JPS61294000A - 新規ポリペプチド及びそれをコ−ドするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗Ｈｍ作用を有する新規ポリペプチド、その製
法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ等に関する。

癌壊死因子（ＴＮＦ　）はマクロファージから放出され
る生理活性物質であり、正常細胞に何ら存置作用を及ぼ
すことなく癌細胞のみを特異的に攻撃し、壊死させるこ
とが知られている。

ＴＮＦについての研究が最近盛んに行われ、その成果に
ついての報告がなされている。例えば、ヒトＴＮＦをコ
ードする逍伝子をクローニングし、この追伝子を組み込
んだベクターにより形質転換した大腸菌を培養し、ヒ）
　ＴＮＦ　Ｊｆ：ｆｆｌ生させることが報告されるに至
っている［Ｎλｔｕｒｅ　３１２．７２４（＋９８４）
、Ｎａｔｕｒｅ　３１３，８０３（１９８５）、５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２２８．＋４９（１９８５）］。

本発明者等は、予てより逍伝子組み換え技術によるヒ）
　ＴＮＦの生産に着目し、研究を重ねた結果、ヒトＴＮ
Ｆをコードするｃ　ＤＮＡのクローン化に成功すると共
に、大腸菌でのヒ）　ＴＮＦＱ製造及びその単殖に成功
し、これらの発明につき既に特許出願している（特願昭
５９−４３６１７．特開［１？７５９−８２６５３等）
、、この一連の研究過程において、ヒトＴＮＦは逍伝子
上にその前駆体としてコードされていることが明らかに
なり、その前駆体のＣ末端側の１５５残基のアミノ酸配
列からなるポリペプチドが成熟（ｍａｔｕｒｅ）ヒトＴ
ＮＦであることを、ウサギ血京から分離精製したＴＮＦ
　（成熟ウサギＴＮＦ　）のアミノ酸配列との対比にお
ける高い相同性に基づき明らかにした（特願昭５９−４
３１３＋７）。

更に研究を重ね、ヒ）　ＴＮＦがその生物活性を発揮す
るためには、必ずしも前記の＋５５残基のアミノ酸が必
須ではなく、そのＣ末端側の１４５残基のアミノ酸配列
よりなるポリペプチドが抗腫瘍活性を存することを見い
出すに至った。

本発明は、下記式で示されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド［■］、そのＮ末端にＭｅｔが結合してなるポ
リペプチド及びそれらの生理的に許容される塩に閃する
。

Ｖａｔ　　Ａｌａ　　ｌ１ｉｓ　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　
　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　ＡｌａＧ
ｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｔ
ｒｐ　　Ｌｅｕ　　八ｓｎ　　Ａｒｇ　　ＡｒｇＡｌａ
　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　＋、ｅｕ　　Ａｌ
ａ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　ＧｌｕＬｅｕ　
　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　
　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ｐｒｏ　　５ｃｒＧｌｕ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ｌｌｃ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　ＶａｔＬｅｕ　　Ｐｈｅ
　　Ｌｙｓ　　Ｇａｙ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ
　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　ＴｈｒＨｉｓ　　Ｖａｔ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　
Ｉｌｅ　　Ｓｅｔ　　Ａｒｇｌｌｅ　　Ａｌａ　　Ｖａ
ｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｖ＆ｔ　　ＡｓｎＬｃｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　
　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　
　Ｃｙｓ　　ＧｉｎＡｒｇ　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｌ
ａ　　ＬｙｓＰｒｏ　　ＴｒＰ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　
　Ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　
　ＧｌｙＶａｔ　　Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　　＋、ｅｕ　　
Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　
ＬｅｕＳｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓ
ｎ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ
Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＧｌ
ｙ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　　　
　　　（Ｉ）本発明はまた、上記本発明のポリペプチド
をフードするＤＮＡにも閃する。

本発明に係るＤＮＡの具体例としては、次の塩基配列 ＜５’）−ＧＴＡ　ＧＣＣＣＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　Ｇ
ＣＡ　ＡＡＣＣＣＴ　ＣＡＡＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＧＧ
Ｇ　　ＣＡＧ　　ＣＴＣＣＡＧ　　ＴＧに　　ＣＴＧ　
　ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ　　ＧＣＣＡＡＴ　　ＧＣＣＣＴ
ＣＣＴＧ　　ＧＣＣＡＡＴ　　ＧＧＣＧＴＧＧＡＧ　　
ＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＧＡＴ　　ＡＡＣＣＡＧ　　ＣＴ
Ｇ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　ＣＣＡＴＣＡ　　ＧＡＧ　
　ＧＧＣＣＴＧ　　ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣ
ＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ　　ＧＧＣＣＡＡ　　Ｇ
ＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ　　ＧＴＧ　　Ｃ
ＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴ
ＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ　　ＡＣＣＡＡＧ　
　ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　　ＧＣＣＡＴＣＡ
ＡＧ　　ＡＣ；ＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ　　ＡＧＧ　　Ｇ
ＡＧ　　ＡＣＣＣＣＡ　　ＧＡＧ　　ＧＧＧ　　ＧＣＴ
　　ＧＡＧ　　にＣＣＡＡＧ　　ＣＣＣＴＧＧ　　ＴＡ
Ｔ　　ＧＡＧ　　ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ　　ＣＴＧ　　Ｇ
ＧＡＧＧＧ　　ＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡ
Ｇ　　ＡＡＧ　　ＧＧＴ　　ＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣ
ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＣＡＡＴ　　ＣＧＧ　　ＣＣ
ＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴ　　ＧＣＣＧＡＧ　
　ＴＣＴ　　ＧＧＧ　　ＣＡＧ　　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
　　ＧＧＧ　　ＡＴＣＡＴＴ　　ＧＣＣＣＴＧ−（３’
）　　　　　　　　（■〕を存するＤＮＡ及びその５′
末端に、開始コドンＡＴＧ及び／又は３′末端に終止コ
ド／が結合してなる塩基配列を有するＤＮＡ及び縮重（
ｄａｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）　コド／を含む該ＤＮＡ誘
導体が挙げられる。

