HU212510B

HU212510B - Process for the preparation of novel plasminogen activator polypeptides and plasmids encoding them

Info

Publication number: HU212510B
Application number: HU9200127A
Authority: HU
Inventors: Regina E Brigelius-Flohe; Leopold Flohe; Wolfgang A Guenzler; Gerd Josef Steffens; Bernhard Wolf
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 1991-01-22
Filing date: 1992-01-15
Publication date: 1996-07-29
Also published as: DE59209915D1; EP0496327B1; RU2108387C1; HK1010108A1; LTIP1532A; FI920263A0; DE4101736A1; ATE204326T1; HU9200127D0; FI920263A; IE914040A1; PT496327E; EP0496327A1; JPH06169770A; LT3948B; HUT63877A; ES2164048T3; LV10974A; DK0496327T3; IL100163A0

Description

A találmány szerint előállított új polipeptidek igen hatékony plazminogén aktivátorok, ezért sikeresen használhatók trombolitikumként. A fibrinnel kapcsolatos véredény elzáródások terápiájában, mint pl. a szívinfarktus, a tüdőembólia, a perifériális vénás, ill. artériás érelzáródások, stb. a plazminogén aktivátorok jelentős szerepet játszanak. Az ötvenes évek eleje óta ismert, hogy az emberi vizelet legalább egy proteolitikus (= fehérjebontó) enzimet tartalmaz, amely a plazminogént plazminná alakítja, vagyis olyan enzim, amely a fibrint oldható polipeptiddé hasítja és így oldani lenne képes a fibrin okozta elzáródásokat is. Ezt a plazminogén aktivátort urokináznak nevezték és később kimutatták, hogy különböző urokináz formák vannak, beleértve legalább egy előanyag molekulát, a zimogén prourokinázt, amelyet a 70-es évek közepén fedeztek fel. Ez a prourokináz egyláncú szerkezet, scu-PA-val jelöljük (egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátor). 411 aminosavból áll és a természetben előforduló formájában ebből 302 glikozilált. Az irodalomban közölt molekulatömege M _r= 54 000 D (Dalton).

1977-ben Nolan és mtsai (Biochim. Biophiys. Acta 496, 384-400) humán vesesejt kultúrában bizonyították többek között egy urokináz-előenzim létét, amely a legkisebb molekulatömegű urokináz formának bizonyult, (31 500 Dalton), amint 1986-ban Wijngaards és mtsai (Thrombosis Rés. 42, 749-760), valamint Rijken et al (Ibid. 42, 761-768) közölték, megelőzve egy 30 kD nagyságú majom sejtkultúrából származó prourokinázt, amelynek tisztítása és fibrolitikus tulajdonságai már ismeretesek voltak. Szintén 1986ban publikált erről Stump és mtsai (J. Bioi. Chem. 261, 17 120-6), akik a CALU-3 (ATCC, HTB 55) humán tumorsejt vonalban mutattak ki egyláncú prourokinázt kb. 32 000 D moltömegűt, amelyet a nagyobb molekulájú prourokináztól (scu-PA 54k) a scu-PA 32k jelöléssel különböztetnek meg. Ez utóbbiból hiányzik az Nterminális 143 aminosava (a Serl-től a Glu 143-ig), valamint a 302. helyen levő Asn glikolizált.

A 247 674 A1 számú európai szabadalmi közzétételi irat írja le a CALU-3 (ATCC, HTB 55) sejtvonal tápoldatából a scu-PA 32k kinyerését és ugyanazt a pSVscu-PA-32k és pSV5HDFR plazmidokkal transzfektált CHO sejtekből [kínai (arany) hörcsög ováriumsejtek]. Bár ez egy lehetőség lett volna a scu-PA 32k előállításra és a genetikailag módosított mikroorganizmusok felhasználására is, ezt megerősítő újabb leírás vagy példa a továbbiakban nem történt.

A 92 182 A2 sz. európai szabadalmi közzétételi irat többek között egy alacsony kb. 33 ezer D molekulatömegű urokinázt kódoló DNS előállítását ismerteti az Escherichia Coli KI2 294 (ATCC 31 446) törzsében expreszszálódó plazmidról, amely egy kb. 33 000 D molekulatömegű glikozilálatlan fehérjét szintetizál (aminosavsorrendjét a 2A. ábra mutatja), s ennek 1-279 pozíciói megfelelnek a scu-PA 54k 133-411. pozícióinak.

Egy glikozilálatlan terméket, amely a 136-411. aminosavsorrenddel rendelkezik, 1987-ben von Günzler és mtsai is publikáltak (Thrombosis and Haemostasis 58, 216).

A scu-PA 32k struktúrájú, prourokináz aktivitású polipeptid - adott esetben kiegészülve a 136-143. szakasszal vagy annak egy részével, amelyről (az N-terminálistól függően) a 156. aminosav (Arg) hiányzik előállítható az E. coli erre alkalmas K12 JM105 plazmidjának expresszáltatásával, s ez mint elsődleges intracelluláris fehérjekémiai átalakítás szerepel a 312 941 A2 sz. európai közzétételi iratban.

A gyógyászatban felhasználható új plazminogén aktivátor polipeptideket, amelyek előállítása a találmány tárgya és amelyeket az 1. ábra szerinti szerkezeti vázlattal szemléltetjük, a következő (I) általános képlettel jelöljük:

Ser-Xj-X^rscu-PA¹⁴³ ⁴¹¹ (I) amelyben az rscu-PA^143-411: a scu-PA 54k 143. Glu (glutaminsav)tól a 411. LeuOH (leucin)-ig terjedő glikozilálatlan aminosavszekvencia;

x,: egy aminosav, amely Asn (aszparaginsav), Pro (prolin) vagy Ser (szerin); és x₂: egy egyszeres (kovalens) kötés, vagy Glu; ProGlu; Pro-Pro-Glu; Glu-Leu-His-Leu-Gln-Gln-ValPro-Ser-Asn aminosavszekvenciák.

Az X] előnyösen Asn vagy Ser. Az X₂ előnyösen egyszeres kötés, vagy Glu, Pro-Glu vagy Pro-Pro-Glu.

