JPS59501714A - 広いスペクトルのインフルエンザ抗血清 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

広いスペクトルのインフルエンザ抗血清関連出願の相互参照 本願は、１９ｇ、２年ｇ月２３日に出願された、なお未決で係属中の出願連続番 号第１１ｉｏ、ｑ−ｓｓ　号の一部継続本発明は免疫化学に関し、さらに詳しく は免疫学的試薬及びインフルエンザウィルスに関する反応に関する。 背景技術 インフルエンザは、徹底した予防接種計画にも拘らず、大きな流行病として広く 世界に残っている。ウェブスタ主ヱＪ　７９６９〜７７７１１１１９ｇ２＋。今 日まで、こうした試みのワクチンのために、にひこっている特定のインフルエン ザ菌株に対して抗体反応を誘発すべくあらゆるウィルスが抗原として利用Ｉｎて きた。ティレルこれら従来のワクチンには、ウィルスが発育卵で生産されるため に特徴が乏しい、不均一であるその他いくつかの不利な点かあシ、また重大な副 作用を引き起すことがある。最も重要なこととして、遺伝的組換えにより生じ得 るインフルエンザ菌株の広いスペクトルに対して有効であるために必要な一般性 を欠くという欠点を有する。 これらの問題を取除く良く特定された（　ｗｅｌｌ　ｄｅｆ＋ｎｅｄｌワクチン がめられている。ミュラー（Ｍｉｉｌｅｒｌ外によるより最近の研究で、ペプチ ドを免疫原として利用する研究が報告されている、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　Ｘ＝υ巻Ｓ乙ヲ〜Ｓり３（１９ｇ−年／月）。この研究 では、Ａ型（Ｈ３Ｉ’１２：ｌインフルエンザウィルスの赤血球に凝集素ＩＨＡ 　１分子のＨＡ、サブユニット（アミン末端サブユニット）の位置ｑ／−１０ｇ に対応する合成ペプチドを利用して免疫原が調製された。ミュラーらは、これら ペプチドで免疫することにより得られた血清とともに低レベル中和活性を得るこ とができた。さらに、ジャクノア　（Ｊａｃｋｓｏｎ　）外、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　、／　２０Ｘ２り３〜コフ乙（１９ｇ、りは、アミノ酸残基の配列がＸ−３１ （＋３Ｎ、２　＋菌株のＨＡ、の位置１．２３〜．／Ｓ／に対応する合成ペプチ ドを使用してその免疫原であるペプチドを認識する抗体を生じさせたが、ウィル スそのものには結合しなかったようである。 製された抗血清を利用する中和（ｎｅｕｔｒａｌ’１ｚａｔｉｏｎ　）　と防護 （ｐｒｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌ　の研究を示し、さらに標準的なすべてのウィルス のインフルエンザワクチン及び免疫化学的方法例代わるよシ効率的でより特徴が はっきりしたペプチド、抗血清及び方法を説明し、特許を請求するものである。 予防接種の中和化反応の主な標的は、ウィルスの主要な表面糖タン、バク質であ る赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔ　１ｎｉｎ　１分子である。ダウドル（Ｄ ｏｗｄｌｅｌ外、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、星、λ６ツ〜λりＳ（／９’７１１）。この 赤血球凝集素は前駆体分子（ＨＡ　）としてインビボで合成された後、タンパク 質加水分解によりλつのサブユニソ）ＨＡ、とＨＡ２に分裂される。分裂はウィ ルスが感染性となるのに必要である。クレンク（に１ｅｎｋツタｆ、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、、乙７．１１．２乙〜グ３９頁（／ｑ７３）及びラザログイノツ（Ｌａｚ ａｒｏｗｉｔｚ　）外、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｘ６　ｇ、ｑｔｉｏ−ｔｉｓｑ−（ ／９７５）。 インフルエンザのいくつかの流行性菌株のＨＡ遺伝子の配列が説明され、これら 遺伝子間には急速な遺伝的変化が起ることが示されている。ラーバー（Ｌａｖｅ ｒ　ｉ外、Ｎａｔｕｒｅ　Ｘ２　ｇ　３、’１３’ｌ−’ｌ５）（／）ｇｏ）； 　ウニ３り３〜３７ｇ　Ｉ／９ｇ／　＋　；ゲシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）外、Ｎ ａｔｕｒｅ　’、／　ｇ　７．３フ３−３’７ｇ　（／９ｇｌ　）。これらの突 然変異的変化はＨＡの抗原構造の変化としてもたらされ、先の免疫による防護か らそのウィルスが逃亡するのを許し、次いで新しい流行性菌株を発生させる。さ らに、前の流行病とは血清学的に異なるウィルスが恐らくヒト以外の宿主から集 団へ時折再入するが、こｎらが以前、Ｘ　−’Ｉ　フインフルエンザウイルスＨ Ａ　（）−１３Ｎ、２］ＣＭｉｎ□−Ｊｏｕ　、　Ｃｅ１ｌ、／ヲ、６ｇ３−乙 ９　ｔ、　ｗ９ｇ、（Ｂ〕の実質的にすべての部分に相幽する合成ペプチドが実 験動物で免疫応答を引き出し得ることが実証された。グリ、。 多くの場合°同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｌ精製赤血球凝集素分子この結果は 、ＨＡ、　とＨＡ２の両方のサブユニットを表わす合成ペプチドに対する抗血清 には、ｘ−ダフインフルエンザウイルスの複製を中和することができ、より重要 なことにそのウィルスにより引起きれる病気から動物宿主を防護できるものがあ ることを示している。さらに、これらの結果は、このインフルエンザウィルスの 合成ペプチド炉似体に対する血清には、異なる赤血球凝集素のサブタイプのウィ ルス感染を中和できるもｑがあるｘ−１１７（＋−＋３Ｎ、２１インフルエンザ ウイルスの赤血球凝集素の実質的全部分を表わす合成ペプチドに対して作られた 抗体ＣＭｉｎ　−Ｊｏｕ　、Ｃｅ１ｌ　、　／　９．６ｇ３〜乙ヲろ（７７ｇ０ ）〕のイイントロでウィルス感染全中和する能力を試験した。ペプチド免疫原の いくつかが、Ｆ［のウィルス・と、より重要なことにはプロトタイプ（原型）Ｈ ３ウィルスから最も分散した（　ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ　１インフルエンザＡサブ タイプであるとわかっているＨ１サブタイプの数菌株との両方を効果的に中和す る抗体反応を誘発した。ウェブスター外、Ｎａｔｕｒｅ　Ｘ７！ｑｂ、／／Ｓ− ’１２／　（／９ｇ、２＋。抗血清の組合せを用いる中和は相乗的ではなくて、 むしろ成分血清の力価の単純な和であった。ざらに、本発明のペプチドをワクチ ンに用いると、インフルエンザウィルスに感染した動物を防護することになる。 中和応答をもたらすこれらの合成免疫原はλつの一般的な種類に分かれた。（ハ 本来９分子におけるジスルフィド橋の一部である／スティン残基金倉むもの；（ ２前駆体赤血球凝集素の分裂部位が成熟した（そして機能的な）サブユニット形 態と隣接し又は該形態まで延びているもの。 ペプチド免疫原を選択する際の根拠はその配列の一部が分子表面で露出していな ければならないことだけであるが、合成抗原を可能性のある用途であるワクチン として計画するときは他の判断基準を考慮すべきである。すなわち、（ハ機能的 に活性な標的分子の部分（ｖｅｇｉｏｎｓ　］に特別の注意を払うべきこと：及 び（２ペプチドはこの゛研究で用いたものよりかな９短かくてもよく、システィ ン残基の回りで対称性がよシ高い方がよいことである。さらに、多価合成抗原は より効果的な中和力価を生ずるはずである。これらの結果は、これらの抗原がイ ンフルエンザに対して安全で一般化したワクチンを製造するのに使用できること を示している。 私達は、ある種のペプチド、特に合成ペプチド（成分質と比較して、２種以上の インフルエンザウィルス菌株を中和する抗体産生を誘発できることも見出し、中 和はインフルエンザの防護及び治療に有用な手段であると考エタ。