PT496327E - Polipeptidos com actividade de pro-uroquinase, plasmideos que os codificam, processos para a sua fabricacao e sua utilizacao - Google Patents

Description

86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ DESCRICÃO "Polipéptidos com actividade de pro-uroquinase, plasmfdeos que os codificam, processos para a sua fabricação e sua utilização"

Novo processo para a fabricação de polipéptidos.

Os polipéptidos fabricados pelo processo de acordo com o invento são activadores de plasminogénio de elevada eficácia e por isso utilizáveis com êxito como trombolíticos. Na terapia de oclusões de vasos sanguíneos provocados por fibrina como, p.ex., enfarte cardíaco, embolias pulmonares, doenças de oclusão venosa e arterial das extremidades etc., os activadores de plasminogénio desempenham um papel importante. Desde o início dos anos 50, aproximadamente, sabe-se que a urina humana contém, pelo menos, uma enzima proteolítica que provoca a transformação de plasminogénio em plasmina, isto é, uma enzima que provoca a clivagem de fibrina em polipéptidos solúveis e, por conseguinte, a dissolução de oclusões provocadas por fibrina. Este activador de plasminogénio foi chamado uroquinase, e verificou-se mais tarde que, na realidade, existem diferentes formas de uroquinase incluindo, pelo menos, uma molécula precursora, o zimogénio pro-uroquinase que se conhece, aproximadamente, desde meados dos anos 70. Esta pro-uroquinase possui uma estrutura de uma só cadeia e é, por isso, também designada por scu-PA ("single chain urokinase-type piasminogen activator"). Esta scu-PA consiste em 411 aminoácidos e está, na forma em que ocorre naturalmente, glicosilada no aminoáeido 302. 0 peso molecular (Mr) desta scu-PA é indicado na literatura especializada como cerca de 54 000 Dalton.

Depois de, já em 1977, Nolan et al. (Biochim. Biophys. Acta 496, páginas 384 a 400) terem verificado em culturas de células de rins humanos, a existência, entre outros, de uma pro-enzima de uroquinase, cujo peso molecular correspondia ao da forma de uroquinase de baixo peso molecular que se conhecia (31 500 Dalton), relataram em 1986 Wijngaards ct al. (Thrombosis Res. 42 (1986), páginas 749 a 760) e Rijken et ai. (Thrombosis Res. 42 (1986), páginas 761 a 768), a existência de uma pro-uroquinase com um tamanho de 30 kd (30 quilodalton) em culturas de células de rins de macaco, a sua purificação e características fibrinolíticas. Também em 1986, Stump et ai. (J. Biol. Chem. 261, páginas 17120 a 17126) revelaram que sobrenadantes da 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 2

linha de células de tumor humana CALU-3 (ATCC, HTB 55) continham uma pro-uroquinase de uma só cadeia apresentando um peso molecular (Mr) de cerca de 32 000 Dalton e que, para a distinguir da pro-uroquinase de peso molecular mais elevado ("scu-PA 54k"), foi designada por "scu-PA 32k". Esta "scu-PA 32k" corresponde à scu-PA 54k menos os 143 aminoácidos N-terminais (Ser1 a Glu143), estando portanto também glicosilada no aminoácido 302 (Asn).

No fascículo de patente europeia publicado com o n° 247 674 A1, é descrita a obtenção da scu-PA 32k a partir do meio de cultura da linha celular CALU-3 (ATCC, HTB 55), assim como de células CHO (células de ovário de hamster chinês) transfectadas com os plasmídeos pSVscu-PA-32k e pSV5DHFR. Neste fascículo menciona-se, como uma possibilidade para a fabricação da scu-PA 32k, também a utilização de microrganismos modificados geneticamente, mas não se deu nenhuma descrição verificável ou qualquer exemplo correspondente. O fascículo de patente europeia 92 182 A2 descreve, entre outros, a fabricação de ADN que codifica a uroquinase de baixo peso molecular, com um peso molecular de cerca de 33 000 Dalton e de plasmídeos correspondentes, assim como a sua expressão em E. co/i K12 294 (ATCC 31 446), com formação de uma proteína não glicosilada de peso molecular de cerca 33 000 Dalton, e da sequência de aminoácidos aí indicada na figura 2A, a qual corresponde ao intervalo das posições 133 a 411 da scu-PA 54k.

Algumas características de um produto não glicosilado que compreende os aminoácidos 136-411, foram relatadas por Gúnzler et at. (Thrombosis and Haemostasis, 58 (1987) página 216).

Polipéptidos com actividade de pro-uroquinase com a estrutura da scu-PA 32k contendo, eventualmente, o domínio sequencial adicional 136 - 143 ou partes do mesmo, e nos quais está, eventualmente, alterada (em função da natureza do terminal N) o aminoácido 156 (Arg), assim como a sua fabricação através de plasmídeos apropriados em E.coli K12 JM105, seguida de transformação quimioproteica dos corpos de inclusão obtidos primariamente sob a forma intracelular, são descritos na publicação de patente europeia 312 941 A2.

86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 3 Ο presente invento refere-se a um novo processo para a produção de polipéptidos utilizáveis terapeuticamente como activadores de plasminogénio, com a seguinte fórmula geral I, ou que correspondem ao esquema estrutural de figura 1: (I).

Ser-X^Xg-rscu-PA143'411 Aí significam: rscu-PA143'411, o domínio sequencial não glicosilado dos aminoácidos 143(Glu) -411 (LeuOH) da scu-PA 54k,

Xv um dos aminoácidos Asn, Pro ou Ser, e X2, uma ligação simples ou Glu, Pro-Glu, Pro-Pro-Glu ou Glu-Leu-His-Leu-Gln-GIn-Val-Pro-Ser-Asn.

Neste processo é inserido no plasmídeo pBR322, do qual foi removida a região nic/bom e/ou, pelo menos, uma parte do gene de resistência à tetraciclina, entre os locais de clivagem de Eco RI e Hind III, um local de clonagem múltipla com a sequência nucleotídica indicada na figura 3, e com a sua ajuda são incorporados, de modo em princípio usual, um codão de terminação da transcrição, as sequências parciais sintéticas do gene estrutural para um polipéptido de fórmula I, de preferência a partir do terminal 3'C do gene estrutural, assim como um promotor regulável. Com o vector recombinante obtido desta maneira, é transformada de maneira em princípio habitual, uma estirpe de enterobactérias, que é a seguir cultivada num meio de cultura usual; a expressão do gene estrutural é induzida, a proteína precursora do composto de fórmula I obtida é separada do meio e das células bacterianas lisadas, a proteína precursora é solubilizada e, a seguir, dobrada novamente através da acção de um sistema redox, oblendo-se o polipéptido de fórmula I.

