LT3948B

LT3948B - Polypeptide, plasmids, method for the preparation of plasmids, method for the preparation of polypeptide, thrombolytic material and applicatio of polypeptide

Info

Publication number: LT3948B
Application number: LTIP1532A
Authority: LT
Inventors: Gerd Josef Steffens; Wolfgang Amandus Guenzler; Leopold Flohe; Regina Elfried Brigelius-Flohe; Bernhard Wolf
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 1991-01-22
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 1996-05-27
Also published as: ATE204326T1; HK1010108A1; FI920263A0; IL100163A0; HU9200127D0; EP0496327A1; DE4101736A1; LV10974A; EP0496327B1; PT496327E; DK0496327T3; HUT63877A; FI920263A; RU2108387C1; ES2164048T3; LTIP1532A; JPH06169770A; DE59209915D1; HU212510B; IE914040A1

Description

Pagal šį aprašymą nauji polipeptidai yra efektyvūs plazminogeno aktyvatoriai, todėl jie su dideLe sėkme naudojami kaip trombolitinės medžiagos. Gydant fibrino sudarytus trombus kraujagyslėse, pavyzdžiui, miokardo infarktas, plaučių arterijos embolija, galūnių venų ir arterijų trombozė ir kt., didelę reikšmę turi plazminogeno aktyvatoriai. Apytikriai nuo 1950 m. pradžios žinoma, kad žmogaus šlapime yra mažiausia vienas proteolitinis fermentas, kuris paverčia plazminogeną į plazminą, tai yra, į fermentą, kuris suskaldo fibriną į tirpius polipeptidus ir tuo pačiu ištirpina fibrino trombus. Šis plazminogeno aktyvatorius buvo pavadintas urokinaze, po to pasirodė, kad faktiškai egzistuoja įvairios urokinazės formos, mažų mažiausia žinomas nuo 1970 metų urokinazės pirmtakas - prourokinazė. Ši prourokinazė turi vieną grandinę, taip pat yra vadinama scu-PA (urokinazės tipo vienos grandinės plazminogeno aktyvatorius). Šią scu-PA sudaro 441 aminorūgšties liekana, gamtinėje formoje yra glikozilinta 302 aminorūgšties liekanos. Šios scu-PA molekulinė masė (M_r) literatūroje yra nurodoma apytikriai 54 000 daltonų.

Po to, kai 1977 metais Nolan ir kiti (Biochim. Biophys. Actą 496, p. 384-400) nustatė žmonių audinių kultūroje, tarp kitko, urokinazės profermentą, kurio molekulinė masė atitiko žinomos mažos molekulinės masės formos urokinazės molekulinei masei (31 500 D) , Wijngaards ir kiti (Thrombosis Res. 42 (1986), p. 749-760) ir Pijken ir kiti (Thrombosis Res. 42 (1986), p. 761-768) pranešė, kad egzistuoja prourokinazė, kurios dydis 30kD (30 kilodaltonų), beždžionių audinių kultūroje, apie jos gryninimą ir fibrinolitines savybes. Taip pat 1986 metais Strump ir kiti pranešė (J. Biol. Chem. 261 p. 1712017126), kad žmonių auglio CALU-3 (ATCC, HTB 55) supernatente yra vienos grandinės prourokinazė, kurios molekulinė masė (M_r) yra apie 32 000 daltonų ir tam, kad skirti nuo didelės molekulinės masės prourokinazės ( scu-PA 54k ) buvo pavadinta scu-PA32k. Šis scu-PA 32k atitinka scu-PA 54k, kuriame nėra 143 aminorūgščių liekanų iš N-galo (nuo Ser¹ iki Glu¹⁴³) , glikozilinta yra ta pati aminorūgšties liekana 302 (Asn.).

Publikuotoje Europos paraiškoje Nr. 247 674 Al aprašomas scu-PA32k gavimas iš ląstelių linijos CALU-3 maitinimo terpės ir iš transfekuotų plazmidėmis pSVscu-PA-32k ir pSVSDHFR ląstelių CHO- (kinietiškų žiurkėnų kiaušidžių ląstelės) maitinimo terpės. Nors ten minima galimybė panaudoti genetiškai pakeistus mikroorganizmus, norint gauti scu-PA 32k, bet papildomas aprašymas arba atitinkamas pavyzdys nepateikti.

Europos paraiškoje Nr. 92 182 A2 aprašoma, tarp kitko, DNR koduojančių mažos molekulinės masės urokinazę, kurios molekulinė masė apie 33 000 daltonų, ir atitinkamų plazmidžių gavimas, o taip pat jų ekspresija E. coli K12 294 (ATCC, 31 446) ląstelėse neglikozilinto baltymo, kurio molekulinė masė apie 33 000 daltonų, su nurodyta ten fig. 2A aminorūgščių liekanų seka, kuri atitinka srityje nuo 133 iki 411 scu-PA 54k baltymui.

Apie kai kurias neglikozilinto produkto, kuriame yra 136-411 aminorūgščių liekanos, aprašė 1987 Gunz-Iev ir kiti (Trombozė ir hemostazė, 58(1987) p. 216).

Publikuotame Europos patente Nr. 312 941 A2 aprašomi scu-PA 32k struktūros polipeptidai, turintys prourokinazės aktyvumą, kurie šiuo atveju turi papildomą sritį nuo 136 iki 143 aminorūgšties liekanų arba atskiras sritis, kuriose, esant būtinumui, (priklausomai nuo Ngalo prigimties) 156 aminorūgšties liekana (Arg) pakeista, ir jų gavimas, ekspresuoj ant atitinkamoms plazmidėms E. coli K12 JM105 ląstelėse, kurios metu vyksta šių peptidų ekspresija, produktas kaupasi viduląsteliniuose intarpiniuose kūneliuose.

Pateikiamas išradimas yra naujų polipeptidų, kurių bendra formulė - I arba kurie atitinka struktūrinę schemą, pateiktai fig. 1, panaudojimas tepapijoje plazminogeno aktyvatoriais:

Ser-X₁-X₂-rscu-PA¹⁴³”⁴¹¹ (I) , kurioje rscu-PA -neglikozilinta aminorugščių sekos sritis nuo 143 (Glu) iki 411(LeuOH) iš scu-PA 54k,

X₂ - viena iš šių aminorugščių liekanų: Asn, Pro arba Ser ir

X₂ - vienguba jungtis arba Glu, Pro-Glu, Pro-Pro-Glu arba Giu-Leu-His-Leu-Leu-Gln-Val-Pro-Ser-Asn.

Geriausia, kai X₄ yra Asn arba ypatingai Ser. Geriausia, kai X₂ yra paprasta jungtis arba Glu, Pro-Glu arba Pro-Pro-Glu.

Teikiama pirmenybė tiems junginiams, kurių bendra (I) formulė yra:

Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-rscu-PA^{143 411} (la) , kurioj e rscu-PA^{143 41 1} -turi tą pačią reikšmę, kuri nurodyta aukščiau, formulėje (I).

