også på analog mide med des 1-44-konstruk- I

tionen kan des 44-84- og des 92-179-mutationerne i princippet også isoleres på I

Bglll/Scal-fragmenter og forbindes med Glu275-mutationerne og t-PA C-terminale I

kodende sekvenser på det 0,63 kb lange Scal/Apal-fragment, hvilket således giver I

20 plasmider, der ligner pi 154 som beskrevet nedenfor. I

C. Fremstilling og anvendelse af ekspressionsvektorer til rekombinant I

fremstilling af t-PA-varianterne I

I 25 1. Plasmidkonstruktioner I

I a. Plasmid pi 154 I

I 1) Plasmid pPADHFR-6 I 30 I Plasmidet pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) blev fremstillet som beskrevet fx i I EP 93619 (supra). Se fig. 1 for perspektivdetaljer. I øvrigt er dette plasmid i sig I selv og i transficeret form i CHO-celler den 15. december 1987 deponeret hos I American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA med ATCC-numrene I 35 henholdsvis 40403 og CRL 9606.

DK 175776 B1 21 2) Plasmid pCVSVPA-N44 D22

Plasmidet pPADHFR-6 {supra) blev skåret med Stul og EcoRI for at frigive et 826 5 basepar langt fragment, som omfattede sekvenser, der koder for t-PA-præsekven-sen indtil aminosyre 203. Dette fragment blev ligeret med vektorfragmentet af Smal/EcoRI-skåret M13mpl0RF, M13-fag-vektoren i replikativ form (se fx Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, red. A.

Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)). Det intermediaere plasmid, pPA-N44intA, var 10 således en replikativ form af M13-fagen, som omfattede den del af t-PA-genet, hvorfra kodonerne for aminosyrerne 1-44 skulle fjernes ved steddirigeret deletions-mutagenese.

Til udførelse af mutagenesen blev der fremstillet en oligonukleotidprimer ved en ! 15 metode såsom phosphotriestermetoden beskrevet af Crea et al., Proc. Natf. Acad. j

Sci. (USA) 75, 5765 (1978). Den primer, der blev anvendt til fremstilling af en des (l-44)-mutant, var som følger: 20

Bglll

Ser

T

5' ACGACCCACATCTCTCCCTCTCAAAAG 3* t-PA PA45 25 præsekvens

Det er klart, at de 10 5’-nukleotider i denne primer koder for præsekvensens 30 aminosyrer -3 til -1 (gly-ala-arg), mens de 17 3’-nukleo-tider koder for aminosyrerne 45-49 (SER-VAL-PRO-VAL-LYS). Bemærk, at "TCT’-kodonen blev anvendt til serin-45 for at bevare Bglll-stedet.

Ca. 200 mg af det syntetiske oligonukleotid blev phosphoryieret i 30 minutter ved 35 37°C i 30 μΙ 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP

I DK 175776 B1 I

I 22 I

I indeholdende ca. 8 enheder T4-polynukleotid-kinase. Ti! dannelse af heteroduplex I

blev ca. 50 ng enkeltstrenget pPA-N44intA opvarmet til 95°C (10 minutter) og I

I langsomt afkølet til stuetemperatur (30 minutter), derefter til 4°C, i ca. 40 μΙ I

I 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 1 mM dithiothreitol indeholdende 100 ng af I

I 5 den phosphorylerede primer. Primerekstension blev startet ved tilsætning af 10 μΙ - I

I ligasebuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 mM af hver af dGTP, dCTP, dATP, dTTP, I

5 enheder E co//-polymerase I stort (Klenow) fragment og 400 enheder T4-DNA- I

ligase. Efter 1 time ved 15°C blev reaktionsblandingen anvendt til at transformere I

I JMlOl-celler. I

I 10 I

Transformationen blev udført ved at blande hele ligeringsblandingen med 200 μΙ I

I kompetente JMlOl-celler efterfulgt af inkubation pi is i 30 og 5 minutter ved 37°C. I

Derefter blev 3,5 ml 2YT-topagar ved 55°C blandet med 200 μ! af de fag-mættede I

I celler, 10 μΙ IPTG (200 mM) og 50 μΙ X-gal, og efter tilsætningen blev cellerne ud- I

I 15 pladet pi Petriskåle indeholdende 2YT og uden lægemiddelstoffer. I

I Farveløse plaques blev udvalgt og overført til en mikrotiterskil indeholdende 100 μΙ I

I 2YT-medium. De inokulerede mikrotitervæsker blev anbragt på 15 cm diameter LB- I

I agarplader overlejret med en plæne af 600 μΙ JMlOl-celler i 8 ml 2YT-topagar og I

20 inkuberet natten over ved 37°C. De dannede plaques blev overført til en nitro- I

I celluloseskal ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskålen blev behandlet med I

I 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI i 3 minutter og vasket to gange med 3 M NaCI-0,5 M Tris- I

I HCI, pH 7,5, i 15 minutter og derefter med 2X SSC i 15 minutter. Præhybridise- I

I ringsblandingen indeholder 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCI, IX I

I 25 Denhardts 0,5% NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natrium- I

phosphat og 50 μ9/ηηΙ E coli tRNA. IX Denhardts indeholder pr. liter 200 mg Ficoll, I

I 200 mg polyvinyl-pyrrolidon, 200 mg bovint serumalbumin (BSA; fraktion V). I

I Skålen blev bagt ved 80°C i vakuum i 90 minutter. Derefter blev skålen inkuberet i I

I 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en Petriskål efterfulgt af tilsætning af I

I 30 5x106 cpm mærket primer og hybridiseret natten over. Selektiv vask af skålen blev I

udført med 0,4X SSC ved 49°C, og efter lufttørring blev skålen udsat for røntgen- I

I film. Positivt hybridiserende kloner blev yderligere analyseret ved dideoxysekven- I

