JPS62252731A

JPS62252731A - 骨髄性白血病抑制剤

Info

Publication number: JPS62252731A
Application number: JP62010038A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Tamura; 政彦田村; Arihiro Hattori; 有宏服部
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-01-22
Filing date: 1987-01-21
Publication date: 1987-11-04
Anticipated expiration: 2009-03-16
Also published as: JPH0618780B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−Ｃ３Ｆ
と略す）を有効成分とりる骨髄性白血病治療剤に関づる
。

（従来の技術）白血病は化学療法剤に代表される薬剤の開発、或いは骨
髄移植等の各種治療法の進歩にもかかわらず、ここ２０
年来、その死亡率の低ドが見られない完全治癒の難しい
難病である。〔医学のあゆみ、第１２８巻、第１３号、
　　（１９８４）　　（以下該文献をあゆみとｌＢ８プ
）８６７−８７３頁〕。

しかし、白血病にλ１′Ｓする薬剤の開発は日進月歩の
勢いで進んでおり、最近の化学療法剤の多剤併用療法に
よるとＡＭＬ（成人急性骨髄性白血病）の場合、完全寛
解（末梢血、骨髄における血液細胞の質的、量的正常化
と白血病による自覚的症状、他覚的身体所見の消失）率
は８０％以上に達したとされている。（あゆみ、９９４
〜９９８頁）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

にも拘らず、残念なことにＡＭＬの完全治り魚について
は前述の化Ｃ率にみるように極めて不満足な状況でしか
なく、又、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）については現在
までのところ適切な薬剤がない。（あゆみ、１００５〜
１０１１頁）。

そこで、最近では化学療法剤のほかに免疫療法剤（あゆ
み、１０５０〜１０５５頁）、分化誘導剤（あゆみ、１
０５９〜１０６３頁）、インターフェロン（あゆみ、１
０５６〜１０５８頁）をはじめとするＢＲＭ　（生物学
的応答調節物質）を利用した新しい白血病治療剤の研究
が進められている。

しかし、今までのところ白血病に対して決め手となるよ
うな薬剤は出現していない。

〔問題点を解決するための手段〕

このにうな状況ドにあって、最近、マウス骨髄性白血病
細胞匪＋＋ｌ−３ｇの分化を誘導する物ｔｉをマウス肺
組織の培養上清より精製したところ、これがマウスのＧ
−Ｃ３Ｆと同一であったという注目づべぎ報告がなされ
た。（Ｎｉｃｏｌａ、Ｎ、＾、ｅｔ　ａｌ；Ｊ、Ｂｉｏ
！、　Ｃｈｅｍ、　２５８．９０１７−９０２３（１９
８３）　）。

このＧ−Ｃ８ｒ−はｉｎ　ＶｉｔｒＯノ実験系ニオＩｉ
’　でｔＡ粒球の前駆細胞にＩＩき顆粒球への分化増殖
を促す［３ＲＭである。〔例えば、Ｈｅｔｃａｌｆ等；
ＥＸｐ、ｔｌｅｌｌｌｆｌｔｏｆ、　Ｌ　１８５．（１
９７３）参照）。ところで、本発明のヒｌ−Ｇ　−ＣＳ
　Ｆは本出願人が鋭意研究を進めてきたものであって、
純粋なヒトＧ−Ｃ３Ｆの人聞取得に成功し先に出願した
ものである。（特願昭５９−１５３２７３号、特願昭ｅ
、ｏ−２２０４５０号、特願昭（３０−２６９４５５号
、特願昭６０−２６９４５６号、特願昭６０−２７０８
３８弓、特願昭６０−２７０８３９号参照）。

そこで、本出願人が製造したＣ３Ｆの一つであるＣ１１
ｔＪ−２山来のヒ１−Ｇ−Ｃ３ＩＴをマウスに投すして
みたところ、末梢血中に成熟好中球の増加が認められた
。（実験例１参照）次に、族０’Ｊ線で誘発したＳＪＬ／Ｊ白血病モデル（
マウス）を−ｂらいてＧ−Ｃ３Ｆの抗白血病効果を検問
したところ、有為な６Ｊｊ命効果が認められた。