Nauji junginiai, kurių formulė yra (I), turi stipriai išreikštą specifiškumą lizuojant fibrino krešulius,

t.y., jie aktyvuoja plazminogeną, esant fibrinui, bet neskelia arba labai silpnai skelia cirkuliuojantį plazminogeną, paversdami jį į plazminą. Tokiu būdu pasieLT 3948B kiamas fibrino krešulių ištirpimas, išvengiama nepageidautinų terapijoje krešėjimo faktorių ir kitų baltymų suardymo, nes, esant plazminui, tai vyksta ne taip stipriai, kai naudojami nespecifiniai plazminogeno aktyvatoriai. Nauji junginiai, kurių formulė yra (I), skirtingai nei scu-PA 54k arba jo neglikozilintai baltyminei daliai ( zaruplaze), išsiskiria padidintu apytikriai 1.7 karto specifiniu amidolitiniu aktyvumu (matuojama naudojant chromogeninį substratą piro-GluArg-p-nitroanilidą po pervedimo į dvigrandžius plazminogeninius aktyvatorius plazmino pagalba). Jei matuojama tiesiogiai fibrinolitinis aktyvumas fibrino-agaro plėvelėje, tai nauji junginiai, kurių formulė yra (I), lyginant su scu-PA 54k, turi 2,5-3 kartus didesnį efektyvumą (lizuotas plotas mm miligramui baltymo). Be to, nauji junginiai, kurių formulė yra (I), priešingai nei scu-PA 54k arba zaruplaze , negali susirišti su specifiniais ląstelių urokinazės receptoriais ir deaktyvuotis. Tokiu būdu, jie ilgesnį laiko tarpą cirkuliuoja ir sustiprina terapinį veikimą. Dėka stipresnio, palyginus su įprastomis fibrinolitinėmis priemonėmis, specifinio veikimo ir didesnės galimybės biosintezei veikimo vietoje, pasiekiama patikimesnė ūžavimo terapija su mažesnėmis dozėmis ir mažesniais pašaliniais poveikiais, tokiais kaip kraujavimas.

Efektyviai ir patikimai trombolizei, specialiai esant arterijų trombams, ypatingai esant miokardo infarktui, terapiškai efektyvi vienkartinė dozė suaugusiam yra tik iki 15 mg junginio, kurio formulė yra (I) . Palyginimui reikia pateikti darbo Bode ir kt. (Am. J. Cardiol. ¢21 (1988) p. 971-973) duomenis: įvedus 74 mg glikozilinto scu-PA 54k, sėkminga trombolizė vyksta tik 55% atvejų, ir reikia atkreipti dėmesį, kad šiam žinomam produktui pagal Bode ir kt. (Circulation 81 (1990) 907, p. 910), esant reikalingoms didelėms dozėms, beveik nespecifiškai lizuoja fibrininį krešulį ir, pagal daugelio tyriLT 3948B nėtojų duomenis, šios didelės dozės sukelia ryškų neigiamą poveikį hemostatinei sistemai.

Nauji junginiai, kurių formulė yra (I), gaunami rekombinantinės DNR technologijos pagalba. Tam, pagal šį išradimą, buvo sukurtos naujos plazmidės, jos ekspresuotos tinkamuose bakterijų šeimininkuose ir po produkto, gauto su didele išeiga, veikiančio ne kaip plazminogeno aktyvatoriai, procesingo, gauti nauji junginiai, kurių formulė yra (I).

Kaip ir daugumoje atvejų, ekspresuoj ant eukariotinius baltymus bakterijose, taip ir junginiai, kurių formulė yra (I), ląstelėje yra denatūruoti intarpų kūneliuose, kurie čia ir žemiau žymimi probaltymu, kuris po tarpinio procesingo turi būti surinktas atgal su teisinga norimo produkto tretine struktūra. Tokiu būdu gautų junginių, kurių formulė yra (I), plazminogeninio aktyvatoriaus kiekį galima nustatyti, pav., pridedant plazmino prie atitinkamo dvigrandžio neglikozilinto mažos molekulinės masės urokinazės darinio, kurio po to nustatomas fermentinis aktyvumas ir tai yra junginio, kurio formulė yra (I), kiekio matas. Bet, aišku, taip pat galima nustatyti probaltymo išeigą arba junginio, kurio formulė yra (I) ir tuo pačiu ekspresijos lygį, pavyzdžiui, elektroforegramos, kurioje yra visi produkuojami baltymai, desitometrijos pagalba.

Pagal šį išradimą plazmidės išsiskiria tuo, kad jų operonas turi reguliuojamą, duotu atveju sintetinį, promotorių, veikiantį, kaip ribosominė ryšio vieta, ShineDalgarno- seką, startinį kodoną, sintetinį junginio, kurio formulė yra (I), struktūrinį geną ir 5'- kryptimi struktūriniam genui mažų mažiausia grandinės nutraukimo agentą. Geriausia, kad būtų du vienas po kito sekantys grandinės nutraukimo agentai, ypatingai trpA grandinę nutraukiantis agentas ir/arba tetA/orfL grandinę nuLT 3948B traukiantis agentas iš ThlO (pal. Schollmeier ir kiti Nucl. Acids Res. 13 (1985) p. 4227-4237).

Reguliuojamas promotorius - tai Trp promotorius arba 5 Tac promotorius.

Kontroliuojamoje plazmidžių srityje, pagal išradimą, tarpas tarp Shine-Dalgarno-sekos ir startinio kodono yra 6 -12, geriau 8 -10 nukleotidų

Konstruojant pagal šį išradimą, į plazmidės struktūrinį geną įterpia koduojančias aminorūgštis-tripletus, kurių bazių seka pateikta lentelėje. Be to, struktūriniame gene gali būti pakeisti ne visi tripletai

Aminorūgštis argininas leucinas valinas glicinas

Tripietas

CGT

CTG

GTT

GGT

Iš kitos pusės, konstruojant struktūrinį geną tikslinga, esant galimybei, vengti šių kodonų (taip pat ir šiuo atveju struktūriniame gene gali būti pakeisti ne visi tripletai):

Kodonas, kurio reikia vengti

ATA

GTC

CCC

AAG

AGG, AGA, CGG, CGA

GGA, GGG

Aminorūgštis izoleucinas valinas prolinas lizinas argininas glicinas

Dėka šio kodonų pasirinkimo struktūriniame gene ir dėka aukščiau nurodytų požymių kontroliuojančioje _ dalyje, stipriai sumažėja galimybė susidaryti antrinėms struktūroms tarp struktūrinio geno ir kontroliuojančios srities.

Sintetinių struktūrinių genų, koduojančių junginius, kurių formulė yra (I), gavimui pirmiausia sintetina nukleotidus po 40 -80 bazių sekas. Tikslinga jas sintetinti po 1 uM ant nešiklio pagal Adams ir kt. J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) p. 661 -663, naudojant DNR sintezatorių (Mode II Biosearch 8600 modelis, New Brunswick Scientific Co) . Kaip monomeriniai sintonai naudojami prekybiniai reikalingų dezoksiribonukleozidų β-cianetil-apsaugcci diizopropilaminofosforamiditai . Po nešiklio nuskėlimo, galinės triti1-apsaugotos grandinės steriliomis sąlygomis nudruskinamos gelfiltracijos pagalba ir valomos, po to du kartus frakcionuojamos atvirkščios fazės pirmąja preparatyvinę plonasluoksne chromatografija. Pagrindinis produktas detritilinamas ir po kitų dviejų valymų preparatyvinę plonasluoksne chromatografija gaunamas reikalingas švarus oligonukleotidas, jo švarumas tikrinamas gelelektroforezės pagalba (PAGE).