I tering, se Aldeman, supra. Fra de positive kloner blev der selekteret et rekom- I

binant plasmid, der blev betegnet pPA-N44intA delta, og som indeholdt den kor- I

I 35 rekte deletion. I

DK 175776 B1 I

For på ny at bringe den muterede gensekvens fra M13-fagen i korrekt ekspres- I

sionssammenhæng i den DHFR-holdige ekspressionsvektor blev plasmidet I

pPADHFR-6 skåret separat med Bgll/Kpnl for at isolere det store fragment, som I

5 koder for DHFR-genet, og BstXI/Kpnl for at isolere et 2240 basepar langt frag- I

ment, der koder for 3'-enden (aminosyrerne 45-527) af naturlig t-PA. Et 400 I

basepar langt fragment, der bar N44 (des l-44)-mutationen, blev isoleret fra pPA- I

N44intA delta ved skæring med Bglll/BstXI og ligeret sammen med de to fragmen- I

ter, der stammede fra pPADHFR-6. Produktet fra denne ligering, som blev beteg- I

10 net CVSVPA-N44 D22, var således en kopi af stamplasmidet pPADHFR-6 bortset ; I

fra, at de kodoner, der kodede for aminosyrerne 1-44, var fjernet, se fig. 2 for i ' i perspektivdetaljer.

3) Plasmid pPADHFR-6 2C9 ! 15

Human t-PA-DNA blev opnået fra plasmiderne pPADHFR-6 (også betegnet pETPFR) og pA25E10. Fremstillingen af disse to t-PA-plasmider er beskrevet i EP 093619, supra.

20 Plasmidet pA25E10 indeholder sekvenser, der koder for de sidste 508 aminosyrer af t-PA-genet og 772 basepar af det 3'-ikke-translaterede område. Dette plasmid blev skåret med SacI og Bglll for at producere et 744 basepar langt fragment, som blev isoleret ved standardmetoder som beskrevet ovenfor. Dette fragment indeholder kodonerne for t-PA's aminosyrer 411-527 og omfatter en del af det 3'-ikke- 125 translaterede område.

Plasmidet pPADHFR-6 indeholder hele strukturgenet for t-PA og en del af det 3'-ikke-translaterede område. Dette plasmid blev skåret med SacI og Bglll for at producere et 1.230 basepar langt fragment, som blev isoleret. Dette fragment 30 indeholder kodoner for de første 410 aminosyrer af den modne form af t-PA.

Disse fragmenter blev ligeret sammen under anvendelse af standardmetoder og skåret med Bglll. Der blev isoleret et 1.974 basepar langt fragment, som indeholdt kodoner for hele den modne t-PA-sekvens samt en del af det 3'-ikke-translaterede 35 område. Dobbeltstrenget M13mp8 (Messing, supra) blev skåret med BamHI og I DK 175776 B1 H sammenføjet med den Bglll-skirne t-PA til dannelse af M13mp8PABglII. E coli JMlOl-celler (ATCC nr. 33876) blev transformeret med den dobbeltstrengede replikative form af M13mp8PABglll. De enkeltstrengede og dobbeltstrengede (RF) H former af M13mp8PABglII kan isoleres fra E coli JMlOl-celler inficeret med denne H 5 fag. Den enkeltstrengede form blev anvendt til stedspecifik mutagenese af t-PA.

H Det humane t-PA-strukturgen blev modificeret ved stedspecifik mutagenese til at H udtrykke t-PA med aminosyresubstitution i de forskellige relevante positioner. Der H blev fremstillet et syntetisk oligonukleotid såsom ved fastfase-phosphotriester- H 10 metoden ifølge Crea et al. (supra). Blandt de syntetiske primere, der blev frem- H stillet og anvendt til en sådan stedspecifik mutagenese, var:

Primer 2C9 Glu

DNA-sekvens G CCT CAG TTT G AA ATC AAA GGA G

I 15

Den i det følgende beskrevne procedure blev anvendt til dannelse af forskellige t- PA-kloner, som indeholdt de syntetiske primeres muterede sekvens. Den generelle metode, der blev anvendt, er metoden ifølge Adelman, supra. Fx blev 3M13RF2C9 H dannet ved anvendelse af ovenstående primer. Oprenset M13-RF-DNA fra det mu- I 20 terede t-PA-gen blev fremstillet ud fra E coli JM101 -celler. Derefter blev DNA-

I fragmenter indeholdende den muterede t-PA-DNA-sekvens anvendt til konstruktion J

af ekspressionsvektorer for den muterede t-PA.

I 50 ng af et syntetisk oligonukleotid blev phosphoryleret i 30 minutter ved 37°C i 25 10 μΙ 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 10 mM di-thiothreitol, 1 mM ATP inde- I holdende 8 enheder T4-po!ynukleotidkinase. Til anvendelse som probe blev 400 ng I af det syntetiske oligonukleotid phosphoryleret som ovenfor bortset fra, at ATP blev I erstattet med 60 mCi [γ32-Ρ]-ΑΤΡ (3000 pCi/mmol), hvilket resulterede i ca. 50-60 I x 106 cpm/400 ng 24-mer. Til dannelse af heteroduplex blev 10 ng enkeftstrenget I 30 M13mp8PABgllI opvarmet til 95°C (10 minutter) og langsomt afkølet til stuetempe- I ratur (30 minutter) i 40 μΙ 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM Mgdi, 1 mM dithiothrei- tol indeholdende 10 ng af den phosphorylerede primer og 50 ng EcoRI-skåret M13mp8PABglIIRF stort fragment. Primerekstension blev startet ved tilsætning af 10 μΙ ligasebuffer indeholdende 2 mM ATP, 0,25 mM af hver af dGTP, dTTP, dCTP 35 og dATP, 5 enheder E coli DNA-polymerase 1 stort fragment og 400 enheder T4- DK 175776 B1 25 DNA-ligase. Efter 1 time ved 12eC blev reaktionsblandingen anvendt til at transformere E. coli JMlOl-celler.

Transformation blev udført ved at blande 10 μΙ af ligeringsblandingen med 200 μΙ 5 kompetente JMlOl-celler efterfulgt af inkubation i 30 minutter på is og 5 minutter ved 37°C. Derefter blev 3,5 ml 2YT-top-agar ved 55°C blandet med 200 μΙ mættede JMlOl-celler, 10 μΙ IPTG (200 mM) og 50 μΙ X-gal, og efter tilsætning af de transformerede celler blev 9 cm udpladet på Petriskåle indeholdende LB uden lægemiddelstoffer.