（実験例２参照）。　なお、上記モデルは放射線誘発白
血病モデルであって、通常用いられるヒルライン化され
た白血病細胞を腹１ｒ？内に移植した−［デルに比べ、
より実際の白血病に近いものである。

ちなみに、ＳＪＬ／Ｊマウスは骨髄性白血病好発性の系
統であり、３０ＯＲ前後の放射線を前用すると１５〜２
０％の割り合いで骨髄性白血病が発症覆る。

又、実験例２では、末梢好中球系細胞の成熟度による分
類を打つ−（みたところＧ−ＣＳト投ちにより成熟した
好中球の割り合いが増えること′ｂ同１１４に確認され
た。（実験例２参照）成熟好中球の由来は■白血病細胞
が分化したもの、■白血病を発症したマウスに残っ−（
いた正常細胞が分化増殖したもの等が考えられるが、い
ずれにしてもＧ−Ｃ３Ｆ−の末梢成熟好中球を増加させ
る作用効果によりＩＩｉ命効宋が認められたものとＪｌ
を認される。　そし−（この結果は、より実際に近いモ
デルを用いているという点で、Ｇ−Ｃ５ｒ−が抗白面病
剤として有用であるということを示しているといえる。

本発明者らは以上の知見にもとづき本発明を完成した。

本発明は、ヒＩ”Ｇ　　Ｃ３Ｆ−を自効成分とする骨髄
性白血病治療剤を提供するものである。

本発明のイｊ効成分であるヒトＧ−Ｃ３ＦはＩｌＦ！度
が高く単離されたと（〜Ｇ−Ｃ３Ｆであれば（の由来は
問わないが、本出願人が先に出願した方法によって取得
される下記（１）及び（２）のヒ＋−ａ−Ｃ３Ｆが特に
好ましく用いられる。

（１）次の理化学的＋４質を有りるヒ１〜Ｇ−Ｃ３［。

０分３４ニドデシル硫酸ノトリウムーポリアクリルアミ
ドグル電気泳動法による測定で１９０００±１０００゜ ■等電点：　ＰＩ　＝５．５±０．１　、　ｐ　）＝５
．８±０．１゜ｐｌ＝６．１±０．１の三つの等電点の
うら少なくとも１つを有する。

■紫外部吸収：　２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５０
ｎｍに極少値を持つ。

（４）Ｎ末喘から２１ｔＩＩ迄のアミノ酸配列が次の如
くである。

１Ｉ２Ｎ−ｒｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
八Ｉａ−３ｅｒ−３ｅｒ−１ｅｕ−Ｐｒｏ−ＧＩ　ｎ−
３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｃｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ−ＧＩｕ−ＧＩ　ｎ−ＶａＩ　−（２）次のアミノ
酸配列またはだの一部で表わされるポリペプチドをイｊ
づるヒ１−Ｇ−ＣＳト。

（Ｈｃｔ）ｎ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｃｒ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｎ　
Ｓｅｒ　Ｐｈｃ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　Ｃｙ
ｓ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｎＶａｌ　　八ｒｇ　Ｌｙ
ｓ　　Ｉｌｅ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｖ　　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｌａ　Ａｌａ　　ＬｅｕＧｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｘ　　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｔｈｒ　ｒｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｅｕ　ＣｙｓＨｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ
　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｑｌｙ　ｔｌｉｓ　５ｅｒ
ｌｃｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　ｒｒｐ　Ａｌａ　Ｐ
ｒｏ　Ｉｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＰｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　１．ｃｕＳｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　１
ｌｉｓ　Ｓｃｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　　Ｐｈｃ　　Ｌｃｕ
　　ｒｙｒ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｌｃｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ＾
ｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒ
。

Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　
１．ｃｕ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　
　ＬｃｕＡｓｐ　Ｖａｔ　　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｌ”ｈｅ
　Ａｌａ　　ｒｈｒ　　ｒｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇ
ｉｎＧｌｎ　Ｍｅｔ　　［２１ｕ　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　
　Ｇｌｙ　Ｈａｔ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　Ａｌａ　　Ｌ
ｅｕＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
　Ｈｅｔ　　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｔ＋Ｑ　八１ａｓｃｒ
＾Ｉａ　Ｐｈｃ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　ＬｅｕＶａｌ　　Ａｌａ　Ｓｃ
ｒ　１ｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｃｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｕ　ＶａｌＳｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｑ
ａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　１ｌｉｓ　　Ｌｃｕ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｐｒ。

（式中Ｘは＋−ｅｕ又はＩ−ｅｕ−Ｖａ　Ｉ　−３ｅｒ
−Ｇ　Ｉ　ｕを示し、「１はＯ又は１を示す）なお、上記のヒトＧ−Ｃ３Ｆで糖鎖部分を持つ糖蛋白質
の形をとる一ｂのが最も好ましいものである。

上記（１）のＧ−Ｃ３Ｆは特願昭５９−１５３２７３号
明細内又は特願昭６０−２２０４５００明細店に記載さ
れた’５ＪｉＷ法によって得ることができる。

前者には、本出願人によって仏ｕ１パスツール研に寄託
されているヒト［１腔底癌由来の細胞株Ｃ（・ＩＵ−１
（（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｈ，）寄託番号１−３１５）の培養上
清から甲離取得覆るｌｊ法が訂述されており、また後者
には同じくじ＋−ｃ＋　＋ｒｐ底癌由来の細胞株ＣＡ・
ＩＬＪ−２（（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｈ，）寄託番号１−４８３
）の１８養上清から製造する方法が記載されている。

詳しくは夫々の明細ｔｔ＋を参照されたい。

又（２）のＧ−Ｃ３Ｆは特願昭６０　２６９４５５＠、
特願昭６０−２６９４５６号、１１願昭６０−２７０８
３８号及び特願昭６０−２７０８３９号の各明細−Ｕに
記載された製造方法によって冑ることができる。　これ
等の各明細書【：λ−１１１Ｖ六れＴいる１ｉ１）ＩＬ
いねｂる逍イーに子鉦１狩１２１古術による方法である
。

最初の２件には、［、ｃｏｌｉ等の原核生物を１６主細
胞とする方法が、又後の２付には、動物細胞を宿主とす
る方法が詳しく開示されている。

なお、前述した糖鎖部分を右する糖蛋白質の形をとるＧ
−Ｃ３Ｆは動物細胞を宿主とする方法によって製造する
ことができる。

得られたヒトｃ−ｃｓＦは凍結保存と１６か又は凍結乾
燥、真空乾燥等の手段により水分を除去して保存するこ
とかできる。

又、所望によりじトＧ−Ｃ３Ｆを通光な緩衝液に溶解し
た後にミリポアフィルタ−等でｆｌＡｌ滅菌して注射剤
とすることもできる。

更に本発明の骨髄性白血病治療剤は医薬製剤としての形
態をとるために必要な製剤担体ヤ賦形剤を、更には安定
化剤、吸看防［Ｌ剤を含むことができる。

本発明の骨髄ｔｉｔ白血病治療剤に含まれるとｔ□Ｇ−
ｃｓｒの投＃ｊ量、投与回数は対象の疾患患者の病状を
配慮して決めることができるが、通常成人−人あたり０
．１〜５００μ９、好ましくは５〜１００μＵのヒ１−
Ｇ−Ｃ３ｒ−を含イ１′Ｌｌる製剤を１週間に１〜７回
投＃Ｊすることができる。しかし本発明はヒＩ−Ｇ−Ｃ
８［の含有量によって限定されるものではない。