Iš 4-9 grupių šių atskirų nukleotidų grandinių gaunami fragmentai, kurių ilgis apie 200 nukleotidų, dėl to, kad galiniai oligonukleotidai su atskiromis grandinėmis 5'-gale fosforilinami ir atitinkamos papildomos grandinės kartu su galiniais oligonukletidais persidengia. Gautus po persiklojimo fragmentus, kuriuos galima klonuoti ir jie turi sudvigubintas grandines, Įterpia Į tinkamus linijinius nešiklius. Tolesnis veiklos principas išplaukia iš pateiktų pavyzdžių.

Panaudoti šiame išradime sutrumpinimai turi sekančias reikšmes:

op	bazių poros
DE52	anijonitas Whatman firmos
EDTA	etilendiamintetraacto rūgštis
IPTG	i zopropiΙ-β-D-tiogalaktopiranozidas
PA	plazminogeninis aktyvatorius
PAGE	elektroforėzė poliakrilamidiniame gelyje
PU	Ploug vienetai
SDS	natrio dodecilsufatas

S. D. - Seguenz Shine-Dalgarno seka tris-HCl trishidroksimetilaminometano hidrochloridas

Tween-80	polietilenoksido (20) sorbitanmonooleatas
TMAC	tetrametilamonio chloridas

Pagal šį išradimą, konstruojant plazmides, pasirenkama prekybinė plazmidė pBR 332 (4363 bp). Dažniausia iš jos pašalinama nic/bom - sritis ir/arba tetraciklinui rezistentinis genas. Tam nebūtina pilnai pašalinti tetraciklino rezistentinį geną, pakanka tokių pakeitimų, kad plazmidė nesuteiktų atsparumo tetraciklinui transformuotiems jos pagalba bakterijų kamienams. Dėka šių priemonių (pašalinamas nic/bom - srities ir mažų mažiausia vienos srities iš tetraciklinui rezistentinio geno) gaunama taip vadinama saugi plazmidė.

Pagal ši išradimą, pirmenybė teikiama plazmides konstravimui iš modifikuotos, kaip aprašyta aukščiau, plazmidės pBR 332 (arba iš kitų, minimų toliau), sekanti operacija yra sintetinės polilinkerinės sekos Įvedimas tarp EeoRI ir HindlII kirpimo vietos. Ši polilinkerinė seka (žiūr. fig. 3) turi nustatytas kirpimo vietas, esančias tarp jų bazes laisvai pasirenkant, išskyrus seką tarp Xbal ir NdeI, kuri turi ribosominę surišimo vietą (Shine-Dalgarno seka) iš B. subtilis Xyl operonas 5'-AAGGAG-3' (Wilheim ir kiti, Nucl. Acids Res. 13 (1985) p. 5717-5722) ir nustatytą fragmentą tarp S.D. sekos ir startinio kodono ATG. Po S.D. - sekos esančios bazės GAAAT, gautos iš Wilheim ir kt. ir sujungtos su CATATG NdeI kirpimo vietoje. Tokiu būdu, tarpas tarp S. D. - sekos ir ATG yra 8 bazių poros. Atstumai tarp atskirų kirpimo vietų polilinkerinėje sekoje pagal klonavimo teoriją turėtų turėti 20 nukleotidų ilgį, ko pasėkoje, palengvėja tarpinių fragmentų pašalinimas.

Polilinkerinės sekos pagalba į plazmidę įvedamos kirpimo vietos, kurios - tikslingos įvesti po grandinės nutraukimo agento transkripcijos, - palengvina įterpti einančias viena po kitos struktūrinio geno sekas junginiui I, geriausia, pradedant nuo baltymo C-galo, t.y., nuo gaunamo struktūrinio geno DNR grandinės 3'-galo, taip pat, pavyzdžiui, sintetinio, išskirto iš kitos plazmidės, arba prekybinio Trp* arba Tac promotoriaus įterpimą.

Panašiu būdu galima pradėti plazmidžių konstravimą iš kitų žinomų komercinių plazmidžių, kurios turi vieninteles EcoRI ir HindlII kirpimo vietas, tokių kaip: pHC9, pHC12, pHC13, pHC18, pHC19 ir kitos.

Taip, pavyzdžiui, gaunama plazmidė pGR Tac 06 (žiūr. pavyzdi ir fig. 8) . Ši plazmidė koduoja junginį, kurio formulė I, kurioje X_x reiškia Asn ir X₂ - seką: Glu-LeuHis-Leu-Leu-Gln-Val-Pro-Ser-Asn (žiūr. fig. 9). Šis junginys toliau žymimas PA/06.

Šią seką koduoja nuo Nde I ir Xba I nukleotidų, kuriems laisvai buvo pasirinkti baltymo scu-PA 54k N-galo kodonai. Ši seka nutraukiama ties Leu-Leu, Pst I kirpimo vieta.

io

Šis ekspresuotas, pavyzdžiui i E. coli ląsteles, baltymas PA/06 po struktūros atstatymo, nelauktai pasižymėjo dideliu fibrinolitiniu aktyvumu, tikrinant ant fibrino-agarinės plėvelės.

Jei plazmidėje pGR Tac 06 pakeičiamas Tac promotorius tarp Eco R I ir Xba I sintetiniu Trp promotoriumi (žiūr, fig. 10), tai gaunama pGR Trp 06 plazmidė.

Transformuotos pGR Trp 06 pagalba E. coli ląstelės K12JM 103 (ATCC 39 403) po indukcijos indolakrilo rūgštimi produkuoja intarpiniais kūneliais baltymą, kuris po ląstelių ūžavimo ir baltymo struktūros atstatymo pasižymi fibronolitiniu aktyvumu, tikrinant ant fibrino-agarinės plėvelės.

Pagal šį išradimą, kitas plazmidės galima gauti iš sukonstruotų plazmidžių, aprašytų aukščiau, pavyzdžiui Eco R I ir Hind III pagalba gaunamas sintetinis struktūrinis genas su visais reguliacijos elementais ir įterpiamas į kitą enterobacteriaceae šeimos bakteriją, ypatingai sugebančią autonomiškai daugintis. E. coli, plazmidę, kuri tam buvo linerizuota ir sutrumpinta pjūviai nuo Eco R I ir Hid III. Principe, tokiu pat būdu, bet naudojant Eco R I ir Xba I, galima pakeisti bet kurioje šiame išradime esančių plazmidžių, pavyzdžiui, Trp’ promotorių Tac’ promotoriumi (ir atvirkščiai) .

Pagal ši išradimą, plazmidės, prailgintas tarp ShineDalgarno sekos ir startinio kodono ATG, galima gauti, kaip aprašyta aukščiau, sukonstruota plazmidė, kur minimas tarpas yra, pavyzdžiui, 8 nukleotidai, kerpama su Nde I, užpildomos kirpimo vietos ir užciklinami nupjauti galai, taip gaunama pagal šį išradimą plazmidė, kuroje atstumas tarp S.D. - sekos ir startinio kodono yra 10 nukleotidų.