10

Farveløse plaques blev udvalgt og overført til en mikrotiterskål indeholdende 100 μΙ 2\T-medium. De inokulerede mikrotitervæsker blev anbragt på 15 cm diameter LB-agarplader overlejret med en plæne af 600 μΙ JMlOl-celler i 8 ml 2YT-topagar og I inkuberet natten over ved 37°C. De dannede plaques blev overført til en nitro- I 15 celluloseskål ved fysisk kontakt i 1 minut. Nitrocelluloseskålen blev behandlet med I 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI i 3 minutter og vasket to gange med 3 M NaCI-0,5 M Tris- I HCI, pH 7,5, i 15 minutter og derefter med 2X SSC i 15 minutter. Præhybridise-

I ringsbfandingen indeholder 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,9 M NaCI, IX

I Denhardts 0,5% NP40, 100 μΜ ATP, 1 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natrium- I 20 phosphat og 50 μg/ml E. coli tRNA. IX Denhardts indeholder pr. liter 200 mg Ficoll, I 200 mg polyvinylpyrrolidon, 200 mg bovint serumalbumin (BSA; fraktion V). Skå- I len blev bagt ved 80°C i vakuum i 90 minutter. Derefter blev skålen inkuberet i I 3 timer med 6 ml præhybridiseringsvæske i en Petriskål efterfulgt af tilsætning af I 5xl06 cpm mærket primer og hybridiseret natten over. Selektiv vask af skålen blev I 25 udført med 0,4X SSC ved 49°C, og efter lufttørring blev skålen udsat for røntgen- I film. Positivt hybridiserende kloner blev yderligere analyseret ved dideoxysekven- I tering, se Aldeman, supra.

I Et vektorfragment, der fik betegnelsen fragment 1, blev opnået ved isolering af det 30 store fragment, som blev dannet ved skæring af pPADHFR-6 med Bglll og BstEII.

I Et fragment, der fik betegnelsen fragment 2, blev opnået ved isolering af det 400 basepar lange t-PA-fragment, der var opnået efter skæring af pPADHFR-6 med I Bglll og BstXI. Et 1.141 basepar langt t-PA-fragment, som indeholdt de ønskede mutationer (fragment 3), blev opnået ved at skære RF-DNA fra de muterede H DK 175776 B1 , i i ' t-PA-kloner {supra) med BstXI og BstEII. Fragmenterne 1 og 2 blev ligeret med fragment 3. DNA-blandingerne blev anvendt til at transformere E. coli. Fra hver af I1 transformanterne opnåedes de respektive eukaryote ekspressionsvektorer, fx H pPADHFR-6 2C9 4) Endelig konstruktion af pi 154 H Plasmidet pETPFR blev skåret med restriktionsenzymerne Bglll og Apal, og frag- H menterne blev fraktioneret ved agarosegelelektroforese. Det 6,0 kb lange frag- 10 ment, som indeholdt det t-PA-præprokodende område, den tidlige SV40-promotor, ' β-lactamase- og DHFR-generne, blev skåret ud fra gelen og elektroelueret.

Plasmidet pCVSVPA-IM44 D22 blev skåret med Bglll og Seal, fragmenterne blev H fraktioneret ved acrylamidgelelektroforese, og det bånd, der indeholdt det 0,63 kb I 15 lange fragment (som repræsenterede de kodende sekvenser for vækstfaktor-,

Kringle 1- og Kringle 2-områderne [partielt] af t-PA) blev skåret ud og elektroelu- er et.

Plasmidet pPADHFR-6 2C9 blev skåret med Seal og Apal, og det 0,63 kb lange 20 fragment, som indeholdt de kodende sekvenser for Kringle 2-området (partielt) og proteaseområdet (med 6lu 275-mutationen), blev oprenset ved acrylamidgel- elektroforese og elektroeluering.

De tre således isolerede, oprensedé fragmenter blev inkuberet i nærværelse af T4- 25 DNA-ligase og rATP til fremstilling af plasmidet pll54, der indeholder sekvenser, I som koder for et t-PA-moiekyle, der mangler resterne 1-44 (fingerområde-dele- ( tion) og omfatter en Arg 275 -> Glu-mutation (enkeltkædet mutant), se fig. 3.

I ; b. Plasmid p652 I 30 I Fag fl RFI-DNA (Zinder et al., Microbiol. Rev. 49, 101 (1985)) blev skåret med I Rsal og Ahalll, og det 0,4 kb lange fragment indeholdende DNA-replikationsini- I tieringsstedet fra + strengen blev isoleret. BamHI-linkere blev ligeret til dette fragment, hvorefter der blev udført skæring med BamHI for at producere kohæsive I 35 BamHI-terminaler. Disse blev dernæst indsat i BamHI-stedet på plasmidet pBR322 DK 175776 B1 27 (Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)) til dannelse af plasmidet pBRflori. Plasmidet ; > pBRflori blev skåret med BamHI og behandlet med KI en o w-fragmentet af E. coli i ;

DNA-polymerase I og deoxynukleosidtriphosphater for at danne stumpe ender, og J

det 0,4 kb lange fragment Indeholdende fl + streng Initieringsstedet blev isoleret.

5 Dette fragment blev derpå indsat i PvuII-stedet på pBR322, hvilket gav plasmidet p652, se fig. 4.

c. Plasmid pl060

10 1) Plasmid pCISt-PA

i Først blev vektoren pCIHt-PA konstrueret; denne vektor indeholder cytomegalo-virus-enhanceren og -promotoren, cytomegalovirus-splejsningsdonorstedet og intron, Ig-variabelt område-splejsningsacceptorstedet, cDNA, der koder for t-PA 15 (Pennica et al., Nature 301, 214 (1983)) og hepatitisoverfladeantigen-polyade-! nylerings- og transkriptionsterminationssted.