Az (I) általános képletű vegyület egy előnyös változata

Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-rscu-PA^143-411 (la) amelyben az rscu-PA^143-411 ugyanaz, mint fent.

Új (I) képletű vegyületek kötődései kimondottan specifikusak a fibrincsapadék oldására, azaz fibrin jelenlétében aktiválják a plazminogént úgy, hogy a cirkuláló plazminogént maga a plazmin egyáltalán nem, vagy csak kevéssé veszi körül. így érthettük el a fibrincsapadék oldódását anélkül, hogy a véralvadási faktorokat és a vérplazma egyéb fehéijéit nemspecifikus plazminogén aktivátorokkal végzett terápia károsítaná. A scu-PA 54k-val, ill. annak glikozilálatlan fehéije részével szemben az (I) általános képletű vegyület újfajta kötései kb. 1,7-szer nagyobb specifitású amidolitikus aktivitásúak (piroGlu-Gly-Arg-p-nitro-anilid színes szubsztráttal mérve, amely a kétláncú plazminogén aktivátor plazminná alakulása során alakul át). Ha egy fibrin-agar lemezen közvetlenül mérjük a fibrinolitikus aktivitást, az (I) általános képletű vegyületek kötődései

2,5-3-szor hatásosabbak, mint a scu-PA 54k (lízisterület mm²/mg-ban). Az is kiderült, hogy a scu-PA 54k előbb említett régiójával ellentétben az (I) általános képletű vegyületek nem kötődnek a specifikus celluláris urokináz receptorokhoz inaktiválva azokat. így e receptorok a keringésben maradva továbbra is betölthetik szerepüket. Összehasonlítva tehát a hagyományos fibrinolitikumokkal specifikusabb fibrinolitikus hatást és biológiailag jobb hatást mutat, így alacsonyabb dózisban is biztosabb lízisterápiára alkalmas és a vér összetételnek kisebb mértékű megváltoztatása miatt mellékhatásai is jelentéktelenebbek.

Hatásos és trombusoldás eléréséhez - különösen artériás elzáródások és főleg szívinfarktus esetén - a terápiá2

HU 212 510 Β san adandó egyszeri dózis felnőttnek csak kb. 15 mg az (I) általános képletű vegyületek valamelyik változatából. Összehasonlításul idézzük Bode és mtsai egyik publikációját (Am. J. Cardiol, 61, 971-3 [1988]), amely szerint 74 mg glikozilált scu-PA 54k alkalmazása trombolízisre csak az esetek 55%-ában volt sikeres és ahogy másik munkájukban (Circulation 81, 907-910 [1990]) közölték, a kívánt hatás eléréséhez beadott nagy dózis nem csak a fibrincsapadékra hatott, hanem kifejezetten káros mellékhatásait tapasztalták a keringési rendszerre.

Az új, értékes (I) általános képletű vegyületeket rekombináns DNS technológiával állítottuk elő. Ehhez a megfelelő új plazmidot kellett előállítani, amelynek expresszióját alkalmas baktériumban is meg kellett oldani, a hozzá kapcsolódó fehéijekémiai átalakulásokat kellőképpen kihasználva nemcsak az (I) általános képletű vegyület újfajta kötődéseinek plazminogén aktivátor funkcióját figyelembe véve.

Mint az esetek többségében, ha eukarióta fehérje termelődik baktériumokban, az (I) általános képletű proteinláncok a sejtben denaturálódott zárványokként jelennek meg - amit „elsődleges proteinének neveznek -, és amely közbeiktatott fehérjekémiai izolálás során nyeri vissza a kívánt termék valódi tercier szerkezetét. Az így nyert (I) általános képletű vegyület szolgál a későbbiekben plazminogén aktivátor alapjául, például a megfelelő kettős láncú urokinázszármazék alapmolekula plazminhoz adásával, aminek enzimaktivitását bizonyítottan, az (I) általános képletű vegyület mennyiségével arányosan - adja. Az elsődleges protein használható pl. (I) általános képletű vegyülethez kapcsolva is, hasonló expressziós rátájával, ami pl. összfehérjét gélelektroforézissel szétválasztva majd denzitométerrel kiértékelve állapítható meg.

A találmányban előállított és felhasznált plazmid jellegzetessége, hogy operonja egy szabályozható, adott esetben szintetikus promoter, amely riboszómakötő helyként működőképes Shine-Dalgamo szekvenciát tartalmaz, azután egy startkodont, egy szintetizált struktúrgént az (I) általános képletű vegyületre, valamint legalább egy terminátort. Leggyakoribb, hogy két terminátor követi egymást, a Tn 10-zel határolt trpA és/vagy tetA/orfL (vö. Schollmeier és mtsai, Nucl. Acid.Res. 13, 4227-37 [1985]).

A promoter pedig leggyakrabban Trp- vagy Tacpromoter.

A találmányban kifejlesztett plazmid kontrollrégiója a Sine-Dalgarno szekvenciától a 6-12 startkodonokig tart - utóbbiakból a 8-10. fontos.

A találmány szerinti plazmid konstrukciójához a beépítendő struktúrgének legtöbbször az itt közölt táblázatban megadott bázissorrendek alapján meghatározott aminosavakat kódolják. De nem kötelezően mindet:

Aminosavak	Triplett
Arginin	CGT
Leucin	CTG
Valin	GTT
Glycin	GGT

Másrészt célszerű egy struktúrgén felépítésében - a fent említett aminosavakra nézve is - elkerülni bizonyos kodonokat (nem soroljuk fel az összesnél).

Az elkerülendő kodon	Aminosavak
ATA	Isoleucin
GTC	Valin
CCC	Prolin
AAG	Lysin
AGG, AGA, CGG, CGA	Arginin
GGA.GGG	Glycin

A struktúrgén konstruálásakor a kodonoknak ily módon való kiválogatását a következőkkel magyarázzuk: a szabályozó régió szekunder struktúrája így válik stabillá és ez fontos a következőkben ismertetendő struktúrgén - kontroll régió átmenet szempontjából.