〔実施例〕

以下本発明を参考例（Ｇ−Ｃ８ｆ−の製造例）、実験例
（薬理効果）、実施例（製剤例）をあげて説明するが、
本発明はこれ等に限定されるものではない。

参考例〔動物細胞（マウスＣ１２７細胞）を用いたヒト
Ｇ−Ｃ８Ｆの製造例〕ＩＪ１願昭６０−２６９４５６号明細出の実施例１〜１
２に記載された方法でＰＴＮ−Ｖ２プラスミドを１９、
これを［３ａｍｌｌｌで処理しておく。即ら、Ｄ　−ｒ
　Ｎ　−Ｖ２プラスミド２０μＱを１０ｍ）を丁ｒｉｓ
−ｔｌ（Ｊ（Ｃ１１８，０）　、　７ｍＭＭｑ（、Ｑ　
２．１００ｍＨＮａＣ，ｌ！　。

２　ｍＭ　２−メルカプ１−エタノール、　０．０１％
［３ＳＡ１００μρに溶ｗｆ、ｔ！Ｌ、めＢａｍ１−Ｉ
Ｉ　（宝酒造社製）２０ｍ位で処理し、フェノール処理
、エーテル処理、：［タノール沈澱を行っておく。

一方、マウスＣ１２７細胞は１０％牛脂児血清（ＧＩＢ
ＣＯ）を含む［）ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ
　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地中で増殖ざＵる。径５ｃｍの
プレートに増殖したＣ１２７細胞に、プレート当たり」
−記調製［）ＮＡを１０μｑの割り合いでリンｆ１．−
１ｔルシウム法　（ｌｌａｙｎｃｓ、Ｊ＆Ｗｃｉｓｓｍ
ａｎｎ、Ｃ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄＲ
ｃｓ、旦、　６８７−７０６参照）にて形質転換を行い
、グリヒロール処理の後、１２時間３７℃でインキュベ
ートした。

次に、この細胞を３枚の新しい径５ｃｍのプレートに移
し、１週間２回の割り合いで培地交換をした。

１６［」目にＦｏｃｉ（集塊）を形成した部分をそれぞ
れ新しいプレー１〜に移し、上述の培地で継代培養し、
Ｇ−Ｃ８Ｆ生産能の高いクローンを選別した。その結果
〜”Ｉｍｙ／ｆ）のレベルのＧ−ＣＳト牛産があった。

なお、回収、精製、検定方法については上記の特願昭６
０−２６９４５６号明細虎の該当実施例に開示しである
通りのものを用いた。

実験例１　（Ｇ−Ｃ３Ｆの末梢成熟好中球増加Ｉｌ！１
５ｆりＣ５７Ｂｌマウス（♂８Ｗ＞を２群に分ける。

一方をコントロール群としてコントロールリーンプル（
「１−プロパツール１％同系マウス血清１０％を含む生
理食塩液＞０．１ａ＆を他方はＣ８［処賄群としてＣ３
Ｆリンプル０．１　ｄ（ＣＩ−ＩＵ−２山来Ｇ−〇ＳＦ
２．５μＵ、プロパツール１％、同系マウス血清１０％
を含む生理食塩液）を１日１回皮下投与した。所定の［
１に各群より４匹ずつのマウスを無作為に抽出して眼窩
静脈より採血し、ミクロレルカウンター（東亜ＣＣｌ３
０型）により白血球数を測定した。同時に血液塗抹標本
を作製し、ギムリ゛染色後顕微鏡ドに白血球２００個を
分類した。末梢好中球数は次の式により柿出した。

（末梢好中球数）＝〔末梢白血球数）Ｘ（白血球中の好
中球の割合〕１度採血に用いたマウスは２度用いることをさけ、又、
無処置マウスを同様に処理し、第ＯＥＩの値を１−１だ
。