I Derefter blev vektoren pF8CIS konstrueret; denne vektor indeholder cytomegalo- i virus-enhancer (Boshart et al., Cell 41, 520 (1985)) og -promotor (Thomsen et al., ' 20 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 659 (1984)), cytomegalovirus-splejsningsdonor- stedet og en del af en intron (Sternberg et al., J. of Virol. 49, 190 (1984)), den Ig-variabelt område-intron og splejsningsacceptorsted, cDNA, som koder for faktor VIII, og SV40-polyadenyleringsstedet. De tre dele af konstruktionen er beskrevet nærmere nedenfor.

25 1. Den færdige vektors markør for ampicillinresistens og replikationsinitieringssted stammede fra udgangsplasmidet pUC13pML, en variant af plasmidet pML (Lusky et al., Nature 293, 79 (1981)). pUC13pML blev konstrueret ved at overføre polylinke-ren fra pUC13 (Veira et al., Gene 19, 259 (1982)) til EcoRI- og Hindlll-stederne på 30 pML. Et andet udgangsplasmid, pUC8CMV, var kilde til CMV-enhanceren, promotoren og splejsningsdonorsekvensen. pUC8CMV blev konstrueret ved at indsætte nukleotiderne 1-732 for CMV-enhanceren, promotoren og splejsnings-donorsekven-sen i de stumpe PstI- og SphI-steder på pUC8, se Veira et al., supra. Syntetiske BamHI-Hindlll-linkere (kommercielt tilgængelige fra New England Biolabs) blev 35 ligeret til den kohæsive BamHI-ende, hvilket dannede et Hindlll-sted. Efter denne

I DK 175776 B1 I

I i

ligering blev der udført skæring med Hindlll-HincII. Denne skæring gav et frag* I

. ment pi ca. 800 bp, som indeholdt CMV-enhanceren, promotoren og splejsnings- I

I I

donor-stedet. Efter gelisolering blev dette 800 bp lange fragment ligeret til et

I 2900 bp langt stykke af pUC13pML. Det fragment, der var nødvendigt til konstruk- I

I 5 tion af pF8C!S, blev opnået ved skæring af ovenstående intermediære plasmid med I

Sall og Hindlll. Dette 3123 bp lange stykke indeholdt ampicillinresistens-markø- I

I ren, replikationsinitieringsstedet fra pllC13pML og kontrolsekvenserne for CMV, I

H herunder enhancer, promotor og splejsningsdonor-sted. I

10 2. Den Ig-variable omrade-intron og splejsningsacceptorsekvens blev konstrueret

I under anvendelse af en syntetisk oligomer. En 99-mer og en 30-mer blev synteti- I

I ; seret kemisk med følgende sekvens for IgG-intronen og splejsningsacceptor-sted I

I (Bothwell et al., Celt 24,625 (1981)): I

I 15 I

I 15’ ACTAGCAAGCTTCACCtCTGGCACCCTTGA... I

I 31 gåtctggccatacacttgagtgacaatga... I

I i 60 CATCCACTTTCCCTTTCTCTCCACAGGT... I

I j 88 GTCCACTCCCAC 3’ I

: 20 13' CAGGTGACGGTCCAGCTTCACGTCGTCCCA 5’ I

I 25 I

I DNA-polymerase I (Klenow-fragment) udfyldte det syntetiske stykke og dannede et I

I dobbeltstrenget fragment (Wartell et al., Gene 9, 307 (1980)). Dette blev fulgt af I

I dobbelt skæring med PstI og Hindlll. Denne syntetiske linker blev klonet i pUC13 I

I I (Veira et al., supra) ved PstI- og Hindlll-stederne. Den klon, der indeholdt det I

I i 30 syntetiske oligonukleotid, betegnet pUCIg.10, blev skåret med PstI. Et Clal-sted I

I blev føjet til dette fragment under anvendelse af en Pstl-Clal-lin-ker. Efter skæring I

I med Hindlll blev der gelisoleret et 118 bp langt stykke, der indeholdt en del af Ig- I

I intronen og Ig-variabelt område-splejsningsacceptoren. I

DK 175776 B1 29 3. I den tredje del af konstruktionsskemaet blev hepatitisoverfladeantigenets 3’-! ende erstattet med polyadenyleringsstedet og transkriptionsterminationsstedet af det tidlige område af SV40. En vektor, pUC.SV40, som indeholdt SV40-sekven-serne, blev indsat i pUC8 i BamHI-stedet som beskrevet i Veira et al., supra.

5 pUC.SV40 blev derpå skåret med EcoRI og Hpal. Et 143 bp langt fragment, som kun indeholdt SV40-polyadenyleringsstedet, blev gelisoleret fra dette skæringsprodukt. To yderligere fragmenter blev gelisoleret efter skæring af pSVE.8clD (EP 160457). Det 4,8 kb lange fragment, der var dannet ved EcoRI- og Clal-skæring, indeholder SV40-DHFR-transkriptionsenheden, pML-replikationsinitieringsstedet og 10 ampicillinresistensmarkøren. Det 7,5 kb lange fragment, der blev dannet efter skæring med Clal og Hpal, indeholder cDNA for faktor VIII. En tredelt ligering giver pSVE.8c24D. Dette intermediære plasmid blev skåret med Clal og Sall, hvilket gav et 9611 bp langt fragment indeholdende cDNA for faktor VIII med SV40-poly-ade-nylerings- og transkriptionsterminationssteder efterfulgt af SV40-DHFR-transkrip-15 tionsenheden.

Ved den endelige tredelte ligering til dannelse af pF8CIS blev der anvendt: a) det 3123 bp lange Sall-Hindlll-fragment indeholdende replikationsinitieringssted, ampicillinresistens-markøren og CMV-enhancer, promotor og splejsningsdonor; b) 20 det 118 bp lange Hindlll-Clal-fragment indeholdende Ig-intronen og splejsnings-acceptor; og c) et 9611 bp langt Clal-Sall-fragment indeholdende cDNA for faktor VIII, SV40-polyadenyleringssted og SV40-DHFR-transkriptionsenheden.