Az (I) általános képletű vegyületeket kódoló struktúrgének konstruálásában a következő lépés a 40-80. bázisig tartó egyszálú oligonukleotid szintézise. Ezt Adams és mtsai szerint (J. Amer. Chem. Soc. 105, 661-3, 1983) célszerűen 1 pmólos törzsoldatban, egy DNS szintetizátor (Modell Biosearch 8600, New Brunswiek Scientific Co.) segítségével végeztük. Monomerekként a szükséges dezoxiribonukleozidok a kereskedelmi forgalomban lévő, β-ciano-etillel védett diizopropilamino-foszforamidit formáit használtuk. A hordozó lehasítása után még tritillel védett formáit steril gélfiltrálással sótalanítottuk és tisztítottuk, majd első szétválasztásként 2x ismételt reverz fázisú HPLC-ben futtattuk. Ennek az eljárásnak eredményeként kapott detritilált termékből még két további reverzfázisú HPLC (kromatografálás) után nyertük a kívánt tisztaságú oligonukleotidokat, melyet PAGE (gélelektrofozési) analízissel ellenőriztünk.

Ezen egyfonalas termékek 4-9. csoportjára jellemző egy kb. 200 nukleotid hosszúságú kétfonalas szakasz is, amit a nem végálló oligonukleotid S'-foszforilálásával, majd a végálló komplementer-fonalas oligonukleotid „kiolvasztása” utáni ligációval (= kovalens összekapcsolás) szüntettünk meg. Ezt követően szintetizáljuk meg a klónozásra alkalmas, kettősszálú formáját a fragmentumoknak, amit beépíthettünk a megfelelő, linarizált vektorokba. A további eljárásokat a példákban részletezzük majd.

Ezen leírásban használt rövidítések: bp: bázispár

DE 52: a Whatman cég anioncserélője

EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav

IPTG: izopropil-P-D-tiogalakto-piranozid

PA: plazminogén aktivátor

PAGE: poliakrilamid gélelektroforézis

PU: Ploug egység

SDS: nátrium-dodecil-szulfát

S. D.-Szekvencia: Shine-Dalgamo-szekvencia

Tris-HCl: 3-hidroximetiI-aminometán-sósav

Tween-80: polietilénoxid (20) szorbit-mono-olaát

TMAC: tetrametil-ammóniumklorid

HU 212 510 Β

A találmány célja szerint konstruálandó, azaz átalakított plazmid előállításához a kereskedelemben kapható pBR 322 plazmidot (4363 bp) használtuk. Ebből célszerűen elimináltuk a nic/bom régiót, és/vagy a tetraciklin-rezisztencia gént. Mindazonáltal nem szükséges a teljes rezisztenciagén eltávolítása, csak annyira, hogy a transzformálandó baktériumnak a rezisztenciát ne adja át. Ezekkel az intézkedésekkel (nic/bom régió és a tetraciklinrezisztencia gén eltávolítása) egy ún. „nagyon biztonságos plazmidot” kaptunk.

Előnyös stratégia a találmányban szereplő plazmid nyeréséhez az előbbiekben leírt, módosított pBR 322 (vagy egy a később említendők közül) plazmidba szintetikus „multi-klónozó hely” beépítése az EcoRI és a Hindin hasítási helyek közé. Ez a „multi klónozó hely” (ld. 3. ábra) a hasítási helyek között egy szigorúan meghatározott helyen van, az Xba I és az Nde I szekvenciák között, amelyek riboszómakötő hely (S. D.szekvencia), a B. subtilis xyl operonjából származó 5'-AAGGAG-3' (Wilhelm és mtsai. Nucl. Acid. Rés. 13, 5717-5722, 1985); és szintén meghatározott helyet foglal el az S. D.-szekvencia és a startkodon között. Az S. D.-szekvenciát követő GAAAT bázisok (Wilhelm és mtsai., Ibid.) előzik meg, utána pedig CAT ATG, egy Nde I hasítási hely van. Tehát az S. D.-szekvencia és az ATG között 8 bp van. A multi klónozó hely és az egyedi hasítási helyek közötti távolság a klónozási technikák miatt legalább 20 nukleotid hosszúságú kell legyen, hogy a klónozott fragmentumot nehézség nélkül eltávolíthassuk.

A multi klónozó hely beépítésével tehát egy hasítási hellyel láttuk el a plazmidot, amely - transzkripciós terminátort sem kifelejtve - így alkalmassá válik a különféle (I) képletű vegyületek rész-szekvenciáinak egymásutáni befogadására a célul kitűzött fehérje Cterminusától kezdve, vagyis a stmktúrgén 3'-végétől, tehát egy szintetikus vagy egy másik plazmidból izolált vagy készen vett Trp vagy Tac promotertól.

A leírtakkal analóg módon ugyanez kivitelezhető a kereskedelemben kapható egyéb plazmidokkal is, amelyek egyetlen EcoRI és Hindin hasítási hellyel rendelkeznek, pl. pUC 9, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19, stb.

Vegyük például a pGR Tac 06 plazmidunkat (1. példa, 9. ábra). Ez az (1) képletű vegyületnek olyan változatát kódolja, amelyben Xj = Asn, X₂ = Glu-LeuHis-Leu-Gln-Gln-Val-Pro-Ser-Asn (9. ábra). A következőkben ezt a típust „PA/06”-tal jelöljük.

Az (I) képletű vegyület ezen változatát, mint szekvenciát az Nde I és az Xba I közé építettük, N-terminálisként pedig az scu-PA 54k aminosavait választottuk. Ebben az aminosav sorrendben a Leu-Gln után egy Pst I hasítási hely következik.

A pl. E. coli sejtekben expresszáltatott PA/06 fehérjék az átstrukturálás után fibrin-agar tesztben meglepő fibrinolitikus aktivitásúak.

Ha a pGR Tac 06 plazmid EcoRI és Xbal között elhelyezkedő Tac promoterét szintetikus Trp promoterre cseréltük (10. ábra), a plazmid neve már pGR Trp 06.

pGR Trp 06-tal transzformált E. coli kl2 JM 103 (ATCC 39 403) vonal indol-akrilsavval indukálva olyan fehérjét produkál, amely a sejtlízis és restrukturáció után fibrin-agar lemezteszten szintén fibrionolitikus aktivitású.