本発明に係るＤＮＡ及びポリペプチドは以下の様にして
作製或いは製造することができる。

ヒ）　ＴＮＦの前駆体或いは成熟ヒ）　ＴＮＦをコード
する塩基配列をイｆするＤＮＡは、例えば後記参考例１
或いは３に示した方法で作製することができる。

（１）　このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、これと
必要に応じ、常法により合成したＤ　Ｎ、Ａアダプター
とを結合することにより本発明のポリペプチドをコード
するＤＮＡ又はそれを含むＤＮＡ断片を作製することが
できる。またこれらのＤＮＡ断片は常法に従い全合成す
ることも可能である、具体的には、本発明のポリペプチ
ドそれ自体をコードする塩基配列をイｒするＤＮＡの３
′末端に終止コドンを、かつ５′末端に開始コドンＡＴ
Ｇが結合していない場合には開始コドンＡＴＧを有する
ＤＮＡ断片を作製し、これを適当なプロモーター及びＳ
Ｄ配列に続いて結合させ、ついでベクターに組み込むこ
とにより本発明のポリベブヂド生産用の形質発現ベクタ
ーを得ることができる。プロモーターとしては、例えば
ｌａｃ、　ｔｒｐ、　ｔａｃ、　ｐｈｏＳ、　ｐｈｏＡ
、　　ｐ＋−、ＳＶ４０初期プロモーター等が挙げられ
る。ＳＤ配列から開始コドン間の配列としては公知のも
のを利用するか或いは好ましくは下記塩基配列からなる
配列が利用される。

ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧベクターとし
ては、形質転換させる宿主中で増殖するものはすべて用
いられ、例えば、プラスミド（ｐｎＲ３２２等）、ファ
ージ（λフアージ誘導体等）、ウィルス（ＳＶ４０等）
、う／ナラエイ　プラスミドが挙げられる。

（２）　　この形質発現ベクターを適当な宿主に、例え
ば大腸菌にコーエンらの方法［１’ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡＧＧ、２１１０（１９７２＞］により、導入する
ことにより形質転換体を得ることができる。

（３）　　ついでこの形質転換体を適当な培養条件下で
培養することにより、式［１］で示されるボ２！ペプチ
ド或いはそのＮ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを
生産することができる。例えば、宿主として大腸菌を用
い、本発明のポリペプチドをその菌体中に生産させた場
合、培養終了後その大腸菌を集め、リゾチーム消化と凍
結融解や超音波破砕。

フレンチプレス等により大腸菌を破壊したのち、遠心分
離又は濾過することにより、目的とする本発明のポリペ
プチド含有粗抽出液を得ることができる。

（４）　　このポリペプチドの粗抽出液を蛋白質の一般
的な精製法（限外濾過、透析、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティクロマトグ
ラフィー等）に従い精製することにより、本発明のポリ
ペプチドを得ることができる。

６）　そして必要により、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン、塩酸、
グルコン酸等と塩を形成せしめ、本発明のポリペプチド
の生理的に許容される塩を得ることができる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を用
いることにする。

Ａ　　　　　　アデニン Ｃシトシン Ｇ　　　　　　グアニン Ｔ　　　　　チミン Ａｌａ　　　　　アラニ／ Ａｒｇ　　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　　システィア ＧＩｎ　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　グリシン 旧Ｓ　　　　　ヒスチジン １１ｃ　　　　　　イソロイシン Ｌｅｕ　　　　　ロイシン Ｌｙｓリジ／ Ｍｅｔ　　　　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　　　フェニルアラニン Ｐｒｏ　　　　　プロリン Ｓｅｔ　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　スレオニン Ｔｒｐ）リプトファン Ｔｙｒ　　　　　　チロシン Ｖａｌ　　　　　　バリ／ ＤＮＡ　　　　　　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　　　　　相補ＤＮＡ ５　ｓ　ｃ　ＤＮＡ　　　単ｍｃＤＮＡｄｓｃＤＮＡ　
　　二重鎖ｃ　ＤＮＡ ＲＮＡ　　　　　　リボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ　　ポリアデニル酸含有伝令Ｒ
ＮＡｄＡＴＰ　　　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄ
ＣＴＰ　　　　　デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ　
　　　　デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　　　
　デオキシチミジ７三リン酸オリゴ（ｄＴ）　　オリゴ
デオキシチミジル酸ポリ（Ａ）　　　　ポリアデニル酸 ｄＣデオキシシチジル酸 ｄＧ　　　　　　デオキシグアニル酸 ＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミン四酢酸ｋｂｐ　　
　　　キロ塩基対 ｂｐ　　　　　　塩基対 ＳＤＳ　　　　　　ドデシル硫酸ナトリウムＭＷ　　　
　　　分子量 ＳＤ配列　　　シャインーダルガーノ配列ＴＰＡ　　　
　　　ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテ
ート 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。

（以下余白） 実施例１　ポリペプチドＣＩ］の製造 （１）　　形質発現プラスミドの構築 ポリペプチド［Ｉコ生産用の形質発現プラスミド（ｐＨ
ＴＲ９１３２）を、参考例３に示した成熟ヒトＴＮＦ生
産用の組み換え体プラスミド（ｐＨＴＲ９１）を用いて
構築した（第１図参照）。

組み換え体プラスミドｐＨＴＲ９１に制限酵素Ｃ１λＩ
と［１ａｌＩを作用させ、４つのＤＮＡ断片に切断し、
それらのうち最も小さな断片（１１３ｂｐ）を５％ポリ
アクリルアミド電気泳動にて分離精製した。この断片を
、更にＩｔ／Ｉ限酵素Ｄｄｅ　Ｉにて２つのＤＮＡ断片
（４７ｂＰと［１６ｂｐ）に切断し、４７ｂｐのＤＮＡ
断片を単離した。