Os significados preferidos de X, são Asn ou, particularmente, Ser. X2 significa preferencialmente uma ligação simples ou Glu, Pro-Glu ou Pro-Pro-Glu.

Um composto preferido de fórmula I corresponde à fórmula 86 981

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Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-rscu-PA143-411 (la), em que rscu-PA143'411 tem o mesmo significado que acima.

Os compostos de fórmula I apresentam uma especificidade acentuada em relação à lise de coágulos de fihrina, isto é, activam o plasminogénio na presença de fibrina, enquanto que não transformam, ou transformam mal, plasminogénio circulante em plasmina. Através disto é conseguido que os coágulos de fibrina sejam lisados, ao passo que a destruição terapeuticamente indesejável de factores de coagulação e de outras proteínas através de fibrina, não ocorre na mesma medida como com os activadores não específicos de plasminogénio. Os compostos de fórmula I distinguem-se da scu-PA 54k ou da sua parte proteica não glicosilada ("saruplase") por terem uma actividade amidolítica específica cerca de 1,7 vezes mais elevada (medida com o substrato cromogénico piroGlu-Gli-Arg-p-nitroanilida, após transformação em activadores de plasminogénio de duas cadeias através de plasmina). Ao medir a actividade fibrinolítica directamente numa placa de fibrina-ágar, os compostos de fórmula I apresentam, em comparação com a scu-PA 54k, uma eficácia até mesmo 2,5 a 3 vezes maior (superície do halo de lise em mm2 por mg). Além disso, ao contrário da scu-PA 54k ou da saruplase, os compostos de fórmula I não podem ser ligados e inactivados por receptores de uroquinase celulares de ligação específica. Permanecem portanto disponíveis durante mais tempo na circulação para desenvolver o seu efeito terapêutico. Através do efeito fibrinolítico específico mais forte em comparação com agentes fibrinolíticos habituais e da melhor biodisponibilidade no local de acção, é obtida uma terapia de lise segura com doses baixas e baixos efeitos secundários sob a forma de hemorragias. A dose individual terapeuticamente eficaz no paciente adulto para uma trombólise eficaz e segura, especialmente em oclusões arteriais, sobretudo em enfartes cardíacos, é, aproximadamente, de apenas até 15 mg de um composto de fórmula I. Para comparar, citemos p.ex. o diayiiúsLico que se encontra num trabalho de Bode et al. (Am. J. Cardiol. 61 (1988) 971 a 973 e segundo o qual se conseguiu com 74 mg de scu-PA 54k glicosilada uma trombólise bem sucedida apenas em 55% dos casos, sendo necessário ter em conta além disso, segundo Bode et al. (Circulation 81 (1990) 907, 910), em relação a este produto que se conhece, que nas elevadas doses necessárias para ter efeito, 5 06 981 ΕΡ 0 496 327/ΡΤ este quase já não é específico para o trombo de fibrina e que, de acordo com as afirmações de vários investigadores, estas doses têm um acentuado efeito prejudicial no sistema hemostático.

Os compostos de fórmula I valiosos são produzidos através de tecnologia de ADN recombinante. Para este efeito foram criados de acordo com o invento, plasmídeos cuja expressão em hospedeiros hacterianos apropriados e transformação quimioproteíca subsequente do produto obtido em cada caso com elevados rendimentos e que não actua como activador de plasminogénio, fornecem os compostos de fórmula I.

Como na maior parte da expressão de proteínas eucarióticas em bactérias, são obtidas também as cadeias proteicas dos compostos de fórmula I na célula sob a forma de um corpo de inclusão desnaturado - o qual é designado aqui, no texto seguinte, por "proteína precursora" - que, após um isolamento intermediário, tem de ser dobrado novamente por técnicas quimioproteicas, para adquirir a estrutura terciária correcta do produto desejado. Para determinar a quantidade formada de activador de plasminogénio, o composto de fórmula I assim obtido pode então ser transformado, p.ex. através de adição de plasmina, no respectivo derivado de uroquinase não glicosilado de duas cadeias e de baixo peso molecular, do qual se determina a actividade enzimática, que pode servir como medida da quantidade formada do composto, ou polipéptido, de fórmula I. Mas é evidente que se pode também determinar o rendimento em proteína precursora ou em composto de fórmula I, respectivamente, e, por conseguinte, a taxa de expressão, p.ex., mediante uma avaliação densitométrica da separação em electroforética em gel de todas as proteínas.

Os plasmídeos utilizados no processo de fabricação de acordo com o invento distinguem-se, de preferência, por o seu operão apresentar um promotor regulável, eventualmente sintético, uma sequência de Shine-Dalgarno que actua como local de ligação ao ribossoma, um codão de iniciação, um gene estrutural sintético para o composto de fórmula I e, a jusante do gene estrutural, pelo menos um codão de terminação. Prefere-se que existam dois codões de terminação, um a seguir ao outro, e são, especialmente, o codão de terminação trp A e/ou o codão de terminação tet A/orf L de Tn 10 (compare-se Schollmeier et ai, Nucl. Acids. Res. J_3 (1 985) 4227 a 4237).

86 081 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 6 Ο promotor regulável é, especialmente, o promotor Trp ou o promotor

Tac.

Na região de controlo dos plasmídeos, a distância entre a sequência de Shine-Dalgarno e o codão de iniciação é de 6 - 12, de preferência 8-10 nucleótidos.

Na construção do gene estrutural a incorporar nos plasmídeos inserem-se, de preferência, as sequências de bases que codificam os respectivos aminoácidos e que são indicadas na tabela seguinte. No entanto, não é necessário que o gene estrutural tenha simultaneamente todas estas características.

Aminoácido Trioleto Arginina CGT Leucina CTG Valina GTT Qlicina GGT

Por outro lado convém evitar, na construção de um gene estrutural, na medida do possível, a utilização dos codões seguintes para os respectivos aminoácidos mencionados (não sendo necessário, mais uma vez, que estas características sejam cumpridas simultaneamente para todos os aminoácidos): Codão a evitar Aminoácido ATA Isoleucina GTC Valina CCC Prolina AAG Lisina AGG, AGA, CGG, CGA Arginina GGA, GGG Glicina

Através desta escolha de codões para os aminoácidos individuais no gene estrutural, assim como das características anteriormente mencionadas da região de controlo, é amplamente impedida a formação de estruturas secundárias estáveis entre o gene estrutural e a região de controlo.