本発明のペプ チドの各々の分子量は完全な赤血球凝集素分子の分子量より小さく、典型的には 約ｇ〜約ダ０個のアミノ酸残基の長さである。最も有効と分かつれ具体的な合成 ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の部分（ｐｏ ｖｔｉｏｎｓ　］　に対応するアミノ酸残基配列である。これらのペプチドは次 のアミノ酸残基配列式（左から右へ、アミ／末端からカルボキン末端への方向） により特定される。 （ａｌ　ＳＩＭＲ３ＤＡＰＩＧＴＣ３ＳＥＣ’１ＴＰＮＧＳＩＰＮＤにＰＦＱＮ ＶＮＫＩＴＹ’　；（ｂｌ　ＲＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷ’ ／ＧＦＲＨＱＮＣ：及び（ｃｌ　ＥＫＱＴＲＧＩＦＧＡＣ。 後述するように、上の（ｂｌや（ｃｌのような合成ペプチドのいくつかは、アミ ノ−又はカルボキシ末端のいずれかに造された。これら追加のアミノ酸残基の存 在は本発明にとり必要ではなく、シたがって、これらは本発明のアミノ酸残基配 列から省略してもよい。 アミノ酸残基配列がＨＡ、分子の位置３０乙−３３０（カルボキシ末端）に対応 する別の合成ペプチドは、（ａ）■細胞の増殖を刺激する１、（ｂｌ　Ｘ　−４ ７以外のインフルエンザ菌株と相互反応（、ｃｒｏｓｓ　−ｒｅａｃｔ　ｌする 抗体の産生を誘発する、そしてｆｃｌワクチ／に用いた時に生きたウィルスによ る攻撃から動物を防護することもわかった。こノヘフチドのアミノ酸残基配列（ 左から右へ、アミン末端からカルボキン末端への方向）を下式に示す。 （ｄｌ　ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬにＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲ別のペプチドも 菌株Ｘ−＋７に対する中和抗体だけでなく、他のインフルエンザ菌株と相互反応 しある程度中和する抗体の産生をも誘発する。このペプチドのアミノ酸残基配列 （左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向で）を下式（ｅ）に示す。 （ｅｌ　ＣＮＮＰＨＲＩＬ　。 中和特性をもつλつの環状又はオリゴマーのペプチドも製造した。これらのペプ チドは、アミン末端及びカルボキン末端にある両方のシスティン残基の酸化され たメルカプト部位を介して環化又は低重合体化された状態にある。これらペプチ ドのアミノ酸残基配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）を 、未酸化状態（ｇｌ　ＣにＲＧＰＤＳＧＦＦＳＲＬＮｖＶＬＹＫＳＧＳＣ。 本発明は、組成物として、合成されたあるいはタンパク質から分離された上に特 定したペプチド類又はその−も使用できる。合成ペプチドが好ましい。また、本 発明は、上記特定したペプチドを含有する７種又はコ種以上のペプチドの生物へ の攻撃から生ずる抗血清、並びに上記ペプチド（単独又は組合せ）に対する抗体 が免疫学的活性剤である組成物ても関する。本発明はさらに、これら組成物の製 法、及びこれらの組成物の免疫学的診断又は治療における使用にも関する。例え ば、本発明は、−面において、通常の接種（１ｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　）　、 摂取又は吸収接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　）に使用するワクチンであって、 免疫された宿主内に誘発された免疫学的活性剤が上に特定したペプチドに対する ７種又は２種以上−の抗体千あるものに関する。 図／ば、ヌクレオチド配列から誘導されたＸ−４ｔ７ＨＡ分子のアミノ酸残基配 列を示す； 図２は、マデイノーダービイ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｌ　犬の腎臓Ｉ　ＭＤ ＣＫ　ｌ　上皮細胞上のＸ−’％フインフルエンザウィルスのマイクロタイトレ ー／ヨ／の結果を示す；図３は、抗ペプチド抗血清の組合せによるＸ−１ｌ−７ の中和を示す。 最良の態　のミロ 個々のアミノ酸残基の完全な名称が、本明細書では周知の３文字略語と同様時折 使用される。アミノ酸残基の／文字記号が最もよく使用される。下の対応表に、 完全な名称並びに略語と各アミノ酸残基のために本明細書で命名した記号を示す 。 アスパラギン　Ａｓｎ、　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギン又はアスパラギン酸Ａｓｘ　Ｂグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グルタミン又はグルタミン酸　Ｇｌｘ　Ｚメチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　５ｅｒＳ 図１を参照すると、Ｘ−４’７ＨＡ分子のアミノ酸残基配列ＣＭｉｎ　Ｊｏｕ外 ＼、Ｃｅ１ｌ＼　／９．Ａｇ３Ａｇ３−４９６（ｉｑ〕が示されている。ＨＡｌ 全体とＨＡ　２のアミン末端が示されている。配列の下の線は合成さｎ免疫に使 用されるペプチドを表す。これらの線の端にａるＣ又はＹは、初めの配列には見 出せないンステイン又はチロシンの追加を表す。ジスルフィド結合はＣ−口と示 されている。非結合（ｆｒｅｅ　ｌ　と示した場合以外は、に記載のようにキー ホール・す／ベント・ヘモシアニン（にＬＭ）に結合させたペプチドに対してウ サギで抗血清を調製した。合成ペプチド及びこれ５を含むワクチンもグリーン外 （止揚文献）により述べられているよ゛うに調製した。彼らの開示文献−を参照 によりここに含める。 Ａ、中和検定 多数の抗ペプチド抗血清の試験を行うために、私達は・通常のプラーク検定に必 要な時間よりも短時間で行うことができる、インフルエンザウィルス用高速定量 インビトロ検定法を開発した。キルボーン、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＳａｌｚｗ ａｎ　ｌＮ、ｐ、　ｌ　／　ＩＩろ一１ｂｏ頁（アカデミツク・プレス、ニュー ヨーク、１９６９）。７０回のウィルス力価測定、即ちｇＯ回の血清中和と同数 のものを半日で行うことができる。さらに、日ごとに生じる可能性のある多数の 実験変数を除くことができる、というのは多くのウィルス又は血清を一日で力価 測定できるからである。 この検定は再現性があり、終点はウィルスの初めの接種物に比例する。 図λに示すテークは次のようにして得られた。マデインーダービー（Ｍａｄｉｎ 　−Ｄａｒｂｙ　ｌ犬腎臓ｔＭＯ，ｃＫｌ上皮細胞上のＸ−＋フインフルエンザ ウイルスのマイクロタイトレーショ／。ＭＤＣＫ細胞を、／θチウン胎胎児血清 ；ユニ／リン７００単位／ｒｎｌ）、ストレフトマインン（１００ｊｊ／ｒｒｔ ）、ｑミリモルのし一グルタミン、７６９モルのピルビン酸ナトリウヱ、θ０７ ．Ｓ％のリン酸トリプトース（ｆｒｉｐｔｏｓｅ　）ブイヨンＩ　Ｄｉｆｃｏ社 ）及び６５％グルコースを補った最小イータｌレス（Ｅａｇｌｅｓ　）培地（Ｍ ＥＧに）で培養した。培地中でのトリプシン化と洗浄に続いて、細胞を増殖培地 中で最終濃度１０６細胞／−まで浮遊させた。５０μｌ　の培地をさらに入れで ある９６穴平底マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ　）の各穴に、ＳＯμ ｔの浮遊液を加えた。プレートを３７℃で一夜保温し、翌日にウィルス又は血清 のいずれかの力価測定を行うために細胞が結合するようにしｈ０９Ａ穴マイクロ タイタープレートで５０μｔ　２倍段階希釈することにより、抗生物質を含有す るＭＥＭｆ希釈培地）中でウィルスを力価測定した。さらにＳＯμｔ　の希釈培 地を各穴に入れ、プレートを３７℃で６０分間保温した（模擬中和）。？Ａ穴プ レートでＭＤＣＫ細胞の単層を覆っている培地を吸い取り、細胞を１００μｌ　 の希釈培地で洗浄した。 