この断片に、常法によりそれぞれ合成した次式５式％（
） で示される２種類のオリゴヌクレオチドアダプターをＴ
ａ　ＤＮＡリガーゼを用いて順次結合させた。

このＤＮＡ断片を、以下１）Ｎ　Ａ断片（ａ）という。

更に、このＤＮＡ断片（ａ）に常法により合成した次式 ％式％（） で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた。このＤＮＡ断片を、以下
ＤＮＡ断片（ｂ）という。

一方、プラスミドｐＣＴ−１［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃ＋。

ＵＳＡ　８１．５９５０（＋９８４）］に制限酵素１１
ｐａＩと＾ａｔｌｌを作用させｔｒｐプロモーター領域
の一部を含む約３８０ｂｐのＤＮＡ断片［このＤＮＡ断
片の３′末端から上流のｔｒｐプロモーター領域の塩基
配列は、ベネブトらの報告（Ｊ、Ｍｏ１．Ｉｌ＋ｏ１．
．１２１，１１３．１９７８年）に示されている］を切
り出し、これを上記のＤＮＡ断片（ｂ）にＴａ　ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた。このＤＮＡ断片を、以下
ＤＮＡ断片（Ｃ）という。

更に、参考例３−（１）項で得た組み換え体プラスミド
ｐＨＴＲ９１に制限酵素Ｂａ１Ｉと旧ｎｄＩ＋１を作用
させ、ヒトＴＮＦのＣ末端部分をコードする領域を含む
ＤＮＡ断片（４８７ｂＰ）を切り出し分離精製し、この
断片を上記のＤＮＡ断片（ｃ）にＴａ　ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させた。このＤＮＡ断片を、以下ＤＮＡ断
片（ｄ）という。

別途に、プラスミドｐＢＲ３２２に制限酵素＾ｖａｌと
Ｐｖｕ　Ｈを作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７ｋ
ｂｐ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し
た。

このＤＮＡ断片の両端をＤＮＡポリメラーゼ■（フレ／
−フラグメント）及びｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＣＴ
Ｐ。

ｄＴＴＰを用い平滑末端とし、その両端をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベクターを
ＰＢＲＳ６という。更に、このベクター（ｐＢＲ５Ｇ　
）に制限酵素ＡａｔｌｌとｔｌｉｎｄＩＩＩを作用させ
、大きなりＮＡ断片（約３．８ｋｂｐ）を単離精製した
。このＤＮＡ断片に先に調整したＤＮＡ断片（ｄ）をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、ポリ
ペプチド［Ｉ］生産用の形質発現プラスミドを構築した
。この形質発現プラスミドをｐＨＴｒ’３６２と名づけ
だ。

（１）項で得た形質発現プラスミドｐＨＴＲ３Ｇ２を参
考例１−　（６）　ＩＡに記載した方法に準じてＥ、ｃ
ｏ目１１１１１０１に４人し、形質転換体を得た。形質
転換体の遣損はテトラサイクリン（１２，５μｇ／璽１
）耐性で行った。

この形質転換体をテトラサイクリン（１２，５μｇ／■
Ｉ）を含むＬＩＩブロス（組成：１１当り、トリプト７
１０ｇ、酵母エキス５　ｇ、　ＮａＣ１１０ｇ　：　Ｐ
Ｈ７，５）に−夜培養し、この培養液を１０倍量の改良
Ｍ９培地（組成：０．７％Ｎａ２）（ＰＯａ’１２１−
１２０　、０．３％　ＫＨ２ＰＯ４゜０．０５％　Ｎａ
Ｃｌ　　、　　０．１％　ＮＨａＣ＋　　、　　　２　
　ｍｇ／　　ｌ　　ビ　タ　ミ　ン１１＋、０．４５％
カザミノ酸、　　１．　ｍＭＭｇｓＯ４，Ｏ，ＩｍＭＣ
ａＣ１２、０，５％ブドウ糖）に接種し、３７℃で１時
間培養し、次いでインドールアクリル酸を最終７０度２
０μｇ／−１になるように加え、更に２４時間培養を継
続したのち、遠心分離により菌体を集めた。

菌体を培地容量の１／ｌＯ容量の０．１％リゾチームと
３０ｍＭ　ＮａＣＩを含む５０ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−１１
Ｃ１’ｆａｌｌ衝液（ＰＩ−１８，０）にＦ！濁させ０
℃で３０分間静置した。更にドライアイス／エタノール
浴での凍結と３７℃での融解を繰り返した後、遠心分離
により菌体残渣を除き、ポリペプチド［■］含含油抽出
液得た。この抽出液について、下記方法に従い抗腫瘍活
性を測定した結果、ｌＸＩＯ２単位／１であった。

（抗腫瘍活性の評価法） 抗腫瘍活性はマウス由来Ｌ−Ｍ細胞（＾ＴＣＣ，ＣＣＬ
１．２）に対する細胞傷害活性で評価した。

検体を培地で倍数希釈した試料０．１１とＬ−Ｍ細胞の
ｌＸ１０’個／１の懸濁液０．１１を９６穴の組織培養
用マイクロプレート（フロー・ラボラトリ−社製）に加
える。培地はｆｖ／ｖ％のウシ胎児血ｔｆｌを含むイー
グルのミニマム・エブセンシャル培地（ＭＥＭ）［ボー
ル著“セルアンド　ティシュ　カルチュア”；　“Ｃｅ
１ｌ　　ａｎｄ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”
　　、Ｅ＆Ｓ　　ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅＬｌ、ｄ、（
１９７０）＃照コを用いる。このマイクロプレートを５
％の炭酸ガスを含む湿潤空気中、３７℃で４８時間培養
する。培養終了後、グルタルアルデヒド２０μりを加え
、生き残った細胞を固定する。固定後、マイクログレー
トを洗浄、乾燥して、　０．０５％メチレンブルー溶液
を０．１ｍｌ加え、固定された細胞を染色する。余分な
メチレンブルーを洗い流し、乾燥後、固定された細胞に
伸行したメチレンブルーを０．：ｌＯＮ塩酸で抽出し、
その６６５ｎ■における吸光度をタイターテブク・マル
チキャン（フロー・ラボラトリ−社製）で測定する。こ
の吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞
の５０％を殺すために必要な生物活性を１単位／１と定
義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当
する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によって求め
、その希釈率の逆数を試料の生物活性の力価（単位／１
で表記するンきする。

