JPS59501714A - 広いスペクトルのインフルエンザ抗血清 - Google Patents
広いスペクトルのインフルエンザ抗血清Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
広いスペクトルのインフルエンザ抗血清関連出願の相互参照
本願は、19g、2年g月23日に出願された、なお未決で係属中の出願連続番
号第11io、q−ss 号の一部継続本発明は免疫化学に関し、さらに詳しく
は免疫学的試薬及びインフルエンザウィルスに関する反応に関する。
背景技術
インフルエンザは、徹底した予防接種計画にも拘らず、大きな流行病として広く
世界に残っている。ウェブスタ主ヱJ 7969〜77711119g2+。今
日まで、こうした試みのワクチンのために、にひこっている特定のインフルエン
ザ菌株に対して抗体反応を誘発すべくあらゆるウィルスが抗原として利用Inて
きた。ティレルこれら従来のワクチンには、ウィルスが発育卵で生産されるため
に特徴が乏しい、不均一であるその他いくつかの不利な点かあシ、また重大な副
作用を引き起すことがある。最も重要なこととして、遺伝的組換えにより生じ得
るインフルエンザ菌株の広いスペクトルに対して有効であるために必要な一般性
を欠くという欠点を有する。
これらの問題を取除く良く特定された( well def+nedlワクチン
がめられている。ミュラー(Miilerl外によるより最近の研究で、ペプチ
ドを免疫原として利用する研究が報告されている、Proc、Natl、Aca
d、Sci、LISA X=υ巻S乙ヲ〜Sり3(19g−年/月)。この研究
では、A型(H3I’12:lインフルエンザウィルスの赤血球に凝集素IHA
1分子のHA、サブユニット(アミン末端サブユニット)の位置q/−10g
に対応する合成ペプチドを利用して免疫原が調製された。ミュラーらは、これら
ペプチドで免疫することにより得られた血清とともに低レベル中和活性を得るこ
とができた。さらに、ジャクノア (Jackson )外、Virology
、/ 20X2り3〜コフ乙(19g、りは、アミノ酸残基の配列がX−31
(+3N、2 +菌株のHA、の位置1.23〜./S/に対応する合成ペプチ
ドを使用してその免疫原であるペプチドを認識する抗体を生じさせたが、ウィル
スそのものには結合しなかったようである。
製された抗血清を利用する中和(neutral’1zation ) と防護
(pretection l の研究を示し、さらに標準的なすべてのウィルス
のインフルエンザワクチン及び免疫化学的方法例代わるよシ効率的でより特徴が
はっきりしたペプチド、抗血清及び方法を説明し、特許を請求するものである。
予防接種の中和化反応の主な標的は、ウィルスの主要な表面糖タン、バク質であ
る赤血球凝集素(hemagglut 1nin 1分子である。ダウドル(D
owdlel外、J、Virol、星、λ6ツ〜λりS(/9’711)。この
赤血球凝集素は前駆体分子(HA )としてインビボで合成された後、タンパク
質加水分解によりλつのサブユニソ)HA、とHA2に分裂される。分裂はウィ
ルスが感染性となるのに必要である。クレンク(に1enkツタf、J、Vir
ol、、乙7.11.2乙〜グ39頁(/q73)及びラザログイノツ(Laz
arowitz )外、Virology X6 g、qtio−tisq−(
/975)。
インフルエンザのいくつかの流行性菌株のHA遺伝子の配列が説明され、これら
遺伝子間には急速な遺伝的変化が起ることが示されている。ラーバー(Lave
r i外、Nature X2 g 3、’13’l−’l5)(/)go);
ウニ3り3〜37g I/9g/ + ;ゲシング(Gething)外、N
ature ’、/ g 7.3フ3−3’7g (/9gl )。これらの突
然変異的変化はHAの抗原構造の変化としてもたらされ、先の免疫による防護か
らそのウィルスが逃亡するのを許し、次いで新しい流行性菌株を発生させる。さ
らに、前の流行病とは血清学的に異なるウィルスが恐らくヒト以外の宿主から集
団へ時折再入するが、こnらが以前、X −’I フインフルエンザウイルスH
A ()−13N、2]CMin□−Jou 、 Ce1l、/ヲ、6g3−乙
9 t、 w9g、(B〕の実質的にすべての部分に相幽する合成ペプチドが実
験動物で免疫応答を引き出し得ることが実証された。グリ、。
多くの場合°同種の(homologousl精製赤血球凝集素分子この結果は
、HA、 とHA2の両方のサブユニットを表わす合成ペプチドに対する抗血清
には、x−ダフインフルエンザウイルスの複製を中和することができ、より重要
なことにそのウィルスにより引起きれる病気から動物宿主を防護できるものがあ
ることを示している。さらに、これらの結果は、このインフルエンザウィルスの
合成ペプチド炉似体に対する血清には、異なる赤血球凝集素のサブタイプのウィ
ルス感染を中和できるもqがあるx−117(+−+3N、21インフルエンザ
ウイルスの赤血球凝集素の実質的全部分を表わす合成ペプチドに対して作られた
抗体CMin −Jou 、Ce1l 、 / 9.6g3〜乙ヲろ(77g0
)〕のイイントロでウィルス感染全中和する能力を試験した。ペプチド免疫原の
いくつかが、F[のウィルス・と、より重要なことにはプロトタイプ(原型)H
3ウィルスから最も分散した( divergent 1インフルエンザAサブ
タイプであるとわかっているH1サブタイプの数菌株との両方を効果的に中和す
る抗体反応を誘発した。ウェブスター外、Nature X7!qb、//S−
’12/ (/9g、2+。抗血清の組合せを用いる中和は相乗的ではなくて、
むしろ成分血清の力価の単純な和であった。ざらに、本発明のペプチドをワクチ
ンに用いると、インフルエンザウィルスに感染した動物を防護することになる。
中和応答をもたらすこれらの合成免疫原はλつの一般的な種類に分かれた。(ハ
本来9分子におけるジスルフィド橋の一部である/スティン残基金倉むもの;(
2前駆体赤血球凝集素の分裂部位が成熟した(そして機能的な)サブユニット形
態と隣接し又は該形態まで延びているもの。
ペプチド免疫原を選択する際の根拠はその配列の一部が分子表面で露出していな
ければならないことだけであるが、合成抗原を可能性のある用途であるワクチン
として計画するときは他の判断基準を考慮すべきである。すなわち、(ハ機能的
に活性な標的分子の部分(vegions ]に特別の注意を払うべきこと:及
び(2ペプチドはこの゛研究で用いたものよりかな9短かくてもよく、システィ
ン残基の回りで対称性がよシ高い方がよいことである。さらに、多価合成抗原は
より効果的な中和力価を生ずるはずである。これらの結果は、これらの抗原がイ
ンフルエンザに対して安全で一般化したワクチンを製造するのに使用できること
を示している。
私達は、ある種のペプチド、特に合成ペプチド(成分質と比較して、2種以上の
インフルエンザウィルス菌株を中和する抗体産生を誘発できることも見出し、中
和はインフルエンザの防護及び治療に有用な手段であると考エタ。本発明のペプ
チドの各々の分子量は完全な赤血球凝集素分子の分子量より小さく、典型的には
約g〜約ダ0個のアミノ酸残基の長さである。最も有効と分かつれ具体的な合成
ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の部分(po
vtions ] に対応するアミノ酸残基配列である。これらのペプチドは次
