CN116004684B - 一种Sm融合抗原及抗Sm抗体化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及医学检测技术领域,公开了一种Sm融合抗原及抗Sm抗体化学发光检测试剂盒。通过融合蛋白序列设计:人工合成SmB除去脯氨酸富集区的剩余序列+SmD1+SmD2+SmD3最高抗原原性序列的基因,然后克隆至大肠杆菌表达载体,得到重组质粒;将重组质粒转化至感受态细胞进行表达,得到Sm融合抗原。所述抗Sm抗体化学发光检测试剂盒包括包被Sm融合抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体和发光底物。本发明通过改进后的抗原,提高试剂性能:采用重点富集强免疫原性区域的方式,可增强抗体检测的灵敏度;同时通过序列优化,规避与抗RNP抗体的交叉反应,极大程度提高检测特异性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及医学检测技术领域,具体涉及一种Sm融合抗原及抗Sm抗体化学发光检测试剂盒。
背景技术
抗Sm抗体在红斑狼疮患者中的一般流行率为5-30%,是红斑狼疮的一类特异诊断抗体。但其检测特异性根据受测人群的种族、基因差异,以及检测方法学的不同而有所差异。Sm抗原本质上是一类蛋白复合物,其功能是剪切核内的mRNA前体,将其变成成熟的mRNA。Sm这类剪切蛋白复合物主要由9种核心蛋白多肽构成,其中包括SmB/B’,SmN,SmD1,SmD2,SmD3,SmE,SmF及SmG。虽然在Sm抗原蛋白复合物中,B,B’,N,D1,D2,D3,E,F及G这9类核心多肽都可作为抗Sm抗体的靶抗原,但最主要的抗原反应来自于SmB及SmD家族。由于Sm抗原蛋白复合物的多样性,在进行天然Sm抗原蛋白分离纯化时,无法保证所得到复合物中的SmD及SmB肽段含量占据优势比例,因此无法保证检测的高灵敏度。同时,由于Sm抗原在核内多与其他剪切体蛋白行成复合物,纯化所得的天然Sm蛋白多含杂蛋白,纯度较低,进而影响检测的特异性。
SmBB’的靠羧基末端区域所含有一段3次重复序列PPPGMRPP与U1RNP蛋白复合物中亦含有的脯氨酸(PROLINE)富集区的序列结构类似,因此容易与抗RNP抗体产生交叉反应,而抗RNP抗体是诊断混合型结缔组织病(MCTD)的特异性抗体。
在SmD家族中,SmD1的免疫原性最强。抗原表位定位显示,SmD1表位区域大多集中在蛋白羧基端,尤其是一段甘氨酸-精氨酸富集区(83-119aa)。SmD2含有5个线性抗原表位区,分别是1-13aa,30-34aa,74-84aa,83-105aa及111-118aa,其中以87-94aa段显示出最高的抗原原性。SmD3含有4个线性抗原表位区,包括24-37aa,60-68aa,76-106aa及104-126aa,其中以76-106aa所含的一段PMLKSmKN序列具有最强的抗原原性。
专利CN111521777A公开了一种降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法及其试剂盒,通过加入了聚合物颗粒与试剂盒内磁微粒对于检测目标物呈现竞争结合非特异性物质,进而减少磁微粒表面磁珠的非特异性吸附能力,显著地降低了检测试剂盒在自身免疫抗体检测过程中由于非特异性吸附性而造成的假阳概率,减弱了非特异性物质对临床样本测试结果的影响,提高了检测试剂盒的检出率、检测结果的有效性和稳定性。但该专利技术并不能提升相应抗原的免疫原性,无法提升检测灵敏度。
目前检测抗Sm抗体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法,但其存在操作过程繁琐和复杂,容易发生操作差错,检测结果的准确度和精密度较差的缺陷。化学发光免疫分析技术(CLIA)具有自动化程度高、检测速度快、灵敏度高和特异性好的优势。CLIA根据发光分子的不同,可以分为金刚烷体系、鲁米诺体系、异鲁米诺体系、钌联吡啶体系以及吖啶酯体系等。鲁米诺、金刚烷体系由于有酶的参与,易受环境pH值、温度等因素影响;钌联吡啶电化学发光体系对仪器设备的性能要求较高,对清洗条件要求苛刻;异鲁米诺较鲁米诺发光体系发光效率低;吖啶酯化学发光体系与其它化学发光体系比较,具有背景低、标记工艺简单、标记后光量子产率不减少、发光时间短、稳定性好等优点,目前广泛应用于体外诊断技术当中。