実施例２　ポリペプチド［１１の精製 実施例１−■項に示した方法に従って得られた抽出液か
ら、ポリペプチド［Ｉ］を分離精製した。

ｔ１１１出液！００１にＩＯ％ポリエチレ／イミンの２
１を添加し、混和放置後、遠心分離にて上清液を得た。

この上ｍ液１００１に飽和硫酸アンモニウム水溶液の２
００１を添加し、混和放置後、遠心分汗にて沈殿を集め
た。この沈殿を１０１の２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−１１
ＣＩ緩衝液（ＰＩＩ８．０＞に溶解し、同緩衝液に対し
て透析した。

その透析内液を、あらかじめ同緩衝液にて平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファ０−スＣＬ−ｔＪ　　（ファルマシア社
）のカラＡ　（３，５Ｘ　１５ｃｍ＞に負荷した。２０
ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ５−１１Ｃ１衝液（ｐＨ８，０）にて
同カラムを十分洗浄したのち、ＮａＣ１の０〜０．３Ｍ
の濃度勾配で溶出した。

抗腫瘍活性をイｆする溶出画分を集め、限外濾過にて濃
縮し、更にセファクリルＳ　−２００カラム（４，４Ｘ
　８３ｃｍ）によるゲルＬＪ□２過に付し、抗腫瘍活性
をイｒするポリペプチドを回収した。

溶媒には５　ｍＭリン酸塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ７，
４）を用いた。

この精製ポリペプチドに等容量の２％ＳＤＳ、１０％２
−メルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含む
Ｏ，Ｉ２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩＦＪｉ衝液（ｐ！
（（ｉ、８）を加え、室温にて３０分間静置ののち、１
２．５％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、＋７５Ｖで
３時間泳動させた。泳動終了後、ゲルを２１１中に切り
出し、各ゲル片を１％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培ｊ
也に浸請し、４℃にて？４１１！７間振盪撹拌してゲル
中のポリペプチドを抽出した。各ゲル片からの抽出液に
つき、抗腫瘍活性を測定した。

分子量既知の標早蛋白質としてホスフォリラーゼｂ　（
ＭＷ９４，０００）　、　　ｔ　シ血７？ｔ７ＪＬフＥ
　ｙ　（ＭＷＧ７，０００）　、　ｔ　ホｙ　ルブＥ　
７　（ＭＷ４３，０００＞　、　炭ｍ脱水酵素（ＭＷ　
３０．０００）　、大豆トリジン／　イノヒビター（Ｍ
Ｗ　２０．１００）及びα−ラクトアルブミン（ＭＷ　
１４，４００）を用いた。

その結果、Ｉ６，０００±５００ダルトンの分子量に相
当する位置に抗ｌ１１ｉ瘍活性を認めた。

形質発現プラスミドｐＨＴＰ３（Ｉ２に組ろ込まれたポ
リペプチド［１１をコードするＤＮＡから翻訳されるア
ミノ酸配列に基づいて算出される分子量は！（ｉ、０５
４ダルトン（但し、開始コドンＡＴＧに由来するメチオ
ニ７を除く）である。

以上の結果は、ポリペプチド［Ｉ］をコードするＤＮＡ
を組み込んだ形質発現プラスミドによる形質転換体、す
なわち大腸菌を培養することにより、ポリペプチド［１
］が産生され、かつ菌体中で分解を受けることなく、該
ポリペプチドが得られたことを示すものである。

（以下余白） 参考例１　ヒトＴＮＦ酵駆体をコードするＤＮＡのクロ
ーニング （１）ヒト肺胞マクロファージからｐｏｌｙ（＾）ｍＲ
ＮＡの調製 ヒト肺洗浄液から採取した肺胞マクロファージをｌθ％
牛脂児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させて
ベトリゾイブシュ（直径８ＣＩ）に１枚当たり９　Ｘ　
１０’個となるように播き、３７℃で１時間培養した後
、エンドトキシン（大腸菌由来のりボボリサブカライド
）、　ＴＰＡ及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度
がＩＯμｇ／ｍｌ、　１０Ｍｇ／ｍｌ及び１　ｕｇｌ＊
Ｉとなるように添加混和し、更に培養を継続した。

４〜４．５時間後に培養液を吸引除去し、ディツシュ」
二のマクリフ１−ジを０．６％ラウロイルサルコシ／酸
ナトリウムと６　ｍＭクエ／酸ナトリウムを含む５Ｍグ
アニジルチオシアネート液で溶解し、ホモジナイズした
。このホモジネートをＯ，１Ｍ　ＥＤＴＡ含有５．７Ｍ
Ｃ５Ｃ１２水溶液上に重層し、超遠心分離ａ（ＲＰＳ２
７−２　ｃｌ−ター、日立製作新製）を用い２（１，５
０Ｏｒｐｍで２０時間遠心分離し、全ＲＮＡ画分をベレ
ットとして得た。これを０．３５Ｍ　ＮａＣｆ、　２０
ｍＭＴｒｉｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液
の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。

この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＩＯｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｍ衝ａ　（ｆ）ＩＩ　７．４＞　（以
下ＴＥ液という）１−１に溶解し、６５℃で５分間加熱
した。これにＮａＣ＋溶液を０．５Ｍとなるように加え
た後、あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣＩを含むＴＥ液で平
衡化したオリゴ（ｄＴ）セルｒｊ−スブＪラムに１寸し
、ｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出した。