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Para a obtenção de genes estruturais sintéticos codificadores dos polipéptidos de fórmula I, sintetizam-se em primeiro lugar, oligonucleótidos de uma só cadeia em troços de 40 - 80 bases. Estes são produzidos, convenientemente, à escala de 1 pmol, de acordo com o método em fase sólida de Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 661 a 663, através de um sintetizador de ADN (modelo Biosearch 8600 da empresa New Brunswick Scientific Co.). Como sintões monoméricos utilizam-se, neste caso, diisopropilaminofosfoamidetos β-cianoetil-protegidos do tipo comercial, dos respectivos desoxirribonucleósidos necessários. Após a separação do suporte, os troços no terminal ainda protegidos com tritilo, são dessalinizados e pré-purificados sob condições estéreis através de filtração em gel e, a seguir, sujeitos em dois ciclos a uma primeira separação através de "reversed phase-HPLC". O respectivo produto principal é destritílado e origina, após mais duas operações de purificação por "reversed phase-HPLC", o oligonucleótido desejado com uma pureza elevada, como demonstra a análise electroforética em gel (PAGE). A partir de grupos de 4 a 9 destes troços individuais são então obtidos fragmentos de cadeia dupla com um comprimento de cerca de 200 nucleótidos, fosforilando os oligonucleótidos de cadeia simples não terminais, no terminal 5', e hibridando e ligando os respectivos troços complementares juntamente com os oligonucleótidos terminais. Depois da ligação, inserem-se então os fragmentos de cadeia dupla formados e capazes de clonagem, em vectores linearizados apropriados. O modo de proceder subsequente vê-se nos exemplos que se seguem posteriormente.

As abreviaturas utilizadas na presente descrição, têm os significados seguintes: pb: pares de bases DE 52: agente de permuta aniónica da empresa Whatman EDTA: ácido etilenodiaminotetra-acético IPTG: isopropil-E-D-tiogalactopiranósido PA: activador de plasminogénio PAGE: electroforese em gel de poliacrilamida PU: unidades Ploug SDS: dodecilsulfato de sódio 8 se 981

EP 0 496 327/PT sequência S.D.: sequência de Shine-Dalgarno Tris-HCI: cioridrato de tris-hidroximetilaminometano

Tween-80: monooieato de polietilenóxido(20)sorbitano TMAC: cloreto de tetrametilamónio

Para a construção dos plasmídeos utilizados no processo de fabricação de acordo com o invento parte-se, de preferência, do plasmírieo pBR322 (4363 pb) de tipo comercial. De preferência elimina-se deste a região nic/bom e/ou o gene de resistência à tetraciclina. Neste caso não é necessário eliminar completamente o gene de resistência à tetraciclina sendo suficiente, pelo contrário, que isto se faça apenas até ao ponto de o plasmídeo já não conferir às estirpes bacterianas transformadas com o mesmo, nenhuma resistência à tetraciclina. Através destas medidas (remoção da região nic/bom e, pelo menos, de uma parte do gene de resistência à tetraciclina) é obtido um assim chamado "plasmídeo de alta segurança". A estratégia preferida para a construção de um plasmídeo utilizado no processo de fabricação de acordo com o invento, partindo do plasmídeo pBR322 (ou de outro dos plasmídeos conhecidos e que ainda serão mencionados adiante), modificado como descrito anteriormente, prevê como passo seguinte, a utilização de um local de clonagem múltipla sintético entre os locais de clivagem de Eco RI e Hind III. Este local de clonagem múltipla (compare-se a figura 3) apresenta uma sequência definida de locais de clivagem, e as bases que se encontram entre estes são escolhidas arbitrariamente, com excepção da sequência entre Xba I e Nde I, que contém o local de ligação ao ribossoma (sequência Shine-Dalgarno) do operão 5'-AAGGAG-3' de Xyl de B. subtilis (Wilhem et aL, Nucl. Acíds Res. 13 (1985) 5717 - 5722), assim como uma distância definida entre a sequência S.D. e o codão de iniciação ATG. As bases GAAAT que se seguem à sequência S.D. foram adoptadas de Wilhelm et al., loc. cit., e ligadas a CATATG, um local de clivagem de Nde I. Desta maneira, a distância entre a sequência S.D. e o ATG é de 8 pares de bases. Por razões técnicas de clonagem, as distâncias entre os locais de clivagem individuais do local de clonagem múltipla deveriam ter um comprimento de, pelo menos, 20 nucleótidos, facilitando isto a remoção dos fragmentos intermediários.

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Por meio deste local de clonagem múltipla são introduzidos locais de clivagem no plasmídeo que tornam possível - convenientemente após a inserção de um codão de terminação da transcrição - a incorporação sucessiva de sequências parciais do gene estrutural para os polipéptidos de fórmula I, de preferência começando no terminal C da proteína desejada, isto é, no terminal 3' da cadeia de ADN do gene estrutural a produzir, assim como a inserção, p.ex., de um promotor Trp ou Tac sintético, isolado de um outro plasmídeo ou de tipo comerciai.

De modo análogo é também possível partir de outros plasmídeos de tipo comercial que se conhecem e que possuam locais de clivagem individuais de Eco RI e Hind III como, p.ex., pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19 e outros. É obtido desta maneira, por exemplo, o plasmídeo pGR Tac 06 (compare-se exemplo 1, assim como figura 8). Este plasmídeo codifica o composto de fórmula I em que X1 é Asn e Xz significa a sequência Glu-Leu-His-Leu-GIn-GIn-Val-Pro-Ser-Asn- (veja-se figura 9). Este polipéptido será designado a seguir por "PA/06”.

Esta sequência é codificada pelos nucleótidos entre Nde I e Xba I, para os quais se escolheram arbitrariamente os codões para os aminoácidos N-terminais da scu-PA 54k. Esta sequência de aminoácidos é interrompida por Leu-GIn para o local de clivagem de Pst I.

Este polipéptido PA/06 expresso, p.ex., em células de E. coli, apresenta inesperadamente, depois de ter sido dobrado novamente, uma actividade fibrinolítica no teste em placas de fibrina-ágar.

No caso de se substituir no plasmídeo pGR Tac 06, o promotor Tac entre Eco RI e Xba I por um promotor Trp sintético (veja-se figura 10), é obtido o plasmídeo pGR Trp 06. Células de E. coli K12 JM 103 (ATCC 39 403) transformadas com pGR Trp 06 produzem também, após indução com ácido indolacrílico, uma proteína que apresenta uma actividade fibrinolítica no teste em placas de fibrina-ágar após lise celular e redobragem dos corpos de inclusão.