Dernæst blev konstruktionen af plasmidet pCIHt-PA ud fra det intermediære plas-25 mid pClat-PA og plasmidet pF8CIS (ovenfor) gjort færdig: t-PA-cDNA'et blev først klonet i pML til dannelse af et Clal-sted ved genets 5'-ende.

Til dette formål blev et 3238 bp langt HindlH-fragment fra pSVpa-DHFR (også betegnet pETPFR, supra) indsat i Hindlll-stedet på pML (Lusky et al., supra).

30 Kolonier blev screenet for kloner, som har cDNA'ets 5'-ende ved siden af Clal-stedet. Det intermediære plasmid blev betegnet pClat-PA. Et t-PA-cDNA efterfulgt af 3’-polyadenyleringsområderne blev isoleret i form af et Clal-KpnI-fragment på 2870 bp. Dette fragment blev ligeret til det 5146 bp lange fragment fra pF8CIS.

Dette Clal-KpnI-fragment fra CIS-vektoren tilvejebragte 5’-kontrolområdet, en

I DK 175776 B1 I

Η

I . I

SV40-DHFR-transkriptionsenhed, genet for ampicillinresistens og initieringsområdet I

I fra pML, se fig. 5. I

Ekspressionsniveauer af t-PA blev opnået ved transfektion af CHO- og 293-celler I

5 med pCIHt-PA ifølge fremgangsmåder, der er generelt kendte i sig selv og beskre- I

I vet ovenfor. Medier fra fx de transficerede 293-celler blev analyseret og viste, at I

I pCIHt-PA producerede 420 ng/ml t-PA. 1 I

I j Vektoren pCISt-PA indeholdende cytometalogvirus-enhanceren og -promotoren, I

O I

10 cytomegalovirus-splejsningsdonorsted og intron, Ig-variabelt omrade-splejsnings-

I acceptorstedet, cDNA, som koder for t-PA, samt pSV40-polyadenyleringssekvensen I

I blev til slut konstrueret: I

I Udgangsvektorerne for denne konstruktion var pCIHt-PA og pF8CIS (supra). Sidst- I

15 nævnte vektor har de samme 5'-kontroller som pCIHt-PA, men omfatter cDNA for I

faktor VIII og SV40-polyadenyleringsstedet. SacII blev anvendt til at skære 3' af t- I

I PA-cDNA'et. Den resulterende 3 -udragende ende blev gjort stump med T4-poly- I

I merase. pCIHt-PA blev derefter skåret med Clal. Dette sted adskiller den kimære I

I intron, der skærer mellem CMV-intronsekvenserne, og Ig-variabelt område-intron* I

I 20 en. Et 2870 bp langt fragment blev gelisoleret efter Clal-behandlingen. SV40-poly- I

I adenyleringsstedet, DHFR, transkriptionskontrol, bakterielt replikationsinitierings- I

I sted og ampr-gen såvel som CMV-enhancer og promotor og splejsningsdonor blev I

isoleret fra pF8CIS. Disse elementer blev isoleret i fragmenter som et 2525 bp I

I langt Sal-BamHI-fragment og et 3113 bp langt Hpal-Sal-fragment. En tredeit I

I 25 ligering af KpnI{stump)-ClaI-fragmentet med Hpal-Sal-fragmentet og Sal-BamHI- I

I fragmentet gav pCISt-PA, som blev udtrykt i både CHO- og 293-celler som beskre- I

I vet ovenfor for plasmidet pCIHt-PA, hvilket gav henholdsvis 55 og 3000 ng/ml t- I

I PA, se fig. 6. I

I 30 2) Endelig konstruktion af pl060 I

I Plasmidet pCISt-PA blev skåret med Kpnl, behandlet med E. coli DNA-polymerase I I

Klenow-fragment og deoxyribonukleosid-triphosphater for at danne stumpe ender I

I og recirkulariseret ved intramolekylær ligering. Denne behandling ødelagde Kpnl- I

I 35 stedet og dannede et plasmid med betegnelsen pCIS t-PA ΔΚρη. Plasmidet pCIS t- I

DK 175776 B1 31 PA ΔΚρη blev skåret med Sall og Sstll, og det 4,6 kb lange fragment blev isoleret. Desuden blev plasmidet pCISt-PA skåret med PstI og Sstll og det 1,4 kb lange fragment isoleret. Plasmidet p652 blev skåret med PstI og Sall og det 3,4 kb lange fragment isoleret. Disse tre fragmenter blev forbundet ved en trevejsligering, hvil-5 ket gav plasmidet pl060, se fig. 7.

d. Plasmid pll79

Plasmidet pl060 blev skåret med Bglll (partiel) og Apal, og det 8,0 kb lange frag-10 ment blev oprenset ved agarosegelelektroforese og elektroeluering. Plasmidet pi 154 blev tilsvarende skåret med Bglll og Apal, og det 1,3 kb lange fragment blev isoleret. Disse to fragmenter blev forbundet ved hjælp af T4-DNA-ligase og rATP til dannelse af plasmidet pll79, se fig. 8. Plasmidet pll79 indeholdt des (1-44)/Glu 275 t-PA-mutanten (des 1-44E275 t-PA) under kontrol af CMV-promotoren 15 samt β-lactamasegenet, DHFR-genetog fl-DNA-replikationsinitieringsstedet.

Sekvensen af det kodende område for des 1-44E275 t-PA er vist i fig. 9.

2. Mutageneseeksempler 20 a. Skabelonfremstilling

Plasmidet pi 179 blev indsat i E. coli stamme JM101 (ATCC 33876) ved CaCI2-medieret transformation. Disse celler blev derefter inficeret med hjælperviruset M13K07, og enkeltstrenget pll79-DNA blev fremstillet som beskrevet af Vera et 25 al., Meth. Enzymoi. 153, 3 (1987). Kort beskrevet blev der til 0,3 ml af en mættet kultur af transformerede celler i 2YT-broth sat 109-10'° pfu M13K07, og blandingen blev inkuberet i 15 minutter ved 37°C. 1,5 ml frisk 2YT-broth indeholdende 50 pg/ml carbenicillin blev tilsat, og kulturen blev forsigtigt omrystet i 16 timer ved 37°C. Efter pelletering af cellerne blev fag-DNA og pakket plasmid-DNA høstet, og 30 enkeltstrenget DNA blev fremstillet som beskrevet af Anderson, Nucl. Acids Res. 9, 3015 (1981).