（２）ｃｌ）ＮＡの合成 （１）項で得られたＰＯＬｙ（八）ｍＲＮＡを鋳型とし
てグプラーとホフマンの方法［Ｇｅｎｅ　２５，２［ｉ
３（＋９８３）］に従ってｃ　ＤＮＡを合成した。すな
わち、６μｇのｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡを、ｌｏｍＭ　
ＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭピロ
ホスフェート　ナトリウム、１．２５ｒｎＭ　ｄＧＴＰ
、１．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ　ｄ、ＴＴＩ
’、０．５ｍＭｄＣＴＰ、　０．１６７μＭα−”Ｐ−
ｄＣＴＰ　（比活性３０００Ｃｉ　／ｓｍｏｔｅ）、　
４μｇオリゴ（ｄＴ）　＋２−＋８および１２Ｏ単位ト
リ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素を含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ緩衝液（ｐｔｌ　８．３）の４０１
１１に溶解させ、４３℃で３０分間反応させた後、ＥＤ
ＴＡを加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホル
ム混液（１：１）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウ
ムをＩ？Ｌ柊ｉ５［１Ｆ２．５Ｍになるように加え、エ
タノールにより反応生成物（５ｓｃＤＮＡ　−ＲＮＡ複
合体）を沈殿させた。このｓ　ｓ　ｃＤＮＡ−ＲＮＡ　
’６１　合体を、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　ｌｏｒｎＭ
　（ＮＩ＋４）　２ＳＯ４，ｌ００ｍＭ　ＫＣＩ。

０、ｌ５ｍＭβ−ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレ
オヂド、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミ／、４０ＭＭ
ｄＧＴｒ’。

４０ＭＭ　ｄＡＴＰ、　４０ＭＭ　ｄＴＴＰ、（０ＭＭ
　ｄｃＴＰ、０．９単位大腸菌リボヌクレアーゼ１１．
２３！１１−位大腸菌１）ＮΔポリメラーゼ■を含む２
０ｒｎＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＴｉＣＩ緩衝液（ｐＨ７
’）の１００μ！に溶解した。

１２℃で６０分間、続いて２２℃で６０分間反応させ、
ｄｓｃＤＮＡを合成した。Ｅ　ＤＴ、〜を加えて反応を
停止させ、上記と同様にフェノール−クロロホルム混液
での抽出操作及びエタ／−ルによる沈殿化にてｄ　ｓ　
ｃ　ＤＮＡを得た。

（２）項で得られたｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡを２　ｍＭ　Ｃ
ＯＣｌ２．０．２ｍＭジヂオスレイトール、０．１ｍＭ
　”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性３Ｃ＋／冒冒ｏ１ｇ）及び
１０単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを含’ｆｆする１００ｍＭカコジル酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，２）の１００μ！に溶解し、３７℃で３０
分間反応させ、ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡの３′末端にｄＣテ
ールを付加させた。

反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、ｄＣテール
（を加ｃＤＮＡをフエ／−ルークロロホルム混液での抽
出操作及びエタノールによる沈殿化にて回収した。これ
を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐ１］７．４＞
、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣ＋を
含む水溶液に１１当たり２μｇのｄＣテール付付加　Ｄ
ＮＡを含むように溶解した。

ｆ４）ｄＧデテール加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの
調製プラスミドｐ［１Ｒ３２２ＤＮＡの１０８ｇを、２
０　ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩｍ衝液（ｔ）１１７．４）
、　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩ２．５０ｒｒ＋Ｍ（ＮＨ４）　
２ＳＯ４及び１菖１当たり０．１■ｇのウシ血清アルブ
ミンを含む水溶液の１００μｌに溶解し、詞限酵潜Ｐｓ
ｔ１１５単位を加え、３７℃で１時間反応させた。

反応液からＤＮＡをフェノール−クロロホルムｉＱ［に
よる抽出操作とエタノールによる沈殿化にて回収した。

得られたＤＮＡを（３）項に示した方法に従って、　ｄ
Ｇテール付加プラスミドｐｎＲ３２２を得た。。但し１
反応液量は２００μ！とし、”Ｉ）−ｄＣＴＩ’の代わ
りに”Ｈ−ｄＧＴＰを用い、さらに８０単位のターミナ
ルデオキシヌクレオチクルトランスフェラーゼ８０単位
を用いて３７℃で２０分間反応させた。これを（３）項
に示したｄＣテール付付加　ＤＮＡの場合と同様の緩衝
液に１１当たり２０℃ｇのｄＧテール付加プラスミドＰ
ＲＲ３２２ＤＮＡを含むように溶解した。

５）績み換え体プラスミドの作製 （３）項で得られたｄＣテール付付加　ＤＮＡ溶液１２
０μ！を、（４）項で得られたｄＧテール付加ＰＢＲ３
２２ＤＮＡ溶液１２０μＩと混合し、６５℃で５分間、
５７℃で１２０分間分間率ュベートしてアニーリングを
行い、組み換え体プラスミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択 ０項で得られた組ろ換え体プラスミド溶液を用い、Ｅ、
ｃｏロχ１７７６株を形質転換させた。すなわち。