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Outros plasmídeos podem ser obtidos de um plasmídeo construído como descrito anteriormente, p.ex., obtendo-se, através de clivagens com Eco RI e Hind III, o gene estrutural sintético com todas as unidades de regulação e incorporando-o num outro plasmídeo capaz de se multiplicar de maneira autónoma em enterobactérias, especialmente em E. coli e que, para este efeito, foi linearizado e encurtado através de clivagens com Eco RI e Hind III. De modo sm princípio análogo, mas aproveitando os locais de clivagem de Eco RI e Xba I, pode também ser substituído, p.ex., o promotor Trp pelo promotor Tac (e vice-versa) num dos plasmídeos de acordo com o invento.

Plasmídeos com uma distância aumentada entre a sequência de Shine-Dalgarno e o codão de iniciação ATG, podem ser obtidos clivando um plasmídeo construído como descrito anteriormente no qual a distância mencionada é, p.ex., de 8 nucleótidos, com Nde I, preenchendo os locais de clivagem resultantes e ligando a seguir as extremidades lisas resultantes, sendo assim formado um plasmídeo em que a distância entre a sequência S.D. e o codão de iniciação é, p.ex., de 10 nucleótidos.

Na construção dos genes estruturais que codificam polipéptidos de fórmula I, preferem-se sequências nucleotídicas que possuem na posição 5' um codão para metionina seguido pelo codão para serina. Na expressão deste gene estrutural é obtido, devido à labilidade da ligação Met-Ser, o respectivo composto de fórmula I com serina como aminoácido N-terminal. Terminais 5' apropriados dos genes estruturais para polipéptidos de fórmula I são (para os grupos N-terminais dos compostos de fórmula I indica-se em cada caso a região 5βΓ-Χη-Χ2 e, entre parênteses, o grupo metionina codificado mas já não contido na proteína):

(Met) Ser Asn -ATG AGCAAT

(Met) Ser Asn Glu -ATG AGCAAT GAA

(Met) Ser Pro Pro Glu -ATG AGCCCACCAGAA

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(Met) Ser Ser Pro Pro Glu -ATG AGCAGTCCACCAGAA

(Met) Ser Asn Glu Leu His Leu Gin Gin Vai Pro Ser Asn -ATG AGC AAT GAACTT CAT CTG CAG CAAGTT CCATGC AAC

Como já foi dito, as bactérias transformadas com estes plasmídeos têm uma taxa de expressão muito elevada. A transformação de organismos hospedeiros competentes apropriados é realizada de modo em princípio habitual. Organismos hospedeiros particularmente apropriados para a expressão dos plasmídeos utilizados no processo de fabricação de acordo com o invento, são estirpes da espécie E. coli e de enterobactérias afins como, p.ex., estirpes de Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, K/ebsie/la ou Serratia.

Os organismos hospedeiros preferidos são estirpes da espécie E. coli como, p.ex., E. coli GRT-1 e, em particular, estirpes de E. coli do sub-grupo K12 como, p.ex., E. coli K12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coli K12 JM105 (DSM 4162), E. coli K12 MM 294 (ATCC 33625), a estirpe ATCC 31446 de £. coli K12 ou também E. coli K12 DH1 (ATCC 33849). A expressão em sistemas de expressão de E. coli contendo o promotor Tac pode ser provocada, p.ex., através de adição de lactose ou remoção de glucose, mas de preferência através de adição de isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG). No entanto, no caso do plasmídeo conter o promotor Trp, a indução é realizada, de preferência, por meio de ácido indolacrílico, -acético ou -propiónico. É evidente que também podem ser utilizados, da mesma maneira, outros indutores conhecidos.

Após a indução e tendo atingido uma determinada densidade celular, as células são centrifugadas e o resíduo de centrifugação é transferido, depois de ter sido suspenso numa solução salina aquosa, p.ex. para um homogeneizador, no qual as células são feitas rebentar através de diferenças de pressão. Após uma outra centrifugação, obtém-se no resíduo a proteína precursora do composto de fórmula I, além de destroços celulares insolúveis em água, etc. Através de tratamento com solução de cloridrato de guanidina, a proteína precursora é dissolvida e tratada com um sistema redox (por exemplo contendo

I, 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 12 glutationa reduzida e oxidada), o que provoca a formação da conformação natural, isto é, a formação do composto desejado de fórmula I. Este fica então presente na mistura reaccional sob a forma dissolvida e pode ser isolado através de operações de purificação usuais (p expl. cromatografia e liofilização subsequentes) na sua forma pura.

Para fins analíticos procede-se, convenientemente, de forma a fermentar as estirpes de E. coli transformadas com o plasmídeo a ensaiar e, após se ter atingido uma densidade óptica previamente definida na suspensão celular, a induzir a expressão da respectiva proteína precursora por meio de um indutor apropriado. Ao fim de uma duração adequada de fermentação, retiram-se porções aliquotas e a células separadas das mesmas por centrifugação são então lisadas com lisozima (1 mg de lisozima por ml de tampão Tris-HCI 50 mM, do pH 8,0, EDTA 50 mM e sacarose a 15%). O homogeneizado de células lisadas é solubilizado em solução de cloridrato de guanidina 4 - 5 M e, após diluição com cloridrato de guanidina 1,2 M, sob adição de um agente redutor (glutationa, mercaptoetanol ou cisteína), é sujeito durante várias horas, sob a acção de oxigénio (do ar) à reacção de redobragem (compare-se também, p.ex., Winkler et al. em Biochem. 25 (1986) 4041 a 4045). O composto de fórmula I de uma só cadeia obtido desta maneira, é transformado através de adição de plasmina no respectivo derivado polipeptídico de duas cadeias, cuja actividade é então determinada com o substrato cromogénico piroGlu-Gli-Arg-p-nitroanilida que é apenas clivado por uroquinases activas de duas cadeias. Esta activação do composto de fórmula I a ensaiar, com plasmina, é realizada em tampão de Tris 50 mM, cloreto de sódio 12 mM, Tween 80 a 0,02%, pH 7,4 e 37°C. A relação entre a substância a ensaiar e a plasmina deveria ser de aproximadamente 100 a 1500 para 1, em relação à molaridade, ou de cerca de 8 000 a 36 000 para 1, em relação às unidades de enzima. A incubação no ensaio é realizada em tampão Tris 50 mM, cloreto de sódio 38 mM, pH 8,8, na presença de aprotinina 0,36 μΜ (para a inibição da plasmina) e substrato 0,27 mM, a 37°C. Conforme o teor de composto de fórmula I na amostra, a reacção é feita parar após uma incubação de 5 - 60 minutos através de adição de ácido acético a 50%, e mede-se a extinção a 405 nm. Ao proceder desta maneira, uma alteração da extinção de 0,05 por minuto a 405 nm corresponde, de acordo com as indicações do fabricante do substrato (Kabi Vitrum, Suécia), a uma actividade de uroquinase de 25 unidades Ploug/ml de solução de teste. 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 13

As figuras anexas mostram:

Figura 1:

Um esquema da estrutura dos compostos de fórmula I, com indicação das pontes dissulfureto determinantes para a conformação.

