CN115656154A - 一种基于重组rnp多抗原的抗rnp抗体化学发光检测试剂盒 - Google Patents
一种基于重组rnp多抗原的抗rnp抗体化学发光检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程及医学检测技术领域,公开了一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒。所述试剂盒包括包被RNP‑A、RNP‑C和RNP‑68/70抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述RNP‑A,RNP‑C和RNP‑68/70抗原通过人胚肾上皮细胞HEK293表达获得。所述包被抗原的磁性微球反应液通过生物素标记的混合抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育得到。本发明采用RNP‑A、RNP‑C和RNP‑68/70三个抗原的混合物进行生物素标记后,与链霉亲和素磁珠交联,并结合吖啶酯化学发光体系,可以提高检出的特异性、准确性和敏感性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及医学检测技术领域,具体涉及一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒。
背景技术
RNP又称为snRNP、nRNP或U1RNP,是细胞核内的一类核小核糖核蛋白复合物,在核内多于mRNA前体及其他蛋白质,如Sm蛋白,一同结合形成一种大型RNA-蛋白质分子复合物,又称剪切体,主要作用于mRNA前体的剪切。
抗RNP抗体多见于红斑狼疮病人及混合型结缔组织病病人血清中。两类疾病的临床特征很相似,唯一不同是相比红斑狼疮病人,混合型结缔组织病一般不会造成肾脏损害。而区分诊断红斑狼疮SLE与混合型结缔组织病MCTD的关键,在于MCTD病人血清中含有高水平的抗RNP抗体,但没有抗Sm抗体或抗dsDNA抗体等典型红斑狼疮特异性抗体的存在。单独的抗RNP抗体阳性是MCTD的高特异性诊断指标,特异性接近100%。但由于体内RNP抗原与Sm抗原以大型剪切体的复合物形式存在,因此所分离纯化的天然RNP抗原多伴随Sm抗原的存在,或称RNP/Sm,这极大程度影响了自身抗体检测的特异性,亦对临床诊断判定造成困扰。
如专利CN104459100A公开了一种抗Sm-RNP抗体试剂盒,所述试剂盒包括用于表达抗Sm-RNP抗体的细胞载体、阴性对照血清、阳性对照血清、酶底物、浓缩样本稀释液,所述阳性对照血清为病人的阳性对照血清筛选后的对照血清。该发明通过对所采集的阳性对照血清进行筛选,取分布比较密集的数值区域的阳性对照血清作为抗Sm-RNP抗体试剂盒中的阳性对照血清,克服了现有试剂盒在检测人血清中抗Sm-RNP抗体的含量时,因每个批次的阳性对照抗体不稳定而导致结果不稳定的问题。专利CN102360033A公开了一种基于流式微球载体技术的Sm-RNP抗体检验试剂盒及其制备和检测方法,具体包括用Sm-RNP重组抗原包被高聚分子微球,用牛血清白蛋白封闭空白结合点,制成准确性Sm-RNP抗体探针-高聚分子微球;与待测标本共培养捕获Sm-RNP抗体,洗涤离心除去未结合的Sm-RNP抗体,再加入荧光标记的抗人IgG抗体;使用流式细胞仪检测微球的荧光强度,对待测抗体进行定性以及灵敏度和特异度分析。该方法具有灵敏度高、准确性强、稳定性好的优点,并可对标本进行微量分析。专利CN103105489A公开了一种检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其制备方法。在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有:分别由dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10种中的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条以上平行的检测线,1条高浓度质控带,1条中浓度质控带,及1条低浓度质控带。克服单一自身抗体检测灵敏度和准确性不足、数种疾病相关自身抗体逐一单独检测在操作上的繁琐,大大提高检测效率和结果判断的准确度。
上述方法虽然公开了通过酶联免疫或化学发光法对抗Sm-RNP抗体进行检测,但无法实现对单独的抗RNP抗体的准确性检测。
随着基因和蛋白工程技术的发展,通过不同的蛋白表达系统,可表达纯化得到特定的高纯度重组抗原蛋白。但现有的重组自身抗原,多来源于原核表达系统,由于二硫键形成体系和翻译后修饰体系在此表达系统中的缺失,所产生的重组抗原构像多与人体内的天然抗原构像有所差异,大大影响对自身抗体的准确性识别,进而造成诊断的敏感度与准确性降低。在我们前期的专利CN110346576A中,公开了利用HEK293细胞表达获得组蛋白、核糖体P0蛋白、PCNA、SmD1、SmD3、SmB/B’、snRNP-A、snRNP-C、snRNP68/70、SSA/Ro60、SSA/Ro52、SSB/La、Jo-1、PL-7、PL-12、PmScl、Scl-70、CENP-A、CENP-B、RA33以及PR3。该专利主要通过重组抗原蛋白的表达,用于制备适用于免疫印迹法的抗原固定化基质膜。
化学发光免疫分析技术(CLIA)具有自动化程度高、检测速度快、灵敏度高和准确性好的优势。其中吖啶酯化学发光体系与其它化学发光体系比较,具有背景低、标记工艺简单、标记后光量子产率不减少、发光时间短、稳定性好等优点。因此,对于如何获得一种适用于CLIA且准确性灵敏性高的抗RNP抗体检测试剂盒,是本领域技术人员面临的一项新挑战。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处,本发明的目的在于提一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒。
本发明利用人胚肾上皮细胞系HEK293细胞系统分别表达了抗原原性最强的3个RNP抗原家族成员,RNP-A、RNP-C和RNP-68/70,使用三个抗原的混合物进行生物素标记后,与链霉亲和素磁珠交联,并结合吖啶酯化学发光体系,可以提高检出的特异性、准确性和敏感性。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,包括包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原通过人胚肾上皮细胞HEK293表达获得。