Egyéb, a találmányban szereplő plazmidok, amelyeket az előzőekben elírtak szerint konstruáltunk, megőrizhetők úgy, hogy az EcoRI és HindlII hasítási hely közé minden szükséges regulációs egység beépítésén túl az Enterobacteriaceae-kben, különösen az E. coli-ban célszerű egy autonóm szaporodásra képes plazmid integrálása is. Ezt az EcoRI és a Hindin lineárissá hasítja és egyúttal le is rövidíti. Lényegében ugyanolyan módon, mint ahogy az EcoRI és az Xba I hasítási helyeit használjuk ki a Trp promoter Tac-ra való cseréjekor (és fordítva).

A találmány céljainak az felel meg, ha a plazmidban az S. D.-szekvencia és az ATG startkodon távolságot a fentebb írtak szerint hosszítjuk: az említett szakasz pl. 8 nukleotid hosszúságú volt. Nde I hasítással a keletkező hely kitölthető és a rendelkezésre álló, „tompa” végek ligálhatók, s ezzel olyan plazmidot nyerünk, amelyben a kérdéses távolság 10 nukleotid.

Az (I) általános képletű típusokat kódoló struktúrgének konstruálásakor előnyben részesítettük azokat a nukleotid-szekvenciákat, amelyeknek 5'-végén metionin majd szerint állt. Ezeknek az expressziójakor a labilis Met-Ser kötés miatt megkaphattuk az összes (I) általános képletű vegyület típusra jellemző kezdő Ser-t (N-terminális). E struktúrgénekre tehát a következő 5'-végeket használtuk [az (I) általános képletű vegyületek mindig Ser-X_rX₂-szerkezetűek, a proteinben már nem szereplő metioninokat zárójelben tüntettük fel:

(Met) Ser Asn ATGAGCAAT (Met) Ser Asn Glu ATGAGCAATGAA (Met) Ser Pro Pro Glu ATG AGC CC A CCA G AA (Met) Ser Ser Pro Pro Glu ATG AGC AGT CCA CCA GAA (Met) Ser Asn Glu Leu His Leu Gin Gin Val Pro Ser Asn ATG AGC AAT GAA CTT CAT CTG CAG CAA GTTCCATGCAAC

Amint korábban említettük, a találmány szerint előállított plazmidokkal transzformált baktériumok bizonyítottan magas expresszió arányt mutatnak. A transzformáció itt ismertetett módja kompetens gazdaszervezetben sikeres. Ezek az E. coli különböző törzsei és a rokon enterobaktériumok, mint pl. a Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella és Serratia nemzetségek fajai.

A jól használható Escherichia coli törzsek pl. az E. coli GRT-1 és különösen a K12 vonal törzsei, mint pl. az E. coli K12 JM 101 (ATCC 33 876), E. coli K12 JM 103 (ATCC 39 403), E. coli K12 JM 105 (DSM 4161), E. coli KI2 MM 294 (ATCC 33 625), E. coli-ATCC 31 446 és az E. coli K12 DH1 (ATCC 33 849).

Az E. coli expressziós rendszerek előkészítése, amelyek Tac promótert tartalmaznak, lehet laktózadás vagy glükózelvonás főleg IPTG segítségével. Létezik

HU 212 510 Β azonban olyan Τη) promoterrel rendelkező plazmid is, ahol az indukció indolaktril-ecetsawal vagy -propionsavval volt sikeres. Más ismert indukáló anyagok természetesen ugyanúgy használhatók.

Az indukálás után megfelelő sejtnagyságot elérve a sejteket lecentrifugáltuk és a csapadékot fellazítás után mosó sóoldattal pl. homogenizátorban hipotonizáltuk. A következő centrifugálás csapadékában az oldhatatlan sejttörmelék mellett megtalálhatók az (I) általános képletű vegyületek elő-fehérjéi. Guaninhidroklorid oldattal kezelve az elő-protein oldatba vihető, majd egy redoxi-rendszerrel (amely pl. oxidált és redukált glutationt tartalmaz) inkubálva értük el a természetes konformáció kialakulását, azaz megkaptuk az (I) általános képletű vegyületet. A reakcióelegyben oldott anyagot a szokásos tisztítási lépésekkel (pl. kromatográfia és fagyasztva szárítás) teljes mértékben izolálni tudtuk.

Analitikai célból a plazmiddal transzformált E. coli törzset fermentáltuk, majd egy adott optikai denzitás elérésekor a sejtszuszpenziót a kívánt elő-fehérjének megfelelő induktorral indukáltuk. A kellő fermentációs idő eltelte után az alikvotból kicentrifugált sejteket lizozimmal (1 mg lizozim/1 ml 50 mM Tris-HCl pufferben; pH = 8,0; 50 mM EDTA és 15% szacharóz) tártuk fel. A lizálódott sejthomogenizátumot 4—5 M guanin-hidroklorid oldatban oldottuk, majd redukáló közegben (glutation, merkaptoteanol, vagy cisztein) a guanin-hidrokloridra nézve 1,2 M-ra hígítottuk, több órányi idő alatt, levegő keverve (ld. még pl. Winkler és mtsai Biochem. 25, 4041-5, 1986). Az így nyert egyláncú (I) általános képletű vegyületet plazminhoz adva és a várt kétláncú polipeptidterméket elválasztva annak aktivitását kromogén szubsztrát, piro-Glu-Gly-Arg-pnitroaniliddal határoztuk meg - amelyet csak a kettős láncú, aktív urokináz hasít. Ez az aktivitás a plazmin és az (I) általános képletű vegyület megfelelő típusának bizonyítéka, az inkubálás körülményei: 50 mM Trispuffer, 12 mM NaCl, 0,02% Tween 80, pH = 7,4; 37 ’C. A plazminnal arányos aktivátor arány 1:100— 1500, molaritásra számolva, vagy 1:8000-16 000 enzimegységben. A teszt inkubációt 37 ’C-on 50mM Tris-pufferben, 38 mM NaCl és 0,36 μΜ aprotinin (plazmingátló) jelenlétében pH = 8,8-nál végeztük. A minta (I) általános képletű vegyület tartalmától függően az inkubálás időtartama 5-60 perc volt, ezután 50%os ecetsavval állítottuk le a reakciót és az extinkciót 405 nm hullámhossznál mértük. Aszubsztrátot a gyártó (Kabi Vitrum, Sweden) előírása szerint 0,05 extinkcióváltozás/perc-től adtuk (405 nm-nél) 25 Ploug-egység/ml urokináz aktivitásnál.