35

I DK 175776 B1 I

I I

b. Steddirigeret in v/tro-mutagenese I

I Der blev udført mutagenese på pi 179 under anvendelse af oligodeoxyribo- · I

nukleotider i det væsentlige som beskrevet af Zoller et al., Meth. Enzymol. 100, I

5 468 (1983) bortset fra, at mutanter blev identificeret ved kolonihybridisering og I

ikke ved plaquehybridisering. Mutationer blev bekræftet ved DNA-sekventering I

direkte på det enkeltstrengede plasmid-DNA under anvendelse af dideoxy-nukleo- I

tidkædeterminationsmetoden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463 I

I (1977)). I

Η I

c. Plasmider, mutanter og primere I

Under anvendelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder (se især del 2b.) blev I

følgende plasmider fremstillet (venstre kolonne) indeholdende de anførte muta- I

15 tioner (kolonnen i midten) under anvendelse af de anførte primere (højre kolonne): I

I Plasmid Hutant Primer (5* --> 3') I

pllSA Vel 213 --> Lys CTCKTf.GGCAACAAGTA.Cf.CAGC I

I pll85 Ile 210 --> Lys TCCATCATCCTCAAGGGCAACCTT I

I pll86 Thr 252 --> Arg AACCGCAGGCTCAGGTGGGAGTA I

I 20 pll88 Asn 184 --> Ser TGCTACTTTGGCAGCCCGTCACCC I

I pll89 Asn 184 --> Asp TGCTACTTTGCGCACGGCTCAGCC I

p1193 Asp 238 --> Asn AATCCTCATGCGAACCCCAACCCC I

I pll94 Ile-Gly-Lys-Val T CCAT GAT CCTCCGT GCCCGACGATACACAGCA I

210-213 --> Arg-Ala-Arg-Arg I

H pl224 lle-Cly-Lys-Val TCCATGATCCTCCCTGGCCACAAGTACACAGC I

25 210-213 ·*> Arg-Gly-Gln-Lys I

pll92 Trp 253 --> Glu CGCACGCTCACCGAGGACTACTGT I

I 3. Ekspression og oprensning I

a. Plasmidfremstilling I

30 I

I Transformerede celler blev dyrket til mætning i 500 ml LB-broth indeholdende I

I 50 fig/ml carbenicillin. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet I

I i 40 ml 50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCI (pH 8,0). Denne suspension I

I blev tilsat 60 ml 1% natriumdodecylsulfat, 0,1 M NaOH, og blandingen blev inkube- I

I 35 ret i 2 minutter ved 25°C og derefter i 10 minutter ved 0°C. Der tilsattes 52 ml 4 Μ I

DK 175776 B1 33 eddikesyre, 3 M natriumacetat, og blandingen blev inkuberet i 30 minutter ved 0°C.

Blandingen blev derefter centrifugeret ved 20.000 omdr./minut i 20 minutter, supernatanten blev blandet med 2 volumina 100% kold ethanol, og det resulterende præcipitat blev opsamlet ved centrifugering. Pelleten, 5 som indeholdt plasmid-DNA og RNA, blev tørret og genopløst i 100 mM Tris {pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 pg/ml Rase A. Efter klaring ved centrifugering blev dette indstillet til 0,5 mg/ml i ethidiumbromid, og en lige så stor vægtmængde CsCI blev tilsat. DNA'et blev derefter centrifugeret i en Beckman VTI65-rotor i 16 timer ved 55.000 omdr./minut og ved 18°C. DNA-båndet blev høstet ved sidepunktur, ekstra-10 heret med n-butanol for at fjerne ethidium-bromidet, fortyndet med H20 og praeci-piteret med ethanol. DNA blev genopløst i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA til en siutkoncentration på 1 mg/ml.

b. Transfektion og ekspression 15 293-celler blev dyrket til konfluens. 10 pg t-PA-plasmid-DNA (fx pi 179 og derivater deraf fremstillet som beskrevet ovenfor) blev blandet med 1 pg DNA, som kodede for VA-RNA-genet (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)), og opløst i 500 μΙ 1 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCIVW. Der tilsattes (dråbevis under om-20 røring) 500 μΙ 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCI, 1,5 mM NaP04, og præcipi-tatet lodes blive dannet i 20 minutter ved 25°C. Det suspenderede præcipitat blev derefter sat til cellerne (i 100 mM plade) og lodes sætte sig i 4 timer i inkubatoren.

Mediet blev derefter suget fra, og 2 ml 20% glycerol i phosphatbufret saltvand blev ^ tilsat i løbet af 30 sekunder. Cellerne blev vasket to gange med 10 ml serumfrit 25 medium, hvorefter der tilsattes frisk medium, og cellerne blev inkuberet i 5 dage.

Til dannelse af stabile CHO-cellelinjer, der udtrykte t-PA-varianterne, blev Bglll/Apal-fragmentet, som indeholdt hovedparten af de t-PA-kodende sekvenser (fig. 7 og 8), ligeret til de 6,0 kb lange BglII/-ApaI-fragmenter fra vektoren 30 pPADHFR-6 (fig. 3). De resulterende plasmider blev derefter indsat i CHO-celler og induceret til at overekspressere t*PA-varianterne ved at amplificere den kodende sekvens ved hjælp af selektion i methotrexatholdige medier.