Konstruojant struktūrinius genus, kurie koduoja junginius, kuriu formulė I, pasirenkamos tokios nukleotidų sekos, kurių 5' gale yra metionino kodonas, po kurio seka serino kodonas. Ekspresuo j ant ši. struktūrini, geną, dėl to kad ryšys tarp Met-Ser nestabilus, gaunami junginiai, kurių formulė I, su serinu aminorūgšties Ngale. Tinkami struktūriniai genai, kurie koduoja junkurių formulė I, atitinkami 5'galai (baltymų, gimus, kurių formule

I, N-galų atitinka sritį Ser-X₁-X₂ ir koduojamas, bet baltyme nesantis metioninas nurodytas skliausteliuose):

(Met)	Ser	Asn-
ATG	AGC	AAT
(Met)	Ser	Asn	Glu-
ATG	AGC	AAT	GAA
(Met)	Ser	Pro	Pro	Glu-
ATG	AGC	CCA	CCA	GAA
(Met)	Ser	Ser	Pro	Pro	Gi u -
ATG	AGC	AGC	CCA	CCA	GAA
(Met)	Ser	Asn	Glu	Leu	His
ATG	AGC	AAT	GAA	CTT	CAT

Leu

CTG

Leu

CAG

Gln Vai

CAA GTT

Pro

CCA

Ser	ASn
TGC	AAC
šio	iš-

Kaip buvo pažymėta, bakterijos, transformuotos radimo plazmidėmis, pasižymi aukštu ekspresijos lygiu. Tinkamų transformavimui šeimininkų paieška atliekama žinomais būdais. Šio išradimo plazmidžių ekspresijai geriausia tinka E. coli arba giminingos Enterobacteriaceae šeimos bakterijoms, kaip Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella arba Serratia kamienai.

Labiausia tinkami šeimininkai yra E. coli, pavyzdžiui,

E. coli GRT-I kamienas ir ypatingai E. coli K12 pogrupio kamienai, tokie kaip: E. coli GRT-I kamienas ir ypatingai E. coli K12 pogrupio kamienai, tokie kaip:

E. coli K12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E, coli K12 JM105 (DSM 4162), E. coli K12 MM294 (ATCC 33625), E. coli K12 (ATCC 31446) arba E. coli K12 DHI (ATCC 33849).

E. coli ekspresijos sistemose, kuros turi Tac promotorių, indukciją galima atlikti, pavyzdžiui, pridedant laktozės arba pašalinant gliukozę, bet geriausia - β-Dtiogalaktopiranozidu (IPTG). Jei plazmidėje yra Trp promotorius, tai indukciją geriausia vykdyti indolakrilo, indolakrilacto arba indolakrilpropano rūgštimis. Taip pat suprantama, kad indukciją galima vykdyti ir su kitais žinomais induktoriais.

Po indukcijos ir pasiekus tam tikrą ląstelių tanki, ląstelės centrifuguojamos ir nuosėdos, suspenduotos druskos tirpale, homogenizuojamos ir ląstelės suardomos. Po pakartotino centrifugavimo, nuosėdose lieka probaltymas, kurio formulė yra I, kartu su ląstelių nuolaužomis. Probaltymas ištirpinamas gaunidinhidrochlorido tirpale ir paveikiamas redukcijos-oksidacijos sistema (pavyzdžiui, oksiduotu ir redukuotu glutationu), tam kad baltymas Įgautų natyvią konformaciją, t.y., susidarytų junginiai, kurių formulė I. Šie junginiai lieka reakcijos mišinyje ištirpę ir galima juos išgryninti Įprastinėmis operacijomis (pavyzdžiui, chromatografija ir po jos sekančia liofilizacija).

Analitiniams tikslams tikslinga dirbti taip: fermentuojamos transformuotos šio išradimo plazmidėmis E. coli, pasiekus reikiamą ląstelių suspensijos tanki, indukuojama baltymo ekspresija. Po reikiamo laiko fermentacijos, suspensija dalimis centrifuguojama, ląstelės liozuojamos lizocimu (1 mg lizocimo 1 ml 50 mM Tris-HCl buferinio tirpalo, pH 8.0, su 50 mM EDTA ir 15% sachrozės) . Homogenizuotos ląstelės tirpinamos 4-5 M gaunidino hidrochlorido tirpale, praskiedus iki guanidino hidrochlorido 1.2 M koncentracijos, pridedama reduktorių (glutationo, merkaptoetanolio arba cisteino) su priėjimu orui paliekama kelioms valandoms, kad atsistatytų baltymo struktūra (palyg. taip pat Winkler ir kiti Bioche. 25, 1986, p. 4041-4045) . Tokiu būdu gauti viengrandžiai junginiai, kurių formulė I, pridėjus plazmino, paverčiami i atitinkamus dvigrandžius polipeptidinius darinius, kurių aktyvumas nustatomas su chromogeniniu substratu piroGlu-Gly-Arg-p-nitroanilidu, kuris skaldomas tik dvigrandžių aktyvių urokinazių. Ši junginio, kurio formulė I, aktyvacija atliekama plazmino tirpalu 50mM Tris-HCL buferyje su 12 mM natrio chlorido, 0.02% Tween 80, kai pH 7.4 37°C temperatūroje keletą valandų. Junginio santykis su plazminu turi būti apytikriai nuo 100 iki 1500 vienam moliui plazmino, perskaičiavus moliais, arba nuo 8000 iki 36000 su 1, skaičiuojant pagal fermentų aktyvumo vienetus. Aktyvumo nustatymas atliekamas 50 mM Tris-HCl buferiniam tirpale su 0.36 mM natrio chlorido, kai pH 8.8, pridėjus 0.36 mM aprotinino (plazmino susilpninimui) ir 0.27 mM substrato 37°C temperatūroje. Priklausomai nuo junginio, kurio formulė I, kiekio, po 5-60 minučių inkubavimo reakcija stabdoma, pridedant 50% acto rūgšties ir optinis tankis matuojamas 405 nm bangoje. Taip nustatant aktyvumą, pagal substrato gamintoją (Kabi Vitrum, Švedija), 0.05 vienetais optinio tankio padidėjimas 405 nm bangoje per 1 minutę atitinka 25 Ploug urokinazės vienetams 1 ml standartinio tirpalo.

Išradimo figūrose pavaizduota:

Fig. 1: Junginių, kurių formulė I, struktūros schema, nurodant būtinus disulfidinius tiltelius

Fig. 2a ir 2b: Plazmidės pBF 158 konstravimas iš komercinės plazmidės pBR 332. Konstruojant, vienas po kito pašalinami nic/bom sritys ir didesnė dalis atsparumo tetraciklinui geno.

Fig. 3: Sintetinė polilinkerinė seka.

Fig. 4: Plazmidės pBF 158-01 konstravimas. Pateiktas intarpas sintetinės polilinkerinės sekos plazmidėje PBF 158 tarp EcoR I ir Hind III kirpimo vietas.

Fig. 5: Plazmidės pBF 158-01 konstravimas. Fragmentas Cla I - Hind III pakeičiamas atitinkamu fragmentu T iš plazmidės pRT 61 (žiūr. Jorgensen ir kiti J. Bacteriol. 138, 1978, p. 705-714), kuriame yra tetA/orf L grandinės nutraukimo agentas iš TnlO (žiūr. Sohollmeier ir kiti Nucl. Acids Res. 13, 1985, p. 4227-4237).