专利CN106645711A公开为了一种抗Sm抗体IgG测定试剂盒(化学发光法),所述试剂盒包括:Sm抗原包被的磁微粒、鼠抗人IgG包被的吖啶酯、样本稀释液、测试稀释液、抗Sm抗体IgG校准品、预激发液、激发液。通过利用全自动化学发光免疫分析仪对校准品进行检测,绘制标准曲线,内置于电脑软件,测试实际样本,根据样本发光值计算样本浓度;最后对抗Sm抗体IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。但该专利技术同样不能提升相应抗原的免疫原性,以及无法规避与抗RNP抗体的交叉反应。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种Sm融合抗原的表达方法。本发明的Sm融合蛋白包含SmD1,SmD3及SmB中的高抗原原性区域,同时删除SmB所含的PPPGMRPP重复区域。相较天然Sm抗原,本融合抗原通过重点富集强免疫原性区域,可增强抗体检测的灵敏度;同时通过序列优化,规避与抗RNP抗体的交叉反应,极大程度提高检测特异性。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法得到的Sm融合抗原。
本发明的再一目的在于提供一种含有上述Sm融合抗原的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种Sm融合抗原的表达方法,包括如下步骤:
(1)融合蛋白序列设计:SmB除去脯氨酸富集区的剩余序列SmB-1-190aa+连接序列GGGS+SmD1-83-119aa+连接序列GGGS+SmD2线性表位区域肽段序列SmD2-F+连接序列GGGS+SmD3-76-106aa;
所述SmB-1-190aa序列为:DGRIFIGTFKAFDKHMNLILCDCDEFRKIKPKNAKQPEREEKRVLGLVLLRGENLVSMTVEGPPPKDTGIARVPLAGAAGGPGVGRAAGRGVPAGVPIPQAPAGLAGPVRGVGGPSQQVMTPQGRGTVAAAAVAATASIAGAPTQYPPGRGTPPPPVGRATPPPGIMAPPPGMRPPMGPPIGLPPARGTP(SEQ IDNO:1);
所述SmD1-83-119aa序列为VEPKVKSKKREAVAGRGRGRGRGRGRGRGRGRGGPRR(SEQ IDNO:2);
所述SmD3-76-106aa序列为MLKNAPMLKSMKNKNQGSGAGRGKAAILKAQ(SEQ ID NO:4);
(2)人工合成步骤(1)融合蛋白的基因,然后克隆至大肠杆菌表达载体,得到重组质粒;
(3)将步骤(2)的重组质粒转化至感受态细胞进行Sm融合抗原的表达。
进一步地,步骤(1)中所述SmD2-F序列为含SmD2最高抗原源性肽段KPVNKDR(SEQID NO:3)的序列。
进一步地,步骤(2)中所述大肠杆菌表达载体为pET-28a(+)。
进一步地,步骤(3)中所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
进一步地,步骤(3)中所述重组质粒转化至感受态细胞进行Sm融合抗原的表达的具体步骤如下:
A)取重组质粒加入到BL21(DE3)感受态细胞中混匀,冰上静置10~30min,42℃水浴热激45~90sec后,立即置于冰上冷却2~3min,加入LB培养基,37℃及转速150~200rpm摇菌1~2h,离心弃掉上清液,菌体重悬,用无菌涂布棒均匀涂在含Amp(氨苄西林)的LB平板培养基上,37℃培养箱中倒置培养12~16h;
B)挑取步骤A)转化培养后的单菌落,接种到含Amp的LB培养基中,37℃,150~250rpm震荡培养至对数生长期(OD600=0.4~0.8),加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷),至摇床中于37℃,150~200rpm条件下继续诱导培养3~6h;
C)诱导完成后,离心收集菌体,加入细菌裂解液重悬菌体,超声波裂解直至溶液半透明;离心收集上清液进行纯化,得到Sm融合抗原。
进一步地,步骤C)中所述细菌裂解液成分组成为:50mMTris(三羟甲基氨基甲烷),10%glycerol(甘油),0.1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚),100ug/mLLysozyme(溶菌酶),pH8.0。
一种Sm融合抗原,通过上述方法制备得到。
一种含有上述Sm融合抗原的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,包括包被Sm融合抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体和发光底物。
进一步地,所述发光底物由浓度为0.05~0.25mol/L的NaOH溶液(A液)和浓度为0.05~0.2mol/L的H2O2溶液(B液)组成。
进一步地,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有质量浓度1%~2%的牛血清白蛋白(BSA)和1%~2%聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。
进一步地,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有Sm抗体的阳性混合血清。