A mellékelt ábrák szövege:

1. ábra Az (I) általános képletű vegyületek szerkezete; a konformációt biztosító diszulfidhidakat is jelöltük.

2. ábra a) és b) A pBF 158 plazmid konstruálása a közismert pBR 322 plazmidból. Ez a nic/bom régió és azt követően a tetraciklinrezisztencia gén nagy részének eltávolításából áll.

3. ábra A szintetikus multi-klónozó hely nukleotidszekvenciája.

4. ábra A pBF 158-01 plazmid konstruálása. Ez egy szintetikus multi klónozó hely beépítését jelentette a pBF 158-ba az EcoRI és a Hindül hasítási helyei közé.

5. ábra A pBF 158-01 TT plazmid konstruálása. A

Cla I x Hindül fragmentumot az ennek megfelelő „T’-vel cseréltük ki - a pRT 61-ből (ld. Jörgensen és mtsai. J. Bacteriol. 138,708-714, 1978) - rajta egy tetA/orf L terminátorTal a Tn 10-ből (ld. Schollmeier és mtsai. Nucl. Acid. Rés. 13,4227-4237,1985).

6. ábra a)-e) A kódolandó gén szintetikus fragmentumának nukleotidsorrendje [a kialakított (I) képletű vegyület struktúrgénjének beépítésével az alkalmas módon előállított plazmádba, kiindulva a pBF 158-01 T-ből, amelyet az ld) példában írtunk le és a 7. ábrán szemléltetünk).

7. ábra a)-c) A pBF 150-02 T - pBF-06 T plazmidok konstruálása a 4M-8M oligonukleotid fragmentumok beépítésével, a pBF 158-01 T C-végétől kiindulva.

8. ábra A pGR Tac 06 plazmid, amelyet a pBF 15806 T-ből állítottunk elő, Tac promotert iktatva az EcoRI és az Xbal hasítási helyek közé (vő. 1. példa).

9. ábra A Ndel és a SacI közé eső nukleotidszekvencia a pGR Tac 06-ban és a belőle adódó aminosavsorrend. Az aminosavakat az 1. ábrának megfelelően számoztuk.

10. ábra A szintetikus Trp promoter nukleotidsorrendje.

11. ábra Az (I) általános képletre vonatkoztatott expressziós ráta (vö. 9. ábra), ill. elő-proteinjére, amelyet pGR Tac 06 plazmiddal transzformáit E. coli JM 103 Tac promoter szabályozással termelt, az idő függvényében: 0. időpontban IPTG-vel indukáltan. A PA aktivitásokat Ploug egységekben mértük és kromogén szubsztrát segítségével értékeltük ki fermentációs oldat ml-re oD 1 és 578 nmnél plazminos bontással (o-----o) vagy anélkül (·-----·). Az értékeket 4 fermentációs kísérlet átlagából adtuk meg.

12. ábra Az (I) képletnek megfelelő (met)-Ser-XiX₂-rscuPA^143-411 nukleotid és megfelelő aminosavsorrendje. A zárójelben levő metionin az E. coli expresszátumáról lehasad.

13. ábra Az (I) képletű vegyület, ill. a megfelelő előfehéijék expressziója E. coli K12 JM 103ban, amelyet pGR 318, pGR 319 vagy pGR 327 plazmiddal transzformáltunk Trp promoter szabályozással, 0 időpontban indolakrilsavval indukáltuk. A PA-aktivitást kromogén szubsztráttal határoztuk meg Ploug-egység/ml fermentációs oldatra OD = 1-nél

578 nm-on plazmin jelenlétében (o-----o), ill. anélkül (·-----·)

HU 212 510 Β

A kísérleti példákban használt restrikciós enzimek kereskedelemben beszerezhetők (ld. pl. Nachr. Chem. Techn. Láb. 35, 939,1987). A tápoldatok szintén általánosan ismertek.

1. példa

Az (I) általános képletű vegyületet expresszáló pGR Tac 06 plazmid konstrukciója, a 9. ábrával illusztrálva, amely TAc promoterrel szabályozott szintetikus gént tartalmaz.

a) A pBF 158 plazmid konstruálása

i) A pBR 322 plazmidból (Pharmacia, Nr. 27-4902,4363 bp) eltávolítottuk a 2207-2263 bázisokra eső nic/bom légiót (ld. Winnacker „Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1985, Seite 298), a 2. ábrán látható módon: a plazmidot a 2998. bázisnál Nde I-gyel hasítottuk és ezzel linearizáltuk. A szabadon maradó („ragadós”) végeket „fill-in” reakcióval kiegészítettük „tompa” végekké (ld. Maniatis et al., .Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Láb., 1982). Ezután a 2068. bázisnál PvuH-vel hasítottuk és a kétféle tompa végeket a szokásos technikával, T4-ligázzal kapcsoltuk. A ligációs terméket kompetens E. coli K12 JM 103 sejtekben (ATCC 39 403) építettük transzformációval (vő. Hanahan. „DNA Cloning” Vol. I, IRL Press Oxford 1985, Seiten 109-135). A transzformált sejteket 150 mg/ml ampicillint tartalmazó tápoldatban növesztettük. A klónokból kiválogattuk a pBF 157 tartalmúakat, amely a kiindulási pBR 322-nél 230 nukleotiddal rövidebb a) Pst IxBspM Π; b) Pst IxBal I; c) Pst IxAva I-ben különböznek. A pBF 157 sem a PvuH, sem a Ndel egyszeres hasítási helyet nem tartalmazza a pBR 322ben lévők közül.

ii) A pBF 157-ből a tetraciklinrezisztencia gén egy nagy részét eltávolítottuk Eco RV x Nru I és a velük kapcsolatos ligációval, a létrejövő tompa végek eltávolításával. E. coli K12 JM 103-ba transzformálva és 150 pg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon növesztve a pBF 158 plazmidos kiónokat válogattuk ki. Ezek 787 nukleotiddal rövidebbek a pBF 157-nél és egy Bam Hl hasítási hely hiányában különböznek tőle. A pBF 158-cal transzformált baktériumtörzsek nem válnak tetraciklin rezisztenssé.

b) pBF 158-01 konstruálása, egy szintetikus multi klónozó hely beépítése

A pBF 158-ból EcoRI x Hindin hasítással egy 31 nukleotid hosszú fragmentumot távolítottunk el, és helyére egy szintetikus multi klónozó helyet kötöttünk, amelynek szekvenciáját a 3. ábrán adjuk meg. A ligációs termékkel transzformált E. coli K12 JM 103 150 pg/ml ampicillines táptalajon való növesztése után a pBF 158-01-et tartalmazó kiónokat kiválaszthatjuk. Ezek ugyanis Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Κρη I, Spe I egyszeres, valamint egy második Pst I hasítási hellyel egészültek ki: 4. ábra.