Figuras 2a e 2b:

Construção do plasmídeo pBF 158 a partir do plasmídeo pBR322 comercializado. Neste processo são removidas seguidamente a região nic/bom e grande parte do gene de resistência à tetraciclina.

Figura 3: A sequência nucleotídica do local de clonagem múltipla sintético.

Figura 4:

Construção do plasmídeo pBF 158-01. É representada a incorporação do local de clonagem múltipla sintético no plasmídeo pBF 158, entre os locais de clivagem de Eco RI e Hind III.

Figura 5:

Construção do plasmídeo pBF 158-01 T. O fragmento de Cia I x Hind III é substituído pelo respectivo fragmento "T" do plasmídeo pRT 61 (veja-se Jorgensen et a/., J. Bacteriol. 138. 1978, 705 - 714), no qual se encontra o codão de terminação tet A/orf L de Tn 10 (veja-se Schollmeier et aL, Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4227 - 4237).

Figuras 6a a 6e:

Sequências nucleotídicas de fragmentos sintéticos para o gene codificador (cuja inserção, sob formação do gene estrutural para compostos de fórmula I, num plasmídeo de acordo com o invento, partindo do plasmídeo pBF 158-01 T, é descrita no exemplo 1d e representada nas figuras 7a a 7c).

Figuras 7a a 7c:

Construção dos plasmídeos pBF 158-02 T a pBF 158-06 T através de inserção dos fragmentos oligonucleotídicos M4 a M8, começando com o plasmídeo pBF 158-01 T a partir do terminal C. 86 981

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Figura 8:

Plasmídeo pGR Tac 06, formado com base no pBF 158-06 T através de incorporação do promotor Tac entre os locais de clivagem de Eco RI e Xba I (veja-se exemplo 1).

Figura 9:

Sequência nucleotídioa entre os locais de clivagem de Nde I e Sac I em pGR Tac 06, e sequência de aminoácidos resultante da mesma. A numeração dos aminoácidos corresponde à figura 1.

Figura 10:

Sequência nucleotídica do promotor Trp sintético.

Figura 11:

Taxas de expressão para o composto de fórmula I de acordo com a figura 9 ou a sua proteína precursora, respectivamente, em E. coli JM 103 transformada com o plasmídeo pGR Tac 06 sob o controlo do promotor Tac, em função do tempo, após a indução com IPTG no momento 0. São indicadas as actividades de PA determinadas com o substrato cromogénico, em unidades Ploug por ml de meio de fermentação com a densidade óptica 1 a 578 nm após (o—o) e sem (·—·) clivagem com plasmina antes do teste. Os valores são as médias de 4 preparações de fermentação.

Figura 12:

Sequências nucleotídicas e sequências de aminoácidos resultantes das mesmas, de compostos de fórmula (Met)-Ser-XrX2-rscuPA143411. As metioninas entre parênteses são clivadas no produto expresso por F. coli.

Figura 13:

Taxas de expressão para compostos de fórmula I ou as suas proteínas precursoras, respectivamente, em E. coli K12 JM 103 transformada com pGR 318, pGR 319 ou pGR 327, isto é, sob controlo do promotor Trp. A indução foi realizada no momento 0, com ácido indolacrílico. É indicada a actividade de PA determinada com o substrato cromogénico, em unidades Ploug por ml de um meio de fermentação com a densidade óptica 1 a 578 nm após (o—o) e sem (·—·) clivagem com plasmina antes do teste. 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 15

As enzimas de restrição utilizadas nos exemplos de realização são de tipo comercial (compare-se, p.ex., Nachr. Chem. Techn. Lab. 35, 939, 1987).

Também os meios de cultura utilizados nos exemplos são de tipo comercial.

Exemplo 1

Construção do plasmídeo de expressão pGR Tac 06 para o composto de fórmula I de acordo com a figura 9, com gene sintético sob controlo do promotor Tac. a) Construção do plasmídeo pBF 158

Do plasmídeo pBR322 (Pharmacia, n° 27-4902, 4363 pb) é removida a região nic/bom, que se encontra entre as bases 2207 e 2263 (veja-se Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgemeinschaft, Weinheim 1985, página 298), da maneira seguinte (compare-se também figura 2): o pBR322 é clivado na base 2998 com Nde I e, desta maneira, linearizado. As extremidades coesivas são preenchidas através de uma reacção de preenchimento, obtendo-se desta maneira extremidades lisas (veja-se Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982). A seguir cliva-se na base 2068 com Pvu II, e as duas extremidades lisas da parte restante do pBR322 tornam a ser ligadas de acordo com a técnica usual, com ligase de T4. A seguir, a preparação de ligação é transformada em células competentes de E. coli K12 JM 103 (ATCC 39403) (veja-se Hanahan, "DNA-Cloning" Vol. I, IRL Press Oxford 1985, páginas 109 - 135). As células transformadas são cultivadas num meio com adição de 150 μ$ de ampicilina/ml. Dos clones obtidos são seleccionados os que contêm o plasmídeo pBF 157, que se distingue do plasmídeo de partida pBR322 por fragmentos a) Pst I x BspM II, b) Pst I x Bal I, e c) Pst I x Ava I que são 230 nucleótidos mais pequenos. Os dois locais de clivagem individuais de Pvu II e Nde I do pBR322 já não existem no pBF 1 57.