进一步地,所述包被Sm融合抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
(1)抗原的生物素标记:将生物素-聚乙二醇-活性酯(Biotin-PEG-NHS)与Sm融合抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的抗原溶液;
(2)将步骤(1)所得生物素标记的抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被Sm融合抗原的磁性微球反应液。
进一步地,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量(Mw)为500~5000;Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1。
进一步地,步骤(2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm;所述生物素标记的抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明的Sm融合蛋白包含SmD1,SmD3及SmB中的高抗原原性区域,同时删除SmB所含的PPPGMRPP重复区域。相较天然Sm抗原,本融合抗原通过重点富集强免疫原性区域,可增强抗体检测的灵敏度;同时通过序列优化,规避与抗RNP抗体的交叉反应,极大程度提高检测特异性。
(2)本发明的试剂盒采用吖啶酯化学发光体系,具有体系简单、激发液成本低,检测灵敏度高、稳定性好的优势,并采用特定的生物素-聚乙二醇-活性酯标记抗原及特定组成的样本稀释液,进一步提高检测准确性、重复性和稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例的检测试剂盒的标准曲线图。
图2为本发明实施例的检测试剂盒的线性范围曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,包括包被Sm融合抗原的磁性微球反应液、吖啶酯标记的羊抗人IgG抗体和发光底物。所述抗Sm抗体化学发光检测试剂盒通过如下方法制备得到:
(1)包被Sm融合抗原的磁性微球反应液的制备:
将生物素-聚乙二醇-活性酯Biotin-PEG4-NHS与Sm融合抗原磷酸盐缓冲溶液混合孵育,Biotin-PEG4-NHS与抗原混合的摩尔比为2:1,孵育、脱盐处理后后得到生物素标记的Sm融合抗原溶液;然后将所得生物素标记的Sm融合抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液(超顺磁性Dynabeads链霉亲和素磁珠,平均粒径为0.5μm)按质量比为1:2混合孵育,洗涤后磁分离,重悬于Tris缓冲液中,得到包被Sm融合抗原的磁性微球反应液。
(2)吖啶酯标记羊抗人IgG抗体的制备:
将吖啶酯(NSP-SA-NHS)与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,纯化后得到吖啶酯标记的羊抗人IgG抗体。
(3)将步骤(1)所得磁性微球反应液、步骤(2)所得吖啶酯标记羊抗人IgG抗体,发光底物A液0.1mol/LNaOH溶液、B液0.1mol/LH2O2溶液,样本稀释液(含有1%wt.BSA和1%wt.聚醚改性聚硅氧烷Tris缓冲液)和Sm抗体的阳性混合血清校准液分别分装至相应试剂瓶中,得到抗Sm抗体化学发光检测试剂盒。
本实施例所述Sm融合抗原通过如下方法制备得到:
1)融合蛋白序列设计:SmB除去脯氨酸富集区的剩余序列(1-190aa:DGRIFIGTFKAFDKHMNLIL CDCDEFRKIK PKNAKQPERE EKRVLGLVLL RGENLVSMTV EGPPPKDTGI ARVPLAGAAGGPGVGRAAGR GVPAGVPIPQ APAGLAGPVR GVGGPSQQVM TPQGRGTVAA AAVAATASIA GAPTQYPPGRGTPPPPVGRA TPPPGIMAPP PGMRPPMGPP IGLPPARGTP)+连接序列(GGGS)+SmD1(83-119aa:VEPKVKSK KREAVAGRGR GRGRGRGRGR GRGRGGPRR)+连接序列(GGGS)+SmD2(上述线性表位区域肽段的一种或多种组合,采用含87-94aa:KPV NKDR最高抗原源性的肽段)+连接序列(GGGS)+SmD3(76-106aa:MLKNA PMLKSMKNKN QGSGAGRGKA AILKAQ)。
2)人工合成上述融合蛋白的基因,然后克隆至pET-28a(+)载体,得到重组质粒(委托基因合成相关公司完成)。
3)将步骤2)的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行Sm融合抗原的表达,具体步骤如下:
A)取重组质粒加入到BL21(DE3)感受态细胞中混匀,冰上静置30min,42℃水浴热激60sec后,立即置于冰上冷却3min,加入LB培养基,37℃及转速180rpm摇菌1h,离心弃掉上清液,菌体重悬,用无菌涂布棒均匀涂在含Amp(氨苄西林)的LB平板培养基上,37℃培养箱中倒置培养12h。
B)挑取步骤A)转化培养后的单菌落,接种到含Amp的LB培养基中,37℃,200rpm震荡培养至对数生长期(OD600=0.6),加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷),至摇床中于37℃,180rpm条件下继续诱导培养4h。
C)诱导完成后,离心收集菌体,加入细菌裂解液(50mM Tris,10%glycerol,0.1%Triton X-100,100ug/mL Lysozyme,pH 8.0)重悬菌体,超声波裂解直至溶液半透明;10000rpm离心5min收集上清液进行柱层析纯化,得到Sm融合抗原。
采用本实施例的检测试剂盒对待测样品进行检测,具体步骤为:
(1)将Sm抗体的阳性混合血清校准液采用样本稀释液稀释至一定浓度梯度,然后分别与试剂盒中的包被Sm融合抗原的磁性微球反应液混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质;然后加入吖啶酯标记羊抗人IgG抗体混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质,再依次加入发光底物A液和B液,测定阳性校准液在不同浓度下的相对发光强度后绘制标准曲线,结果如图1所示。
(2)取待测的人血清样本采用样本稀释液稀释,然后按步骤(1)的方法测试样本的相对发光强度,根据相应抗体标准曲线计算样本中抗体浓度。
一、线性范围:取接近线性范围上限的高值样本用样本稀释液倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列,以测值与预期值拟合线性回归方程,计算线性回归相关系数R。结果见图2。通过标准曲线及线性范围计算检出限为0.11RU/ml。
二、灵敏度、特异性:采用系统性红斑狼疮(SLE)确诊病人血样126例进行检出率比较,结果显示SM检出121例,即灵敏度为96%。检测238例正常对照血样(排除SLE等相关免疫性疾病),235例SM检出阴性,特异性为98.7%。
三、准确度:用试剂盒测定两个不同浓度的质控血清,重复测定3次,分别计算相对偏差(B),相对偏差应不超过±10%,结果见表1。
表1
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
15.1 | 14.8 | 14.9 | 15.0 | 0.67% | -1.33% | -0.67% |
198.5 | 195.4 | 201.2 | 200.0 | -0.75% | -2.30% | 0.60% |
四、重复性:用同一批号试剂盒对两个不同浓度的临床标本或质控血清连续进行10次测定,计算测量值的平均值(M)和标准差(SD),根据式(1)计算其变异系数CV,结果见表2。
CV=SD/M×100%……………………………………………(1)
式中:
CV—变异系数
SD—10次测量结果的标准差
M—10次测量结果的平均值
表2
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 204.71 | 2.82 | 1.38% |
2 | 15.18 | 0.21 | 1.38% |
五、储存稳定性:将试剂放置于2-8℃下,分别于3/6/9/12/15个月测试质控品,并将测定结果与第0月测定结果进行比较,结果见表3。
表3
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 15.0 | 14.8 | 15.1 | 14.9 | 15.2 | 14.9 |
偏差% | -1.33 | 0.67 | -0.67 | 1.33 | -0.67 | |
质控品2(RU/ml) | 200.0 | 198.4 | 196.5 | 201.5 | 199.8 | 202.5 |
偏差% | -0.80 | -1.75 | 0.75 | -0.10 | 1.25 |
对比例1
本对比例与实施例1相比,采用天然分离纯化Sm抗原替代Sm融合抗原,其余相同。
按照实施例1的方法进行检出限、灵敏度及特异性测试,结果显示检出限为3.15RU/ml,系统性红斑狼疮(SLE)病人血清检出率为67%,正常对照血样阴性检出率为86.6%。
按照实施例1的方法进行准确度测试,结果如下表4所示。
表4
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
18.2 | 11.7 | 11.2 | 15.0 | 21.3% | -22.0% | -25.3% |
