JP2015514398A - ポリペチドの生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリペチド生産の分野、特に封入体で組み換えポリペチドを生産する宿主細胞における組み換えポリペチドの生産に関する。
宿主細胞における組み換えポリペチド発現は、バイオテクノロジーおよび医薬品産業において広く使用されている標準的技術である。特に例えば大腸菌(E. coli)のような微生物宿主が、比較的単純な発現系および細胞培養条件がこれらの宿主細胞に利用可能であるために、一般に使用されている。概して、培養工程はそのために比較的経済的である。
本発明は、ポリペチド生産の分野、特に封入体で組み換えポリペチドを生産する宿主細胞における組み換えポリペチドの生産に関する。本発明は、活性タンパク質の収量を上げる、封入体からの組み換えポリペチドの生産のための新規方法を提供する。本発明者らは、ここで、細胞培養条件の調節が活性形態での組み換えポリペチドの収量に良い影響を与えることを証明する。例えば、本発明者らは、第一の高培養温度および第二の低培養温度を含む2段階培養方法が有益であることを発見した。細胞増殖および微生物宿主細胞における組み換えポリペチド発現に良い影響を与える他の培養パラメーターもまたここに記載する。
(a) 微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、
(b) 培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして
(c) 微生物宿主細胞を第二の温度で培養する
ことを含む、方法を提供する。
表1:種々の第二培養温度での細胞培養からのG−CSFの収量
表2:2回の再折り畳み工程を含む下流プロセシングのための好ましい条件の一覧
表3:洗浄され、凍結された封入体650gから出発した3回の生産操作での純度および収量。収量の計算は、封入体の湿重量による。
表4:G−CSF精製における総純度および2種の工程依存不純物(サルコシル、エンドトキシン)の値。数値幅は、異なる分析方法を使用した3個のG−CSF生産ロットの分析の結果を示す。
表5:3個のG−CSF生産ロットの純度および活性
本発明は、宿主細胞において封入体で発現される組み換えポリペチドの生産方法を提供する。本組み換えポリペチドをコードする核酸を宿主細胞に導入する。次いで、宿主細胞を培養して組み換えポリペチドを発現させ、ここで、該宿主細胞は、該組み換えタンパク質を含有する封入体を形成する。最初の培養期間終了後、培養を継続しながら、培養温度を高温から低温に変更する。次いで、宿主細胞の培養を低温で継続する。
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QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
(配列番号1)であり、これは、例えばHolloway, 1994またはDrugbank Accession No DB00099の下に維持されている。
TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAP
LSSCSSQSLQLRGCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQ
MEDLGAAPAVQPTQG AMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
(配列番号2)であり、これは、例えばUS5849883の図7またはPDB Accession No: 1BGC-Aの下に維持されている。
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWA
PLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQ
QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
(配列番号3)である。
本発明のある態様において、細胞培養のインキュベーション温度を、第一の高い温度から第二の低い温度に低下させる。温度の低下を、宿主細胞の培養を継続しながら行う。この低い温度で、細胞は増殖相から生産相に変わる。ある態様において、第一の温度は36℃〜38℃である。好ましい態様において、第一の温度は36.5℃〜37.5℃または36.7℃〜37.2℃であり、より好ましい態様において第一の温度は約37℃、より好ましい態様において第一の温度は37℃である。