进一步地,所述RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原通过如下方法获得:
(1)人工合成RNP-A(GeneID6627)、RNP-C(GeneID6631)和RNP-68/70(GeneID6625)的基因序列,然后分别克隆至pcDNA3.1(+)载体,得到重组质粒;
(2)将步骤(1)所得重组质粒分别转化至HEK293细胞进行表达,得到RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原。
进一步优选地,步骤(2)中所述转化至HEK293细胞进行表达的步骤如下:
通过氨苄霉素对有抗性的阳性重组质粒进行筛选,并从阳性菌株中提取阳性质粒DNA,再使用转染试剂JET-PEI介导阳性质粒转染至HEK293细胞,并使用含有G418抗生素的培养基培养,将培养细胞裂解后采用柱层析纯化,得到RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原。
进一步地,所述包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
1)抗原的生物素标记:将生物素-聚乙二醇-活性酯(Biotin-PEG-NHS)与RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的混合抗原溶液;
2)将步骤1)所得生物素标记的混合抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液。
进一步地,步骤1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量(Mw)为500~5000。
进一步地,步骤1)中所述RNP-A、RNP-C和RNP-68/70的摩尔比为1~2:1~2:1~2;所述Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1。
进一步地,步骤2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm。
进一步地,步骤2)中所述生物素标记的混合抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
进一步地,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体是指吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体。其通过如下方法制备得到:
将吖啶酯或吖啶磺酰胺与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,得到吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体。
进一步地,所述发光底物由NaOH溶液(A液)和H2O2溶液(B液)组成。优选地,所述NaOH溶液的浓度为0.05~0.25mol/L,所述H2O2溶液的浓度为0.05~0.2mol/L。
进一步地,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白(BSA)和聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。
进一步优选地,所述样本稀释液中BSA的质量浓度为1%~2%;所述聚醚改性聚硅氧烷的质量浓度为1%~2%。
进一步地,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有抗RNP抗体的阳性混合血清。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明利用人胚肾上皮细胞系HEK293细胞系统分别表达了抗原原性最强的3个RNP抗原家族成员,RNP-A、RNP-C和RNP-68/70,使用三个抗原的混合物进行生物素标记后,与链霉亲和素磁珠交联,并结合吖啶酯化学发光体系,可以提高检出的特异性、准确性和敏感性。
(2)本发明的抗核抗体谱检测试剂盒采用吖啶酯化学发光体系,具有体系简单、激发液成本低,检测灵敏度高、稳定性好的优势。
(3)本发明采用特定的生物素-聚乙二醇-活性酯标记抗原,相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,在本发明的检测体系中可以显著提高检测准确度、灵敏度和重复性。
(4)本发明通过在样本稀释液中加入一定量聚醚改性聚硅氧烷,相比现有常规表面活性剂,具有一定的降黏和消泡效果,在本发明的检测体系中经验证可以显著提高检测稳定性和检测准确度。
附图说明
图1为本发明实施例的检测试剂盒的标准曲线图。
图2为本发明实施例的检测试剂盒的线性范围曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,通过如下方法制备得到:
(1)RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原制备:
委托生物公司人工合成RNP-A(GeneID6627)、RNP-C(GeneID6631)和RNP-68/70(GeneID6625)的基因序列,然后分别克隆至pcDNA3.1(+)载体,得到重组质粒;通过氨苄霉素(终浓度0.1mg/ml)对有抗性的阳性重组质粒进行筛选,并从阳性菌株中提取阳性质粒DNA,再使用转染试剂JET-PEI介导阳性质粒转染至HEK293细胞,并使用含有G418抗生素的培养基(10%FBS,1%PSF)培养,将培养细胞裂解后采用柱层析纯化,得到RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原,经SDS-PAGE鉴定,单个重组抗原纯度可达90%以上。
(2)包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液的制备:
将生物素-聚乙二醇-活性酯Biotin-PEG4-NHS与RNP-A、RNP-C和RNP-68/70混合抗原磷酸盐缓冲溶液混合孵育,其中RNP-A、RNP-C和RNP-68/70的摩尔比为1:1:2,Biotin-PEG4-NHS与混合抗原的摩尔比为2:1,纯化后得到生物素标记的混合抗原溶液;然后将所得生物素标记的混合抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液(超顺磁性Dynabeads链霉亲和素磁珠,平均粒径为0.5μm)按质量比为1:2混合孵育,洗涤后磁分离,重悬于Tris缓冲液中,得到包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液。
(3)吖啶酯标记羊抗人IgG抗体的制备:
将吖啶酯(NSP-SA-NHS)与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,纯化后得到吖啶酯标记的羊抗人IgG抗体。
(4)将步骤(2)所得磁性微球反应液、步骤(3)所得吖啶酯标记羊抗人IgG抗体,发光底物A液0.1mol/LNaOH溶液、B液0.1mol/LH2O2溶液,样本稀释液(含有1%wt.BSA和1%wt.聚醚改性聚硅氧烷Tris缓冲液)和抗RNP抗体的阳性混合血清校准液分别置于试剂盘的微孔中封装,得到抗RNP抗体化学发光检测试剂盒。
采用本实施例的检测试剂盒对待测样品进行检测,具体步骤为:
(1)将RNP抗体的阳性混合血清校准液采用样本稀释液稀释至一定浓度梯度,然后分别与试剂盒中的包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70混合抗原的磁性微球反应液混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质;然后加入吖啶酯标记羊抗人IgG抗体混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质,再依次加入发光底物A液和B液,测定阳性校准液在不同浓度下的相对发光强度后绘制标准曲线。
(2)取待测的人血清样本采用样本稀释液稀释,然后按步骤(1)的方法测试样本的相对发光强度,根据相应抗体标准曲线计算样本中抗体浓度。
一、标准曲线、线性范围及检出限:本实施例的检测试剂盒的标准曲线如图1所示。取接近线性范围上限的高值样本用样本稀释液倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列,以测值与预期值拟合线性回归方程,计算线性回归相关系数R,结果见图2。通过标准曲线及线性范围计算检出限为0.16RU/ml。
二、灵敏度、特异性:采用混合型结缔组织病人血样进行相关免疫性疾病的检出率比较,结果显示检出率为98%;检测正常对照血样(排除MCTD相关免疫性疾病),阴性检出率为100%。说明本发明检测试剂盒具有良好的灵敏度和特异性。
三、准确度:用试剂盒测定两个不同浓度的质控血清,重复测定3次,分别计算相对偏差(B),相对偏差应不超过±10%,结果见表1。
表1
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
14.9 | 15.4 | 15.3 | 15.0 | -0.67% | 2.67% | 2.00% |
198.4 | 205.4 | 203.7 | 200.0 | -0.80% | 2.70% | 1.85% |
四、重复性:用同一批号试剂盒对两个不同浓度的临床标本或质控血清连续进行10次测定,计算测量值的平均值(M)和标准差(SD),根据式(1)计算其变异系数CV,结果见表2。
CV=SD/M×100%……………………………………………(1)
式中:
CV—变异系数
SD—10次测量结果的标准差
M—10次测量结果的平均值
表2
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 226.82 | 0.37 | 0.16% |
2 | 14.68 | 0.27 | 1.84% |
五、储存稳定性:将试剂放置于2-8℃下,分别于3/6/9/12/15个月测试质控品,并将测定结果与上次测定结果进行比较,结果见表3。
表3
对比例1
本对比例与实施例1相比,采用天然分离纯化RNP/Sm抗原替代RNP-A、RNP-C和RNP-68/70混合抗原,其余相同。
按照实施例1的方法进行检出限、灵敏度及特异性测试,结果显示检出限为2.78RU/ml,MCTD病人血清检出率为63%,正常对照血样阴性检出率为85.0%。
按照实施例1的方法进行准确度测试,结果如下表4所示。
表4
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
10.7 | 10.4 | 10.7 | 15.0 | -28.7% | -30.7% | -28.7% |
167.2 | 167.5 | 166.7 | 200.0 | -16.4% | -16.3% | -16.7% |
通过以上结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用本发明的RNP-A、RNP-C和RNP-68/70混合抗原相比RNP/Sm抗原,可以显著提高对混合型结缔组织病的检测灵敏度、特异性和准确度。
对比例2
本对比例与实施例1相比,采用Sulfo-NHS-LC-biotin替代Biotin-PEG4-NHS,其余相同。
按照实施例1的方法进行准确度和重复性测试,结果分别如下表5和表6所示。
表5.准确度测试结果
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
13.2 | 16.6 | 13.5 | 15.0 | -12.0% | 10.7% | -10.0% |
170.2 | 178.0 | 225.1 | 200.0 | -14.9% | -11.0% | 12.6% |
通过表5与表1的对比结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测准确度。
表6.重复性测试结果
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 213.56 | 10.90 | 5.10% |
2 | 13.15 | 0.77 | 5.86% |
通过表6与表2的对比结果可以看出,在本发明的检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测重复性。
对比例3
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中采用常规表面活性剂OP-10替代聚醚改性聚硅氧烷(含有1%wt.BSA和1%wt.OP-10的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表7所示。
表7.储存稳定性测试结果
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 15.0 | 14.3 | 15.6 | 13.7 | 13.5 | 14.2 |
偏差% | -4.67 | 9.09 | -12.18 | -1.46 | 5.19 | |
质控品2(RU/ml) | 200.0 | 206.3 | 211.6 | 189.5 | 182.6 | 178.8 |
偏差% | 3.15 | 2.57 | -10.44 | -3.64 | -2.08 |
对比例4
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中不加入表面活性剂(含有1%wt.BSA的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表8所示。
表8.储存稳定性测试结果
通过表7~8与表3的对比结果可以看出,本发明通过在样本稀释液中加入一定量聚醚改性聚硅氧烷,相比不加入表面活性剂及现有常规表面活性剂,可以显著提高试剂的储存稳定性和检测准确性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,包括包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述RNP-A,RNP-C和RNP-68/70抗原通过人胚肾上皮细胞HEK293表达获得。
2.根据权利要求1所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原通过如下方法获得:
(1)人工合成RNP-A、RNP-C和RNP-68/70的基因序列,然后分别克隆至pcDNA3.1(+)载体,得到重组质粒;
(2)将步骤(1)所得重组质粒分别转化至HEK293细胞进行表达,得到RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原。
3.根据权利要求2所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,步骤(2)中所述转化至HEK293细胞进行表达的步骤如下:
通过氨苄霉素对有抗性的阳性重组质粒进行筛选,并从阳性菌株中提取阳性质粒DNA,再使用转染试剂JET-PEI介导阳性质粒转染至HEK293细胞,并使用含有G418抗生素的培养基培养,将培养细胞裂解后采用柱层析纯化,得到RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原。
4.根据权利要求3所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
1)抗原的生物素标记:将Biotin-PEG-NHS与RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的混合抗原溶液;
2)将步骤1)所得生物素标记的混合抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被RNP-A、RNP-C和RNP-68/70抗原的磁性微球反应液。
5.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,步骤1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量Mw为500~5000;所述RNP-A、RNP-C和RNP-68/70的摩尔比为1~2:1~2:1~2;所述Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1。
6.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,步骤2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm;所述生物素标记的混合抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
7.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体是指吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体。其通过如下方法制备得到:
将吖啶酯或吖啶磺酰胺与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,得到吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体。
8.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述发光底物由NaOH溶液和H2O2溶液组成;所述NaOH溶液的浓度为0.05~0.25mol/L,所述H2O2溶液的浓度为0.05~0.2mol/L。
9.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有BSA和聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液;所述样本稀释液中BSA的质量浓度为1%~2%;所述聚醚改性聚硅氧烷的质量浓度为1%~2%。
10.根据权利要求4所述的一种基于重组RNP多抗原的抗RNP抗体化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有抗RNP抗体的阳性混合血清。
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