Az Xba I és a Nde I között van a S. D.- szekvencia, amely a B. subtilitis xyl operonjából származik (ld. Wilhelm és mtsai, loc cit.).

c) pBF 158-01 T konstruálása, egy transzkripciós terminátor beépítése

ApBF 158-01-ből a multi cloning site Cla 1 x Hind ΙΠ-részét eltávolítottuk, és a pRT 61 Cla I x Hind ΠΙ fragmentumával helyettesítettük (ld. Jorgensen és mtsai, loc. cit.), amely Tn 10-ből származó tetA/orf L terminátort is tartalmaz.

Az E. coli K12 JM 103 törzset transzformálás után 150 pg/ml ampicillines táptalajon növesztve választottuk ki a pBF 158-01 T plazmidot tartalmazó kiónokat. Ezek a pBF 158-01-nél 297 nukleotiddal nagyobbak, ami a Cla IX Hind ΙΠ fragment hossza (5. ábra).

d) Szintetikus M4-M8 fragmentumok beépítése a kódolandó gén részeiként; a pBF 158-02 T-pBF 158-06 T plazmidok konstruálása

Valamennyi szintetikus fragmentumot ismertettük a 6a)-6e) ábrán. Mindegyikük kb. 200 nukleotidnyi, a megfelelő vektorba beépítettük. így a vektorok a hasítási helyeket a megfelelő restrikciós enzimekkel nyitjuk, majd agaróz elektroforézissel, elektroelúcióval és DE 52-n történő tisztítással választottuk szét a különböző fragmentumokat. Ezt követte az összetartozó kettősfonalú szintetikus fragmentumok T4-ligázos kötése, majd E. coli KI2 JM 103-ba transzformálása [7a)-7c) ábra] és szelekciója ampicillintartalmú táptalajon.

i) M 8 fragmentum kötése a Bam Hl és a Cla I közé pBF 158-01 Tplazmidba.

Ily módon pBF 158-02 T plazmid keletkezik.

019 oligonukleotid kapcsolódik az (I) képletű vegyület C-terminálisához.

A TAAstop kód után egy új, Nhe I hasítási hely keletkezik a trpA terminátorok szekvenciái után a Cla I-ig.

(ld. Christie és mtsai. PNAS 78, 4180-4, 1981) ii) Az M 7 fragmentum kötése a Spe I és a Bam Hl közé a pBF 158-03 T-be a pBF 158-03 T plazmidot adja.

iii) Az M 6 fragmentumot a Κρη I és a Spe I közé építettük a pBF 158-03-ba. így a pBF 158-04 T plazmid jött létre.

i v) Az M 5 fragmentumot a pBF 158-04 T Eag I és Κρη I közé ligáivá a pBF 158-05 T plazmid keletkezett,

v) Az M 4 fragmentum bekötése a pBF 158-05 T Sac

I és Eag I szekvenciája közé. Az eredmény a pBF 158-06 T plazmid.

Az i)—v) plazmidokat tartalmazó kiónokat kiválogattuk, és a megfelelő beépített új fragmentum azonosítása alapján különböztettük meg őket.

e) A pGR Tac 06 plazmid konstruálása, Tac promoter beépítése

A pBF 06 T plazmidot Eco Rl-gyel és Xba I-gyel hasítottuk. A keletkező 26 nukleotidos fragmentumot agaróz gélelektroforézissel választottuk el, majd a plazmid maradékát elektroeluálással eltávolítva DE 52-n tisztítottuk.

A ptac SDT (DSM 5018) plazmidból izoláltuk a Tac promotert tartalmazó Eco Rí x Xba I fragmentumot. Ehhez a kihasított fragmentumot proparatív PAGE-vel választottuk el. Ezután ammóniumacetátos

HU 212 510 Β

SDS pufferben 65 “C-ra melegítve pH = 8,0-nál, mechanikusan aprított poliakrilamidon eluáltuk és többszöri fenolos extrahálással (1 M Tris-szel, pH = 8,0) telítve tisztítottuk.

Az ily módon nyert két darabot a szokásos T4 ligálás után E. coli KI2 JM 103-ba transzformáltuk és 150pg/ml ampicillines táptalajon növesztettük a baktériumklónokat. IPTG hozzáadása után az elő-proteinből a 9. ábrán látható „PA/06” lett. Ezek a kiónok tartalmaztak pGR Tac 06 plazmmidot.

f) Expressziós tesztelés

i) Fermentálás

A pGR Tac 06-tal transzformált E. coli K12 JM 103 sejteket 38 mM (NH₄)₂SO₄, 56 mM foszfátpuffer: pH = 7,0; 1 mM MgSO₄, 1% élesztőkivonat és 1% glükózból álló médiumban 150 mg/1 ampicillinnel fermentáltuk és 0,5 mM IPTG-vei indukáltuk a PA/06 elő-proteinek expresszálódását.

Az indukció előtt minden órában, utána 6 óránként 1 ml szuszpenzió sejtjeit mértük le OD = 1 és 578 nmnél centrifugálás és expressziós ráta tesztelésre való előkészítés után.

ii) Az elő-protein térbeli átrendeződése ΡΑ/06-tá, a kettős lánc bomlása és PA-aktivitásmérés.