力価測定したウィルスを次に、洗浄したＭＤＣに細胞を含むプレートの対応する 穴に移した。ウィルスを３７℃でＡθ分間吸収させた後、ウィルスを除き、細胞 を１００μｌの希釈培地で洗浄した。次いでこの細胞に、抗生物質、ｏ、ｏｏｓ ％ＤＥＡＥ−デキストランｆ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、λミリモルＬ−グルタ ミン、θ０５チウン胎児血清及びλμｇ／−のトリプシン（タイプ■、２ｘ晶出 、’３　ｉ　ｇｍａ社）を含有する基礎培地（Ｅａｇ、ｌｅ社）からなるかぶせ 培地（ｏｖｅｒ　ｌａｙ　ｍｅｄｉｕｍ　）をがぶせた〇これらの細胞をダｇ時 間保温した。この時間で、顕微鏡により細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた。 その後、２０％エタノールに溶かした０７％結晶バイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ 　ｖｉｏｌｅｔ　）　で染色し、次いで極〈少量の水中でリンスした。各ウィル スをスクリーニングした後に最後の希釈を行ってダｇ時間でＭＤＣに単層を完全 溶゛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｓｉｓ　）　Ｌ、この希釈液を後の抗体中和試験 で使用した。 図、２Ａは、Ｘｌ’？ウィルスの力価測定の７日及び２日（２グ時間及びｌ１ｇ 時間）の終点を示す。ＣＰＥの終ｌ３ 点は肉眼できわめて容易に評価できる。このプレートはマイクロタイタープレー トリーダーで機械的に読むことができ、その結果は図２Ｂに示すようにグラフと してプロットされる。２日検定を選択した。その理由は、抗ペプチド抗血清の中 和強度の試験において、９ｇ時間で完全なＣＰＥに必要なウィルス接種物が全体 に最も良好な感度をもたらすことがわかったからである。 図２Ｂは、’１９２ｎｍフィルターを備えたＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｋａ ｎ装置で読んた後に図２Ａの染色されたプレートをグラフ表示したものを示す。 ＣＰＥの程度は、ウィルスを受入れていない対照穴ｔＣ＋のパーセントとして表 す。Ｘ−＆？ウィルスに対するＣＰＥ終点の希釈は、２ｑ時間及びダざ時間に対 してそれぞれｌ：Ｓ及び／：、３００である。 この検定は、Ｍａｄｉｎ　−Ｄａｒｂｙ犬腎臓上皮（ＭＤ（、に）細胞の単層に 対するインフルエンザウィルスの細胞変性効果（ＣＰＥＩに基づいている。ゴー シュ（Ｇａｕｓｈ　ｌ外、Ａｐｌ）ｌ　ｉｅｄ　Ｍｉ℃ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｓ 　／　６．３ｇｇ−５ｑ／％（／９Ａｇ＋。 中和検定は、血清をマイクロタイタープレートに階段希釈液（５ｅｒｉａｌ　ｄ ｉｌｕｔｉｏｎｓ　Ｉ　ｆつく９１次いで各穴に１４３時間で完全なＣＰＥをも たらす、力価検定により先に示した希釈でｌアリコートのウィルスを加えて実施 される。すなわち、Ｘ−Ｑ？ウィルスに対しては、これはγラントイン液のｉ： ｓｏｏ希釈液であった。私達は、浄書（内容に変更なし） ４ 詩表−５９−５０ｉ７１４　（６） これは約１０．０００プラ一ク形成単位／穴であると測定した。 図３に示したデータは、図２に関して述べた七関し一般法を用いて得られた。血 清は、９６穴プレ一トＩ！Ｚ５０μｍ　２倍希釈液をつくった後、おおよそに希 釈した（図２から１＝３００）ウィルス５０μｉを添加して力価測定した。３７ °むで６０分間の保温後、各血清−ウィルス混合物を４浄したＭ　Ｄ　Ｃ’　Ｋ 細胞の単層を含んでいる９６穴プレートの対応する穴に移した。この方法の残り は図２に示すとおりである。対照の穴（Ｃ）は血清もウィルスも含んでいなかっ た。 図３は、抗ペプチド抗血清の組合せによるＸ−４７ウイルスの中和結果を示す、 ＮＲ３（止木つ号ギ血漬）は、抗［［Ｉ漬を組合せて試験する時の希釈係数を補 償するために、試験されている抗血／ｉｌをに４容量の正常ウサギ血清で希釈す る己とを示す。力価は表１に示すように５Ｏ％中和の点として表される。抗血清 は、（＄）抗Ｘ４７ウイルス；　（ロ）正常ウサギ血清；　（○）抗ペプチド− ２・３；（△）抗ペプチド−２４；そして（◆）抗ペプチド−２３及び２４゜ 表１に記載の結果から、多数のペプチドがインビトロでのＸ−４７ウイルス（８ ３Ｎ２）に対する中和活性とともに抗体を誘発することがわかる。 表１　抗ペプチド抗血清によるｘ−９７ウイルスの１６−非結合　５−ｉ。 １７−非結合　Ｏ つ　つ　ＩＱ−’１０ 表１　（つづき） ２３−非結合　λｏ−１Ｉ。 コグ−非結合　２Ｏ−４ｔ０ ２３　３ コ乙　ｌＩｏ−ｇ。 Ｘ−９’７　／２６０ ａ、中和検定の詳細を図３に関して上に示す。 ｂ、これらの数字は、図／に示すように、対応する数を有するペプチドに対する 抗血清を示す。 Ｃ１この力１ｉＩｌｉは、ＣＰＥが対照の５０％に阻害された合、血清希釈範囲 の逆数をとる。データは７回の実験代表値である。 ｄ、抗血清の最高濃度すなわち非希釈でも、正常ウサ血清の対照に対して防護の 兆候がなかったときに力価口とした。 上で検討したペプチド類は、赤血球凝集素分子におけ位置に関して、λつの明確 なグループに分れるようでるる。そのグループとは。 ｌ　以下を含むジスルフィド橋を含有する分子の部分。 ａ、　ライ’Ｊ　（Ｗｉ　ｌｅｙ　）外の提案に係る抗原性部位ＴｈＣ“〔ウィ リー外、Ｎａｔｕｒｅ　、　２　ｇ　９．３り３−３’１ｇ　＋／９ｇ／）〕。 これは、ンヌテインＳ３とンスティ／、２りｇの間のジスルフィド結合により形 成された分子内の突起部である。ソステイ／Ｓ、？の部分にあるペプチド（ペプ チドＳ、Ｉり及びり）とシスティンコクｇ（ペプチド２／及びλ３）は中和性抗 体を誘発した。 ｂ、　システィンλｇ、２とシスティン３０６の間のジスルフィド橋。これらの システィンを含むペプチド２．２及び２０に対する抗血清は中和性であった。 ｃ、ＨＡ、のシスティン／ＳとＨＡ２のシスティン／３りの間のジスルフィド橋 。私達の後者のシスティンを含有するペプチドを合成しなかったが、ペプチド２ に対する抗血清は低中和力価を示す。 Ω　前、躯体ＨＡがＨＡ、とＨＡ２に分裂する部位の周囲の部分。ガーテ７　（ Ｇａｒｔｅｎ　）外、Ｖｉｖｏｌｏｇｙ　％　／　／　５　Ｘ３Ａ’ｌ−ジり’ ｉ（ｉｑｇ、ｉ）。すなわち、ＨＡ、のカルボキン末端（ペプチド２０）及びＨ Ａ　２のアミノ末端（ペプチド、２グ、及び程度が低いがペプチド、２Ｓ）は中 和性であった。さ、らに、前駆体）−ＩＡの分裂部位を表すペプチド（ペプチド 、２６）も中和応答を与えた。 実際、ＨＡ２の疎水性アミン末端はＨＡ中で最高に保存された配列である。ウォ ーターフィールド（／ｑ７９１゜それは、センダイウィルレス融合糖タン・々り 質のＦ、成分のアミン末端に類似し〔ゲンングｆ　Ｇｅｔｈｉｎｇ　ｌ外、Ｐｒ ｏｃ−Ｎａｔ　１．　ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　％　７５　％、２’）３ ’）〜λフダθ（１９７ｇ）〕、したがって膜融合段階に含まれ得る。ＨＡ２ア ミノ末端はＨＡ）リマーのｐ■で分子内にコンフォーメーションの変化があるこ と”が化はＨＡ２のアミン末端をはじめとする分子の諸部分を露出させると考え られる〔リチャードンン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　ｌ外、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　 ／　Ｏ５、２０！−２２２（／　９ざＯ）〕。 いずれの場合でも、抗ペプチド血清の中和力価°は完全なＸ−９７ウイルスに対 してつくられた血清の中和力価より小さい。したがって、抗ペプチド血清の組合 せがどんな効果を生み出すかを見ることは興味深い。