pHは、第一および/または第二の培養温度/培養時間中、特定のpH値内に維持される。本発明者らは、6〜8のpHが、発現タンパク質の高収量をさらに促進するために特に有益であり、pH6.8〜7.2が特に好ましいことを発見した。それゆえに、ここに記載する方法は、pHの1回以上の測定操作を含み得る。pHは、第一および/または第二培養温度/培養時間中、6〜8または6.5〜7.8または6.6〜7.4または6.7〜7.3または6.8〜7.2または6.9〜7.1または6.9〜7.0;または6.6〜7.2または6.7〜7.2または6.8〜7.2または6.9〜7.2または7.0〜7.2または7.1〜7.2;または6.6〜7.1または6.7〜7.1または6.8〜7.1または6.9〜7.1または7.0〜7.1;または6.6〜7.0または6.7〜7.0または6.8〜7.0または6.9〜7.0の範囲に維持され得る。pHは、第一および/または第二の培養温度/培養時間中、6.8〜7.2または6.9〜7.2または7.0〜7.2または7.1〜7.2;または6.8〜7.3または6.9〜7.3または7.0〜7.3または7.1〜7.3または7.2〜7.3;または6.8〜7.7または6.9〜7.7または7.0〜7.7または7.1〜7.7または7.2〜7.7または7.3〜7.7または7.4〜7.7または7.5〜7.7または7.6〜7.7の範囲に維持され得る。特にpHは(約)6.8、6.9、7.0、7.1、7.2であり得るかまたはこれらの数値の2個の任意の組み合わせにより定義される範囲であり得る。第一の培養温度/培養時間のpHは、第二の培養温度/培養時間のpHと異なってもよい。
培養温度を、細胞培養物の光学密度によって、第一の温度から第二の温度に低下させ得る。本発明者らは、光学密度による温度の変更が、発現タンパク質の収量にさらに好影響を有し得ることを発見した。600nmで測定した光学密度(OD)が10〜50のときに培養温度を低下させるのが有益であり、27〜33で行うのが特に有益であることが判明した。それゆえに、ここに記載する方法は、光学密度の測定を含み得る。600nmにおける細胞培養物の光学密度が、10〜50または15〜45または20〜40または24〜36または27〜33に達したときに、培養温度を第一の温度から第二の温度に低下させ得る。600nmにおける細胞培養物の光学密度が27〜32または27〜31または27〜30または27〜29または27〜28;または28〜32または28〜31または28〜30または28〜29;または29〜32または29〜32または29〜31または29〜30または30〜32または30〜31または31〜32に達したときに、培養温度を第一の温度から第二の温度に低下させ得る。600nmにおける細胞培養物の光学密度が25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35またはこれらの値の任意の2個の組み合わせにより規定される密度に達したときに、温度を第一の温度から第二の培養温度に低下させ得る。
発現のために、組み換えポリペチドを宿主細胞で発現する。ある態様において、それゆえに、上記方法の工程(a)、(b)および(c)の前に、宿主細胞に核酸を導入する工程があってよく、ここで、該核酸は目的の組み換えポリペチドをコードする。核酸をベクターの一部として導入し得る。ある態様において、本方法を、組み換え核酸を既に含む宿主細胞で行う。
目的の組み換えポリペチドを含む発現ベクターを、当分野で知られる標準的方法を使用して宿主細胞に導入し得る。
封入体での組み換えタンパク質の発現を可能にする任意の微生物細胞を、本発明により使用し得る。組み換えタンパク質の封入体を生産する微生物細胞は、例えば、細菌および酵母細胞および糸状菌細胞を含む。“宿主細胞”または“宿主”は、細菌、酵母または糸状菌細胞のような任意の微生物細胞であり得る。細菌細胞が好ましい宿主細胞であり、グラム陰性細菌が特に好ましい。例は、C2523、C2523およびBL21(DE3)のような細胞を含む(全てNew England Biolabs)。特に好ましい宿主細胞は大腸菌細胞である。特定の発現系の適当な宿主細胞も上に記載している。
微生物細胞の培養のための一般的設定および培養条件は十分確立されており、ここで要旨のみを記載する。標準的細胞培養パラメーターを、当分野で共通の一般的知識に基づき調節し得る。
“下流プロセシング”は、培養物から回収した細胞のさらなる処理を含む。細胞は、組み換えタンパク質を伴う封入体を含む。
a) 可溶化剤の存在下で組み換えタンパク質を可溶化し;
b) 酸化剤および可溶化剤の存在下で組み換えタンパク質をインキュベートすることを含む、酸化および1回目の再折り畳み工程を実施し;
c) イオン交換樹脂吸着および/またはイオン交換クロマトグラフィーにより可溶化剤を除去し、所望により酸沈殿を実施し;そして
d) 工程(c)の組み換えタンパク質を可溶化剤非存在下で希釈およびインキュベートすることを含む、2回目の再折り畳み工程を実施する
ことを含む。
a) 組み換えタンパク質溶液と懸濁樹脂物質の混合によるイオン交換樹脂物質への結合および濾過による樹脂物質の除去および/または
b) 可溶化剤が樹脂と結合し、組み換えタンパク質が通過画分に残る条件下でのイオン交換クロマトグラフィーおよび/または、