Fig. 6a-6e: Koduojančio geno sintetinių fragmentų nukleotidų sekos (Jų Įjungimas, sudarant struktūrini geną junginiams, kurių formulė I, pagal šį išradimą, į plazmidę pBF 158-01, T aprašomas I d pavyzdyje ir pavaizduotas fig. 7a-7c)

Fig. 7a-7c: Plazmidžių pBF-02 T - pBF 158-06 konstravimas, Įterpiant oligonuleotidinius fragmentus M4-M8, pradedant nuo plazmidės pBF 158-01 T nuo C-galo.

Fig. 8: Plazmidė pGR Tac 06, gauta iš pBF 158-06

T, Įterpiant Tac’promotorių tarp EcoRI ir Xbal (Žiūr. pavyzdį 1)

Fig. 9:

Fig. 10

Fig. 11

Fig. 12

Nukleotidų seka, įterpta tarp Nde I ir Sac I kirpimo vietų plazmidėje pGR Tac 06 ir atitinkanti aminorūgščių seka. Aminorūgščių numeravimas toks pats kaip fig. 1.

Sintetinio Trp~ promotoriaus nukleotidų seka.

Junginių, kurių formulė I, arba jų probaltymų, sukonstruotų pagal fig. 9, transformuotų pGR Tac 06 plazmidė su Tac promotoriumi E. coli ląstelėse, ekspresijos lygio priklausomybė, indukuojant IPTG, kai laikas lygus 0. Nurodomi aktyvumai Ploug vienetais 1 ml kultūros skysčio, kurio optinis tankis lygus 1, matuojant 578 nm bangoje, nustatyti naudojant chromogeninį substratą (o-----o) po nuskėlimo plazminogenu ir be skėlimo (·- - -·). Nurodyti aktyvumai yra vidurkiai iš 4 fermentacijų.

Nukleotidų sekos ir atitinkanti aminorūgščių seka junginių, kurių formulė (Met)-Ser-X_L-X₂-rscu-?A^{143 411}. Metioninas, nurodytas skliausteliuose, nukerpamas E. coli ląstelėje.

Fig. 13

Junginių, kurių formulė I, arba jų probaltymų, transformuotų pGR 318, pGR 319 arba pGR 327 tai yra su Trp promotoriumi E. coli K12 JM 103 ląstelėse, ekspresijos lygio priklausomybė. Indukcija buvo atliekama, kai laikas lygus 0 su indolakrilio vumai Ploug rūgštimi. vienetais

Nurodomi akty1 ml kultūros skysčio, kurio optinis tankis lygus 1, matuojant 578 nm bangoje, nustatyti naudojant chromogeninį substratą (o----o) po nuskėlimo plazminogenu ir be skėlimo (·---·) ·

Pateikiamuose pavyzdžiuose eksperimentuose naudojami komerciniai fermentai (palygink Nachr. Chem. Techn. Nab. 35, 1987, p. 939).

Naudojamos pavyzdžiuose mitybinės terpės taip pat komercinės .

Pavyzdys 1:

Ekspresinės plazmidės pGR Tac 06, kuriose koduojami junginiai, kurių formulė I, pagal fig. 9, su sintetiniu Tac promotoriumi, konstravimas.

A. Plazmidės pBF 158 konstravimas

i) Iš plazmidės pBR 322 (Farmacija, Nr. 27-4902, 4363 bp) pašalinama nic/bom sritis, kuri yra tarp 2207 ir 2263 bazių (žiūr. Winnacker, Genai ir klonai, leidykla VCH, Vainhaim, 1985, p. 296), sekančiu būdu (žiūr. taip pat fig. 2): pBR 322 plazmidė perkerpama su Nde I ties 2998 baze ir tuo pačiu plazmidė linerizuojama. Lipnūs galai užpildymo reakcijos pagalba užbukinami (žiūr. Maniatis ir kiti, Molecular Cloning, Cold Spring Harborlab, 1982). Po to kerpama ties 2068 baze su PvuII ir abu plazmidės pBR 322 lipnius galus įprastu būdu sujungia ligaze T4. Po to transformuojama į kompetentines E. coli K12 JM 103 (ATCC 39403) ląsteles (žiūr. Hanahan, DNA Cloning, T.I, IRL Press, Oksford, 1985, p. 109-135). Transformuotos ląstelės kultivuojamos terpėje, kurioje yra 150 pg/ml ampicilino. Iš gautų klonų atrenkami tie, kurie sąvyje turi plazmidę pBF 157, kuri skiriasi nuo pradinės plazmidės pBR 322

230 nukleotidų: a-Pst-BspMII, b-Pstl-Ball, c-Pstl-Aval fragmentais. Abiejų vienintelių PvuII ir NdeI _ kirpimo vietų, esančių plazmidėje pBR 332, plazmidėje pBF 157 nėra.

i) Iš plazmidės pBF 157 didesnioji tetraciklinui atsparumo geno dalis pašalinama, kerpant EcoPV-NruI ir sujungiant lipnius galus. Po transformacijos į E. coli K12 JM 103 ir kutivavimo terpėje, kurioje yra 150 ųg/ml ampicilino, gaunami klonai, iš kurių atrenkami tokie, kurie turi sąvyje plazmidę pBF 158. Ši plazmidė mažesnė 787 nukleotidais, nei pBF 157 ir skiriasi tuo, kad joje nėra BamHI kirpimo vietos. Transformuoti kamienai plazmide pBF 158 neįgyja atsparumo tetraciklinui.

B. pBF 158-01 plazmidės konstravimas, sintetinės polilinkerinės sekos įterpimas

Iš plazmidės pBF 158 EcoPI ir HindlII iškerpamas 31 nukleotido fragmentas ir į tą vietą įterpiamas multiklonavimo saitas, kurio seka parodyta fig. 3. Po transformacijos į E. coli K12 JM 103 ląsteles ir kultivavimo terpėje, kurioje yra 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami klonai, kurie turi sąvyje plazmidę pBF 15801. Ši plazmidė nuo pBF158 skiriasi tuo, kad ji turi papildomas vieninteles kirpimo vietas Xbal, NdeI, EagI, KpnI, Spel ir turi antrą PstI kirpimo vietą (fig. 4).

Tarp Xbal ir NdeI yra Shine-Dagarno seka iš Xyl operon

B. subtilis (žiūr. Ihelm ir kt, cituotoje vietoje).

C. pBF 158-01, T plazmidės konstravimas, transkripcijos grandinės nutraukimo agento įterpimas.

Iš plazmidės pBF 158-01 pašalinamas Clal - HindlII polilinkerinės sekos fragmentas ir pakeičiamas Clal LT 3948B

HindlII fragmentu iš pRT 61 (žiūr. Jorgensen ir kiti, cituojamoje vietoje).

Po transformacijos f E. coli K12 JM 103 ląsteles ir 5 kutivavimo terpėje, kurioje yra 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi savyje plazmidę pBF

158-01 T. Ši plazmidė nuo pBF158-01 skiriasi tuo, kad ji didesnė 297 nukleotidų Clal - HindlII fragmentu (fig. 5) .