Ｅ、ｃｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメリン酸＋０
０ｕｇ／１１及びチミジン４０μｇ１１を補ったＬ−ブ
ロス２０１中、３７℃で吸光度（６００ｒｖ）が０．５
となるまで培養し、菌体を４°Ｃで遠心分離して集め、
５０ｍＭ　ＣａＣＥ２含イ’ｆ　ＩＯｍＭＴ　ｒ　ｉ　
ｓ　−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，３＞のＩｏｎ　ｌに分散
し、再度遠心分離にて菌体を集めた。この菌体を同じ緩
衝液の２閣１中に分散し、０℃で５分間静置した。この
分散１０．２ｍ＋に（５）項で得られた組み換え体プラ
スミド溶液０．１冒１を添加混合し、０℃で１５分間静
置し、更に４２℃で２分間保持した後、前の培養で用い
たのと同一組成のし一ブロス０．５１を加えて１時間振
盪培養を行った。この培養液の一部を取り、上記成分の
他にテトラサイクリン１５／１ｇ／ｍ＋を含むＬ−グロ
スの寒天平板上に拡げ、３７°Ｃで約１２ｆｆ！ｉ間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してｃ　ＤＮＡラ
イブラリーを作製した。

（２）クローニング （６）項で得られたｃ　ＤＮＡライブラリーについて、
ヒトＴＮＦをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを持
つ形質転換体をスクリーニングするため、コロニー・ハ
イグリダイゼーシクン試験をハナハ／（Ｉｌａｎａｈａ
ｎ）らの方法（Ｇａｎｅ　１０．６３（１９８０）コに
従って行った。参考例２−　［８）　’ＩＴで得たウサ
ギＴＮＦをコードするりａ−ン化ＤＮＡを制限＃索）１
ａｅｌｌ及びＡｖａ　Ｔを用いて切断し、第２表の１８
〜１０５番の８８ｂｐからなるＤＮＡ断片己２７０〜５
１３８番の２９９ｂｐからなるＤＮＡ断片を切り出し、
それぞれの断片を単離した後、３２Ｐで５２したものを
プローブとして用いた。約２万個のコロニーから、これ
らの標識プローブと強く結合する６個のコロニーを選び
出した。

（８）クローン化ＤＮＡの塩基配ダ１１の決定（２）項
で選択された組み換え体プラスミドの中からｐＨＴＮＦ
−１３を選び、そのクローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列を
マキサム−ギルバート法により決定した。

この塩基配列の解析により明らかにされたヒトＴＮＦ前
駆体をコードする領域の゛塩基配列及びこの塩基配列か
ら翻訳されるアミノ酸配列は第１表の通りである。成熟
ヒ）ＴＮＦをコードする領域（〔〕で囲んだ部分）は、
第２表に示したウサギＴＮＦをコードする塩基配列及び
アミノ酸配列との相同性に基づいて決定した。

（以下余白） 参考例２　ウサギＴＮＦをコードず７＞　Ｉ）ＮＡ　（
’）クローニング （１）ウサギ肺胞マクロファージからｐｏｌｙ（＾）ｍ
ＲＮＡの調製 ウサギにプロピオニバクテリウム　アクネス死菌体を１
羽当り１００■ｇの投与量で静脈内に注入し、８日後に
屠殺した。直ちに（＋ｌ′Ｉｗ４気管切間し、気管内に
挿入したチューブを介してリン！ｌ１ｌｆｉ衝化生理食
塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを検電
した。との肺胞マクロファージを１０％牛脂児血清含有
のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させてペトリディッシ
ュ（直径８　ｃ＋ｇ）に１枚当り２　Ｘ　１０７個とな
るように播き、３７℃で１時間培養した。更に、参考例
１−（１１項に示した方法に従って、エントドキシｙ、
ＴＩ’Ａ及びシクロへキシミドとともに培養したのち、
マクロア１−ジからｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを調製した
。ここで得たｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ　’ｅアガロース
ゲル電気泳ｇ１（ゲル濃度１％、６Ｍ尿素存在下。

ｐＨ４）に付し、分子サイズとして１．１３〜２．７ｋ
ｂに相当する両分にウサギＴＮＦ　ｍＲＮＡを高濃度に
回収した。

（２）ｃ　ＤＮＡの合成 （１１項で得た精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ　４　ｕｇ
を、１０ｍＭＭｇＣＩ２．７０ｍＭ　ＫＣＩ、　　１　
ｍＭジチオスレイトール。

０．５ｍＭ　ｄＴＴＰ、　０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　０
．５ｍＭ　ｄＡＴＩ’、　０．５ｍＭ　ｄＧＴｒ’　（
但しｄｃＴｒ’はｆｆ２ｐで標識、比活性４．４×１０
’　ｃｐｓ／　ｎｍｏｌＣ）、　　３１１ｇオリゴ（ｄ
Ｔ、）　＋２−１８及び８０単位トリ骨髄性白血病ウィ
ルス由来逆転写酵階を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ
Ｉ　緩衝液（ｐＴＩ　８．３）の１００μｆｆに溶解さ
せ、４３℃で９０分間反応させた後、ＥＤＴＡ水１８液
で反応を停止させた。ｃＤＮＡ　−ｍＲＮＡ複合体を参
考例１−２）項に示した方法に従って、フェノール−ク
ロロホルム混液（１：１）による抽出操作及びエタノー
ルによる沈殿化にて回収した。更に、アルカリ加温処理
することによりｍＲＮＡを分解除去した後、合成された
５ｓｃＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。

この５ｓｃＤＮＡを、０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．５
ｍＭ　ｄＴＴＰ。

０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ、　０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　　
５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．７０ｍＭ　ＫＣＩ、　１．５ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール、８単位大ＩＩｇ菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■（クレノー　フラグメント）を含任する
０、１Ｍヘベス緩衝液（ｐＨ［ｉ、９）の４ｏａｎに溶
解し、　１５℃で２０Ｈ′！間反応させｄｓｃＤＮＡを
合成した。反応液にＳＤＳ水溶液を加えて反応を停止さ
せ、ｄｓｃＤＮＡをフエ／−ルークロロホルム混液によ
る抽出操作及びエタノールによる沈Ｒ化にて回収した。

得られたｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡの沈殿を、５０ｍＭ酢酸ナ
トリウｌ−（ｐｌ−１４，５＞、　１　ｍＭ　ＺｎＳＯ
４，２００ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％グリセロール及び
Ｓ１ヌクレアーゼ０．５単位を含任する水溶液の１００
μｊに溶解し、３７℃で２０分間反応させてヘアピン構
造を開裂させた。反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止
させ、ｄｓｃＤＮＡをフェノール−クロロホルム混液に
よる抽出、更にエーテルによる抽出操作の後、エタノー
ルにより沈殿させ回収した。

（３）　ｄ　Ｃｆ　−Ｊｌ／付加付加ＤＮＡの調製■項
で得られたｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡの３′末端に参考例１−
（３）項に示した方法に準じて、ｄＣテールを付加させ
、これをｌｏｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ緩衝Ｓ　＜
　Ｉ）Ｈ７，↓）。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ　ＮａＣ＋を含む水
溶液に１１当り０．２μｇのｄＣテール付付加　ＤＮＡ
を含むように溶解い：ａ （４１ｄＧテール付加プラスミドＰＢＲ３２２ＤＮＡの
調製ｄＧデテール加プラスミドｐＢＲ３２２は参考例１
−（４）項の方法により調製した。これをｄＣテール付
付加　ＤＮＡの場合と同様の緩衝液に１１当り２μｇの
ｄＧデテール加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを含むよ
うに溶解した。

（５）組み換え体プラスミドの作製 ｄＣテール付加ｃＤＮＡｔＢ液５Ｏｕ１をｄＧテール付
付加［１Ｒ３２２ＤＮＡ溶液５０μｊと混合し、６５℃
で１０分間、５７℃で１２０分間、４５℃で６０分間、
３５℃で６０分間及び室温で６０分間インキュベートし
てアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液を調
製した。

（６）形質転換体の選択 （５）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、
参考例１−　（６）項の方法に従ってＥ、ｃｏｌ＋χ１
７７６株を形質転換させ、ｃＤＮＡライブラリーを作製
した。

■ハイブリダイゼーション試験 （６）項で得られたｃ　ＤＮＡライブラリーの中から、
下記の方法によりウサギＴＮＦをコードするｃ　ＤＮＡ
を含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリーニングし
た。（１）項の方法で得たｍＲＮＡを鋳型として、（２
）項の方法で合成した１２ｐ標ｍ５ｓｃＤＮＡを誘導プ
ラス　プローブとした。但し、”Ｐ　−ｄＣＴＰは高放
射能比活性のものを用い、高濃度に標識した。別に、エ
ントドキシ７、ＴＰＡ及びシクロヘキシミドによる培養
を省略したマクロファージを用いて、同じ方法により調
製した３２ｐ標識５ｓｃＤＮＡを誘導マイナス　プロー
ブとした。約２万個のコロニーについて、これらのプロ
ーブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション試験を
行い、誘導プラスのプローブと強く結合し、誘導マイナ
スのプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む
組み換え体プラスミドを存する５０個のコロニーを選別
した。

次いで、これらの選択された形質転換体のうち２０個に
ついてハイブリダイゼーション・トランスレーション試
験をマニアナイス編“モレキュラークローニング”［“
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″、３２９（１９
８０）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、
］に記載の方法に従って行った。すなわち、それぞれの
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ニトロセル
ロースフィルター上に加熱変性させた後固定し、これに
上記（１）項で得たウサギＴＮＦ　ｍＲＮＡを含むｐｏ
、ｌｙ（＾）ｍＲＮＡを加え、５０℃で１８０分間反応
させ、ハイブリダイゼーションを行った。結合したｐｏ
ｌｙ（＾）ｍＲＮＡを溶出回収した後、アフリカッメガ
エルの卵母細胞を用いる方法により蛋白質に翻訳させ、
その蛋白質のＬ細胞傷害活性をラフの方法［Ｊ、ｌｍ５
ｕｎｏｌ　１２Ｂ＋２３５（＋９８１＞１に準じて測定
することにより、回収されたｍＲＮＡがウサギＴＮＦ　
　ｍＲＮＡであるか否かを検定した。この試験により、
ウサギＴＮＦ　ｍＲＮＡと強（ハイブリダイズするｃＤ
ＮＡを含むプラスミドを持つ形質転換体３個を見いだし
た。そのうち最も長いｃＤＮＡ　（約７５０ｂｐ）を有
するプラスミドよりｃ　ＤＮＡを単離し、制限酵素Ｄｄ
ｅ　ＩでＤＮＡ断片を切り出し、二次スクリーニング用
のプローブとした。このＤＮＡ断片を３２ｐで標識し、
上記（６）項で得たｃ　ＤＮＡライブラリーについてＦ
Ｔ［ｌ’コロニー・ｌ＼イプリダイゼーション試験を行
い、標識プローブと強く結合するｃ　ＤＮＡを含むプラ
スミドを持つ形質転換体を選んだ。ｃ　ＤＮＡライブラ
リーの約６万個のコロニーのうち９８個が陽性コロニー
であった。

これらからｃ　ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで切り出し
、そのサイズをポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ
、１ｋｂｐ以上のサイズを仔する１７個のクローンを選
び出した。これらのうち最も大きなｃ　ＤＮＡを含む形
質転換体（組み換え体プラスミド番号：ｐＲＴＮＦ８０
２）について、クローン化ｃ　ＤＮＡを単離し、塩基配
列を決定した。

（８）クローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列の決定■項で選
択された組み換え体プラスミド（ｐＲＴＮＦ８０２）か
ら単離したクローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列をマキサム
−ギルバート法で決定した。

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されるアミノ酸
配列は第２表の通りである。ウサギＴＮＦ前駆体は第２
表の１９〜７２３番の塩基配列に、成熟ウサギＴＮＦは
２６２〜７２３番の塩基配列（第２表中、〔〕で囲んだ
部分）にコードされている。