A lecentrifugált sejteket lizozimmel tártuk fel, majd a homogenizátumot a korábban leírtak szerint kezeltük tovább.

Az aktivitás mérése után (az elő-protein átrendeződés miatt) is a PA/06 kötődésből keletkező kettősláncú plazminogén aktivátor expressziós rátájának kiértékelését mind PA/06 kötésre, mind elő-proteinre elvégeztük, és a 11. ábrán mutatjuk be. Ezt csak a plazmin bomlása mutatja, a PA/06, ill. az elő-fehérje egyláncúvá válik.

2. példa

A pGR Trp 06 expresszálódó plazmid konstrukciója

A von De Boer és mtsai (PNAS 80, 21-25, 1983) által leírt Trp promoter szekvencia átéri az Xba I hasítási helyet és 5' vége a AATTCTGAAAT-3' szekvenciával túlnyúlik azon. Ily módon egy Eco Rí hasítási hely keletkezik (10. ábra, Μ 1 fragment). Az egyfonalas 021 és 021. A szakaszokat kiolvasztottuk és Eco Rí x Xba I hasítású pGR Tac 06 plazmidba építettük. E. coli KI2 JM 103 transzformálása és 150 pg/ml ampicillin tartalmú táptalajon való növesztése után a pGR Tac 06 tartalmú kiónokat kiválasztottuk és vizsgáltuk a korábban leírtak alapján indolakrilsav hozzáadása után, valamint az elő-fehérje és a PA/06 kötődés alapján.

3. példa

a) A pGR 318 expresszálódó plazmid konstruálása

A pGR Trp 06 plazmidot a Nde I és a Sac I helyeken hasítottuk. A keletkező 58 bp fragmentumot, amely a multi klónozó hely része preparatív agaróz gélelektroforézissel választottuk el a plazmid többi részétől, és elektroeluálás után DE 52-n tisztítottuk.

Ezt a fragmentumot a szintetikus oligonukleotid 18-cal 5'-T ATG AGC AAT GAG CT-3'

AC TCG TTA C

T4 ligáz segítségével kapcsoltuk és az ezzel transzformált E. coli KI 2-t ampicillin tartalmú médiumon növesztettük. Azokat a kiónokat választottuk ki, amelyek indolakrilsavat hozzáadva az elő-protein „PA 318”-at produkálják. Ezek a kiónok tartalmazzák a pGR 318 plazmidot, amely kódolja az (I) általános képletnek megfelelő „PA 318”-at, melynek aminosavszekvenciáját a 12. ábra szemlélteti.

b) Expressziás teszt

A pGR 318-cal transzformált E. coli K12 JM 103 fermentációját az 1. példában leírtak szerint végeztük. Indukálás: 62 mg/1 indolakrilsav adása a fermentációs tápoldatba. Mérés 2-3 oD fölött, 578 nm-nél.

Az indukálás előtt óránként, utána 5 óránként vett 1 ml sejtszuszpenzió sejtjeit OD = 1 fölött (575 nm) lecentrifugáltuk és expressziós ráta tesztelésre előkészítettük.

Az előprotein átrendeződése után (ld. 1. példa) a PA 318 kötődése amidolitikus aktivitásban nyilvánul meg, az indukálás vagy a plazmin adás után 1-5 órával. Az eredmények a 13. ábrán láthatók. Abból kitűnik, hogy az expressziós ráták összevethetők a pGR Tac 06 plazmidéival (ill. az elő-proteineké), és hogy az amidolitikus aktivitás csak a plazmin hasadás után mutatkozik. Az (I) általános képletnek megfelelő PA 318 az E. coli KI 2-ből (elő-protein) egyláncú formában távozik.

c) Izolálás, tisztítás és fehérjekémiai jellemzés

Erre a célra kontrollált körülmények (pH = 7,0;

*C) között 11 fermentátumot használtunk. Ezek a feltételek optimális végdenzitást (20-ig; 578 nm-nél mérve) tesznek lehetővé. Az expresszió befejeződése után (5-6 óra) 50 ml sejtszuszpenziót centrifugáltunk és a leülepedett sejteket 40 ml vízzel reszuszpendálva erős homogenizálással tártuk fel. Újabb centrifugálás után az összes inaktív elő-protein a csapadékban van, ezért ezt 100 ml 5 M guanidin HC1,40 mM Dys, 1 mM EDTA (pH = 8,0ra beállítva) elegyében oldottuk, majd 400 ml EDTA pH = 9,0-val hígítottuk. Levegőn, ill. a levegő oxigénjének hatására az átrendeződési reakció kb. 12 óra alatt lezajlik.

A PA 318-at kromatográfiásan izoláltuk és tisztítottuk. Az N-terminális szekvenciaanalízise egyszálúságot mutat, a szekvencia az elvártnak adódott.

4. példa

a) A pGR 319 expresszálódó plazmid konstruálása

A 3a példában leírtak szerint hasítottuk Nde I és Sac I között a pGR Trp 06 plazmidot, és a nagyméretű fragmentumot izoláltuk. Ezután a szintetikus oligonukleotid 19-cel

5'-TATG AGC AAT GAA GAG CT-3'

AC TCG TTA CTT C a szokásos módon, T4 ligázzal kapcsoltuk. Az ezzel transzformált E. coli K12-ből ampicillines táptalajon való növesztés után az indolakrilsav hatására PA 139-et produkáló kiónokat válogattunk ki. Ezekben a kiónokban volt pGR 319 plazmid, aminek kódja és az aminosavszekvencia a 12. ábrán látható.

HU 212 510 Β

b) Expressziós teszt

ApGR 319-cel transzformált E. coli K12-t fermentáltuk, indukáltuk és a 3b példában leírtak szerint mértük.

Az izoláció, tisztítás, fehéijekémiai jellemzés pedig a 3c példa alapján történt.

A „PA 319” elő-proteinjének átalakulása és az expresszálódás rátájának meghatározását a 3b-ben írtuk le. Az eredményeket a 13. ábra mutatja: összevethető a többi elő-fehérjével, amelyet a pGR Tac 06-ban kódoltunk; amidolitikus aktivitása csak a plazminhasítás után tapasztalható. Az E. coli KI2-ből a pGR 319 plazmiddal együtt, egy láncú formában szabadul fel.