c) 組み換えタンパク質が樹脂と結合し、可溶化剤が通過画分に残る条件下でのイオン交換クロマトグラフィー
を含む。
a) 組み換えタンパク質溶液と懸濁樹脂物質の混合による可溶化剤のイオン交換樹脂物質への結合および濾過による樹脂物質の除去;
b) pHをpH5より低く下げることによる不純物の沈殿および濾過による沈殿の除去;
c) 残留可溶化剤が樹脂に結合し、組み換えタンパク質が通過画分に残る条件下で行うアニオン交換クロマトグラフィー;
d) 組み換えタンパク質が樹脂に結合し、残留可溶化剤が通過画分に残る条件下で行うカチオン交換クロマトグラフィー;および
e) pHまたは塩濃度を増加させながら溶出緩衝液を使用することによる、段階的または勾配溶出による、カチオン交換樹脂からの結合した組み換えタンパク質の溶出。
可溶化:封入体(IB)フラクションの組み換え物を可溶化剤存在下に可溶化する。任意の適当な可溶化剤を使用し得る。このような可溶化剤は、例えば(しかし限定されない)GuHClまたはウレアのような変性剤またはカオトロピック剤の群または例えば(しかし限定されない)N−ラウロイルザルコシン(サルコシル)、ラウリン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)またはN−セチルトリメチルアンモニウム塩化物のような洗剤、界面活性剤またはサーファクタントの群から、例えば、選択される(しかしこれらに限定されない)。好ましい態様において、可溶化を、サルコシルをアルカリpHで、優先的にpH8で用いて、好ましくは0.2〜2.0%(w/v)、より好ましい態様において約0.5%〜1%(w/v)および最も好ましくは約1%(w/v)または1%(w/v)のサルコシルの濃度で行う。可溶化のための好ましい緩衝液は、Tris−HCl/pH8、優先的に40mM Tris−HCl/pH8である。可溶化後、希釈工程を、水または低伝導率(すなわち少なくとも2mS/cmより低い、より好ましくは1mS/cmより低い伝導率)の緩衝液を用いて実施し得る。
G−CSFの製造
物質および方法
1. 宿主細胞株の生産
T7 RNAポリメラーゼカセットの製造
lacオペロンの制御ドメインに操作可能に結合した機能的T7 RNAポリメラーゼ(受託番号AY264774、タンパク質AAP33914.1)を含む4.44kb遺伝子カセットを単離するために、大腸菌BL21(DE3)株(Novagene)からのゲノムDNAを使用した。DNAを、標準的プロトコールを使用してQuiagen Genomic tip-20キット(Quiagen, Hilden, Germany)を用いて製造した。次いでT7カセットをPCR反応により増幅した。増幅を、100μl反応体積で、KOD HiFi DNAポリメラーゼ(Merck, Darmstadt, Germany)を使用して行った。反応混合物は、DNAポリメラーゼ緩衝液、5U KOD HiFi DNAポリメラーゼ、2mM MgCl2、250μM dNTPs、100ng DNA鋳型、10μM 順方向プライマー(IntLambd 1)、10μM 逆方向プライマー(IntLambd 2)を含んだ。反応のために、PCRサイクラー[MJ Research PTC-200]を次の設定で使用した:変性98℃で30秒、続いて35サイクル30秒、98℃(変性)、30秒、65℃(アニーリング)、2分、72℃(合成)。最終合成を10分、72℃で行った。
IntLambd 1:GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC
IntLambd 2:TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG
上記単離T7 RNAポリメラーゼカセットを、修飾BL21大腸菌株C2523H(New England Biolabs)の染色体DNAに導入するために、上記単離T7 RNAポリメラーゼカセットを705-pmjプラスミドにクローン化した。このプラスミドは、温度感受性複製起点を含む。
G−CSF発現ベクター:
G−CSFのための特異的発現ベクターを構築した。N−(L−メチオニル)顆粒球−コロニー刺激因子(metHuG−CSF)の525bp長完全長ヒトcDNA配列は、例えばEP0401384に公表された付加的N末端メチオニン残基を有する、ヒトG−CSFの174アミノ酸アイソフォームと同一のタンパク質をコードする。
100mlの無菌種培養培地(RBY)に、WCB(作業細胞バンク)細菌細胞懸濁液を、無菌条件下接種した。摂取した種培養物を、37℃で、185rpmで一定撹拌しながら24時間インキュベートした。種培養物の光学密度が、600nmの光学密度で1.0に達したとき、種培養液を20Lバイオリアクター(可動容積15L)に移す。接種した種培養液を、18時間、37℃で、400rpmで一定に撹拌し、15L/分の速度で通気しながらインキュベートした。種培養物の600nmの光学密度が約0.9に達したとき、回収した種培養物を、合成成分および炭素源としてのグリセロールを含むGBA培地を含む1000Lバイオリアクター(可動容積500L)に移す。培養を、37℃での液内培養により厳密な好気条件(DO≧30%)下に行った。全培養期間中、pH値を6.8〜7.2の範囲に維持した。
1. 封入体(IB)の調製
発酵後、封入体の調製を実施した。撹拌、通気および炭素源供給を停止し、培養物を15℃未満に冷却し、細菌を、11000gで分離することにより回収した。細胞は回転子中に沈降し、水により洗い出した(排出)。細菌細胞濃縮物を回収し、水により半分の体積まで希釈し戻し、0.5M NaH2PO4を10mMの最終濃度まで添加した。細胞を、ホモジナイザーを3回通すことにより、加圧(100MPa)下に破壊した。封入体を、分離器中、11000gでの沈降により細胞残屑から分離した。沈降した封入体を、5mM DTT、10mM NaH2PO4、5mM EDTAおよび2%Tween 20含有洗浄緩衝液、pH7.2に排出した。濃縮IB懸濁液を同緩衝液で2倍に希釈し、再び沈降させた。この洗浄工程を10mM NaH2PO4緩衝液を使用して2回繰り返し、2回目の終了時には希釈しなかった。IBの最終沈降物を−80℃で保存したものは、8ヶ月安定であった。
表1は、上記形質転換宿主細胞の発酵の結果を示し、ここで、第一の培養温度は37℃であり、第二の培養温度はそれぞれ25℃、30℃、32℃、35℃または37℃であった。
G−CSF(フィルグラスチム)を、組み換え大腸菌C2523 T7 pol pRG/GCSFaクローン(G−CSF含有発現ベクターでトランスフォームした大腸菌)を用いて生産した。無菌条件下、調製した種培養培地に、液体窒素中で保存していた融解作業細胞バンクバイアルから得た0.10〜0.15cm3細胞懸濁液を接種した。接種した種培養フラスコを、旋回シェーカーインキュベーター中、37℃で185rpmで、24〜28時間インキュベートした。6個の振盪フラスコ培養の600nmでの光学密度(OD)の平均値が0.9〜1.1に達したとき、フラスコの内容物を、シリコンチューブを備えた無菌5dm3ガラスフラスコに回収した。回収した3dm3体積種培養を、WM323U/Rポンプで、無菌および補給生産培地(GBA、合成培地と炭素源としてのグリセロール)で75dm3を仕込んだ100dm3発酵槽に移した。培養を、厳しい好気条件下、37℃での液内培養で行った。培地の炭素源が使い尽くされたら、グリセロール供給溶液を、適当な速度で培養に添加した。溶存酸素濃度を、全培養期中、30%以下にならないレベルに維持した。培養物のOD値が30に達したら、温度を32℃に下げ、0.33mM IPTGを添加して、G−CSF発現を誘発した。細菌を、さらに5時間、80〜95のODまでG−CSFを生産するために培養した。
撹拌、通気および炭素源供給を停止し、培養物を15℃未満に冷却し、細菌を11000gでの分離により回収した。細胞は回転子中に沈降し、水により洗い出した(排出)。細菌細胞濃縮物を回収し、水により半分の体積まで希釈し戻し、0.5M NaH2PO4を10mMの最終濃度まで添加した。湿細菌細胞(バイオマス)の総質量は約10〜11.5kgであった。
分離し、洗浄した細菌を、ホモジナイザーを3回通すことにより、加圧(100MPa)下に破壊した。封入体を、分離器中、11000gでの沈降により細胞残屑から分離した。沈降した封入体を、5mM DTT、10mM NaH2PO4、5mM EDTAおよび2%Tween 20含有洗浄緩衝液、pH7.2に排出した。濃縮IB懸濁液を同緩衝液で2倍に希釈し、再び沈降させた。この洗浄工程を10mM NaH2PO4緩衝液を使用して2回繰り返し、2回目の終了時には希釈しなかった。IBの最終沈降物を−80℃で保存した。
凍結封入体(650g湿質量)を融解し、総体積32.5dm3で40mM Tris−HCl、pH8および1%(w/v)N−ラウロイルザルコシン(サルコシル)を含む可溶化緩衝液に溶解した。懸濁液を、室温で連続的撹拌下にインキュベートした。
可溶化IB懸濁液を、総体積の65dm3中最終濃度として0.5%サルコシルおよび20mM Tris−HClまで水で2倍濃縮した。CuSO4を、最終濃度40μMまで添加した。G−CSFは、ヘッドスペースに通気しながら、室温で少なくとも20時間連続的撹拌して酸化することにより、一部再折り畳みされた。酸化を、最終濃度1mMでのEDTA添加により停止させた。
サルコシルを、アニオン交換(AEX)樹脂にバッチ・モードで吸着させた。サルコシル1gあたり20g AG 1−X8樹脂(BioRad, USA)の量を適用し、溶液に添加した。懸濁液を2時間撹拌して、大部分のサルコシルを結合させた。樹脂を、100μm細孔径ナイロンバッグフィルターメッシュで濾過した。濾液に残存するサルコシルを、続く精製工程(実施例8および9)により生成物から完全に除去した。
pH4.3〜4.5での酸性沈殿により、G−CSFは溶存したままで、幾分かの不純物は容易に除去された。G−CSFの非特異的な、望まない共沈を、最終濃度1M ウレアの添加により阻止した。ウレアは、6M原液として提供され、実施例6の濾液に1dm3/分の速度でゆっくり添加した。その後、pHを1/20体積の1M 酢酸ナトリウムpH4.8により低下させた。pHを、50%酢酸での滴定によりさらに4.3〜4.5まで低下させ、少なくとも1時間沈澱させた。次いで、沈殿物質を、デプスフィルター(Pall K700/KS50 dual layer)による濾過により除去した。
酢酸ナトリウム50mM/pH4.5緩衝液を、1)DEAE Macro-Prep(Bio-Rad, USA)AEX樹脂充填4dm3カラムおよび2)Toyopearl SP-650C(東ソー、日本)CEX樹脂充填8dm3カラムの平衡化に使用した。両カラムを、直列配置でAEKTAプロセスクロマトグラフィー系(GE Healthcare, Sweden)と接続した。0.2μm無菌フィルターで浄化後、実施例7の濾液を第一のカラムに載せた。残留サルコシルはDEAE樹脂に結合し、一方G−CSFは未結合のままであり(非結合モード)、第一のカラムの通過画分に溶出された。この通過画分を直接第二のカラム(SP樹脂)に乗せ、これはG−CSFと結合した(結合モード)。20mM Tris−HCl/pH8での1工程溶出で、樹脂からG−CSFを脱離させた。この二段操作により、残留サルコシルの除去とともに、酢酸Na/pH4.5からTris−HCl/pH8への緩衝液交換もこの方法により達成した。
この段階で、タンパク質フラクションの約半分の折り畳みが完了していたが、残りのタンパク質は不完全に折り畳まれているかまたは誤って折り畳まれていた。G−CSF溶液は、Toyopearl SP-650Cから20mM Tris−HCl、pH8中に溶出し、0.2μm無菌フィルターを通してステンレススチール容器に入れた。濾過した溶液を水で2倍に希釈した。タンパク質折り畳み(2回目の再折り畳み)のための2回目のインキュベーションを、低電導率環境(<1mS/cm)で、pH8で2〜8℃に冷却下、32〜42時間行った。
カラムに、DEAE Macro-Prep(Bio-Rad, USA)を充填し、10mM Tris−HCl/pH8で平衡化した。2回目の再折り畳み(実施例9)由来の溶液をDEAEカラムに充填した。正しく折り畳まれたG−CSFを、10mM Tris−HCl/pH8中、0mM〜200mMへの直線的NaCl増加勾配で溶出した。溶出G−CSFを貯留し、水で2倍に希釈した。pHを、50%酢酸での滴定により4.5に調節した。
最終仕上げ工程のために、正しく折り畳まれたタンパク質から成るAEXクロマトグラフィー(実施例10)から回収したG−CSFプールを、Toyopearl CM-650S樹脂を充填したCEXカラムに直接載せた。カラムを20mM 酢酸ナトリウム、pH5.3で平衡化した。結合したG−CSFを、24カラム体積内で、pH5.3の、20mM〜400mM 酢酸ナトリウムの直線的NaCl増加勾配により溶出した。純粋G−CSFを含むフラクションを回収し、製剤のためにプールした。
CEXカラム(実施例11)から溶出した精製G−CSFを、0.2μm無菌フィルターで濾過し、製剤緩衝液(10mM 酢酸ナトリウム、pH4、5%ソルビトールおよび0.006%ポリソルベート80)で平衡化したSephadex G-25ファインレジンを充填した14dm3カラムを通した。同じ緩衝液をランニング緩衝液として使用した。G−CSFは、製剤緩衝液の空隙容積中に溶出した。全バッチ(35〜48g G−CSF)のために、各々、濾過したCEX溶離液の1/3を用いるSephadex G-25上での3連続製剤ランを行った。製剤したG−CSFを、製剤緩衝液での希釈により0.9〜1.0mg/ml濃度に調製し、最終に0.2μm無菌フィルターカプセルで濾過した。無菌溶液として製剤したG−CSFはきわめて安定であり、2〜8°で、数ヶ月間保存できる(数年は無理でも)。
周知の標準的分析方法を、特定分析方法を記載するフィルグラスチムのモノグラフを含む欧州薬局方(Ph. Eur.)に従って実施した(European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM) (2010): Filgrastim concentrated solution. European Pharmacopoeia 7.0, 2015-2018)。該モノグラフは、基本的方法について、欧州薬局方内の他の章を相互に引用する。技術についてさらに詳細な記載を提供するこれらの具体的記述部分を、下記実施例中で角括弧内に引用する。利用された対照標準品は、欧州連合により医薬として承認された購入製剤(フィルグラスチム)または該市販対照を使用してキャリブレートした社内標準品であった。国際単位(IU)による相対力価の分析には、世界保健機関(WHO)の国際的G−CSF標準を使用した。純度、特定不純物、G−CSF関連タンパク質および生物活性(力価)の分析に使用した試験方法は、Ph. Eur. モノグラフに則り、わずかな改変のみを施し適用した。以下では、当分野で知られるこれらの標準的分析方法の使用を簡単に記載しない。
Claims (23)
- 封入体中での組み換えポリペチドの生産方法であって、
(a) 微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、
(b) 培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして
(c) 微生物宿主細胞を第二の温度で培養する
ことを含む、方法。 - 微生物宿主が大腸菌である、請求項1に記載の方法。
- 第一の温度が36℃〜38℃である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 第一の温度が37℃である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 第二の温度が25℃〜36℃である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 第二の温度が30℃〜36℃、より好ましくは30℃〜35℃、より好ましくは31℃〜33℃である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 第一の温度および/または第二の温度で培養中のpHが6〜8である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 第一の温度および/または第二の温度で培養中のpHが6.8〜7.2である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 温度の低下を、細胞培養物の600nmにおける光学密度が10〜50に達したときに行う、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 温度の低下を、細胞培養物の600nmにおける光学密度が27〜33に達したときに行う、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 組み換えポリペチドが4ヘリックスバンドルポリペチドである、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 組み換えポリペチドがG−CSFである、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 組み換えポリペチドがG−CSFであり、該G−CSFが、所望によりそれぞれ−1位に開始メチオニンアミノ酸残基を有してよいヒトまたはウシG−CSFである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)〜(c)の前に宿主細胞該組み換えポリペチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入する工程を含み、ここで、該核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 誘導性プロモーターがT7プロモーターである、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 微生物宿主細胞の染色体が所望によりlacプロモーターに操作可能に結合してよいバクテリオファージRNAポリメラーゼをコードする核酸配列を含み、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- バクテリオファージRNAポリメラーゼがT7ポリメラーゼである、請求項17に記載の方法。
- ポリペチドの発現をインデューサーの添加により実施する、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- インデューサーを温度の低下と同時またはその後に添加する、請求項19に記載の方法。
- インデューサーがIPTGである、請求項19または請求項20に記載の方法。
- ベクターが配列番号4の配列を含む、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜22のいずれかに記載の方法であって、該組み換えポリペチドをコードする核酸が次の
(i) 配列番号3または配列番号1のポリペプチドをコードする核酸配列;および
(ii) 配列番号3に記載する配列と少なくとも90%配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択される、方法。
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