86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 16 ii) De pBF 157 é removida uma grande parte do gene de resistência à tetraciclina através de clivagem com Eco RV x Nru I e ligação subsequente das extremidades lisas resultantes. Após transformação em E. coli K12 JM 103 e cultura no meio com 150 //g de ampicilina/ml são obtidos clones, dos quais são seleccionados os que contêm o plasmídeo pBF 158. Este é 787 nucleótidos mais pequeno do que o pBF 157 e difere, além disso, pela ausência de um local de clivagem Bam Hl. A transformação de estirpes bacterianas com pBF 158 não lhes confere nenhuma resistência à tetraciclina. b) Construção de pBF 1 58-01. incorporação de um local de clonaaem múltipla sintético

De pBF 158 é removido um fragmento de 31 nucleótidos através de clivagem com Eco RI x Hind III, e nesta lacuna é ligado um local de clonagem múltipla sintético cuja sequência está representada na figura 3. Após transformação da preparação de ligação em E. coli K12 JM103 e cultura no meio com 150 μg de ampicilina/ml são seleccionados os clones que contêm o plasmídeo pBF 158-01. Este difere de pBF 158 por ter os locais de clivagem singulares individuais Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Κρη I, Spe I, assim como um segundo local de clivagem Pst I (figura 4).

Entre Xba I e Nde I encontra-se a sequência de Shine-Dalgarno do operão Xyl de B. subtilis (veja-se Wilhelm et ai, loc. cit.). c) Construção de pBF 158-01 T, incorporação de um codão de terminação da transcrição

De pBF 158-01 é removido o fragmento Cia I x Hind III do local de clonagem múltipla e substituído pelo fragmento de Cia I x Hind III de pRT 61 (veja-se Jorgensen et ai, loc. cit.), no qual se encontra o codão de terminação tet A/orf L de Tn 10 (Schollmeier et ai, loc. cit.).

Após transformação na estirpe E. coli K12 JM103 e cultura no meio com 150 μg de ampicilina/ml são seleccionados os clones que contêm o plasmídeo pBF 158-01 T. Este difere de pBF 158-01 por ter um fragmento de Cia I x Hind III que é em 297 nucleótidos maior (figura 5).

86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 17

d) Incorporação dos fragmentos sintéticos M 4 - M 8 para o gene codificador, construção dos plasmídeos pBF 158-02 T a pBF 158-06 T

Todos os fragmentos sintéticos estão descritos nas figuras 6a - 6e. São inseridos nos respectivos vectores sob a forma de fragmentos de um tamanho de aproximadamente 200 nunleótidos. Para este efeito, os vectores são clivados com as enzimas de restrição correspondentes aos respectivos locais de clivagem mencionados, e separados do fragmento a remover através de electroforese em agarose, electroeluição e purificação através de DE 52. A seguir é realizada a ligação ao fragmento sintético de duas cadeias correspondente por meio de ligase de T4, transformação em E. coli K12 JM 103 (figuras 7a - 7c) e selecção num meio contendo ampicilina. i) Ligação do fragmento M8 entre Bam Hl e Cia I no plasmídeo pBF 158-01 T. Resulta o plasmídeo pBF 1 58-02 T. O oligonucleótido 019 tem a sequência C-terminal do composto de fórmula I. A jusante do codão de terminação TAA encontra-se um local de clivagem de Nhe I, seguido de sequências de terminação da transcrição adicionais do codão de terminação trpA (veja-se Christie et al., P.N.A.S. 78 (1981) 4180 -4184) até Cia I. ii) Ligação do fragmento M 7 entre Spe I e Bam Hl no plasmídeo pBF 158-02 T. Resulta o plasmídeo pBF 1 58-03 T. iii) Ligação do fragmento M 6 entre Κηρ I e Spe I no plasmídeo pBF 158-03 T. Resulta o plasmídeo pBF 1 58-04 T. iv) Ligação do fragmento M 5 entre Eag I e Κηρ I no plasmídeo pBF 158-04 T. Resulta o plasmídeo pBF 1 58-05 T. v) Ligação do fragmento M 4 enlre Sac I e Eag I no plasmídeo pBF 158-05 T. Resulta o plasmídeo pBF 1 58-06 T.

Dos clones i-v obtidos são, em cada caso, seleccionados os que diferem do respectivo precursor pela existência do novo fragmento incorporado na sequência correcta verificada. 86 081 ΕΡ 0 496 327/ΡΤ 18

e) Construção do plasmídeo pGR Tac 06. incorporação do promotor Tac O plasmídeo pBF 158-06 T é clivado com Eco RI e Xba I. O fragmento de 26 nucleótidos resultante é separado através de electroforese em gel de agarose preparativa, a parte restante do plasmídeo é eluída através de electroeluição e, a seguir, purificada através de DE 52.

Do plasmídeo ptac SDT (DSM 5018) é isolado o fragmento de Eco RI x Xba I que contém o promotor Tac. Para este efeito, o ptac SDT é clivado com Eco RI x Xba I, e o fragmento é separado através de PAGE preparativa. O fragmento é eluído da poliacrilamida triturada mecanicamente, através de aquecimento a 65°C num tampão de acetato de amónio/SDS, pH 8,0, e purificado através de extracção repetida varias vezes com fenol saturado com Tris 1 M, pH 8.

Ambos os fragmentos assim obtidos são ligados de maneira habitual com ligase de T4 e transformados em E. coli K12 JM103. Após cultura num meio com 150/yg de ampicilina/ml são seleccionados os clones que produzem, após adição de IPTG, a proteína precursora do composto de fórmula I de acordo com a figura 9 "PA/06". Estes clones contêm o plasmídeo pGR Tac 06. f) Teste de expressão i) Fermentação Células de E. coli K12 JM 103 transformadas com o plasmídeo pGR Tac 06 são fermentadas num meio que consiste em sulfato de amónio 38 mM, tampão de fosfato 56 mM, pH 7,0, sulfato de magnésio 1 mM, extracto de levedura a 1 %, glucose a 1 % e que contém 150 mg de ampicilina por litro, e a expressão da proteína precursora do composto PA/06 é induzida com IPTG 0,5 mM.

Antes da indução e de hora em hora após a indução, durante 6 horas no total, células correspondentes a 1 ml de uma suspensão celular com a densidade óptica (DO) de 1 a 578 nm são separadas por centrifugação e utilizadas para o ensaio da taxa de expressão.

L· 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 19 ii) Redobragem da proteína precursora do composto PA/06, clivagem desta resultando o respectivo composto de duas cadeias e medição da actividade de PA deste.

As células separadas por centrifugação são lisadas com lisozima e o homogeneizado de células lisadas é tratado, a seguir, como já foi descrito anteriormente.