206.5 | 174.4 | 223.2 | 200.0 | 3.25% | -12.8% | 11.6% |
通过以上结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用本发明的Sm融合抗原相比天然分离纯化Sm抗原,可以显著提高对系统性红斑狼疮(SLE)的检测准确度、特异性和灵敏度。
对比例2
本对比例与实施例1相比,采用Sulfo-NHS-LC-biotin替代Biotin-PEG4-NHS,其余相同。
按照实施例1的方法进行准确度和重复性测试,结果分别如下表5和表6所示。
表5.准确度测试结果
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
16.8 | 13.9 | 14.3 | 15.0 | 12.0% | -7.33% | -4.67% |
175.3 | 176.8 | 224.6 | 200.0 | -12.4% | -11.6% | 12.3% |
通过表5与表1的对比结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测准确度。
表6.重复性测试结果
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 189.32 | 8.98 | 4.74% |
2 | 13.56 | 0.82 | 6.05% |
通过表6与表2的对比结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测重复性。
对比例3
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中采用常规表面活性剂OP-10替代聚醚改性聚硅氧烷(含有1%wt.BSA和1%wt.OP-10的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表7所示。
表7.储存稳定性测试结果
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 15.0 | 14.4 | 14.0 | 13.7 | 13.3 | 13.1 |
偏差% | -4.00 | -6.67 | -8.67 | -11.33 | -12.67 | |
质控品2(RU/ml) | 200.0 | 191.6 | 186.2 | 185.8 | 182.6 | 180.4 |
偏差% | -4.20 | -6.90 | -7.10 | -8.70 | -9.80 |
对比例4
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中不加入表面活性剂(含有1%wt.BSA的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表8所示。
表8.储存稳定性测试结果
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 15.0 | 13.9 | 13.5 | 13.6 | 13.2 | 13.5 |
偏差% | -7.33 | -10.00 | -9.33 | -12.00 | -10.00 | |
质控品2(RU/ml) | 200.0 | 182.7 | 177.5 | 178.4 | 175.6 | 179.0 |
偏差% | -8.65 | -11.25 | -10.8 | -12.2 | -10.5 |
通过表7~8与表3的对比结果可以看出,本发明通过在样本稀释液中加入一定量聚醚改性聚硅氧烷,相比不加入表面活性剂及现有常规表面活性剂,可以显著提高试剂的储存稳定性和检测准确性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Sm融合抗原的表达方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)融合蛋白序列设计:SmB除去脯氨酸富集区的剩余序列SmB-1-190aa+连接序列GGGS+SmD1-83-119aa+连接序列GGGS+SmD2线性表位区域肽段序列SmD2-F+连接序列GGGS+SmD3-76-106aa;
所述SmB-1-190aa序列为:dgrifigtfkafdkhmnlilcdcdefrkikpknakqpereekrvlglvllrgenlvsmtvegpppkdtgiarvplagaaggpgvgraagrgvpagvpipqapaglagpvrgvggpsqqvmtpqgrgtvaaaavaatasiagaptqyppgrgtppppvgratpppgimapppgmrppmgppiglppargtp(SEQ ID NO:1);