0

D. Plazmidžių pBF 158-02 T-pBF 158-06 T konstravimas, sintetinių fragmentų M4-M8 įterpimas į koduojantį geną.

Visi sintetiniai fragmentai aprašyti fig. 6a-6e. Jie įvedami 200 nukleotidų fragmentais į atitinkamus vektorius. Tam vektoriai su žinomomis kirpimo vietomis fermentų pagalba užbukinami, perkerpami ir elektroforezės pagalba agarozėje, elektroeliucija ir valant per DE 52 celiuliozę, atskiriami nuo pašalinamo frag20 mento. Po to vykdomas surišimas ligazės T4 pagalba su atitinkamu sintetiniu dvispiraliu fragmentu, transformuojami į E. coli K12 JM 103 (fig. 7 a-7 c) ir vykdoma atranka terpėje su ampicilinu.

5 i) . Fragmento M8 įterpimas tarp BamHI ir Clal plazmidėje pBF 158-01 T

Gaunama plazmidė pBF 158-02 T.

Oligonukleotidas 019 turi junginio, kurio formulė I, Cgalo seką.

Už stop kodono TAA yra NdeI kirpimo vieta po kurios yra papildomos transkripcijos galo trpA grandinės nutrau35 kimo agento sekos (žiūr. Shristie ir kiti, P.N.A.S. 78, 1981, p. 4180-4184) iki Clal.

ii) Fragmento M7 įterpimas tarp Spel ir BamHI plazmideje pBF 158-02 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-03 T.

iii) Fragmento M8 įterpimas tarp KpnI ir Spel plazmidėje pBF 158-04 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-04 T.

iv) Fragmento M5 įterpimas tarp EagI ir KpnI plazmidėje pBF 158-04 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-05 T.

v) Fragmento M4 įterpimas tarp SacI ir EagI plazmidėje pBF 158-05 T.

Gaunama plazmidė pBF 158-06 T.

Iš gautų klonų i) - v) atrenkami tokie, kuriuose yra įterptas atitinkamas fragmentas su patikrinta taisyklinga seka.

E. Plazmidės pGR Tac 06 konstravimas, Tac promotoriaus įterpimas

Plazmidė PBF 158-06 T kerpama Eco I ir Xba I. 26 nukleotidų fragmentas pašalinamas preparatyvine elektroforeze agarozės gelyje, likusioji plazmidės dalis eliuojama elektroeliucij a ir valoma per DE 52.

Iš plazmidės ptacSDT (DSM 5018) išskiriamas Eco I ir Xba I fragmentas, kuriame yra Tac* promotorius. Tam plazmidė ptac SDT kerpama su Ecol ir Xba, ir atskiriamas fragmentas preparatyvinės elektroforezės agarozės gelyje. Fragmentas pašildomas iki 65°C amonio acetato - SDS buferiniame tirpale, pH 8.0, eliuojamas iš mechaniškai susmulkinto poliakrilamido ir valomas kelis kartus ekstrahuojant fenoliu prisotintu 1M TRISHC1 buferiu, pH 8.0.

Gauti abu fragmentai sujungiami įprastu būdu su ligaze T4 ir transformuojami į E. coli K12 JM 103. Po kultivavimo terpėje, kurioje yra 150 ųg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie po IPTG įdėjimo produkuoja probaltymą, PA/06, kurio formulė I pagal fig. 9. Šie klonai turi savyje plazmidę pGR Tac 06.

f) Ekspresijos testas

i) Fermentacija

Transformuotos E. coli K12 JM 103 ląstelės plazmide pGR Tac 06 terpėje, kurioje yra: 38 mM amonio sulfato, 56 mM fosfatinio buferinio tirpalo, kurio pH 7.0, 1 mM magnio sulfato, 1% mielių ekstrakto, 1% gliukozės ir 150 mg/1 ampicilino. Probaltymo PA/06 indukcija atliekama 0.5 mM IPTG.

Prieš indukciją ir po kiekvienos valandos po indukcijos, viso 6 valandas, paimamas 1 ml ląstelių suspensijos taip, kad optinis tankis (OD) 578 nm bangoje būtų lygus 1, ir nustatomas ekspresijos lygis.

ii) Probaltymo struktūros atstatymas, jo suskaldymas iki atitinkamo dvigrandžio junginio PA/06 ir jo PAaktyvumo matavimas.

Atskirtos centrifuguoj ant, ląstelės tirpinamos lizocime, po to ląstelių lizatas apdorojamas aukščiau aprašytu būdu.

PA/06 arba jo probaltymo ekspresijos lygis nustatytas, matuojant dvigrandžio plazminogeninio aktyvatoriaus, gauto iš junginio PA/06 (gauto atstačius struktūrą probaltymui), aktyvumą. Gauti rezultatai pateikti fig. 11. Ši aktyvumą turi tik po skėlimo plazminu (žiūr. fig. 11), todėl junginys PA/06 (arba jo probaltymas) yra su viena grandine.

Pavyzdys 2

Ekspresinės plazmidės pGR Trp 06 konstravimas

Aprašyta De Boer ir kitų PNAS, 80, 1983, p. 21-25 Trp promotoriaus seka yra iki Xbal kirpimo vietos prailginama 5' gale seka 5'-AATTCTGAAAT-3'.

Rezultate gaunama EcoRI kirpimo vieta (fig. 10, fragmentas Ml) . Atskiros grandinės 021 ir 021A surenkamos ir sujungiamos su EcoRI ir Xbal fragmentu iš plazmidės pGR tac 06. Po transformacijos į E. coli K12 JM 103 ląsteles ir kultivavimo terpėje, kurioje yra 150 mg/ml ampicilino, atrenkami tie klonai, kurie turi plazmidę pGR Trp 06. Plazmidė pGR Trp 06 skiriasi nuo aukščiau minėtų pirmtakų tuo, kad ja trasformuotos E. coli kamienų bakterijos, pridėjus indolakrilo rūgšties, produkuoja probaltymą junginio PA/06.

Pavyzdys 3

Ekspresinės plazmidės pGR 318 konstravimas

Plazmidė pGR Trp 06 kerpama NdeI ir Sacl. Gautas 58 bp ilgio fragmentas, kuris yra polilinkerinė seka išskiriama preparatyvinės elektroforėzės pagalba agarozės gelyje, likusi plazmidės dalis pašalinama elektroeliucija ir fragmentas valomas per DE 52 celiuliozę.

Šis fragmentas su sintetiniu oiigonukleotidu 18

5'-TATG AGC AAT GAG CT-3 '

AC TGG TTA C

Įprastu būdu sujungiamas ligaze T4 ir transformuojamas Į E. coli K12, kultivuojamas ampicilino turinčioje terpėje. Atrenkami tie klonai, kurie, pridėjus indolakrilo rūgšties, produkuoja probaltymą junginio PA 318. Šie klonai turi plazmidę pGR 318, kuri koduoja junginius, kurių formulė I, PA 318. Šių junginių aminorugščių seka nurodyta fig. 12.

B. Ekspresijos testas

Po transformacijos E. coli K12 JM 103 plazmidę pGR 318, fermentuojamos tokiu pat būdu, kaip aprašyta pavyzdyje 1. Indukcija vykdoma 62 mg indoilakrilo rūgštimi 1 litrui fermentinei terpei prie 578 nm, kai ląstelių suspensijos optinis tankis pasiekia 2-3 optinius vienetus.