35

I DK 175776 B1 I

I 34 I

I c. Oprensning I

I Oprensning af t-PA-produkteme blev udført ved at lede det konditionerede medium I

I hen over en søjle (1 ml lejevolumen) af kontrollerede glaskugler, hvortil der var I

I 5 koblet et anti-t-PA-gede polyklonalt A6-antistof (fremstillet ved i og for sig kendte ( I

standardmetoder). Før påføring af mediet blev søjlen ækvilibreret med phosphat- I

I bufret saltvand, og efter påføring blev søjlen ækvilibreret med 0,1 M Tris-HCI (pH I

I 7,5), 1 M NaCI. t-PA blev elueret med 0,1 M eddikesyre, 0,15 M NaCI, 0,02 M argi- I

I nin (pH 2,0), og fraktioner blev umiddelbart neutraliseret med Tris-base. Fraktioner I

10 blev indstillet til 0,01% Tween 80 før samling i pujle. I nogle tilfælde blev t-PA- I

varianterne præoprenset på lysin-sepharose før endelig oprensning på en anti-t- I

PA-gede polyklonalt antistof-søjle. I

I D. Biologiske og farmakokinetiske assays I

I 15 I

I 1. t-PA-kvantificering I 1

Proteinkoncentrationer blev rutinemæssigt bestemt ved ELISA standardiseret til t- I

I PA med nativ sekvens (se EP 93619, supra). Proteinrenhed og -homogenitet blev I

I 20 analyseret ved polyacrylamidgelelektroforese i nærværelse af natriumdodecylsulfat I

I (PAGE-SDS) med buffersystemet beskrevet af Laemmli, Nature 227, 680 (1970). I

I Typisk blev der anvendt 7-17% gradientgeler, og proteiner blev visualiseret ved I

I sølvfarvningsteknikken ifølge Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307 (1981).

I 25 2. Koagellyse I

I t-PA-varianterne blev analyseret for deres evne til at lysere fibrin i nærværelse af I

mættende plasminogenkoncentrationer ifølge fremgangsmåden beskrevet af I

I Carlsen et al., Anal. Biochem. 168, 428 (1988). Ved in v/fro-koagellyseassayet I

30 måles vævsplasminogenaktivatorers aktivitet ved turbidimetri under anvendelse af I

I et mikrocentrifugeanalyseapparat. En blanding af trombin og t-PA-testprøver een- I

I trifugeres ind i en blanding af fibrinogen og plasminogen for at initiere koageldan- I

I nelse og efterfølgende koagelopløsning. Den resulterende absorbansprofil i forhold I

I til tiden analyseres for at bestemme assay-endepunktet. t-PA-varianternes aktivi- I

35 teter blev sammenlignet med en standardkurve for rt-PA (EP 93619, supra). Den I

DK 175776 B1 35 buffer, der anvendtes i hele assayet, var 0,06 M natriumphosphat, pH 7,4, indeholdende 0,01% (vol/vol) Tween 80 og 0,01% (vægt/vol) natriumazid. Humant trombin var i en koncentration pi 33 enheder/ml. Fibrinogen (med 2,0 mg/ml koagulerbart protein) blev nedkølet på våd is for at præcipitere fibronektin og 5 derefter gravitetsfiltreret. Glu-plasminogen var i en koncentration på 1 mg/ml.

Temperaturen i analysekammeret indstilles pi 37°C. "Loaderen" indstilles til at afgive 20 μΙ rt-PA (-500 ng/ml til 1,5 Mg/ml) som prøven for standardkurven eller 20 μΙ rekombinante t-PA-varianter i en koncentration, der forårsagede lyse inden for omfanget af standardkurven, 20 μΙ trombin som sekundært reagens og 200 μΙ 10 af en 50:1 (vol/vol) fibrinogen:plasminogenblanding som det primære reagens. Absorbans/tids-programmet blev anvendt med en 5 minutters inkubationstid, et 340 nm-filter og 90-interval-aflæsninger.

3. Fibrinbinding 15

Fremgangsmåden til fibrinbinding er en modifikation af fremgangsmåden beskrev- 1 et af Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). Den t-PA-prøve, der skal testes, sættes til en opløsning indeholdende 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,12 M NaCI, 0,01%

Tween 80, 1 mg/ml humant serumalbumin og forskellige koncentrationer af plas-20 minogenfri fibrin (0, 0,05, 0,1, 0,25 og 0,5 mg/ml). Reaktionsblandingens endelige volumen var 1 ml. Prøven blev inkuberet ved 37°C i 5 minutter efterfulgt af tilsætning af 1 enhed trombin. Prøverne blev derefter inkuberet i 1 time ved 37°C. Koa-gelet blev fjernet ved centrifugering, og den mængde t-PA, der forblev ubundet i supernatanten, blev bestemt ved ELISA. Dataene er plottet som procent bundet t-25 PA-variant i forhold til fibrin(ogen)-koncentrationerne.

4. Farmakokinetik a. Formål 30

Formålet var at sammenligne de endelige halveringstider og clearance-hastigheder for 12SI-mærket rt-PA og t-PA-mutanter.

35

I DK 175776 B1 I

36 I

b. Procedure I

20 kaniner blev tilfældigt tildelt én af fire behandlingsgrupper: rt-PA, des 1-44 t- I

PA, des 1-44E275 t-PA og des 1-44D184E275 t-PA. Proteinerne blev mærket med I

5 J25I til ca. 10 μθ/kg og blandet med 0,1 mg/kg rt-PA for at formindske uspecifik I

adsorption af det mærkede protein. Dosis af TCA-præcipiterbart 125I-protein var I

nominelt 5 μϋ/kg. I

Kaninerne havde et kateter med en heparinlås i hvert øre. Dosis blev administreret I

10 som en intravenøs bolus i ét kateter efterfulgt af skylning med saltvand. Alle blod- I

prøver blev taget fra det modsatte øre. 1 ml blodprøver blev taget pi følgende I

I tidspunkter: 0 (før dosis) og 2, 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 og 180 minutter I

efter dosis. Saltvand blev anvendt til at skylle katetrene og erstatte blodvolumenet I

på hvert tidspunkt. Blodprøverne blev anbragt i 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende I

15 4,2 mM EDTA og 1 mM PPACK. Rørene blev holdt på is indtil centrifugering. Efter I

centrifugering blev plasmaet øjeblikkeligt fjernet, anbragt i Eppendorf-rør og opbe- I

varet på is indtil afslutningen af undersøgelsen. Proteiner i 100 μΐ af hver plasma- I

prøve blev præcipiteret med trichloreddikesyre. Det 125I, der var bundet til protei- I

ner, blev kvantificeret ved at tælle hvert præcipitats gammastråling. Resultaterne I