As taxas de expressão do composto PA/06 ou da sua proteína precursora, respectivamente, determinadas desta maneira após a medição da actividade do activador de plasminogénio de duas cadeias formado a partir do composto PA/06 (obtido através de redobragem da proteína precursora), são apresentadas na figura 11. Esta actividade só pode ser conseguida após a clivagem com plasmina (veja-se figura 11), o composto PA/06 (ou a sua proteína precursora, respectivamente) é expresso, por conseguinte, sob a forma de cadeia simples.

Exemplo 2

Construção do plasmídeo de expressão pGR Trp 06 A sequência do promotor Trp descrita por de Boer et ai em PNAS 80 (1983) 21 - 25, é adoptada até ao local de clivagem de Xba I, e prolongada no terminal 5' pela sequência 5'-AATTCTGAAAT-3', sendo construído assim um local de clivagem de Eco RI (figura 10, fragmento M 1). As cadeias simples 021 e 021 A são hibridadas e ligadas no plasmídeo pGR Tac 06 clivado com Eco RI x Xba I. Após transformação em E. coli K12 JM103 e cultura num meio com 150 //g de ampicilina/ml são seleccionados os clones que contêm o pGR Trp 06. 0 plasmídeo pGR Trp 06 difere de todos os precursores descritos anteriormente pelo facto de as estirpes bacterianas de E. coli transformadas com o mesmo expressarem, através de adição de ácido indolacrílico, a proteína precursora do composto PA/06. 20 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ

Exemplo 3 a) Construção do plasmídeo de expressão pGR 318 O plasmídeo pGR Trp 06 é clivado com Nde I e Sac I. O fragmento resultante, de 58 pb de comprimento, que pertencia ao local de clonagem múltipla, é separado através de electroforese em gel de agarose preparativa, e a parte restante do plasmídeo é eluída através de electroeluição e, a seguir, purificada através de DE 52.

Este fragmento é ligado de maneira usual com ligase de T4, ao oligonucleótido sintético 18 5'-T ATG AGC AAT GAG CT-3’ ACTCGTTA C, transformado em E. co/i K12 e cultivado num meio contendo ampicilina. São seleccionados os clones que, após adição de ácido indolacrílico, produzem a proteína precursora do composto "PA 318". Estes clones contêm o plasmídeo pGR 318 que codifica o composto de fórmula I ”PA 318" com a sequência de aminoácidos indicada na figura 12. b) Teste de expressão

Após transformação com o plasmídeo pGR 318, E. coli K12 JM 103 é fermentada como descrito no exemplo 1. A indução é realizada a uma densidade óptica de 2-3 a 578 nm, com 62 mg de ácido indolacrílico por I de meio de fermentação.

Antes da indução e de hora em hora após a mesma, durante 5 horas no total, células correspondentes a 1 ml de uma suspensão celular com a densidade óptica de 1 a 578 nm são separadas por centrifugação e utilizadas para o ensaio da taxa de expressão. A seguir à redobragem da proteína precursora do composto PA 318 (veja-se o exemplo 1), determina-se a actividade amidolítica nas amostras recolhidas antes e 1 a 5 horas após a indução, antes e após o tratamento com 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 21

plasmina. Os resultados são apresentados na figura 13. Vê-se que a taxa de expressão é comparável à que foi obtida com o plasmídeo pGR Tac 06 (no entanto, para a expressão de uma outra proteína precursora) e que uma actividade amidolítica só pode ser obtida após a clivagem com plasmina. 0 composto PA 318 de fórmula l, por conseguinte, é expresso por E. coli K12 com pGR 318 (sob a forma de proteína precursora) sob a forma de cadeia simples. c) Isolamento, purificação e caracterização quimioproteica

Para o isolamento, purificação e caracterização quimioproteica, são realizadas fermentações de 1 I, sob condições controladas de pH e temperatura (pH 7,0, 37°C). Estas condições tornam possível atingir densidades (ópticas) finais de até 20 (medidas a 578 nm). Terminada a expressão (cerca de 5 - 6 horas), são centrifigados 50 ml de suspensão celular, o precipitado celular é ressuspenso em 40 ml de H20 e lisado no homogeneizador de alta pressão. Após centrifugação, o precipitado contendo toda a proteína precursora inactiva, é dissolvido em 100 ml de cloridrato de guanidina 5 M, cisteína 40 mM, EDTA 1 mM (ajustado a pH 8,0) e diluído com 400 ml de tampão Tris 25 mM, pH 9,0. Com a entrada ou sob a acção do oxigénio do ar, a reacção de redobragem fica concluída ao fim de cerca de 12 horas. O composto PA 318 é isolado e purificado através de cromatografia. Através de análise sequencial do terminal N confirmou-se, por um lado, a existência de uma só cadeia e, por outro lado, a presença da sequência N-terminal desejada.

Exemplo 4 a) Construção do plasmídeo de expressão pGR 319 O plasmídeo pGR Trp 06 é clivado com Nde I e Sac I, como descrito no exemplo 3a, e o fragmento grande é isolado.

Este fragmento é ligado de maneira usual com ligase de T4, ao oligonucleótido sintético 19 22 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 5'-TATG AGC ΑΑΤ GAA GAG CT-3' AC TCG ΤΤΑ CTT C, transformado em Ε. coli Κ12 e cultivado num meio contendo ampicilina. São seleccionados os clones que, após adição de ácido indolacrílico, produzem a proteína precursora do composto "PA 319" de fórmula I. Estes clones contêm o plasmídeo pGR 319 que codifica o composto PA 319 com a sequência de aminoácidos indicada na figura 12. b) Teste de expressão A E. coli K12, transformada com o plasmídeo pGR 319, é fermentada, induzida, e a seguir são recolhidas amostras para o teste, como descrito no exemplo 3b. 0 isolamento, a purificação e a caracterização quimioproteica são realizados como descrito no exemplo 3c. A redobragem da proteína precursora do composto "PA 319" e a determinação da taxa de expressão são realizadas como descrito no exemplo 3b. Os resultados são apresentados na figura 13. Daí resulta que a taxa de expressão é comparável à que foi obtida com o plasmídeo pGR Tac 06 na expressão de uma outra proteína precursora e que uma actividade amidolítica só pode ser obtida após a clivagem com plasmina. Por conseguinte, o PA 319 é expresso por E. coli K12 com o plasmídeo pGR 319 (sob a forma de proteína precursora) sob a forma de cadeia simples.

Exemplo 5 a) Construção do plasmídeo de expressão pGR 327 O plasmídeo pGR Trp 06 é clivado com Nde I e Sac I, como descrito no exemplo 3a, e o fragmento grande é isolado.