Prieš indukciją ir po kiekvienos valandos po indukcijos, viso 5 valandas, paimamas 1 ml ląstelių suspensijos taip, kad optinis tankis (OD) 578 nm bangoje būtų lygus 1, ir nustatomas ekspresijos lygis.

Po junginio PA 318 probaltymo (žiūr. pavyzdį 1) struktūros atstatymo, surinktuose mėginiuose nustatomas amidolitinis aktyvumas, paveikus plazminu, prieš indukciją ir 1-5 valandą po indukcijos. Rezultatai pateikti fig. 13. Iš šių duomenų seka, kad pasiektas toks pats ekspresijos lygis kaip ir su plazmidę pGR Tac 06 (tiesa, tik kitam probaltymui) ir kad amidolitinis aktyvumas pasireiškia tik po apdorojimo plazminu. Todėl junginys PA 318, kurio formulė I, produkuojamas E. coli K12 su plazmidę pGR 318 kaip probaltymas su viena grandine.

C. Išskyrimas, gryninimas ir charakterizavimas

Tam, kad išgrynintų baltymus, fermentuojama 1 litro tūryje, kontroliuojant pH ir temperatūrą (pH 7.0, 37°C) .

Šiomis sąlygomis galima išauginti ląsteles iki 20 optinių vienetų, matuojant 578 nm bangoje. Po ekspresijos pabaigos (apie 5-6 valandos) 50 ml ląstelių suspensijos centrifuguojama, nuosėdos suspenduojamos 40 ml vandens ir suardomos aukšto slėgio homogenizatoriuje. Po centrifugavimo nuosėdos, kuriose yra visas neaktyvus probaltymas, tirpinamos 100 ml 5 M guanidmhidrochlorido tirpale su 40mM cisteino, 1 mM EDTA (pH pasiektas 8.0) ir praskiedžiama 400 ml 25 mM TRIS-HC1 buferinio tirpalo, pH 9.0. Prieinant orui arba prapučiant deguonimi, baltymo struktūros atstatymas trunka apie 12 valandų .

Junginys PA 318 išskiriamas ir išgryninamas chromatografijos pagalba. Nustatant N-galus, buvo Įrodyta, kad baltymas turi vieną grandinę ir kad N-gale yra norima seka.

Pavyzdys 4:

Ekspresinės plazmidės pGR 319 konstravimas

Plazmidė pGR Trp 06 kerpama kaip aprašyta pavyzdyje 3a, su NdeI ir SacI, išskiriamas didelis fragmentas.

Šis fragmentas su sintetiniu oligonukleotidu 19

5'-TATG	AG C	AAT	GAA GAG CT-3’
AC	TCG	TTA	CTT C
įprastu būdu	sujungiamas	ligaze T4 ir transformuojamas

E. coli K12, kultivuojamas ampicilino turinčioje terpėje. Atrenkami tie klonai, pridėjus indolakrilo rūgšties, kurie produkuoja junginio PA 318 probaltymą. Šie klonai turi plazmidę pGR 318, kuri koduoja junginius, PA 319, kurių formulė I. Šių junginių aminorūgščių seka nurodyta fig. 12.

B. Ekspresijos testas

E. coli K12, trasf ormuotos su plazmidę pGR 319, fermentuojamos, vykdoma indukcija ir surenkami pavyzdžiai bandymams tokiu pat būdu, Kaip aprašyta pavyzdyje 3b.

Junginys PA 319 išskiriamas, išgryninamas ir charakterizuojamas taip pat, kaip pavyzdyje 3C.

Junginio PA 319 probaltymo struktūros atstatymas ir ekspresijos lygio įvertinimas atliekamas kaip pavyzdyje 3B. Rezultatai pateikti fig. 13. Iš šių duomenų seka, kad pasiektas toks pats ekspresijos lygis kaip ir su plazmidę pGR Tac 06 ir kad amidolitinis aktyvumas pasireiškia tik po apdorojimo plazminu. Todėl junginys PA 319, kurio formmulė I, produkuojamas E. coli K12 plazmidę pGR 318 kaip probaltymas su viena grandine.

Pavyzdys 5:

Ekspresinės plazmidės pGR 327 konstravimas

Šis fragmentas su sintetiniu oligonukleotidų 27

5'-TATG	AGC	AG T	CCA	CCA	GAG	CT-3 '
AC	TCG	TCA	GGT	CCT	CTT	C
įprastu	būdu sujungiamas	ligaze	T4 ir	trans formuoj amas

į E. coli K12. Selekcija ir klonų atranka atliekami kaip aprašyta pavyzdyje 3A. Atrinkti klonai turi plazmidę pGR 327, kuri koduoja junginius, PA 327_, kurių formulė I. Šių junginių aminorūgščių seka nurodyta fig. 12.

B. Ekspresijos testas

E. coli K12, trasformuotos su plazmidė pGR 327, fermentuojamos ir tikrinamas ekspresijos lygis taip pat kaip pavyzdyje 3B. Rezultatai pateikti fig. 13.

Junginio PA 319 probaltymo struktūros atstatymas ir ekspresijos lygio įvertinimas atliekamas kaip pavyzdyje 3B. Rezultatai pateikti fig. 13. Iš šių duomenų seka, <ad pasiektas toks pats ekspresijos lygis kaip ir su plazmidė pGR Tac 06 ir kad amidolitinis aktyvumas pasireiškia tik po apdorojimo plazminu. Todėl junginys PA 327, kurio formulė I, produkuojamas E. coli K12 plazmidė pGR 327 kaip probaltymas su viena grandine. Išskyrimas, išgryninimas ir charakterizavimas buvo atliekami taip pat kaip pavyzdyje 3C.

Pavyzdys 6:

Šis fragmentas su sintetiniu oligonukleotidu 36

5'-TATG AC	AGC TCG	CCA GGT	CCA CCT	GAA CTT	GAG C	CT-3 '
įprastu būdu sujungiamas	ligaze T4	ir transformuojamas
į E. coli	K12	JM 105.	Selekcija	ir	klonų	atranka

atliekami kaip aprašyta pavyzdyje 3A. Atrinkti klonai turi plazmidę pGR 336, kuri koduoja junginius, PA

336, kurių formulė I. Šių junginių aminorūgščių seka nurodyta fig. 12.

E. coli K12 JM 105, trasformuotos plazmide pGR 336, 5 fermentuojamos ir po indukcijos tikrinamas ekspresijos lygis taip pat kaip pavyzdyje 3B. Iš pirminio probaltymo gaunamas vienos grandinės junginys PA 336 (aminorūgščių seka parodyta fig. 12) . Pasiektas toks pats ekspresijos lygis kaip ir su plazmide pGR Tac 06.