図３は、最高の中和活性を 個々に実証された抗ペプチド抗血清の組合せによるｘ’　−＋りの中和を示す。 このデータは、血清組合せの相乗効果はないことを示す。力価はそれらの部分の 本線な和・であり、各部分が独立に作用していることを示している。普通の配列 含まれるペプチドに対する血ｉの力価は付加的ではない。中和活性をもたない抗 血清を組合せて試験しても中和活性を示さないし、これらは中和能力をもつ血清 によっても刺激されない。 Ｂ、他のインフルエンザウィルスとの相互反応性多数のインフルエンザウィルス ＨＡ分子のアミノ酸配列を、それらＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列から誘導した 。ＨＡサブタイプの変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｌにも拘らず、かなりの保存が 配列間に存在する。ウェブスター外、２ｇ９．３７３〜３７ｇ　（／９ｇ／　ｌ 　；及びゲンング外、Ｎａｔｕｒ’ｅ　Ｘ／　ｇり、３７３〜３’７ｇ　（／９ ｇ／　ｌ。これらの部分には、私達が私達の抗ペプチド抗血清を用いて中和活性 を実証した部分が含まれている。表コは、本発明の抗体を含有する抗ペプチド抗 血清が異種の（ｈｅｔ’ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｌ　ウィルスを相互に中和するこ とができることを実証するデータを示す。 表λ、抗ペプチド抗血清による他のインフルエンザウィルスの相互中和 ＡＢＣＤＥＦＧＨ 血清（田−）ｕ−＋ｌＮｌ＋　（）−１／Ｎ／＋　（田に＋　（Ｈ／Ｎ／］　（ 田に）（田に）ｘ−４／７ｉ、：ｕｏ　ｉｏ−、ｖ　ｏ　ｉ、ｕｏ　ｏ　ｉｘｏ 　１ｗ　。 Ｘ）　１ｏ＝ｘｒ　５−ｉｏ　、　ｏ　ｉｏ−、ｖ、、ｉ、ｓ−ｓ　、：ｚ、ｓ −ｓ　ｘｔ−ｍ　。 ＃　Ｊ−ｕ　１Ｏ−Ｘ）　５−１０１Ｏ−Ｘ）　１０−．２０７２−’１０　’ １０−ｇ０１０−Ｘ）ｒｑ　ｖ−ｇｏ　、：ｖ−ＪＩ０’ｒ、ｓ−ｓ　１ｏ−ｖ 　、：ｖ−ｉｎ　、：ｖ−ｍ　ｔｉｏ−ｇｏ　ｉｏ−、：ｖｈ　ｌ１０−ｇｏ　 ｘ−ｍ　ｒ、ｓ−ｓ　ｘｔ−ｍ　ｔｏ−ｖ　１０−ｖ　ｔｍ−ｇｏ　１ｏ−ｖ１ ウィルス：　Ａ＝Ｘ−４７；　Ｂ＝ＭＷＳＮ／３３”。 Ｃ＝Ａ／５ｗ１ｎｅ／７　ｂ／／　：　Ｄ＝Ａ／ＥＮＧ／４’２／２　：Ｅ＝− 、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／り’７　：　Ｆ＝Ａ／ＰＣ／／／）３：Ｇ　＝　Ａ　／ 　Ａｉｃｈｉ　／　２　／６ｇ　；　）−１＝　Ｂ／ＨＫ／ｇ／り３゜寸常２ウ サギ血清。 ※示した数値より少ない 他のＨ３菌株はｘ−ｑフの中和パターンに類似した中和パターンを示す。反対に 、Ｈ１菌株はこの高力側坑Ｘ−４７ウイルス血清によっては中和されなかったが 一１抗ペプチド血清の少なくともいくつかにより中和された。 合成ペプチド、１３．２’ｌ及び２乙に対する抗ペプチド血清が特に有効であっ た。Ａ／ＷＳＮ／３３１ウィルスＢ：Ｈ／Ｎ／　）が抗Ｘ−＋７抗血清により中 和される程度は、Ｈ３サブタイプウィルスに対する抗ウイルス抗血清の性能に比 べて重要でない。ＨＡ配列が入手可能なこれラノウィルスにと９、結果はＨ／サ ブタイプとＨ３サブタイプの間のアミノ酸配列の相同性の程度と一致しているよ うである。 私達は、インフルエンザウィルス赤血球凝集素の特定部分に対応する合成ペプチ ドが同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ウィルスに対して中和性抗体応答を誘導する ことを実証した。 さらに、中和性抗体を組合せると合算されてより強力な中和血清ができる。した がって、２種以上のペプチドを用いる同時免疫により、多数の部位における共同 的な中和を行うことができる血清ができる。不活性血清のグループは相乗的に組 合わさってウィルスを中和することがなく、多数の大きな抗体分子をＨＡの露出 した部分に結合させるだけでは感染と複製を阻止するには不十分であることを示 している。 データは、感染及び複製の過程で機能的である部位又はジスルフィド橋により形 成される部位のような構造的に区別できる部位

【抗体を結合す、る必要があるこ とを示唆している。抗Ｘ−＋７ウイルス抗血清に比して相対的に低い抗ペプチド 血清の力価は、恐らく、抗ペプチド抗血清中の、対応するアミノ酸配列が感染性 ウィルス内で獲得するコンフオーメーンヨンを認識する抗体の割合が限定されて いるためであろう。さらに、抗Ｘ　−４，’７ウイルス抗血清は他のウィルス成 分、例えばｌイーラミダーゼに対する抗体を含有し、これらはこの血清中のＨＡ 抗体の中和活性を高めることがある。 私達の研究において、私達はインフルエンザウィルス（Ｈ３サブタイプ）の部分 に対応する合成ＨＡペプチドに対する本発明の抗血清のいくつかがＨ３サブタイ プの変異株、並びに他のインフルエンザＡウィルスＨＡサブタイプの代−表的な ものと７つのインフルエンザウィルスに対して良好な程度の相互反応性（相互中 和性）をもつことを示した。このことは特に興味をそそされる所である。という のは、ｘ−ｙフウイルスに対しては抗ペプチド血清よりずっと高い中和力価を有 する抗Ｘ−グアウィルス抗血清が異種ウィルスに対しては全く不活性であるか、 非常に小さな活性しか示さないのであるから。さらに、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　 ）外、止揚文献、による研究により、抗Ｘ−＋フウイルス抗血清は合成ペプチド をまるで認識しないことがわかっている。この不一致の理由は、完全なウィルス の制限された免疫原性又は完全なウィルスに対する免疫応答への炭水化物の影、 響に起因するのかもしれない。 これらのデータは、（従来の免疫におけるように）完全なウィルスに対する免疫 応答が合成ペプチドを用いて得ることができる免疫応答とかなシ異なっているこ と、さらに後者はペプチド免疫原を適切に選べばインフルエンザに対する一般的 な接種に有効に使用することができることを示唆している。 上記の相互反応性ペプチドのアミノ酸残基配列を下式に左から右へ、アミン末端 からカルボキシ末端の方向で表す： ペプチドＳ　ＣＮＮＰＨＲＩＬ　： ペプチド２０　ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲ；ペプチ ド、２３　ＳＩＭＲ３ＤＡＰＩＧＴＣ５ＳＥＣＩＴＰＮＧＳＩＰＮＤＫＰＦＱＮ ＶＮＫＩＴＹ：ペプチドΩ１１ｔＲＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧＦＲＨＱＮ：ペプチド２６ＥＫＱＴＲＧＩＦＧＡ。 図／を調べるとわかるように、ペプチドＳは、アミノ酸残基配列において、Ｘ− ＝フインフルエンザウイルスのＨＡ　＋分子の位置３３−６０（アミノ末端から ）に対応しており；ペプチド−〇は、アミノ酸残基配列において位置３０１．− ３３０（アミン末端から）に対応し、Ｘ−９７のＨＡ１分子のカルボキシ末端を 含んでおり；−ニブチド２３はアミノ酸残基配列においてＸ−１ｌ？のＨＡ。 分子の位置２乙？　−３００（アミン末端から）に対応しており：ペプチド２ダ はアミノ酸残基の配列においてＨＡＩ分子の併置３３０（カルボキン末端）から 位置２９（、Ｘｌ’りのＨＡ２分子のアミン末端から）に対応しており；ペプチ ド、２乙は位置３；乙（ＨＡＩ分子のアミン末端から）からカルボキン末端（位 置３３０）を通ってＸ−＋７のＨＡ２分子の位置乙までに対応する。 アミノ酸残基配列がＸ−クク以外の表２に列記したインフルエンザウィルスの菌 株の赤血球凝集素分子中の上記アミノ酸残基の位置に対応する合成ペプチドは、 その赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に該ペプチドが対応しているよ うな菌株又はサブタイプを中和するほか、上記表２のインフルエンザ菌株又はサ ブタイプの少なくとも一部と相互反応し中和する□抗体の産生をも誘導すると考 えられる。 理論てこだわることを望むわけではないが、合成ペプチドを用いる免疫によって 誘導される相互反応的な中和性抗体の産生は、免疫する合成ペプチドの位置配列 の役割であると考えられる。したがって、相互反応的な中和性抗体は、アミノ酸 残基配列がペプチドＳＸ、２０１．２３．２ダ又は２乙の赤血球凝集素分子上の 位置の同類のアミノ酸残基配列に対応する合成ペプチドで免疫することにより誘 導することができる。 上記ペプチドの位置は接近していること、ペプチドが約ｇ〜約グ０のアミノ酸残 基を含み、これらペプチド残基の配列が上記ペプチドの７種の配列に対応してい る限シ、約３個のアミノ酸残基分までいずれかの方向へ変えることができること も気づく。９対応する〃の語はアミノ酸残基、配列に関して用いる時は、λつの ペプチドの配列又は１つのペプチドとタンパク質の配列が非常に類似していて、 本発明のペプチドに対して産生された抗体が相互反応し、そのペプチド及び第二 の対応するペプチドもしくは対応するタンパク質の両方に結合することを意味す る。アミノ酸残基配列は同一であることが好寸しいが、配列の完全な同一性は不 要である。例えば、リンンとアルギニン、又はグルタミン酸とアスパラギン醗、 又はロイシソとイソロイ７ンのようなアミノ酸残基間の保存型の変更は行われて もよい。さらに、相互反応的な抗体結合性を壊さなければ、配列に残基を付加し たシ残基を削除することができる。 Ｃ，ヒトＴ細胞応答 動物宿主の防御は、典型的には、抗体産生性８細胞（体液性応答）の参加と様々 な機能をもつＴ細胞（細胞性応答）の参加の両方を含む。上述の結果は主として 抗体産生の８細胞刺激に関連する。 本発明のペプチドがＴ細胞増殖に及ぼす影響を評価するために別の研究が行われ ている。該研寄はラム（Ｌａｍｂ　ｌ外、Ｎａｔｕｒｅ、３００．６６−６９（ １９ｇ２）に報告されておシ、その開示は参照によシ本明細書に含められる。 簡単に述べると、ラム外の報告に示された結果は、菌株Ａのインフルエンザウィ ルス（Ａ／テキサス／／／７？：Ｈ３Ｎｕ＋に対する公知の応答として選ばれた ヒト供血者の末しよう血液リンパ球から導ひかれたＴ細胞クローンの増殖を誘導 するの知、合成ペプチド２０が特に有効であったことを示している。ペプチド− 〇の配列は提案した抗体結合部位から離れているが、ウィルスに対する細胞性応 答にとり免疫的に優勢のよう丁ある。 ペプチド２０のアミノ酸残基配列は図１及び上記セクションＢに示されている。 ペプチド２０はアミノ酸残基配列において位置３０６から３３０（ＨＡ、分子の カルボキシ末端）に対応する。 別の言い方をすると、このペプチドはＨＡ、のカルボキシ末端からＨＡ、のアミ ノ末端の方へＨＡ、中の最もカルボキシ末端に近いシスティン（システィン３０ ６）に隣接する残基まで延びている。完全なＨＡ、分子では、システィン３０６ は位置２ｇ２にある残基とともにジスルフィド結合を形成するシスチン残基の一 部として存在する。したがって、システィン３０６は、当業界で知られているよ うに、より正確には半シスチン（ｈａｔ　ｆ　−ｃｙｓｔ　１ｎｅ１３０６と称 される。ＨＡ、分子のこの部分が、インフルエンザウィルスでＴ細胞増殖を一般 に刺激する部分（位置、３０１．−３３０、すなわちカルボキシ末端の位置から ＨＡ、分子上の最初の半シスチンまで）であると考えられる。 本発明の別の実施態様は、アミノ酸配列が単独で又は結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ ｅ　）として合成ペプチド２０のアミノ酸残基配列に対応するペプチドを利用゛ して１．■細胞増殖を刺激し、及び／又はＢ細胞による抗体産生の誘導も行う。 このペプチドはこうした目的に使用でき、またｌ又は２以上の追加ペプチドある い゛はそれらの結合体と共同゛させて使用し、Ｔ細胞及びＢ細胞の双方を刺激し て細胞性及び体液性の両応答を生じしめることができる。 応する合成ペプチド結合体６種の混合物でＣＡＦ、マウスを免疫した。各マウス に、完全フロインドアジュバントに溶かした２０μｇの混合ペプチドそれぞれを 含有する３種の注射液を投与した。グリーン（Ｇｒｅｅｎ　ｌ外、止揚文献、が 論じたＥＬＩＳＡ検定法を用いると、Ｓ週間後の血清力価はθ〜３２０の範囲で あった。類似のウサギの力価は約Ｓ１２θであった。 一見低力価がみとめられたにも拘らず、感染性インフルエンザウィルスによる鼻 腔内攻撃に対する防護が認められた。すなわち、食塩水と完全７０インドアシユ ・くンドの注射を受けた対照グループでは１５動物のうち９匹（６０％）が死ん だが、ペプチドで免疫した（接種した）グループでは１５動物のうち３匹しか死 ななかった。 上記の防護測定で利用したペプチド混合物は、ベフ′チドー、グ、り、／／、／ ワ及び２０（表／）をほぼ等量ずつ含有していた。各ペプチドはＫＬＨに結合さ れた。 上記測定の接種記録は次のとおりであった。７週令の（ＩＩ　−ｗｅｅｋ−ｏｌ ｄ　ｌ　ＣＡ　Ｆ　＋　雄マウスのグループに、完全フロイントアジバントに溶 かしたペプチド含有ワクチン又は食塩水含有ワクチンを０日、／ｌ／日及び３５ 日に接種した。３５日に血清力価のデータを得るために動物から採血した後、３ ｇ日にＬＤ５ＧないししＯＳＯとなるように、すなわち集団のＳＯＳからｇ０％ を殺すように計画した濃度のマウスに適応させた（　ｍｏｕｓｅ−ａｄａｐｔｅ ｄ　）Ｘ−弘フインフルエンザウィルスを鼻腔内接種により攻撃した。 攻撃した動物を次に隔離設備に入れ、病気の兆候を毎日調べた。隔・離から３週 間後、死亡百分率を計算し対照グループと比較した。 その長さに応じて、ペプチドは単独で又はにＬＨとの結合体として用いた。その 溶解性に応じて約３ｑより少ない残基を含有するペプチドは典型的には結合体と して用い、−万３Ｓ残基より長いペプチドは典型的ＫＦｉ単独前述し、表／に示 したように、本発明のペプチドは単独で使用でき、あるいは担体（ｃａｒｒ、ｉ ｅ、ｒ　）に結合させ結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｌとしても使用できる。キ ーホール・リンペット・ヘモンアニン（ＫＬＨ）が表１の結果ｔ−得るために結 合体の担体として使用された。結合体を調製するの（（有用なその他の担体とし ては、□これに限定するものではないが、アガロース、架橋アガロース、エテス チン、カーキュビン（ｃｕｒｃｕｂｉｎ　ｌ　、ラン血清アルシ゛ミン、ヒト血 清アルブミン、ヒツジ赤血球のような赤血球及びポリ（Ｄ−リンン：Ｄ−グルタ ミン酸）のようなポリアミノ酸がある。 結合体を利用する免疫が、単独の及び担体に結合されていないペプチドを使用す る同様の免疫よりも効果的で中和性抗体産生（体液性）応答に及ぼす影響を調べ るために研究を行った。 これらの研究で用いたペプチドは、そのアミノ末端にＣｙｓ残基を含む合成ペプ チド、２０であった。これらの研究での担体はファルマシア・ファイン・ケミカ ルズ（ピスキャタウエイ、ニューシャーシー州）から入手できるチオプロピル− セファロース（ｔｈｉｏｐｒｏｐｙト５ｅｐｈａｒｏｓｅ）乙Ｂとチオプロピル −セファロース４Ｂであった。 これら研究からの表３（下記）に示すデータは、両方の担体とも免疫学的に有効 であったことを示している。 事実、セファロース６Ｂ結合体に応答して生じた抗血清の［：ＬＩＳＡ検定法（ グリーノ外、止揚文献）により得た力価はＸ−４’？ウイルスを用いて得た力価 （約７６００〜．３２００　）と同じオーダーの大きさであったので、セファロ ース６Ｂ結合体はＸ−’７？ウィルスそのものとほぼ同程度有効であった。 表　３ セファロース結合ペプチド２０で免疫したマウスのグループｌ：セファロース乙 Ｂ−ペプチド２０　（５０μｇ　のペプチド（結合体）／マウスおよ′び９＋ｙ のａｌｕｍで）の３回のｉ　ｐ／ｓ　ｑ注射１グループλ°セファロース６Ｂ− ペプチドｒｏ　（ｓ。 ８ｇのペプチド（結合体）／マウスおよび５　Ｔｎ９　Ｘ　ｍｙｃｏｂ’のＣＦ 　Ａ３）の３回のｓｑ注射２グループ μｓのペプチド（結合体）／マウスでｌＩ■のａｌｕｍとともに）　（Ｄ　／　 回）ｉｐ／ｓｑ　注射１／／　０ ／２　０ ７　３　ｇ　Ｏ グループグ：セファロースｌＩ日ーペプチド２０　（３０μｓ　のペプチド（結 合体）／マウスで、Ｓｍ７　ｍｙｃｏｂ’．のＣＦＡ３　とともに）の３回の１ 　’　ｉｐ／ｓｑ　＝　／回の腹腔内注射と９回の皮下注射（各ヒップと各肩に １回ずつの皮下注射）Ω　ｓｑ−＝上記のとおりのグロの皮下注射３　ＣＦＡ一 完全７０インドアジュバント’Ａ　Ｍｙｃｏｂ−アジュバントに添加したマイコ バクテリウム・ノベルクローンスｔ　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓ　）　Ｈ　、３フＲＡ０昔　示した数値よ．り小さい。 セファロース担体としてのＫＬＨよりもいくつかの利点を有する。これらの物質 は、架橋多糖類鎖（アガロース）、スペーサ部分及び保護されたチオール基（ペ プチドとの結合反応前）からなる固相を有する。コーチオビリジル保護部分は、 合成ペプチドに利用できるシスティン−ＳＨ基によって容易に置換される。この 置換反応は食塩水溶液で起９、カンプリング剤を必要とせず、効率的であシ（セ ファロース乙Ｂ：収率＝６０〜ｂｓｓ　：セファロースダＢ：収率ー４’θ％ｌ 、−一チオピロリドンの遊離による３　ｌＩ３　ｎｍにおける吸収の増加によシ 容易にモニターされる。 チオプロピルセファロース６Ｂは、チオプロピルセファロ−スゲＢに比較して、 高い結合力（　ｂｉｎｄｉｎｇｃａｐａｃｉ’ｔｙ　ｌ　、大きな結合効率例え ば６６〜ろＳ％対ダ０チを有し、明らかに大きな免疫原性を示す。さらに、可能 性のあるヒトワクチ／として、チオブロピルセシアロース乙Ｂーペプチド、２０ 結合体の免疫原性は、ヒトワクチンに使用されない完全フロインドアジュバント （ＣＦＡ）の存在下よりもヒトに使用することができる水酸化アルミニウム（　 ａｌｕｍ　ｌ　の存在下において一層犬である。 ペプチドは、０５モルのＮａα、０．　０　０　１モルのエチレンジアミン四酢 酸及びθ２　％　ＮａＮ　３をさらに含んでいるｐＨ　７の税気された００１モ ルりん酸塩緩衝液中で、セファロース担体に結合した。セファロース４ＢＩＣ結 合するためには、／コの包装した膨潤セファロース４Ｂを、Ｓη／ｒｎｌのペプ チドをさらに含んでいるりん酸塩緩衝液コ一に加えた。セファロース６Ｂに結合 するためには、θＳ−の包装した膨潤セファロースろＢを、５キ／−のペプチド をさらに含んでいるシん酸塩緩衝液Ｓ−に加えた。反応溶液を４℃の温度で一夜 穏やかに攪拌し、結合した生成物を使用前に緩衝液で望ましいように洗浄したセ ファロ−スペースで水酸化アルミニウムの系は、ヒト接種に関してはいくつかの 利点をもつが、担体としてにＬ）−１を希釈剤／アジュバントとしてＣＦＡを免 疫処置に使用すると、他の変数についてのデータ比較上有用な系が得られる。こ のような系を、合成ペプチドを免疫原として用いる単一の免疫処置記録の効果を 評価するのに使用した。結果を下の表ゲに示す。 コ　３　０　０　０　、ＯＱ　０ ３ｓ　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　、Ｑｔｔｏｔ４ｏ。 ’ｔｓｏｒｏ”　ｏ　ｏ　ｏ　。 ｓ　ｓ　、２ｏ”、２ｏ”　ｏ、　ｏ　ｇｏ　ｇｏ。 乙　２０　０　２０”　、！ゲ　、２ゲ　３２００　１．’１００’７　２０　 ２０“　２０″　２０”　２０”　７２旬　／乙□Ｏｇ　、２ｏ　ｏ　、２ｏ＋ 　＝　、：ｘゲ　乙グ。ｏ　６グ。０≠９　．２０　０　．２０”　／、２ｇＯ ／、２ｇＯ，３，２００／、、４１００１０　２０　．２０”　’１０．　．２ １１．０”　／ＩｇＯＡ’１００　、ｌ。０／／　グｏ　、；ｘｏ”　、：ｉｏ ’　ｉバ。　／、２ｇ。　ｔ、ｙｏｏ＋　ｂｔｉｏｏ＋／＝２　ｔｉｏ　ｏ　、 ：ｔｏ“　ｇｏ　１ｔｏ３−ｇｏ　６ｔｉｏθｔ３　ｑｏ　θ　ｏ　２ｏ　ｌｂ ｏ　ｂｑｏｏ　６ｔｔｏ。 グｇり１１９ｇ、ｌＩに記載のように、結合体は、約′グθ〜５ｏμｇ　のペプ チドと約２５〜３２μｇ　のＫＬ、Ｈから調製された。１ｏｏｓの反応を仮定し た。 免疫処置は、全容量θ２−／マウス中に。６■／マウスのマイコバクテリウム・ ノベルクローシスヲ含Ｓ 有する完全フロインドアジュバントで行った。 コ　注射した各ＫＬＨ結合体中のペプチドの量、μＩ０ユ　免疫処置を行った後 足された経過週間の時点で、グリーン（Ｇｒ’ｅｅｎ　ｌ外、Ｃｅ１ｌ１．２ｇ 、、、り７７〜’Ｉｇ７（／ｑｇｌ）に記載のようにしてＥＬＩＳＡ検定法でめ られた力価。 繁　示した数ｆ直より小さい力価。 ナ　示した数値より大きい力価。 上記データは、ｘ−ｑフィンフルエンザライルスト反応するかなりの量の抗体が 、ＫＬＨ−ペプチド−〇結合体で免疫した３週間後にマウス内に誘発されていた ことを表す。それらの力価は示されているように次のｑ週間にわたって増加し続 け、免疫処置後ｇ〜ノ、２週の期間でピークになった。単一の注射後乙ケ月で、 °Ｓ／ｉＪ　の投与量を受けたマウスの力価は約ｇ００〜約３．２ｏｏで乏った ；コ０μｇ　の投与量を受けたマウスの力価は約ｇ０θ〜約乙４ｔ００以上であ った；そしてり０μｇ　の投与量を受けたマウ′スの力価は約３．．２００〜６ ｑ００以上であった。私達が前に論じた、×−ｑ７ウイルスを用いる鼻腔攻撃（ １ｎｔｒａｎａｓｅｌ　ｃｈａｌｌｅｎｇｓ　）　に関する研究は、上記の乙ケ 月の範囲の抗体力価を有するマウスはウィルスの感染に対し防護されることを示 した。 単一の免疫処置からの上記データは多数回投与（ｍｕｌｔｉｃｌｏｓｅ　）記録 を用いて得られた結果よりも優れてゆっくり減退するパターンは、ペプチド免疫 原の単一の注射がインフルエンザに対する長期間の免疫を誘発するのに十分であ る可能性を示唆している。 Ｆ、環化ペプチド アミノ酸残基配列がＨＡ、の位置３０６〜３３ｏ（カルボキシ末端；ペプチド− 〇）及びＨＡ、の位置／’Ｑ。 〜／６０ＣウィＵ　−（Ｗｉ　ｌｅｙ　ｌ外により同定された抗原部位、Ｎａｔ ｕｒｅ　、　’２　ｇ　９．３９３〜３７ｇ（７９ｇ１）〕に対応している環状 ペプチドも調製した。最初の合成された直鎖の環状ペプチド前駆体はアミノ及び カルボキシ末端にシスティン残基を含み、これらは茨に酸化されて環状及び／又 はオリゴ−性物質を生成した。該オリゴー性物質もここでは環状ペプチドと称さ れる、というのは遊離のメルカプタンがエルマン（Ｅｌｌｍａｎ　ｌ　ｆス）［ Ｅｌ　１ｍａｎ　、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｓ、　、　ｇ　 ２．７ｏ７７（／？５９１　’Ｊにより全く検出されなくなるまで酸化が続行さ れるからである。こうしてペフ：チドの末端には遊離の−ＳＨ基は実質的に奮然 存在しないことが示さ、れた。 −メーションは比較的直線的である。赤血球凝集素の位置１ｔｉｏ−ｉｂｏの部 分は、天然のタンパク質中の自然な環状のコンフォーメーションヲ形成する。 変異株を分析することにより、位置１ｔｔｏ−ｉ乙。の壌が天然の赤血球凝集素 に対する抗体の発生上重要であることがわＺ）つた。この部分に対応する線状ペ プチド、例えばペプチド／Ｓ（位置／１ｌ−０−／３乙に対応する）は、完全な ウィルスと反応する抗体の産生を一貫してできなかったが、それらの抗体は赤血 球凝集素とは反応する。 ペプチドを０１モル重炭酸塩溶液に溶かして環状ペプチドを調製した。環状でモ ノマー性の又は実質的にモノマー性のペプチドを、ペプチドを０／η／ｒｎｌの 濃度で溶解することにより調製し、一方オリゴマー性物質は１０ｍｙ　／　ｍｌ の濃度で調製した。このように調製したペプチド溶液を、大気圧の酸素に暴露し て環化性酸化を起させながら一夜攪拌した。その後酸化した溶液の反応完了を試 験し、次いで凍結乾燥した。このように調製した乾燥物質を次に免疫処置に使用 した。 上述したεＬＩＳＡを使用して、線状のベブチドコ０に対するウサギとマウスの 抗体が環化ペプチド、２０を、特にオリゴマー状態のペプチド、２Ｏｆ認識する ことがわかった。