（以下余白） 参考例３　成熟ヒ）ＴＮＩ；生産用形質発現プラスミド
の構築 参考例１−　（８１項で得た組み換え体プラスミドＰＩ
ＩＴＮＦＩ３から、ルｊ限酵素ＰｓｔＩによりクローン
化ｃＤＮＡを切り出し、更に非翻訳領域の一部を制限酵
素ＥｃｏＲＩで分解除去し、約１．１ｋｂｐの断片を得
た。

これをプラスミドｐｎＲ３２２のＰｓｔｌ　−ＥｃｏＲ
Ｉ断片（約３．０ｋｂｐ）に組み込むことにより再りロ
ー二／グした。この組み換え体プラスミドをｐＨ７１１
３と名づけた。

このプラスミＬ″ｐＨＴ１１３に制限酵素＾ｖａｌと５
ａｌｌを作用させ、３！ｌのＤＮＡ断片（それぞれ約０
．８ｋｂｐ。

１．３ｋｂＰ及び２．Ｂｋｂｐ）に切断した。これらの
断片のうち、ヒトＴＮＦをコードする領域の大部分とプ
ラスミドｐＢＲ３２２のテトラザイクリン耐性逍伝子の
一部を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した
。

この断片に、次式 ％式％） で示されるオリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させた。このＤＮＡ断片を、以
下］−１Ｔ　Ｎ　Ｆ−アダプター断片という。

一方、ｔｒｐプロモーター　ベクターｐＤＲ７２０［Ｇ
ｅｎｅ２０．２３＋（１９８２）；Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルズ社より購入］にＦｔ＋Ｉ　ＩＵ酵素ＥｃｏＲＩと＋
１ｐａｌを作用させ、　ｔｒｐプロモーター領域の一部
を含むＤＮＡ断片（３５ｂｐ）を切り出した。

このＤＮＡ断片の塩基配列は次式に示す通りである。

５′−ＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴ
ＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴ３′−ＧＧＧＧＡＣＡＡＣ
Ｔ’Ｇ丁ＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡ丁ＣＡＡこれ
に、次式で示される合成オリゴヌクレオチド　アダプタ
ー ５′−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡ
ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡＴ〔２〕３’−ＴＴＧＡＴＣＡＴ
ＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡ
ＧＣをＴ、ｔ　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。こ
のＤＮＡ断片を、以下ｔｒｐプロモーター断片という。

別途に、プラスミドｐＢＲ３２２に制限酵素ＥｃｏＲＩ
とシリ−■を作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７ｋ
ｂｐ）を切り出した。これに、先に調製したＨＴＮＦ−
アダプター断片とｔｒｐプロモーター断片を７４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させることにより、第°１表のア
ミノ酸番号７９〜２３３番に相当する１５５残基のアミ
ノ酸よりなる成熟ヒトＴＮＦ生産用の形質発現プラミド
を構築した。この形質発現プラスミドをｐＨ丁Ｒ９１と
名づけた。

第２図はｐＨＴＲ旧の構築工程を示す。

（以下余白） 第１表　ヒ）ＴＮＦ前駆体をコードする塩基配列及び塩
バ配列から推測されるアミノ酸配列ＧＡＣＣＣＡＣＧＧ ＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＣ〔〕で囲
んだ部分は成熟ヒ）ＴＮＦをコードする塩基配列及びア
ミノ酸配列を示す。

第２表　ウサギＴＮＦ前駆体をコードする塩基配列及び
塩基配列から推測されるアミノ酸配列ＡｒｇＡＩａＬｅ
ＬｌｅｒＡＳｐＭ／Ｓｌ’ｒ０１．（！ＩＪＡＩ　ａｌ
ｌｌ　Ｓｅｔｏ　　　　　　　　　　　ｅｓｏ　　　　
　　　　　　　ｃｃ。

ＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣ
ＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧ （〕で囲んだ部分は成熟ウサギＴＮＦをコードする塩Ｕ
配列及びアミ／ＩＩＥ列を示す。

（以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図は形質発現プラスミドｐＨＴＰ３０２のもが築工
程図を、第２図は形質発現プラスミドｐＨＴＲ９１の構
築工程図を示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式で示されるアミノ酸配列からなるポリペプ
   チド又はその生理的に許容される塩。 【アミノ酸配列があります】〔 I 〕
2. （２）特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド［ I
   ］のＮ末端にＭｅｔが結合してなるポリペプチド又はそ
   の生理的に許容される塩。
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド［ I
   ］をコードする塩基配列を有し又は含むＤＮＡ。
4. （４）下記式で示される塩基配列を有し又は含む特許請
   求の範囲第３項記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】〔II〕
5. （５）特許請求の範囲第３又は４項記載の塩基配列の５
   ′末端に開始コドンおよび／又は３′末端に終止コドン
   が結合してなる特許請求の範囲第３又は４項記載のＤＮ
   Ａ。
6. （６）特許請求の範囲第４項記載の塩基配列〔II〕の５
   ′末端に下記の塩基配列が結合してなる特許請求の範囲
   第３項記載のＤＮＡ。 ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧ
7. （７）特許請求の範囲第３〜６項記載のいずれかのＤＮ
   Ａを形質発現ベクターに組み込んでなるベクター。
8. （８）ベクターがｐＨＴＰ３６２である特許請求の範囲
   第７項記載のベクター。
9. （９）特許請求の範囲第７又は８項記ｌのベクターによ
   り形質転換された宿主。
10. （１０）形質転換された宿主が微生物である特許請求の
    範囲第９項記載の宿主。
11. （１１）形質転換された宿主が大腸菌である特許請求の
    範囲第９又は１０項記載の宿主。
12. （１２）特許請求の範囲第９〜１１項記載のいずれかの
    宿主を培養し、培養物を精製することを特徴とする特許
    請求の範囲第１項記載のポリペプチドの製造法。
13. （１３）特許請求の範囲第１又は２項記ｌのポリペプチ
    ド又はその生理的に許容される塩を含有する医薬用組成
    物。