所述SmD1-83-119aa序列为vepkvkskkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr(SEQ ID NO:2);
所述SmD2-F序列为kpvnkdr(SEQ ID NO:3);
所述SmD3-76-106aa序列为mlknapmlksmknknqgsgagrgkaailkaq(SEQ ID NO:4);
(2)人工合成步骤(1)融合蛋白的基因,然后克隆至大肠杆菌表达载体,得到重组质粒;
(3)将步骤(2)的重组质粒转化至感受态细胞进行Sm融合抗原的表达。
2.根据权利要求1所述的一种Sm融合抗原的表达方法,其特征在于,步骤(2)中所述大肠杆菌表达载体为pET-28a (+);步骤(3)中所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;所述重组质粒转化至感受态细胞进行Sm融合抗原的表达的具体步骤如下:
A)取重组质粒加入到BL21(DE3)感受态细胞中混匀,冰上静置10~30 min,42℃水浴热激45~90 sec后,立即置于冰上冷却2~3 min,加入LB培养基,37℃及转速150~200 rpm摇菌1~2h,离心弃掉上清液,菌体重悬,用无菌涂布棒均匀涂在含Amp的LB平板培养基上,37℃培养箱中倒置培养12~16 h;
B)挑取步骤A)转化培养后的单菌落,接种到含Amp的LB培养基中,37℃,150~250rpm 震荡培养至对数生长期,加入终浓度为1mM的IPTG,至摇床中于37℃,150~200 rpm条件下继续诱导培养3~6h;
C)诱导完成后,离心收集菌体,加入细菌裂解液重悬菌体,超声波裂解直至溶液半透明;离心收集上清液进行纯化,得到Sm融合抗原。
3.一种Sm融合抗原,其特征在于,通过权利要求1或2所述的方法制备得到。
4.一种含有权利要求3所述Sm融合抗原的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,包括包被Sm融合抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体和发光底物。
5.根据权利要求4所述的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述发光底物由浓度为0.05~0.25mol/L的NaOH溶液和浓度为0.05~0.2mol/L的H2O2溶液组成。
6.根据权利要求4所述的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有质量浓度1%~2%的BSA和1%~2%聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。
7.根据权利要求4所述的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有Sm抗体的阳性混合血清。
8.根据权利要求4所述的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述包被Sm融合抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
(1)抗原的生物素标记:将Biotin-PEG-NHS与Sm融合抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的抗原溶液;
(2)将步骤(1)所得生物素标记的抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被Sm融合抗原的磁性微球反应液。
9.根据权利要求8所述的抗Sm抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量Mw为500~5000;Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1;步骤(2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm;所述生物素标记的抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
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-
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Title |
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Smith抗原的性质特征及临床意义;吴文冰等;《医学研究生学报》;第20卷(第1期);第90-93页全文 * |
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