Ｉｉ！ｌ果を表−′１に示覆。

表−１１〕（危険率）　水＊＊＜０．ＱＱｌ＜＊＊＜Ｑ、ｏｉ
＜＊＜ｏ、０！］（測定回数ｎ＝４＞表−１から明らかな通り、Ｃ）−Ｉ　Ｕ　−２山来ヒト
Ｇ−Ｃ３Ｆは末梢血中に成熟好中球を増加せしめる効果
を有ηる。

実験例２（ＳＪＬ／ＪンウスによるＧ−Ｃ３Ｆの抗白血
病効果）ＳＪＬ／Ｊマウス（♂７Ｗ）に３００　Ｒの放射線を照
射した。

その後１２０　Ｅｌ目までは、約３０［旧こ１回、ぞれ
以後は約１０日に１回実験例１と同様に採血し、末梢赤
、白血球数を測定した。このとき塗抹標本も同［１，’
ｉに作成した。末梢白血球数が３００００個／　ｍｍ　
　以上、末梢赤血球数が５×１０　個／ｍｔｎ　　以ド
、及び末梢血への幼若白血球の出現、の３つのうら最低
２つ以上を）６またしたものを白血病と断定した。

該白面病マウスに実験例１で示したコントロールリンプ
ル若しくはＧ　　Ｃ３ｒ・リンプルのいずれか一方を０
．１ｍｌ１１シ１１回死ぬまで皮ド投Ｌｊシ、投与開始
後の生存［］数を比較した。　又、別の白血病マウスを
上記と同様に処置し、所定の［ｌに眼窩静脈より採血し
、末梢白血球数と好中球系細胞の成熟石を調べた。以１
−の実験に使用した白血病マウスは死後、牌の腫大及び
白血病細胞の浸潤をａｒ認することにより白血病である
ことが追認された。

結果は■及び■（表−２）の通りであった。

■生存Ｆ１数　　コントロール群；　９±１．４ＩＣ８
Ｆ処置群　；　　２８．７５±１．９３（測定回数　ｎ
＝４）Ｐ（危険率＞　＜０．００１以上の実験結果から明らかな通り、Ｇ−Ｃ３Ｆ投りによ
り有意な延命効果が認められ、又、成熟好中球の増加効
果が確認８゛れた。

なお、この実験が実際に近い−Ｌデルで実施された点は
小要である。

実施例１（製剤例）参考例によってｊ￥ＩられたヒトＧ−Ｃ３Ｆを前筒処理
した後−２０℃で凍結された凍結物を用いて注射剤とし
た。

実施例２（製剤例）参考例によって得られたヒトＧ−Ｃ３ｒ−を無菌操作で
１０ＩＩＩｌバイアル瓶に５Ｉｒ１Ｎ充填し、−２０℃
で凍結乾燥後ゴム栓にて施栓した凍結乾燥物を用いて注
射剤とした。

〔発明の効果〕

本発明の骨髄性白血病治療剤は、骨髄性白血病患者の末
梢成熟好中球を増加させる効果と延命効果の両方を有し
ている。

従って本発明により、従来から完全治癒への通が聞かれ
ていなかった骨髄性白血病に対づる冶癒への希望が増加
したといえる。

Claims

【特許請求の範囲】１　ヒト顆粒球コロニー刺激因子を有効成分とする骨髄
性白血病治療剤。２　ヒト顆粒球コロニー刺激因子が以下の理化学的性質
を有するものであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の骨髄性白血病治療剤。（１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による測定で１９０００±１００
０。（２）等電点：ＰＩ＝５．５±０．１、ＰＩ＝５．８±
０．１、ＰＩ＝６．１±０．１の三つの等電点のうら少
なくとも１つを有する。（３）紫外部吸収：２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５
０ｎｍに極少値を持つ。（４）Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如
くである。【アミノ酸配列があります】３　ヒト顆粒球コロニー刺激因子が、以下のアミノ酸配
列又はその一部で表わされるポリペプチドを有するもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の骨
髄性白血病治療剤。【アミノ酸配列があります】（式中ＸはＬｅｕ又はＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ
を示し、ｎは０又は１を示す。）