Ｘ−４７ウイルスに対する抗体は環化ペプチドに結合しなかっ た。同様に、抗Ｘ−グフ血清は部位Ａ環構造に対応する環化ペプチドに結合しな かった。 要約すると、より具体的な実施態様では、本発明は明確に特定されたペプチドに 関する。当業者は、上に開示したペプチド類の免疫学的特徴を実質的に損わない で該ペプチド類の正確な配列からのわずかなズ、しは可能であることを理解する であろう。 本発明の、中和性で防護的な抗体を産生ずるペプチドは、次のアミノ酸残基配列 （左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）を酸化され、環状もしく はオリゴマーの形態で含んでいる、 （ａｌ　ＳＩＭＲＳＤＡＰＩＧＴＣ３ＳＥＣＩＴＰＮＧＳＩＰＮＤＫＰＦＱＮＶ ＮＫＩＴＹ；（ｂｌ　ＲＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷｖ’ＧＦ ＲＨＱＮ：（ｃｌ　ＥＫＱＴＲＧ　Ｉ　ＦＧＡ　：（ｄｉ　ＣＰＫＹにＱＮＴＬ ＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲ；（ｅｌ　ＣＮＮＰＨＲＩ　Ｌ　： （ｆｌ　ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲＣ；及び（ｇｌ 　ＣにＲＧＰＤＳＧＦＦＳＲＬＮ＃ＬＹＫＳＧＳＣ０■、レセプター分子 生物学的に活性なレセプター分子が本発明の別の実施態様を構成する。これらの 分子は、本発明の合成ペプチドに対しであるいはその担体との結合体に対して誘 発された又は育てられた抗体、又は抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分で ある。好ましい実施においては、レセプターは本発明の好ましい合成ペプチドに 対して育てられる。 レセプターは、少なくとも・生理学的ｐＨ及びイオン強度の水溶液中で合成ペプ チドと混合されると、少なくともレセプターが自然に生ずるウィルス又は赤血球 凝集素分子とも同じ条件で結合することが好ましい。レセプターが約Ｓ〜約７の 範囲内のｐＨ値で、そして蒸留水のイオン強度ないし約１モル塩化ナトリウムの イオン強度のようなイオン強度で合成ペプチド、赤血球凝集素およびウィルスと 結合することがより好ましい。 抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分は抗原に結合する抗体の部分である。 このような部分には、周知の酵素切断技術（ｅｎｚｙｍａｔｉ、ｃ　ｃｌｅａｖ ａｇｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｌにより抗体から製造されるＦａｂ　、Ｆａｂ ’及びＦ（ａｂ’１２　フラグメントが含まれる。抗体が当該技術においてゝゝ 育てられる〃（ｒａｉｓｅｄ　）又はＮ誘発される“（１ｎｄｕｃｅｄ　ｌ　と して論じられるので、抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分も、抗体からこ のような物質をつくるには次の切断段階が通常必要であるとの理解の下で９育て られる“又はゝゝ誘発される“ものとして本明細書で論じられている。 レセプター分子は先に述べた抗血清の抗体の場合のようにポリクローナルでもよ いし、あるいはレセプターはモノクローナルでもよい。モノクローナル抗体の製 造技術は周知であり、本発明のモノクローナルレセプターは、アーンハイク−Ｉ 　Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ　ｌ外、　ＮａｔｕｒｅＸ、２９　ＩＩ。 、！？ｇ−，２ｇＯ（／ｑｇ／　）により行われたように、本発明の合成ペプチ ドを好ましくは担体に結合された状態で免疫原として使用することにより製造す ることができる。 モノクローナル抗体は、典型的には、ノ・イブリドーマ組織培養から、又はノ・ イブリドーマ組織を導入した動物ナル抗体を、本発明の合成ペプチド又はその担 体との結合体２に対して育てられる〃又は５によって誘発される“ものとして述 べることができる。 レセプターは“指示グループ（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ丁”（時ては ５標識（１ａｂｅｌ　）　〃と称されることがある）とともに利用される。指示 グループすなわち標識、は、免疫反応が起ったかどうかを測定するための、そし である場合にはそのような反応の程度を測定するための手段としてレセプターに 関して利用される。 指示グループは、ヨウ素／２５もしくは／３／°、水素３又はイオウ３５のよう な放射性元素、あるいはフッ素／９又は窒素１５のような核磁気共鳴（ＮＭＲ＋ 分光法において活性な元素の場合のように単一の原子でもよい。 指示グループは、フルオレセインのような螢光染料、又は酵素例えばホースラデ イノ／ユｆ　ｈｏｉｓｅｒａｄｉｓｈ　ｌベルオキ／ダーセ（ＨＲＰＩ等のよう な分子でもよい。 指示グループは、抗体を　１　で標識する場合のようにレセプターに結合されて もよい。指示グループは、抗体レセプターをウサギ内で育てた場合のＨＲＰ−結 合したヤギ抗ウサギ抗体、あるいは　１　のような放射性元素をスタフィロコッ カス・アラレラムから得たタンパク質Ａに結合した場合のような、レセプター分 子と反応する別個の分子又は原子の全体又は部分を構成してもよい。 主要な指示グループがＨＲ，Ｐのような酵素である場合、免疫反応が起った事実 を視覚化するにさらに試薬が必要である。ＨＲＰに対するこのような追加の試薬 には、過酸化水素及びジアミノベンジジン又はλ、二′　−アジノージ＝（３− アチルベンソチアジンン・スルホナト）（誰から、何処の国ないしは州、都市で 入手できるか？）のような酸化染料前駆体がある。 “指示グループ“又はゝゝ標識〃の用語は、本明細書では、レセプターに結合す 九た又は分離して使用される単一の原子及び分子を含むように使用され、これら の原子又は分子は単独で使用されるか追加の試薬と一緒に使用されるかに関わり ない。このような指示グループすなわち標識は免疫化学においてそれ自体周知で あり、これらが他の観点からして新規なレセプター、方法及び／又は系と一緒に °利用される限りにおいてだけ本発明の一部を構成する。 産業上の利用性 安全で効果的な合成ペプチドワクチンをインフルエンザに対して製造することが でき、より普遍的なワクチンの計画の実現可能性がある。これらペプチド免疫原 を用いる接種は、それ自身のパターンをもつ遺伝的意味（ｄｒｉｆｔ　ｌを形成 するに至る。しかし、ウィルス複製に機能的に必要である部位に関してペプチド を選択すれば、その部分で生ずる突然変異はまず死滅させることができる。 浄魯消容に変更なし） 昭和　年　月　日 特許庁長官　志　賀　学　殴 】、事件の表示　Ｐ　ＣＴ　／　ＬＩ　Ｓ　８３　、／　０１２９１３、補正を する者 事件との関係　出願人 ７、補正の内容　別紙の通り 明細書（第１４頁）及び図面の浄書（内容に変更なし）。 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／　アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部分 に対応し、約ｇ〜約９０のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドであって、該 ペプチドは単独又は担体に結合された結合体であり、（ａ）インフルエンザウィ ルスのサブタイプであってその赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に前 記ペプチドが対応しているサブタイプを中和する、並びにｆｂｌ第一のサブタイ プの第２のインフルエンザウィルスを相互中和する、抗体の産生を誘発する動物 を免疫するのに用いられる前記免疫原ペプチド。 ２　請求の範囲第１項のペプチドであって、該−ζプチドのアミノ酸残基配列が 下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応するペ プチド：Ｓ　Ｉ　ＭＲ５ＤＡＰ　Ｉ　Ｇ、ＴＣ５ＳＥＣＩ　ＴＰＮＧＳ　Ｉ　Ｐ ＮＤＫＰ　ＦＱＮＶＮＫ　Ｉ　ＴＹ３　請求の範囲第１項のペプチドであって、 該ヘプチドのアミノ酸残基配列が下式の配列（左から右へ、アミン末端からカル ボキン末端の方向）に対応するペプチドＲＧＩ　ＦＧＡＩＡＧＦ　ＩＥＮＧＷＥ ＧＭＩＤＧＷＹＧＦＲＨＱＮ。 Ｉｌ請求の範囲第１項つペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応するペプ チド。 ＥＫＱＴＲＧ　Ｉ　ＦＧＡ　。 Ｓ　請求の範囲第１項のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応するペプ チド。 乙　請求の範囲第１項のペプチドであって、該ペプチドのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向）に対応するペプ チド。 ＣＮＮＰＨＲＩＬ。 ７　請求の範囲第１項のペプチドであって１．該ペプチドがアミン末端及びカル ボキン末端の両方のシスティン残基の酸化されたメルカプト部分を介してつくら れた環化又はオリゴマー化形態にあり、かつ未酸化形態においてＣＰＫＹＶＫＱ ＮＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＤＣ：及びＣＫＰＧＰＤＳＧＦＦＳＲＬＮ ＷＬＹに５ＧＳＣからなる群から選ばれる式（左から右へ、アミン末端からカル ボキン末端の方向）に対応するアミノ酸残基配列を有するペプチド。 ｇ　請求の範囲第１項のペプチドであって、該ペプチドが合成されたものである ペプチド。 ９　アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部分 に対応し、約ｇ〜約７０のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドを含むインフ ルエンザウィルスに対するワクチンであって、該ペプチドは単独又は担体に結合 された結合体であり、（ａｌインフルエンザウィルスのサブタイプであってその 赤血球凝集素分子のアミノ酸残基配列の一部に前記ペプチドが対応しているサブ タイプを中和する、並びに（ｂｌ第２のサブタイプの第一のインフルエンザウィ ルスを相互中和する、抗体の産生を誘発する動物を免疫するのに用いられる前記 ワクチン。 ｌθ請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向）に対応するペプ チドＳ　ＩＭＲ３ＤＡＰ　Ｉ　ＧＴＣ３ＳＥＣＩ　ＴＰＮＧＳ　Ｉ　ＰＮＤＫＰ ＦＱＮＶＮＫ　Ｉ　ＴＹ。 ／／　請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が 下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応するワ クチンＲＧ　Ｉ　ＦＧＡ　Ｉ　ＡＧＦ　Ｉ　ＥＮＧＶｌ／ＥＧＭ　Ｉ　ＤＧＷＹ ＧＦＲＨＱＮ　。 ／２請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向）に対応するワク チン゛ＥＫＱＴＲＧ　Ｉ　ＦＧＡ　。 ／３　請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が ・下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応する ワクチン：ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲ。 ／ダ請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンのアミノ酸残基配列が下 式の配列（左から右へ、アミノ末端からカルボキン末端の方向）に対応するワク チン゛ＣＮＮＰＨＲＩ　Ｌ　。 ／左請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンがアミン末端及びカルボ キン末端の両方のシスティン残基の酸化されたメルカプト部分を介してつくられ た環化又はオリゴマー化形態にあシ、かつ未酸化形態においてＣＰＫＹＶＫＱＮ ＴＬＫＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＤＣ；及びＣにＲＧＰＤＳＧＦＦＳＲＬ［Ｙ ＫＳＧＳＣからなる群から選ばれる式（左から右へ、アミン末端からカルボキン 末端の方向）に対応するアミノ酸残基配列を有するワクチン。 ／乙　請求の範囲第９項のワクチンであって、該ワクチンが合成されたものであ るワクチン。 ／７　アミノ酸残基配列においてインフルエンザウィルス赤血球凝集素分子の部 分に対応し、約ｇ〜約７０のアミノ酸残基を含有する免疫原ペプチドに対して育 てられたレセプター分子であって、該ペプチドは単独又は担体に結合された結合 体であり、（ａ）インフルエンザウィルスのサブタイプであってその赤血球凝集 素分子のアミノ酸残基配列の一部に前記ペプチドが対応しているサブタイプを中 和する、並びに（ｂｌ第二のサブタイプの第ユのインフルエンザウィルスを相互 中和する、抗体の産生を誘発する動物を免疫するのに用いられる前記レセプター 。 ７ｇ　請求の範囲第１７項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基 配列が下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応 するレセプター゛ ＳＩＭＲ５ＤＡＰＩＧＴＣ３ＳＥＣＩＴＰＮＧＳＩＰＮＤＫＰＦＱＮＶＮＫＩＴ Ｙ。 ／９　請求の範囲第１７項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基 配列が下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向）に対応 するレセプター。 ＲＧ　Ｉ　ＦＧＡ　Ｉ　ＡＧＦ　Ｉ　ＥＮＧＷＥＧＭ　Ｉ　ＤＧＶＩ／’／ＧＦ ＲＨＱＮ　。 コθ請求の範囲第１り項のレセプターであって、該レセフリーのアミノ酸残基配 列が下式の配列（左から右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向）に対応す るレセプター： ＥにＱＴＲＧ　Ｉ　ＦＧ　Ａ　。 ２／請求の範囲第１７項のレセプターであって、該レセプターのアミノ酸残基配 列が下式の配列（左力１ら右へ、アミン末端からカルボキシ末端の方向）に対応 するレセプター。 ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬにしＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＲ。 ２、特許請求の範囲第１フ項のレセプタターであって、該レセプターのアミノ酸 残基配列が下式の配夕１１　（左力＼ら右へ、アミン末端からカルボキ・ン末端 の方向）に対応するレセプター： ＣＮＮＰＨＦｔ　ｌ　Ｌ　。 ２３　請求の範囲第１り項のレセプターであって、該レセプターがアミノ末端及 びカルボキシ末端の両方の７ステイン残基の酸化されたメルカプト た環化又はオリゴマー化形態にあり、力・つ未酸イヒ形態において ＣＰＫＹＶＫＱＮＴＬにＬＡＴＧＭＲＮＶＰＥＫＱＴＤＣ　；及びＣＫＲＧＰＤ ＳＧＦＦＳＲＬＮＷＬＹＫＳＧＳＣからなる群から選ばれる式（左から右へ、ア ミン末端力Ｓらカルボキシ末端の方向）に対応するアミノ酸残基配夕Ｉ］を有す るレセプター。 Ｍ　請求の範囲第１り項のレセフリーであって、該レセプターが合成されたもの であるレセプター。