20 var baseret på CPM/100 μΙ prøve og omdannet til CPM/ml med henblik på dataana- I

lyse. I

c. Dataanalyse I

I 25 Arealet under kurven (AUC) for hver kanin blev beregnet fra 2 til 180 minutter ved I

trapezmetoden under anvendelse af AUC-proceduren. Clearance blev beregnet ved I

I hjælp af formlen CL = dosis/AUC. Hvert proteins clearance i forhold til rt-PA er an- I

I ført nedenfor: I

I 30 I

1 35 I

DK 175776 B1 37

Sammenligning Clearance-forhold des 1-44 t-PA 0,12 des 1-44E275 t-PA 0,11 5 des 1-44D184E275 t-PA 0,38 d. Résumé 10 Rækkefølgen af de endelige halveringstider for de 125I-mærkede proteiner er som følger: rt-PA, des 1-44 t-PA, des 1-44 E275 t-PA, des 1-44D184E275 t-PA. De faktiske værdier for halveringstiderne skal bestemmes ud fra farmakokinetiske undersøgelser med umærkede proteiner. Clearance af 125I-mærket des 1-44 t-PA 15 og des 1-44E275 t-PA var sammenlignelige og udgjorde ca. 1/9 af den værdi, der blev opnået for 125I-mærket rt-PA. Clearance af den tredobbelte mutant, des 1-44D184E275 t-PA, var 3 gange højere end de andre mutanter og ca. 2,5 gange lavere end den 125I-mærkede rt-PA.

' 20 E. Farmaceutiske præparater

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan formuleres ifølge kendte fremgangsmåder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, ved hvilke fremgangsmåder det humane vævstype-plasminogenaktivatorprodukt ifølge op-25 findelsen kombineres i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer. Egnede bærere og deres formulering, herunder andre humane proteiner, fx humant serumalbumin, er fx beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Sciences af E.W. Martin. Sådanne præparater indeholder en virksom mængde af proteinet ifølge opfindelsen sammen med en hensigtsmæssig mængde af bæreren for at fremstille farmaceu-30 tisk acceptable præparater, der er egnede til effektiv administration til værten.

Fx kan den humane vævstypeplasminogenaktivator ifølge opfindelsen administreres parenteralt til patienter, der lider af cardiovaskulære sygdomme eller tilstande. Dosering og dosishastighed kan være parallel med det, der for tiden anvendes ved 35 kliniske undersøgelser af andre cardiovaskulære, trombolytiske midler, fx ca. 1-

I DK 175776 B1 I

I

2 mg/kg legemsvægt i form af en intravenøs eller intraarteriel dosis i løbet af 1,5- I

12 timer hos patienter, der lider af myocardieinfarkt, iungeemboli, etc. I

Som ét eksempel på en passende doseringsform kan et hætteglas indeholdende I

5 50 mg human vævstypeplasminogenaktivator, arginin, phosphorsyre og polysorbat I

80 rekonstitueres med 50 ml sterilt vand til injektion og blandes med et hensigts- I

mæssigt volumen 0,9% natriumchlorid-injektionsvæske. I

Den humane vævstypeplasminogenaktivator med forlænget eller reduceret I

10 halveringstid kan være egnet til hurtig intravenøs injektion, fx især som en bolus. I

Dette eliminerer behovet for komplicerede administrationsprocedurer og kan forøge I

I , muligheden for at anvende t-PA i omgivelser med begrænset medicinsk udstyr I

I I såsom i ambulancer med paramedicinsk personale. En forlænget halveringstid for I

human vævstype-plasminogenaktivator kan også muliggøre lavere og mere sikre I

15 initiale doser og kan opretholde trombolytisk virksomme plasminniveauer i op til 45 I

minutter eller længere. En længere halveringstid for human vævstype-plasmino- I

I genaktivator kan også være nyttig med hensyn til forlænget lav-dosisterapi, hvilket I

kan være nødvendigt for at undgå reokklusion efter vellykket akut trombolyse eller I

I til forlænget trombolyse, hvilket kan være nødvendigt i tilfælde af perifer vaskulær I

I 20 okklusion. En reduceret halveringstid for human vævstypeplasminogenaktivator I

I kan hos nogle patienter være den ønskede type af trombolytisk terapi, idet den I

tilvejebringer virksomme plasminniveauer over kortere tidsrum. I

Claims (2)

39 DK 175776 B1 kendetegnet ved, at den er yderligere modificeret ved énkæde- til tokæde-spaltningsstedet. 3. Human vævsplasminogenaktivator ifølge krav 1 eller 2, 5 kendetegnet ved, at den er yderligere modificeret ved et N-bundet glycosy-leringssted. 4. Human vævsplasminogenaktivator ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den er yderligere modificeret ved 244-255-området. 10 i 5. Human vævsplasminogenaktivator, kendetegnet ved, at den er valgt fra gruppen bestående af des 1-44D184E275 t-PA, des 1-44S184E275 t-PA, des 1-44K213E275 t-PA, des 1-44R210A211R212R213E275 t-PA, des 1-44R252E275 t-PA, des 1-44K210E275 t-PA 15 og des 1-44R210G211Q212K213E275 t-PA. 6. Farmaceutisk præparat, der omfatter en t-PA-variant ifølget et hvilket som helst af kravene 1-5. 25 PATENTKRAV

1. Human vævsplasminogenaktivator-(t-PA)-variant, kendetegnet ved, at den har en første modifikation, der omfatter funktionel fjernelse af al eller en del af det fingerområde og/eller vækstfaktorområde og/eller 30 Kringle 1-område eller Kringle 2-område, som resulterer i reduceret fibrinbindings-aktivitet, og i det mindste én yderligere modifikation, der resulterer i en genoprettet fibrinbinding, der er sammenlignelig med nativ t-PA's, hvor den yderligere modifikation er det formodede Kringle 2-lysinbindingssted.

2. Human vævsplasminogenaktivator ifølge krav 1,