のアミノ酸残基配列式(左から右へ、アミ/末端からカルボキン末端への方向)
により特定される。
(al SIMR3DAPIGTC3SEC’1TPNGSIPNDにPFQN
VNKITY’ ;(bl RGIFGAIAGFIENGWEGMIDGW’
/GFRHQNC:及び(cl EKQTRGIFGAC。
後述するように、上の(blや(clのような合成ペプチドのいくつかは、アミ
ノ−又はカルボキシ末端のいずれかに造された。これら追加のアミノ酸残基の存
在は本発明にとり必要ではなく、シたがって、これらは本発明のアミノ酸残基配
列から省略してもよい。
アミノ酸残基配列がHA、分子の位置30乙−330(カルボキシ末端)に対応
する別の合成ペプチドは、(a)■細胞の増殖を刺激する1、(bl X −4
7以外のインフルエンザ菌株と相互反応(、cross −react lする
抗体の産生を誘発する、そしてfclワクチ/に用いた時に生きたウィルスによ
る攻撃から動物を防護することもわかった。こノヘフチドのアミノ酸残基配列(
左から右へ、アミン末端からカルボキン末端への方向)を下式に示す。
(dl CPKYVKQNTLにLATGMRNVPEKQTR別のペプチドも
菌株X−+7に対する中和抗体だけでなく、他のインフルエンザ菌株と相互反応
しある程度中和する抗体の産生をも誘発する。このペプチドのアミノ酸残基配列
(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向で)を下式(e)に示す。
(el CNNPHRIL 。
中和特性をもつλつの環状又はオリゴマーのペプチドも製造した。これらのペプ
チドは、アミン末端及びカルボキン末端にある両方のシスティン残基の酸化され
たメルカプト部位を介して環化又は低重合体化された状態にある。これらペプチ
ドのアミノ酸残基配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)を
、未酸化状態(gl CにRGPDSGFFSRLNvVLYKSGSC。
本発明は、組成物として、合成されたあるいはタンパク質から分離された上に特
定したペプチド類又はその−も使用できる。合成ペプチドが好ましい。また、本
発明は、上記特定したペプチドを含有する7種又はコ種以上のペプチドの生物へ
の攻撃から生ずる抗血清、並びに上記ペプチド(単独又は組合せ)に対する抗体
が免疫学的活性剤である組成物ても関する。本発明はさらに、これら組成物の製
法、及びこれらの組成物の免疫学的診断又は治療における使用にも関する。例え
ば、本発明は、−面において、通常の接種(1nnoculation ) 、
摂取又は吸収接種(vaccination )に使用するワクチンであって、
免疫された宿主内に誘発された免疫学的活性剤が上に特定したペプチドに対する
7種又は2種以上−の抗体千あるものに関する。
図/ば、ヌクレオチド配列から誘導されたX−4t7HA分子のアミノ酸残基配
列を示す;
図2は、マデイノーダービイ(Madin−Darby l 犬の腎臓I MD
CK l 上皮細胞上のX−’%フインフルエンザウィルスのマイクロタイトレ
ー/ヨ/の結果を示す;図3は、抗ペプチド抗血清の組合せによるX−1l−7
の中和を示す。
最良の態 のミロ
個々のアミノ酸残基の完全な名称が、本明細書では周知の3文字略語と同様時折
使用される。アミノ酸残基の/文字記号が最もよく使用される。下の対応表に、
完全な名称並びに略語と各アミノ酸残基のために本明細書で命名した記号を示す
。
アスパラギン Asn、 N
アスパラギン酸 Asp D
アスパラギン又はアスパラギン酸Asx Bグルタミン酸 Glu E
グルタミン又はグルタミン酸 Glx Zメチオニン Met M
フェニルアラニン Phe F
プロリン Pro P
セリン 5erS
図1を参照すると、X−4’7HA分子のアミノ酸残基配列CMin Jou外
\、Ce1l\ /9.Ag3Ag3−496(iq〕が示されている。HAl
全体とHA 2のアミン末端が示されている。配列の下の線は合成さn免疫に使
用されるペプチドを表す。これらの線の端にaるC又はYは、初めの配列には見
出せないンステイン又はチロシンの追加を表す。ジスルフィド結合はC−口と示
されている。非結合(free l と示した場合以外は、に記載のようにキー
ホール・す/ベント・ヘモシアニン(にLM)に結合させたペプチドに対してウ
サギで抗血清を調製した。合成ペプチド及びこれ5を含むワクチンもグリーン外
(止揚文献)により述べられているよ゛うに調製した。彼らの開示文献−を参照
によりここに含める。
A、中和検定
多数の抗ペプチド抗血清の試験を行うために、私達は・通常のプラーク検定に必
要な時間よりも短時間で行うことができる、インフルエンザウィルス用高速定量
インビトロ検定法を開発した。キルボーン、FundamentalSalzw
an lN、p、 l / IIろ一1bo頁(アカデミツク・プレス、ニュー
ヨーク、1969)。70回のウィルス力価測定、即ちgO回の血清中和と同数
のものを半日で行うことができる。さらに、日ごとに生じる可能性のある多数の
実験変数を除くことができる、というのは多くのウィルス又は血清を一日で力価
測定できるからである。
この検定は再現性があり、終点はウィルスの初めの接種物に比例する。
図λに示すテークは次のようにして得られた。マデインーダービー(Madin
−Darby l犬腎臓tMO,cKl上皮細胞上のX−+フインフルエンザ
ウイルスのマイクロタイトレーショ/。MDCK細胞を、/θチウン胎胎児血清
;ユニ/リン700単位/rnl)、ストレフトマインン(100jj/rrt
)、qミリモルのし一グルタミン、769モルのピルビン酸ナトリウヱ、θ07
.S%のリン酸トリプトース(friptose )ブイヨンI Difco社
)及び65%グルコースを補った最小イータlレス(Eagles )培地(M
EGに)で培養した。培地中でのトリプシン化と洗浄に続いて、細胞を増殖培地
中で最終濃度106細胞/−まで浮遊させた。50μl の培地をさらに入れで
ある96穴平底マイクロタイタープレート(Falcon )の各穴に、SOμ
tの浮遊液を加えた。プレートを37℃で一夜保温し、翌日にウィルス又は血清
のいずれかの力価測定を行うために細胞が結合するようにしh09A穴マイクロ
タイタープレートで50μt 2倍段階希釈することにより、抗生物質を含有す
るMEMf希釈培地)中でウィルスを力価測定した。さらにSOμt の希釈培
地を各穴に入れ、プレートを37℃で60分間保温した(模擬中和)。?A穴プ
レートでMDCK細胞の単層を覆っている培地を吸い取り、細胞を100μl
の希釈培地で洗浄した。
力価測定したウィルスを次に、洗浄したMDCに細胞を含むプレートの対応する
穴に移した。ウィルスを37℃でAθ分間吸収させた後、ウィルスを除き、細胞
を100μlの希釈培地で洗浄した。次いでこの細胞に、抗生物質、o、oos
%DEAE−デキストランf Pharmacia社)、λミリモルL−グルタ
ミン、θ05チウン胎児血清及びλμg/−のトリプシン(タイプ■、2x晶出
、’3 i gma社)を含有する基礎培地(Eag、le社)からなるかぶせ
培地(over lay medium )をがぶせた〇これらの細胞をダg時
間保温した。この時間で、顕微鏡により細胞変性効果(CPE)が認められた。
その後、20%エタノールに溶かした07%結晶バイオレット(crystal
violet ) で染色し、次いで極〈少量の水中でリンスした。各ウィル
スをスクリーニングした後に最後の希釈を行ってダg時間でMDCに単層を完全
溶゛解(completelysis ) L、この希釈液を後の抗体中和試験
で使用した。
図、2Aは、Xl’?ウィルスの力価測定の7日及び2日(2グ時間及びl1g
時間)の終点を示す。CPEの終l3
点は肉眼できわめて容易に評価できる。このプレートはマイクロタイタープレー
トリーダーで機械的に読むことができ、その結果は図2Bに示すようにグラフと
してプロットされる。2日検定を選択した。その理由は、抗ペプチド抗血清の中
和強度の試験において、9g時間で完全なCPEに必要なウィルス接種物が全体
に最も良好な感度をもたらすことがわかったからである。
図2Bは、’192nmフィルターを備えたTitertekMultiska
n装置で読んた後に図2Aの染色されたプレートをグラフ表示したものを示す。
CPEの程度は、ウィルスを受入れていない対照穴tC+のパーセントとして表
す。X−&?ウィルスに対するCPE終点の希釈は、2q時間及びダざ時間に対
してそれぞれl:S及び/:、300である。
この検定は、Madin −Darby犬腎臓上皮(MD(、に)細胞の単層に
対するインフルエンザウィルスの細胞変性効果(CPEIに基づいている。ゴー
シュ(Gaush l外、Apl)l ied Mi℃robiology s
/ 6.3gg−5q/%(/9Ag+。
中和検定は、血清をマイクロタイタープレートに階段希釈液(5erial d
ilutions I fつく91次いで各穴に143時間で完全なCPEをも
たらす、力価検定により先に示した希釈でlアリコートのウィルスを加えて実施
される。すなわち、X−Q?ウィルスに対しては、これはγラントイン液のi:
soo希釈液であった。私達は、浄書(内容に変更なし)
4
詩表−59−50i714 (6)
これは約10.000プラ一ク形成単位/穴であると測定した。
図3に示したデータは、図2に関して述べた七関し一般法を用いて得られた。血
清は、96穴プレ一トI!Z50μm 2倍希釈液をつくった後、おおよそに希
釈した(図2から1=300)ウィルス50μiを添加して力価測定した。37
°むで60分間の保温後、各血清−ウィルス混合物を4浄したM D C’ K
細胞の単層を含んでいる96穴プレートの対応する穴に移した。この方法の残り
は図2に示すとおりである。対照の穴(C)は血清もウィルスも含んでいなかっ
た。
図3は、抗ペプチド抗血清の組合せによるX−47ウイルスの中和結果を示す、
NR3(止木つ号ギ血漬)は、抗[[I漬を組合せて試験する時の希釈係数を補
償するために、試験されている抗血/ilをに4容量の正常ウサギ血清で希釈す
る己とを示す。力価は表1に示すように5O%中和の点として表される。抗血清
は、($)抗X47ウイルス; (ロ)正常ウサギ血清; (○)抗ペプチド−
2・3;(△)抗ペプチド−24;そして(◆)抗ペプチド−23及び24゜
表1に記載の結果から、多数のペプチドがインビトロでのX−47ウイルス(8
3N2)に対する中和活性とともに抗体を誘発することがわかる。
表1 抗ペプチド抗血清によるx−97ウイルスの16−非結合 5−i。
17−非結合 O
つ つ IQ−’10
表1 (つづき)
23−非結合 λo−1I。
コグ−非結合 2O−4t0
23 3
コ乙 lIo−g。
X−9’7 /260
a、中和検定の詳細を図3に関して上に示す。
b、これらの数字は、図/に示すように、対応する数を有するペプチドに対する
抗血清を示す。
C1この力1iIliは、CPEが対照の50%に阻害された合、血清希釈範囲
の逆数をとる。データは7回の実験代表値である。
d、抗血清の最高濃度すなわち非希釈でも、正常ウサ血清の対照に対して防護の
兆候がなかったときに力価口とした。
上で検討したペプチド類は、赤血球凝集素分子におけ位置に関して、λつの明確
なグループに分れるようでるる。そのグループとは。
l 以下を含むジスルフィド橋を含有する分子の部分。
a、 ライ’J (Wi ley )外の提案に係る抗原性部位ThC“〔ウィ
リー外、Nature 、 2 g 9.3り3−3’1g +/9g/)〕。
これは、ンヌテインS3とンスティ/、2りgの間のジスルフィド結合により形
成された分子内の突起部である。ソステイ/S、?の部分にあるペプチド(ペプ
チドS、Iり及びり)とシスティンコクg(ペプチド2/及びλ3)は中和性抗
体を誘発した。
b、 システィンλg、2とシスティン306の間のジスルフィド橋。これらの
システィンを含むペプチド2.2及び20に対する抗血清は中和性であった。
c、HA、のシスティン/SとHA2のシスティン/3りの間のジスルフィド橋
。私達の後者のシスティンを含有するペプチドを合成しなかったが、ペプチド2
に対する抗血清は低中和力価を示す。
Ω 前、躯体HAがHA、とHA2に分裂する部位の周囲の部分。ガーテ7 (
Garten )外、Vivology % / / 5 X3A’l−ジり’
i(iqg、i)。すなわち、HA、のカルボキン末端(ペプチド20)及びH
A 2のアミノ末端(ペプチド、2グ、及び程度が低いがペプチド、2S)は中
和性であった。さ、らに、前駆体)−IAの分裂部位を表すペプチド(ペプチド
、26)も中和応答を与えた。
実際、HA2の疎水性アミン末端はHA中で最高に保存された配列である。ウォ
ーターフィールド(/q791゜それは、センダイウィルレス融合糖タン・々り
質のF、成分のアミン末端に類似し〔ゲンングf Gething l外、Pr
oc−Nat 1. ACad、 Sci、 USA % 75 %、2’)3
’)〜λフダθ(197g)〕、したがって膜融合段階に含まれ得る。HA2ア
ミノ末端はHA)リマーのp■で分子内にコンフォーメーションの変化があるこ
と”が化はHA2のアミン末端をはじめとする分子の諸部分を露出させると考え
られる〔リチャードンン(Richardson l外、Virology、
/ O5、20!−222(/ 9ざO)〕。
いずれの場合でも、抗ペプチド血清の中和力価°は完全なX−97ウイルスに対
してつくられた血清の中和力価より小さい。したがって、抗ペプチド血清の組合
せがどんな効果を生み出すかを見ることは興味深い。図3は、最高の中和活性を
個々に実証された抗ペプチド抗血清の組合せによるx’ −+りの中和を示す。
このデータは、血清組合せの相乗効果はないことを示す。力価はそれらの部分の
本線な和・であり、各部分が独立に作用していることを示している。普通の配列
含まれるペプチドに対する血iの力価は付加的ではない。中和活性をもたない抗
血清を組合せて試験しても中和活性を示さないし、これらは中和能力をもつ血清
によっても刺激されない。
B、他のインフルエンザウィルスとの相互反応性多数のインフルエンザウィルス
HA分子のアミノ酸配列を、それらHA遺伝子のヌクレオチド配列から誘導した
。HAサブタイプの変異(variation lにも拘らず、かなりの保存が
配列間に存在する。ウェブスター外、2g9.373〜37g (/9g/ l
;及びゲンング外、Natur’e X/ gり、373〜3’7g (/9
g/ l。これらの部分には、私達が私達の抗ペプチド抗血清を用いて中和活性
を実証した部分が含まれている。表コは、本発明の抗体を含有する抗ペプチド抗
血清が異種の(het’erologous l ウィルスを相互に中和するこ
とができることを実証するデータを示す。
表λ、抗ペプチド抗血清による他のインフルエンザウィルスの相互中和
ABCDEFGH
血清(田−)u−+lNl+ ()−1/N/+ (田に+ (H/N/] (
田に)(田に)x−4/7i、:uo io−、v o i、uo o ixo
1w 。
X) 1o=xr 5−io 、 o io−、v、、i、s−s 、:z、s
−s xt−m 。
# J−u 1O−X) 5−101O−X) 10−.2072−’10 ’
10−g010−X)rq v−go 、:v−JI0’r、s−s 1o−v
、:v−in 、:v−m tio−go io−、:vh l10−go
x−m r、s−s xt−m to−v 10−v tm−go 1o−v1
ウィルス: A=X−47; B=MWSN/33”。
C=A/5w1ne/7 b// : D=A/ENG/4’2/2 :E=−
、A/USSR/90/り’7 : F=A/PC///)3:G = A /
Aichi / 2 /6g ; )−1= B/HK/g/り3゜寸常2ウ
サギ血清。
※示した数値より少ない
他のH3菌株はx−qフの中和パターンに類似した中和パターンを示す。反対に
、H1菌株はこの高力側坑X−47ウイルス血清によっては中和されなかったが
一1抗ペプチド血清の少なくともいくつかにより中和された。
合成ペプチド、13.2’l及び2乙に対する抗ペプチド血清が特に有効であっ
た。A/WSN/331ウィルスB:H/N/ )が抗X−+7抗血清により中
和される程度は、H3サブタイプウィルスに対する抗ウイルス抗血清の性能に比
べて重要でない。HA配列が入手可能なこれラノウィルスにと9、結果はH/サ
ブタイプとH3サブタイプの間のアミノ酸配列の相同性の程度と一致しているよ
うである。
私達は、インフルエンザウィルス赤血球凝集素の特定部分に対応する合成ペプチ
ドが同種(homologous)ウィルスに対して中和性抗体応答を誘導する
ことを実証した。
さらに、中和性抗体を組合せると合算されてより強力な中和血清ができる。した
がって、2種以上のペプチドを用いる同時免疫により、多数の部位における共同
的な中和を行うことができる血清ができる。不活性血清のグループは相乗的に組
合わさってウィルスを中和することがなく、多数の大きな抗体分子をHAの露出
した部分に結合させるだけでは感染と複製を阻止するには不十分であることを示
している。
データは、感染及び複製の過程で機能的である部位又はジスルフィド橋により形
成される部位のような構造的に区別できる部位
【抗体を結合す、る必要があるこ
とを示唆している。抗X−+7ウイルス抗血清に比して相対的に低い抗ペプチド
血清の力価は、恐らく、抗ペプチド抗血清中の、対応するアミノ酸配列が感染性
ウィルス内で獲得するコンフオーメーンヨンを認識する抗体の割合が限定されて
いるためであろう。さらに、抗X −4,’7ウイルス抗血清は他のウィルス成
分、例えばlイーラミダーゼに対する抗体を含有し、これらはこの血清中のHA
抗体の中和活性を高めることがある。
私達の研究において、私達はインフルエンザウィルス(H3サブタイプ)の部分
に対応する合成HAペプチドに対する本発明の抗血清のいくつかがH3サブタイ
プの変異株、並びに他のインフルエンザAウィルスHAサブタイプの代−表的な
ものと7つのインフルエンザウィルスに対して良好な程度の相互反応性(相互中
和性)をもつことを示した。このことは特に興味をそそされる所である。という
のは、x−yフウイルスに対しては抗ペプチド血清よりずっと高い中和力価を有
する抗X−グアウィルス抗血清が異種ウィルスに対しては全く不活性であるか、
非常に小さな活性しか示さないのであるから。さらに、グリーン(Green
)外、止揚文献、による研究により、抗X−+フウイルス抗血清は合成ペプチド
をまるで認識しないことがわかっている。この不一致の理由は、完全なウィルス
の制限された免疫原性又は完全なウィルスに対する免疫応答への炭水化物の影、
響に起因するのかもしれない。
これらのデータは、(従来の免疫におけるように)完全なウィルスに対する免疫
応答が合成ペプチドを用いて得ることができる免疫応答とかなシ異なっているこ
と、さらに後者はペプチド免疫原を適切に選べばインフルエンザに対する一般的
な接種に有効に使用することができることを示唆している。
上記の相互反応性ペプチドのアミノ酸残基配列を下式に左から右へ、アミン末端
からカルボキシ末端の方向で表す:
ペプチドS CNNPHRIL :
ペプチド20 CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR;ペプチ
ド、23 SIMR3DAPIGTC5SECITPNGSIPNDKPFQN
VNKITY:ペプチドΩ11tRGIFGAIAGFIENGWEGMIDG
WYGFRHQN:ペプチド26EKQTRGIFGA。
図/を調べるとわかるように、ペプチドSは、アミノ酸残基配列において、X−
=フインフルエンザウイルスのHA +分子の位置33−60(アミノ末端から
)に対応しており;ペプチド−〇は、アミノ酸残基配列において位置301.−
330(アミン末端から)に対応し、X−97のHA1分子のカルボキシ末端を
含んでおり;−ニブチド23はアミノ酸残基配列においてX−1l?のHA。
分子の位置2乙? −300(アミン末端から)に対応しており:ペプチド2ダ
はアミノ酸残基の配列においてHAI分子の併置330(カルボキン末端)から
位置29(、Xl’りのHA2分子のアミン末端から)に対応しており;ペプチ
ド、2乙は位置3;乙(HAI分子のアミン末端から)からカルボキン末端(位
置330)を通ってX−+7のHA2分子の位置乙までに対応する。
アミノ酸残基配列がX−クク以外の表2に列記したインフルエンザウィルスの菌
株の赤血球凝集素分子中の上記アミノ酸残基の位置に対応する合成ペプチドは、
その赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に該ペプチドが対応しているよ
うな菌株又はサブタイプを中和するほか、上記表2のインフルエンザ菌株又はサ
ブタイプの少なくとも一部と相互反応し中和する□抗体の産生をも誘導すると考
えられる。
理論てこだわることを望むわけではないが、合成ペプチドを用いる免疫によって
誘導される相互反応的な中和性抗体の産生は、免疫する合成ペプチドの位置配列
の役割であると考えられる。したがって、相互反応的な中和性抗体は、アミノ酸
残基配列がペプチドSX、201.23.2ダ又は2乙の赤血球凝集素分子上の
位置の同類のアミノ酸残基配列に対応する合成ペプチドで免疫することにより誘
導することができる。
上記ペプチドの位置は接近していること、ペプチドが約g〜約グ0のアミノ酸残
基を含み、これらペプチド残基の配列が上記ペプチドの7種の配列に対応してい
る限シ、約3個のアミノ酸残基分までいずれかの方向へ変えることができること
も気づく。9対応する〃の語はアミノ酸残基、配列に関して用いる時は、λつの
ペプチドの配列又は1つのペプチドとタンパク質の配列が非常に類似していて、
本発明のペプチドに対して産生された抗体が相互反応し、そのペプチド及び第二
の対応するペプチドもしくは対応するタンパク質の両方に結合することを意味す
る。アミノ酸残基配列は同一であることが好寸しいが、配列の完全な同一性は不
要である。例えば、リンンとアルギニン、又はグルタミン酸とアスパラギン醗、
又はロイシソとイソロイ7ンのようなアミノ酸残基間の保存型の変更は行われて
もよい。さらに、相互反応的な抗体結合性を壊さなければ、配列に残基を付加し
たシ残基を削除することができる。
C,ヒトT細胞応答
動物宿主の防御は、典型的には、抗体産生性8細胞(体液性応答)の参加と様々
な機能をもつT細胞(細胞性応答)の参加の両方を含む。上述の結果は主として
抗体産生の8細胞刺激に関連する。
本発明のペプチドがT細胞増殖に及ぼす影響を評価するために別の研究が行われ
ている。該研寄はラム(Lamb l外、Nature、300.66−69(
19g2)に報告されておシ、その開示は参照によシ本明細書に含められる。
簡単に述べると、ラム外の報告に示された結果は、菌株Aのインフルエンザウィ
ルス(A/テキサス///7?:H3Nu+に対する公知の応答として選ばれた
ヒト供血者の末しよう血液リンパ球から導ひかれたT細胞クローンの増殖を誘導
するの知、合成ペプチド20が特に有効であったことを示している。ペプチド−
〇の配列は提案した抗体結合部位から離れているが、ウィルスに対する細胞性応
答にとり免疫的に優勢のよう丁ある。
ペプチド20のアミノ酸残基配列は図1及び上記セクションBに示されている。
ペプチド20はアミノ酸残基配列において位置306から330(HA、分子の
カルボキシ末端)に対応する。
別の言い方をすると、このペプチドはHA、のカルボキシ末端からHA、のアミ
ノ末端の方へHA、中の最もカルボキシ末端に近いシスティン(システィン30
6)に隣接する残基まで延びている。完全なHA、分子では、システィン306
は位置2g2にある残基とともにジスルフィド結合を形成するシスチン残基の一
部として存在する。したがって、システィン306は、当業界で知られているよ
うに、より正確には半シスチン(hat f −cyst 1ne1306と称
される。HA、分子のこの部分が、インフルエンザウィルスでT細胞増殖を一般
に刺激する部分(位置、301.−330、すなわちカルボキシ末端の位置から
HA、分子上の最初の半シスチンまで)であると考えられる。
本発明の別の実施態様は、アミノ酸配列が単独で又は結合体(conjugat
e )として合成ペプチド20のアミノ酸残基配列に対応するペプチドを利用゛
して1.■細胞増殖を刺激し、及び/又はB細胞による抗体産生の誘導も行う。
このペプチドはこうした目的に使用でき、またl又は2以上の追加ペプチドある
い゛はそれらの結合体と共同゛させて使用し、T細胞及びB細胞の双方を刺激し
て細胞性及び体液性の両応答を生じしめることができる。
応する合成ペプチド結合体6種の混合物でCAF、マウスを免疫した。各マウス
に、完全フロインドアジュバントに溶かした20μgの混合ペプチドそれぞれを
含有する3種の注射液を投与した。グリーン(Green l外、止揚文献、が
論じたELISA検定法を用いると、S週間後の血清力価はθ〜320の範囲で
あった。類似のウサギの力価は約S12θであった。
一見低力価がみとめられたにも拘らず、感染性インフルエンザウィルスによる鼻
腔内攻撃に対する防護が認められた。すなわち、食塩水と完全70インドアシユ
・くンドの注射を受けた対照グループでは15動物のうち9匹(60%)が死ん
だが、ペプチドで免疫した(接種した)グループでは15動物のうち3匹しか死
ななかった。
上記の防護測定で利用したペプチド混合物は、ベフ′チドー、グ、り、//、/
ワ及び20(表/)をほぼ等量ずつ含有していた。各ペプチドはKLHに結合さ
れた。
上記測定の接種記録は次のとおりであった。7週令の(II −week−ol
d l CA F + 雄マウスのグループに、完全フロイントアジバントに溶
かしたペプチド含有ワクチン又は食塩水含有ワクチンを0日、/l/日及び35
日に接種した。35日に血清力価のデータを得るために動物から採血した後、3
g日にLD5GないししOSOとなるように、すなわち集団のSOSからg0%
を殺すように計画した濃度のマウスに適応させた( mouse−adapte
d )X−弘フインフルエンザウィルスを鼻腔内接種により攻撃した。
攻撃した動物を次に隔離設備に入れ、病気の兆候を毎日調べた。隔・離から3週
間後、死亡百分率を計算し対照グループと比較した。
その長さに応じて、ペプチドは単独で又はにLHとの結合体として用いた。その
溶解性に応じて約3qより少ない残基を含有するペプチドは典型的には結合体と
して用い、−万3S残基より長いペプチドは典型的KFi単独前述し、表/に示
したように、本発明のペプチドは単独で使用でき、あるいは担体(carr、i
e、r )に結合させ結合体(conjugate lとしても使用できる。キ
ーホール・リンペット・ヘモンアニン(KLH)が表1の結果t−得るために結
合体の担体として使用された。結合体を調製するの((有用なその他の担体とし
ては、□これに限定するものではないが、アガロース、架橋アガロース、エテス
チン、カーキュビン(curcubin l 、ラン血清アルシ゛ミン、ヒト血
清アルブミン、ヒツジ赤血球のような赤血球及びポリ(D−リンン:D−グルタ
ミン酸)のようなポリアミノ酸がある。
結合体を利用する免疫が、単独の及び担体に結合されていないペプチドを使用す
る同様の免疫よりも効果的で中和性抗体産生(体液性)応答に及ぼす影響を調べ
るために研究を行った。
これらの研究で用いたペプチドは、そのアミノ末端にCys残基を含む合成ペプ
チド、20であった。これらの研究での担体はファルマシア・ファイン・ケミカ
ルズ(ピスキャタウエイ、ニューシャーシー州)から入手できるチオプロピル−
セファロース(thiopropyト5epharose)乙Bとチオプロピル
−セファロース4Bであった。
これら研究からの表3(下記)に示すデータは、両方の担体とも免疫学的に有効
であったことを示している。
事実、セファロース6B結合体に応答して生じた抗血清の[:LISA検定法(
グリーノ外、止揚文献)により得た力価はX−4’?ウイルスを用いて得た力価
(約7600〜.3200 )と同じオーダーの大きさであったので、セファロ
ース6B結合体はX−’7?ウィルスそのものとほぼ同程度有効であった。
表 3
セファロース結合ペプチド20で免疫したマウスのグループl:セファロース乙
B−ペプチド20 (50μg のペプチド(結合体)/マウスおよ′び9+y
のalumで)の3回のi p/s q注射1グループλ°セファロース6B−
ペプチドro (s。
8gのペプチド(結合体)/マウスおよび5 Tn9 X mycob’のCF
A3)の3回のsq注射2グループ
μsのペプチド(結合体)/マウスでlI■のalumとともに) (D /
回)ip/sq 注射1// 0
/2 0
7 3 g O
グループグ:セファロースlI日ーペプチド20 (30μs のペプチド(結
合体)/マウスで、Sm7 mycob’.のCFA3 とともに)の3回の1
’ ip/sq = /回の腹腔内注射と9回の皮下注射(各ヒップと各肩に
1回ずつの皮下注射)Ω sq−=上記のとおりのグロの皮下注射3 CFA一
完全70インドアジュバント’A Mycob−アジュバントに添加したマイコ
バクテリウム・ノベルクローンスt MycobacteriumTuberc
ulosis ) H 、3フRA0昔 示した数値よ.り小さい。
セファロース担体としてのKLHよりもいくつかの利点を有する。これらの物質
は、架橋多糖類鎖(アガロース)、スペーサ部分及び保護されたチオール基(ペ
プチドとの結合反応前)からなる固相を有する。コーチオビリジル保護部分は、
合成ペプチドに利用できるシスティン−SH基によって容易に置換される。この
置換反応は食塩水溶液で起9、カンプリング剤を必要とせず、効率的であシ(セ
ファロース乙B:収率=60〜bss :セファロースダB:収率ー4’θ%l
、−一チオピロリドンの遊離による3 lI3 nmにおける吸収の増加によシ
容易にモニターされる。
チオプロピルセファロース6Bは、チオプロピルセファロ−スゲBに比較して、
高い結合力( bindingcapaci’ty l 、大きな結合効率例え
ば66〜ろS%対ダ0チを有し、明らかに大きな免疫原性を示す。さらに、可能
性のあるヒトワクチ/として、チオブロピルセシアロース乙Bーペプチド、20
結合体の免疫原性は、ヒトワクチンに使用されない完全フロインドアジュバント
(CFA)の存在下よりもヒトに使用することができる水酸化アルミニウム(
alum l の存在下において一層犬である。
ペプチドは、05モルのNaα、0. 0 0 1モルのエチレンジアミン四酢
酸及びθ2 % NaN 3をさらに含んでいるpH 7の税気された001モ
ルりん酸塩緩衝液中で、セファロース担体に結合した。セファロース4BIC結
合するためには、/コの包装した膨潤セファロース4Bを、Sη/rnlのペプ
チドをさらに含んでいるりん酸塩緩衝液コ一に加えた。セファロース6Bに結合
するためには、θS−の包装した膨潤セファロースろBを、5キ/−のペプチド
をさらに含んでいるシん酸塩緩衝液S−に加えた。反応溶液を4℃の温度で一夜
穏やかに攪拌し、結合した生成物を使用前に緩衝液で望ましいように洗浄したセ
ファロ−スペースで水酸化アルミニウムの系は、ヒト接種に関してはいくつかの
利点をもつが、担体としてにL)−1を希釈剤/アジュバントとしてCFAを免
疫処置に使用すると、他の変数についてのデータ比較上有用な系が得られる。こ
のような系を、合成ペプチドを免疫原として用いる単一の免疫処置記録の効果を
評価するのに使用した。結果を下の表ゲに示す。
コ 3 0 0 0 、OQ 0
3s o o o o 、Qttot4o。
’tsoro” o o o 。
s s 、2o”、2o” o、 o go go。
乙 20 0 20” 、!ゲ 、2ゲ 3200 1.’100’7 20
20“ 20″ 20” 20” 72旬 /乙□Og 、2o o 、2o+
= 、:xゲ 乙グ。o 6グ。0≠9 .20 0 .20” /、2gO
/、2gO,3,200/、、410010 20 .20” ’10. .2
11.0” /IgOA’100 、l。0// グo 、;xo” 、:io
’ iバ。 /、2g。 t、yoo+ btioo+/=2 tio o 、
:to“ go 1to3−go 6tioθt3 qo θ o 2o lb
o bqoo 6tto。
グgり119g、lIに記載のように、結合体は、約′グθ〜5oμg のペプ
チドと約25〜32μg のKL、Hから調製された。1oosの反応を仮定し
た。
免疫処置は、全容量θ2−/マウス中に。6■/マウスのマイコバクテリウム・
ノベルクローシスヲ含S
有する完全フロインドアジュバントで行った。
コ 注射した各KLH結合体中のペプチドの量、μI0ユ 免疫処置を行った後
足された経過週間の時点で、グリーン(Gr’een l外、Ce1l1.2g
、、、り77〜’Ig7(/qgl)に記載のようにしてELISA検定法でめ
られた力価。
繁 示した数f直より小さい力価。
ナ 示した数値より大きい力価。
上記データは、x−qフィンフルエンザライルスト反応するかなりの量の抗体が
、KLH−ペプチド−〇結合体で免疫した3週間後にマウス内に誘発されていた
ことを表す。それらの力価は示されているように次のq週間にわたって増加し続
け、免疫処置後g〜ノ、2週の期間でピークになった。単一の注射後乙ケ月で、
°S/iJ の投与量を受けたマウスの力価は約g00〜約3.2ooで乏った
;コ0μg の投与量を受けたマウスの力価は約g0θ〜約乙4t00以上であ
った;そしてり0μg の投与量を受けたマウ′スの力価は約3..200〜6
q00以上であった。私達が前に論じた、×−q7ウイルスを用いる鼻腔攻撃(
1ntranasel challengs ) に関する研究は、上記の乙ケ
月の範囲の抗体力価を有するマウスはウィルスの感染に対し防護されることを示
した。
単一の免疫処置からの上記データは多数回投与(multiclose )記録
を用いて得られた結果よりも優れてゆっくり減退するパターンは、ペプチド免疫
原の単一の注射がインフルエンザに対する長期間の免疫を誘発するのに十分であ
る可能性を示唆している。
F、環化ペプチド
アミノ酸残基配列がHA、の位置306〜33o(カルボキシ末端;ペプチド−
〇)及びHA、の位置/’Q。
〜/60CウィU −(Wi ley l外により同定された抗原部位、Nat
ure 、 ’2 g 9.393〜37g(79g1)〕に対応している環状
ペプチドも調製した。最初の合成された直鎖の環状ペプチド前駆体はアミノ及び
カルボキシ末端にシスティン残基を含み、これらは茨に酸化されて環状及び/又
はオリゴ−性物質を生成した。該オリゴー性物質もここでは環状ペプチドと称さ
れる、というのは遊離のメルカプタンがエルマン(Ellman l fス)[
El 1man 、 Arch、 Biochem Biophs、 、 g
2.7o77(/?591 ’Jにより全く検出されなくなるまで酸化が続行さ
れるからである。こうしてペフ:チドの末端には遊離の−SH基は実質的に奮然
存在しないことが示さ、れた。
−メーションは比較的直線的である。赤血球凝集素の位置1tio−iboの部
分は、天然のタンパク質中の自然な環状のコンフォーメーションヲ形成する。
変異株を分析することにより、位置1tto−i乙。の壌が天然の赤血球凝集素
に対する抗体の発生上重要であることがわZ)つた。この部分に対応する線状ペ
プチド、例えばペプチド/S(位置/1l−0−/3乙に対応する)は、完全な
ウィルスと反応する抗体の産生を一貫してできなかったが、それらの抗体は赤血
球凝集素とは反応する。
ペプチドを01モル重炭酸塩溶液に溶かして環状ペプチドを調製した。環状でモ
ノマー性の又は実質的にモノマー性のペプチドを、ペプチドを0/η/rnlの
濃度で溶解することにより調製し、一方オリゴマー性物質は10my / ml
の濃度で調製した。このように調製したペプチド溶液を、大気圧の酸素に暴露し
て環化性酸化を起させながら一夜攪拌した。その後酸化した溶液の反応完了を試
験し、次いで凍結乾燥した。このように調製した乾燥物質を次に免疫処置に使用
した。
上述したεLISAを使用して、線状のベブチドコ0に対するウサギとマウスの
抗体が環化ペプチド、20を、特にオリゴマー状態のペプチド、2Of認識する
ことがわかった。X−47ウイルスに対する抗体は環化ペプチドに結合しなかっ
た。同様に、抗X−グフ血清は部位A環構造に対応する環化ペプチドに結合しな
かった。
要約すると、より具体的な実施態様では、本発明は明確に特定されたペプチドに
関する。当業者は、上に開示したペプチド類の免疫学的特徴を実質的に損わない
で該ペプチド類の正確な配列からのわずかなズ、しは可能であることを理解する
であろう。
本発明の、中和性で防護的な抗体を産生ずるペプチドは、次のアミノ酸残基配列
(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)を酸化され、環状もしく
はオリゴマーの形態で含んでいる、
(al SIMRSDAPIGTC3SECITPNGSIPNDKPFQNV
NKITY;(bl RGIFGAIAGFIENGWEGMIDGWv’GF
RHQN:(cl EKQTRG I FGA :(di CPKYにQNTL
KLATGMRNVPEKQTR;(el CNNPHRI L :
(fl CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRC;及び(gl
CにRGPDSGFFSRLN#LYKSGSC0■、レセプター分子
生物学的に活性なレセプター分子が本発明の別の実施態様を構成する。これらの
分子は、本発明の合成ペプチドに対しであるいはその担体との結合体に対して誘
発された又は育てられた抗体、又は抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分で
ある。好ましい実施においては、レセプターは本発明の好ましい合成ペプチドに
対して育てられる。
レセプターは、少なくとも・生理学的pH及びイオン強度の水溶液中で合成ペプ
チドと混合されると、少なくともレセプターが自然に生ずるウィルス又は赤血球
凝集素分子とも同じ条件で結合することが好ましい。レセプターが約S〜約7の
範囲内のpH値で、そして蒸留水のイオン強度ないし約1モル塩化ナトリウムの
イオン強度のようなイオン強度で合成ペプチド、赤血球凝集素およびウィルスと
結合することがより好ましい。
抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分は抗原に結合する抗体の部分である。
このような部分には、周知の酵素切断技術(enzymati、c cleav
age techniques lにより抗体から製造されるFab 、Fab
’及びF(ab’12 フラグメントが含まれる。抗体が当該技術においてゝゝ
育てられる〃(raised )又はN誘発される“(1nduced l と
して論じられるので、抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分も、抗体からこ
のような物質をつくるには次の切断段階が通常必要であるとの理解の下で9育て
られる“又はゝゝ誘発される“ものとして本明細書で論じられている。
レセプター分子は先に述べた抗血清の抗体の場合のようにポリクローナルでもよ
いし、あるいはレセプターはモノクローナルでもよい。モノクローナル抗体の製
造技術は周知であり、本発明のモノクローナルレセプターは、アーンハイク−I
Arnheiter l外、 NatureX、29 II。
、!?g−,2gO(/qg/ )により行われたように、本発明の合成ペプチ
ドを好ましくは担体に結合された状態で免疫原として使用することにより製造す
ることができる。
モノクローナル抗体は、典型的には、ノ・イブリドーマ組織培養から、又はノ・
イブリドーマ組織を導入した動物ナル抗体を、本発明の合成ペプチド又はその担
体との結合体2に対して育てられる〃又は5によって誘発される“ものとして述
べることができる。
レセプターは“指示グループ(indicating group丁”(時ては
5標識(1abel ) 〃と称されることがある)とともに利用される。指示
グループすなわち標識、は、免疫反応が起ったかどうかを測定するための、そし
である場合にはそのような反応の程度を測定するための手段としてレセプターに
関して利用される。
指示グループは、ヨウ素/25もしくは/3/°、水素3又はイオウ35のよう
な放射性元素、あるいはフッ素/9又は窒素15のような核磁気共鳴(NMR+
分光法において活性な元素の場合のように単一の原子でもよい。
指示グループは、フルオレセインのような螢光染料、又は酵素例えばホースラデ
イノ/ユf hoiseradish lベルオキ/ダーセ(HRPI等のよう
な分子でもよい。
指示グループは、抗体を 1 で標識する場合のようにレセプターに結合されて
もよい。指示グループは、抗体レセプターをウサギ内で育てた場合のHRP−結
合したヤギ抗ウサギ抗体、あるいは 1 のような放射性元素をスタフィロコッ
カス・アラレラムから得たタンパク質Aに結合した場合のような、レセプター分
子と反応する別個の分子又は原子の全体又は部分を構成してもよい。
主要な指示グループがHR,Pのような酵素である場合、免疫反応が起った事実
を視覚化するにさらに試薬が必要である。HRPに対するこのような追加の試薬
には、過酸化水素及びジアミノベンジジン又はλ、二′ −アジノージ=(3−
アチルベンソチアジンン・スルホナト)(誰から、何処の国ないしは州、都市で
入手できるか?)のような酸化染料前駆体がある。
“指示グループ“又はゝゝ標識〃の用語は、本明細書では、レセプターに結合す
九た又は分離して使用される単一の原子及び分子を含むように使用され、これら
の原子又は分子は単独で使用されるか追加の試薬と一緒に使用されるかに関わり
ない。このような指示グループすなわち標識は免疫化学においてそれ自体周知で
あり、これらが他の観点からして新規なレセプター、方法及び/又は系と一緒に
°利用される限りにおいてだけ本発明の一部を構成する。
産業上の利用性
安全で効果的な合成ペプチドワクチンをインフルエンザに対して製造することが
でき、より普遍的なワクチンの計画の実現可能性がある。これらペプチド免疫原
を用いる接種は、それ自身のパターンをもつ遺伝的意味(drift lを形成
するに至る。しかし、ウィルス複製に機能的に必要である部位に関してペプチド
を選択すれば、その部分で生ずる突然変異はまず死滅させることができる。
浄魯消容に変更なし)
昭和 年 月 日
特許庁長官 志 賀 学 殴
】、事件の表示 P CT / LI S 83 、/ 012913、補正を
する者
事件との関係 出願人
7、補正の内容 別紙の通り
明細書(第14頁)及び図面の浄書(内容に変更なし)。
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 / アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部分 に対応し、約g〜約90のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドであって、該 ペプチドは単独又は担体に結合された結合体であり、(a)インフルエンザウィ ルスのサブタイプであってその赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に前 記ペプチドが対応しているサブタイプを中和する、並びにfbl第一のサブタイ プの第2のインフルエンザウィルスを相互中和する、抗体の産生を誘発する動物 を免疫するのに用いられる前記免疫原ペプチド。 2 請求の範囲第1項のペプチドであって、該−ζプチドのアミノ酸残基配列が 下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応するペ プチド:S I MR5DAP I G、TC5SECI TPNGS I P NDKP FQNVNK I TY3 請求の範囲第1項のペプチドであって、 該ヘプチドのアミノ酸残基配列が下式の配列(左から右へ、アミン末端からカル ボキン末端の方向)に対応するペプチドRGI FGAIAGF IENGWE GMIDGWYGFRHQN。 Il請求の範囲第1項つペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応するペプ チド。 EKQTRG I FGA 。 S 請求の範囲第1項のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応するペプ チド。 乙 請求の範囲第1項のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向)に対応するペプ チド。 CNNPHRIL。 7 請求の範囲第1項のペプチドであって1.該ペプチドがアミン末端及びカル ボキン末端の両方のシスティン残基の酸化されたメルカプト部分を介してつくら れた環化又はオリゴマー化形態にあり、かつ未酸化形態においてCPKYVKQ NTLKLATGMRNVPEKQTDC:及びCKPGPDSGFFSRLN WLYに5GSCからなる群から選ばれる式(左から右へ、アミン末端からカル ボキン末端の方向)に対応するアミノ酸残基配列を有するペプチド。 g 請求の範囲第1項のペプチドであって、該ペプチドが合成されたものである ペプチド。 9 アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部分 に対応し、約g〜約70のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドを含むインフ ルエンザウィルスに対するワクチンであって、該ペプチドは単独又は担体に結合 された結合体であり、(alインフルエンザウィルスのサブタイプであってその 赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に前記ペプチドが対応しているサブ タイプを中和する、並びに(bl第2のサブタイプの第一のインフルエンザウィ ルスを相互中和する、抗体の産生を誘発する動物を免疫するのに用いられる前記 ワクチン。 lθ請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向)に対応するペプ チドS IMR3DAP I GTC3SECI TPNGS I PNDKP FQNVNK I TY。 // 請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が 下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応するワ クチンRG I FGA I AGF I ENGVl/EGM I DGWY GFRHQN 。 /2請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向)に対応するワク チン゛EKQTRG I FGA 。 /3 請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が ・下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応する ワクチン:CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR。 /ダ請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列(左から右へ、アミノ末端からカルボキン末端の方向)に対応するワク チン゛CNNPHRI L 。 /左請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンがアミン末端及びカルボ キン末端の両方のシスティン残基の酸化されたメルカプト部分を介してつくられ た環化又はオリゴマー化形態にあシ、かつ未酸化形態においてCPKYVKQN TLKLATGMRNVPEKQTDC;及びCにRGPDSGFFSRL[Y KSGSCからなる群から選ばれる式(左から右へ、アミン末端からカルボキン 末端の方向)に対応するアミノ酸残基配列を有するワクチン。 /乙 請求の範囲第9項のワクチンであって、該ワクチンが合成されたものであ るワクチン。 /7 アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部 分に対応し、約g〜約70のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドに対して育 てられたレセプター分子であって、該ペプチドは単独又は担体に結合された結合 体であり、(a)インフルエンザウィルスのサブタイプであってその赤血球凝集 素分子のアミノ酸残基配列の一部に前記ペプチドが対応しているサブタイプを中 和する、並びに(bl第二のサブタイプの第ユのインフルエンザウィルスを相互 中和する、抗体の産生を誘発する動物を免疫するのに用いられる前記レセプター 。 7g 請求の範囲第17項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基 配列が下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応 するレセプター゛ SIMR5DAPIGTC3SECITPNGSIPNDKPFQNVNKIT Y。 /9 請求の範囲第17項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基 配列が下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向)に対応 するレセプター。 RG I FGA I AGF I ENGWEGM I DGVI/’/GF RHQN 。 コθ請求の範囲第1り項のレセプターであって、該レセフリーのアミノ酸残基配 列が下式の配列(左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向)に対応す るレセプター: EにQTRG I FG A 。 2/請求の範囲第17項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基配 列が下式の配列(左力1ら右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向)に対応 するレセプター。 CPKYVKQNTLにしATGMRNVPEKQTR。 2、特許請求の範囲第1フ項のレセプタターであって、該レセプターのアミノ酸 残基配列が下式の配夕11 (左力\ら右へ、アミン末端からカルボキ・ン末端 の方向)に対応するレセプター: CNNPHFt l L 。 23 請求の範囲第1り項のレセプターであって、該レセプターがアミノ末端及 びカルボキシ末端の両方の7ステイン残基の酸化されたメルカプト た環化又はオリゴマー化形態にあり、力・つ未酸イヒ形態において CPKYVKQNTLにLATGMRNVPEKQTDC ;及びCKRGPD SGFFSRLNWLYKSGSCからなる群から選ばれる式(左から右へ、ア ミン末端力Sらカルボキシ末端の方向)に対応するアミノ酸残基配夕I]を有す るレセプター。 M 請求の範囲第1り項のレセフリーであって、該レセプターが合成されたもの であるレセプター。
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