5. példa

a) A pGR 327 expresszálódó plazmid konstruálása

A 3a példában leírtak szerint a Nde I és a Sac I között hasítottuk a pGR Trp 06-ot és e nagy fragmentumot izoláltuk. Ezt a szintetikus oligonukleotid 27-tel

5'-TATG AGC AGT CCA CCA GAA GAG CT-3' AC TCG TCA GGT GGT CTT C

T4 ligázzal kapcsoltuk egybe, és E. coli-ba transzformáltuk. A szelekciót és a klőnkiválasztást a 3a példában írtuk le. A pGR 327 plazmidot tartalmazó kiónok a

12. ábrán feltüntetett aminosavsorrendű ,,PA 327” típusú (I) általános képletű vegyületet eredményeznek.

b) Expressziós teszt

Transzformált E. coli KI2-t fermentáltunk és mértük az expressziós rátát a 3b példában leírtak szerint. Az eredmények szintén a 13. ábrán láthatók. Hasonlít a már ismertetett elő-fehérjékhez: aktivitása csak a plazminhasítás után mérhető, az E. coli-ból egyláncú formában (elő-proteinként) szabadul fel.

6. példa

A pGR Trp 06 plazmidból a 3a példa szerint izoláljuk a nagyméretű Nde Ι-Sac I hasítási hely közé eső fragmentumot. Ezt a szintetikus oligonukleotid 36-tal kapcsoltuk össze:

5'-TATG AGC CCA CCA GAA GAG CTAC TCG GGT GGT CCT C a T4 módszerrel és E. coli K12 JM 105-be transzformáltuk. A szelektálás és a klónkiválasztás módszere is a 3a példában szerepel. Az (I) képletnek megfelelő „PA 336” kódja és aminosavsorrendje a 12. ábrán látható.

A pGR 336-tal transzformált E. coli K12 JM 105-öt fermentáltuk és indukálás után a 3a példa szerint mértük az expressziós rátát. Az elsődlegesen keletkező elő-proteinből a PA 336 vegyületet (amelynek aminosavszekvenciája a 12. ábrán látható) mint egyláncú proteint kaptuk. Az elő-fehérje egyláncú expressziója összehasonlítható a többi, pGR TAc 06-ban kódolt elő-proteinével.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Ser-X,-X₂-rscu PA¹⁴³^¹¹ (I) általános képletű polipeptidek előállítására mely képletben rsu-PA¹⁴³'*¹¹ egy scu-PA 54k-ból származó 143 (Glu)411 (LeuOH) aminosavak nem glikozilált szekvenciája;

X] jelentése Asn, Pro vagy Ser aminosavak egyike;

X₂ jelentése egy egyszeres kötés, Glu, Pro-Glu, ProPro-Glu vagy Glu-Leu-His-Leu-Gln-Gln-Val-ProSer-Asn azzal jellemezve, hogy a pBR 322 plazmidba, amelyből a nic/bom régiót és/vagy a tetraciklin-rezisztencia gén legalább egy részét eltávolítottuk, az EcoRI és a HindlII hasítási helyek közé a 3. ábra szerinti nukleotidszekvenciájú multi-klónozó helyet helyezzük be, amelynek segítségével egy vagy két transzkripciós terminátort, az (I) képletű polipeptid struktúrgénjének szintetikus részszekvenciáit, előnyösen a struktúrgén 3'C-terminálistól kezdődően, valamint egy szintetikus szabályozóképes promotert építünk be, kívánt esetben a 3. ábra szerinti Ndel-SacI közötti nukleotidszekvenciát az X_ret és X₂-őt kódoló részszekvenciák valamelyikére cseréljük, majd az így kapott rekombináns vektorral ismert módon egy Enterobacter törzset transzformálunk, ezt a transzformált törzset szokásos táptalajon tenyésztjük, a struktúrgén kifejezést indukáljuk, az (I) képletű vegyület így kifejeződött előproteinjét a táptalajtól és a lizált baktériumsejtekből elválasztjuk, az előproteint szolubilizáljuk, és végül egy redox-rendszer alkalmazásával az (I) képletű polipeptiddé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű polipeptideket állítunk elő, amelyekben X, jelentése Asn vagy Ser.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű polipeptideket állítunk elő, amelyekben X₂ jelentése egyszeres kötés, Glu, Pro-Glu vagy Pro-Pro-Glu.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) általános képletű polipeptideket állítunk elő, amelyekben X1-X2 jelentése Ser-Pro-ProGlu.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azz/al jellemezve, hogy egy szabályozóképes promotert, egy a riboszomális kötődés helyeként szolgáló Shine-Dalgamo szekvenciát, egy startkodont, az (I) képletű polipeptid szintetikus struktúrgénjét és a struktúrgéntől áramlásirányban lefelé egy vagy két terminátort tartalmazó rekombináns vektort alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szabályozóképes promoterként egy Trp- vagy Tac-promotert alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Trp-promoterként egy szintetikus, a 10. ábra szerinti nukleotidszekvenciájú Trp-promotert alkalmazzuk.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Tac-promoterként a ptac SDT jelű plazmidból (DSM 5018) származó tac-promotert alkalmazzuk.
9. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektorban egymásra következő terminátorokként a trpA terminátort és/vagy a Tn 10-ből származó tetA/orf L terminátort alkalmazzuk.

HU 212 510 Β
10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű polipeptid struktúrgénjében arginin ködönként CGT triplettet, leucin ködönként CTG triplettet, valin ködönként GTT triplettet és/vagy glicin ködönként GGT triplettet alkalmazunk.
11. Az 5-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű polipeptid struktúrgénjeként a 6a-6e ábra szerinti nukleotidszekvenciát és egy, a 12. ábra szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó struktúrgént alkalmazunk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 12. ábra szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó struktúrgént alkalmazunk, amely X] Asn és X₂ egyszerű kötés jelentését kódolja.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületeket

5 kódoló vektorral valamely E. coli törzset, előnyösen egy E. coli-K12 törzset transzformálunk.
14. Eljárás trombolitikus hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított plazmino10 gén aktivátor tulajdonságú polipeptidet inért, gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.