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Nauji polipeptidai, kurių bendra formulė I:

Ser-X₁-X₂-rscu-PA¹⁴³'⁴¹¹ (I), kurioje rscu-PA¹⁴³’⁴¹¹ - negliukozilinta aminorūgščių sekos sritis nuo 143 (Glu) iki 411 (LeuOH) iš scu-PA 54k,

X! - viena iš šių aminorūgščių liekanų: Asn, Pro arba Ser, ir

X₂ - vienguba jungtis arba Glu, Pro-Glu, Pro-Pro-Glu arba Glu-Leu-His-Leu-Leu-Gln-Val-Pro-Ser-Asn.
2. Polipeptidai pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad Xi yra Asn arba Ser.
3. Polipeptidai pagal 1 ir 2 punktą, besiskiriantys tuo, kad X! yra Ser.
4. Polipeptidai pagal 1-3 punktus, besiskiriantys tuo, kad X₂ yra vienguba jungtis arba Glu, Pro-Glu arba Pro-Pro-Glu.
5. Polipeptidai pagal 1 punktą, besiskiriantys tuo, kad X_x yra Asn arba Ser, o X₂ yra vienguba jungtis arba Glu, Pro-Glu arba Pro-Pro-Glu ir rscuPA^{143 411} turi tą pačią reikšmę kaip 1 punkte.
6. Polipeptidas pagal 1 ir 3 punktus, besiskiriantis tuo, kad jo formulė yra (I a) :

Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-r scu-PA^{143 4 1 1} , kurioje rscu-PA¹⁴ ⁴¹ turi tą pačią reikšmę kaip ir i punkte.
7. Naujos plazmidės, naudojamos polipeptidams pagal 1-6 punktus gauti, besiskiriančios tuo, kad jų operonas turi reguliuojamą promotorių, pasireiškiantį kaip surišimo vieta su ribosomine Shine-Dalgarno seka, startini, kodoną, sintetinį struktūrinį geną polipeptidams pagal 1-6 punktus ir 5' kryptimi nuo struktūrinio geno nuo vieno iki dviejų terminacijos agentų, ir naudojami probaltymc ekspresijai Enterobacteriaceae šeimos bakterijose, geriausia Escherichia coli kamienuose.
8. Plazmidės pagal 7 punktą, besiskiriančios tuo, kad atstumas tarp Shine-Dalgarno sekos ir startinio kodono yra 6-12, geriausia 8-10 nukleotidų.
9. Plazmidės pagal 7 ir 8 punktus, besiskiriančios tuo, kad reguliuojamas promotorius yra sintetinis Trp arba Tac promotorius.
10. Plazmidės pagal 9 punktą, besiskiriančios tuo, kad reguliuojamas promotorius yra sintetinis Trp promotorius, kurio nukleotidų seka yra parodyta fig. 10, o fig. 10 yra šio punkto dalis.
11. Plazmidės pagal 9 punktą, besiskiriančios tuo, kad reguliuojamas promotorius yra plazmidės ptac SDT(DSM 5018) Tac* promotorius.
12. Plazmidės pagal 7-11 punktus, besiskiriančios tuo, kad terminacijos agentais operone yra einantys vienas po kito Trp A terminacijos agentas ir/arba tet A/orf L terminacijos agentas iš Th 10.
13. Plazmides pagal 7-12 punktus, besiskiriančios tuo, kad struktūriname gene argininas koduojamas tnpletu CGT, leucinas - CTG, valinas - GTT ir/arba glicinas - GGT.
14. Plazmides pagal 7-13 punktus, besiskiriančios tuo, kad struktūrinis genas turi nukleotidų sekas, parodytas fig. 6a-6e, o fig. 6a-6e yra šio punkto dalis ir ypatingai vieną iš šių nukleotidų sekų:

ATGAGCAAT

ATGAGCAATGAA

ATGAGCAGTCCACCAGAA

ATGAGCCCACCAC-AA.
15. Plazmides pagal 7-14 punktus, besiskiriančios tuo, kad struktūrinis genas yra sudarytas iš šios nukleotidų sekos:

ATGAGCAAT

ATGAGCAATGAA

ATGAGCAGTCCACCAGAA

ATGAGCCCACCAGAA.
16. Plazmides pagal 7-15 punktus, besiskiriančios tuo, kad struktūrinio geno nukleotidų sekos 5' gale yra metionino kodonas, po kurio eina serino kodonas.
17. Plazmides pagal 7-16 punktus, besiskiriančios tuo, kad jose yra operonas plazmidėje pBR 322, iš kurio pašalinta nic/bom sritis.
18. Plazmides pagal 7-16 punktus, besiskiriančios tuo, kad jose yra operonas plazmidėje pBR 322, iš kurio pašalintas atsparumo tetraciklinui genas pilLT 3948B nai arba dalinai taip, kad plazmidė neturėtų atsparumo tetraciklinui.
19. Plazmidės pagal 7-18 punktus, besiskiriančios tuo, kad jose yra operonas plazmidėje pBR 322, iš kurio pašalinta nic/bom sritis ir pašalinta tokia atsparumo tetraciklinui geno dalis, kad plazmidė neturėtų atsparumo tetraciklinui.
20. Plazmidės pagal 7-19 punktus, besiskiriančios tuo, kad jos yra pGR, Trp 06, PGR 318, pGR 319, pGR 336 su sintetiniu struktūriniu genu, kontroliuojamu Trp promotoriumi.
21. Plazmidė pagal 7-19 punktus, besiskiriant i tuo, kad ji yra tokia, kaip atvaizduota piešinyje:
22. Plazmidžių pagal 7 punktą gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į plazmidę pBR 322, iš kurios pašalinta nic/bom sritis ir/arba rezistentinio tetraciklinui geno bent dalis tarp EcoRI ir HindlII kirpimo vietų, Įterpia polilinkerinę seką, kurios nukleotidų seka parodyta fig. 3 (fig. 3 yra šio punkto dalis) ir kurios pagalba žinomais būdais įterpia transkripcijos terminavimo agentą, atskiros sintetinės struktūrinio geno sekos I formulės junginiams, geriausia pradedant nuo struktūrinio geno 3' C galo, bei sintetinis Trp promotorius.
23. Plazmidžių pagal 7 punktą gavimo būdas, besis k i r i a n t i s tuo, kad iš gautos pagal 22 punktą plazmidės EcoRI ir HindlII fragmentas kaip ekspresijos kasetė žinomais būdais įterpia į kitą, galinčią autonomiškai replikuotis enterobacteriacea šeimos bakterijose, geriausia E. coli, plazmidę.
24. Polipeptido pagal 1-6 punktus gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad žinomais būdais transformuoja plazmidėmis pagal 7-21 punktus enterobacteriacea šeimos bakterijų kamienus, geriausia E. coli kamienus, indukuoja struktūrinio geno ekspresiją, išskiria iš terpės ir ląstelių nuolaužų junginį, kurio formulė I, probaltymą, probaitymą ištirpina ir po to, naudojant oksidacijos-redukcijos sistemą, gauna polipeptidą pagal 1-6 punktus.
25. Būdas pagal 24 punktą, besiskiriantis tuo, kad plazmidę transformuoja E. coli kamieną, geriausia E. coli K12.
26. Trombolitinis preparatas, besiskiriantis tuo, kad jo sudėtyje yra vienas iš junginių pagal 1-6 punktus, kaip aktyvuoj antis plazminogeną į aktyvų jungini, .
27. Junginio pagal 1-6 punktus, kurio formulė I, panaudojimas trombolitinio preparato su plazminogeno aktyvatoriumi, kaip veikliąją medžiaga, gamybai.