Este fragmento é ligado de maneira usual com ligase de T4, ao oligonucleótido sintético 27 23 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ δ'-TATG AGC AGT CCA CCA GAA GAG CT-3'

AC TCG TCA GGT GGT CTT C e transformado em Ε. coli Κ12. A selecção dos clones é feita como descrito no exemplo 3a. Os clones seleccionados contêm o plasmídeo pGR 327 que codifica os compostos de fórmula I "PA 327" com a sequência de aminoácidos indicada na figura 12. b) Teste de expressão A E. coli K12 com o plasmídeo pGR 327 é fermentada e a taxa de expressão é testada como descrito no exemplo 3b. Os resultados são apresentados na figura 13. Daí resulta que a taxa de expressão é comparável à que foi obtida com o plasmídeo pGR Tac 06 (no entanto, na expressão de uma outra proteína precursora) e que esta actividade só pode ser obtida após a clivagem com plasmina. Por conseguinte, o composto "PA 327" é expresso por E. coli K12 com o plasmídeo pGR 327 (sob a forma de proteína precursora) sob a forma de cadeia simples. O isolamento, a purificação e a caracterização quimioproteica foram realizados como descrito no exemplo 3c.

Exemplo 6 O plasmídeo pGR Trp 06 é clivado com Nde I e Sac I, como descrito no exemplo 3a, e o fragmento grande é isolado.

Este fragmento é ligado de maneira usual com ligase de T4, ao oligonucleótido sintético 36 5'-TATG AGC CCA CCA GAA GAG CT-3'

AC TCG GGT GGT CTT C e transformado em E. coli K12 JM105. A selecção dos clones é feita como descrito no exemplo 3a. Os clones seleccionados contêm o plasmídeo pGR 336 que codifica o composto de fórmula I "PA 336” com a sequência de aminoácidos indicada na figura 12. 24 86 081

ΕΡ 0 496 327/PT A E. coli K12 JM105 é transformada com o plasmídeo pGR 336, a seguir é fermentada e, após a indução, é ensaiada a taxa de expressão, como descrito no exemplo 3b. Da proteína precursora obtida primariamente é obtido o composto PA 336 (cuja sequência de aminoácidos é indicada na figura 12) sob a forma de proteína de uma só cadeia. A taxa de expressão é comparável à que foi obtida na expressão de uma outra proteína precursora, com o plasmídeo pGR Tac 06.

Lisboa, tó. * ®

Por Leopold Flohé, Prof. Dr. e Josef Gerd Steffens, Prof. Dr. - O AGENTE OFICIAL-

Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200495 LISBOA

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA

Claims (11)

1. 8G 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de polipéptidos de fórmula geral I Ser-XrX2-rscuPA143-411 (I) em que rscu-PA143411 representa o domínio sequencial não glicosilado dos aminoácidos 143 (Glu) a 411 (LeuOH) da scu-PA 54k, ΧΊ significa um dos aminoácidos Asn, Pro ou Ser, e X2 representa uma ligação simples ou Glu, Pro-Glu, Pro-Pro-Glu ou Glu-Leu-His-Leu-GIn-GIn-Val-Pro-Ser-Asn, caracterizado por se inserir no plasmídeo pBR322, do qual foi removida a região nic/bom e/ou, pelo menos, uma parte do gene de resistência à tetraciclina, entre os locais de clivagem de Eco RI e Hind III, um local de clonagem múltipla com a sequência nucleotídica indicada na figura 3 e se incorporar, com a sua ajuda, de modo em princípio usual, um codão de terminação de transcripção, as sequências parciais sintéticas do gene estrutural para um polipéptido de fórmula I, de preferência a partir do terminal 3'C do gene estrutural, assim como um promotor regulável, por se transformar com o vector recombinante obtido desta maneira, de modo em princípio habitual, uma estirpe de enterobactérias, por se cultivar esta, em seguida, num meio de cultura usual, por se induzir a expressão do gene estrutural, por se separar a proteína precursora do composto de fórmula I formada, do meio e das células bacterianas lisadas, por se solubilizar a proteína precursora e se a dobrar novamente, em seguida, através da acção de um sistema redox, para obter o polipéptido de fórmula I.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção de polipéptidos de fórmula geral I em que X, significa Asn ou, especialmente, Ser.
3. 3. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 para a produção de polipéptidos de fórmula geral I em que X2 representa uma ligação simples ou Glu, Pro-Glu ou Pro-Pro-Glu. 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 2/3
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção do polipéptido de fórmula 1 43-411 Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-rscuPA em que rscuPA143'411 tem o mesmo significado que na reivindicação 1.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o operão do vector recombinante a produzir e codificador do composto de fórmula I, apresentar um promotor regulável, uma sequência de Shine-Dalgarno que actua como local de ligação ao ribossoma, um codão de iniciação, um gene estrutural sintético para um polipéptido de fórmula I e, a jusante do gene estrutural, um a dois codões de terminação.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o promotor regulável ser um promotor Trp ou Tac.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o promotor regulável ser um promotor Trp sintético com a sequência nucleotídica de acordo com a figura 10.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o promotor regulável ser o promotor Tac do plasmídeo ptac SDT (DSM 5018).
9. 9. Processo de acordo com as reivindicações 5 a 8, caracterizado por estarem presentes como codões de terminação sucessivos no operão, o codão de terminação trp A e/ou o codão de terminação tet A/orf L de Tn 10.
10. 10. Processo de acordo com as reivindicações 5 a 9, caracterizado por se utilizarem no gene estrutural para um polipéptido de fórmula I, como codões para arginina o tripleto CGT, para leucina o tripleto CTG, para valina o tripleto GTT e/ou para glicina o tripleto GGT.
11. 11. Processo de acordo com as reivindicações 5 a 10, caracterizado por a sequência nucleotídica do gene estrutural para um polipéptido de fórmula I possuir na posição 5', um codão para metionina, seguido pelo codão para serina. 86 981 ΕΡ Ο 496 327/ΡΤ 3/3 2. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado por se transformar com o vector que codifica o composto de fórmula I, uma estirpe da espécie E. co/i, de preferência uma estirpe de E. coli K12, e por se proceder a seguir de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 16. tiOV. 2001 Por Leopold Flohé, Prof. Dr. e Josef Gerd Steffens, Prof. Dr. - O AGENTE OFICIAL -

    g.° ANTÓNIO JOAO DA CUNHA FERREIRA Aq. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA