ES2295584T3 - "dopaje" en mutagenesis de paso. - Google Patents
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Abstract
Un método de mutagénesis de paso a través de un ácido nucleico que codifica un polipéptido prototipo de interés, que comprende: a) seleccionar una o más regiones diana de aminoácidos prototipo en el polipéptido prototipo de interés, codificado por el ácido nucleico; b) para cada una de las regiones diana, predeterminar un aminoácido para que se incorpore a la región diana, en lugar de los aminoácidos prototipos; y c) sintetizar una mezcla de oligonucleótidos que contiene una secuencia de nucleótidos para cada región diana, donde cada oligonucleótido contiene, en cada posición de secuencia en la región diana, un nucleótido que se requiere para la síntesis del aminoácido prototipo del polipéptido, o un nucleótido predeterminado que se requiere para la síntesis del aminoácido predeterminado, donde, durante la síntesis, la relación entre nucleótidos prototipo disponibles y nucleótidos predeterminados disponibles, es igual o mayor que 4:1, donde dicha relación se determina mediante el uso de ladistribución binomial y donde dicha distribución de probabilidad tiene en consideración el número (N) de aminoácidos en la región o regiones diana, y la probabilidad (P) de éxito en incorporar los nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado, y donde X (número total de aminoácidos mutados en una secuencia de longitud N), es menor que N.
Description
"Dopaje" en mutagénesis de paso.
La mutagénesis es una poderosa herramienta para
el estudio de la estructura y la función de las proteínas. Pueden
fabricarse mutaciones en la secuencia de nucleótidos de un gen
clonado que codifica una proteína de interés, y el gen modificado
puede expresarse para producir formas mutantes de la proteína.
Comparando las propiedades de una proteína natural y de las
mutantes generadas, es frecuentemente posible identificar
aminoácidos individuales o dominios de aminoácidos que son
esenciales para la integridad estructural y/o la función bioquímica
de la proteína, tales como su actividad de unión y/o catalítica. El
número de mutantes que puede generarse de una proteína única, sin
embargo, hace difícil seleccionar mutantes que sean informativas o
que tengan una propiedad deseada, incluso si las mutantes
seleccionadas, que contienen mutaciones solo en regiones
específicas, supuestamente importantes de una proteína (por
ejemplo, regiones dentro o alrededor del lugar activo de la
proteína). Por ejemplo, la sustitución, delección o inserción de un
aminoácido particular puede tener un efecto local o global sobre la
proteína. Existe una necesidad de medios para evaluar los efectos de
la mutagénesis de una proteína sistemáticamente.
El Documento WO 91/15581 describe un método de
mutagénesis de paso a través.
G. Weiss et al, describen el mapeo rápido
de los epítopos funcionales de una proteína en PNAS, 1 de Agosto de
2000, vol. 97, nº 16, pags. 8950-8954.
J. Hermes et al, describen un método
fiable para mutagénesis al azar: la generación de bibliotecas de
mutantes utilizando cebadores de oligodesoxirribonucleótidos
espiculados, en Gene, 84 (1989) 143-151.
L. Jensen et al, describen funciones de
puntuación para algoritmos computacionales aplicables al diseño de
oligonucleótidos espiculados en Nucleic Acid Research, 1998, vol.
26, Nº 3, pags. 697-702.
El Documento WO 01/48485 describe la utilización
de un epítopo natural para seleccionar miembros de unión,
desarrollados a partir de una biblioteca de mutantes de una
proteína, capaces de unirse a dicho epítopo.
La invención actual se refiere a métodos de
mutagénesis de paso a través de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido de interés. En los métodos, se seleccionan una o más
regiones de aminoácidos diana en el polipéptido natural (prototipo)
de interés; las regiones diana representativas incluyen, por
ejemplo, dominios funcionales del polipéptido, tales como una
región hipervariable de un anticuerpo. Para cada región diana, se
selecciona un aminoácido predeterminado para incorporarse en la
región diana en el lugar de los aminoácidos prototipo. Se sintetiza
una mezcla de oligonucleótidos, en la que los oligonucleótidos
contienen una secuencia de cada región diana, y en cada posición de
secuencia en la región diana, contienen o bien un nucleótido
requerido para la síntesis del aminoácido prototipo del polipéptido
(un "nucleótido prototipo"), o bien un nucleótido requerido
para la síntesis de aminoácido predeterminado (un "nucleótido
predeterminado"). Durante la síntesis, se utiliza "dopaje";
"dopaje" indica que la relación de nucleótidos prototipos a
nucleótidos predeterminados, que están disponibles para
incorporarse a los oligonucleótidos durante la síntesis, es mayor de
1:1, preferiblemente 4:1 o mayor de 4:1, incluso más
preferiblemente 7:1 o mayor de 7:1, y todavía más preferiblemente
9:1 o mayor de 9:1. En una realización, la relación de nucleótidos
prototipos a nucleótidos predeterminados, se determina utilizando
una distribución binomial que tiene en consideración la longitud de
la región diana, y un grado deseado de éxito en la incorporación de
nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado.
Los métodos de la invención permiten la
producción de polipéptidos mutantes en los que la presencia global
(paso a través) del aminoácido predeterminado está limitada a una o
dos posiciones por polipéptido mutado, dejando los restantes
aminoácidos en la región diana intactos, o tan cerca como sea
posible de la secuencia prototipo. De esta forma, pueden producirse
variaciones químicas más precisas y más específicas, rápidamente y
de una forma sistemática.
La Figura 1 es un dibujo esquemático de la
región Fv de la inmunoglobulina MCPC 603, para la que se realizó
mutagenésis de paso a través sobre tres regiones CDR, incluyendo la
CDR1 (utilizando el aminoácido predeterminado Asp), la CDR2
(utilizando el aminoácido predeterminado His), y la CDR3 (utilizando
el aminoácido predeterminado Ser) de la cadena pesada (H).
La Figura 2 ilustra el diseño de los
oligonucleótidos "degenerados" para CDR1.
La Figura 3 ilustra el diseño de los
oligonucleótidos "degenerados" para CDR2.
La Figura 4 ilustra el diseño de los
oligonucleótidos "degenerados" para CDR3.
La Figura 5 ilustra las secuencias de
aminoácidos de la región diana, que son el resultado de la
mutagénesis de paso a través en la región CDR1.
La Figura 6 ilustra las secuencias de
aminoácidos de la región diana, que son el resultado de la
mutagénesis de paso a través en la región CDR2.
La Figura 7 ilustra las secuencias de
aminoácidos de la región diana, que son el resultado de la
mutagénesis de paso a través en la región CDR3.
La Figura 8 es una representación gráfica de la
distribución de mutantes, en la que se empleó una relación 1:1 de
aminoácidos de la forma natural (prototipo):mutante (forma no
natural) durante la mutagénesis de paso a través.
La Figura 9 es una representación gráfica de la
distribución de mutantes, en la que se empleó una relación 4:1 de
aminoácidos de la forma natural (prototipo):mutante (forma no
natural) durante la mutagénesis de paso a través.
La Figura 10 es una representación gráfica de la
distribución de mutantes, en la que se empleó una relación 9:1 de
aminoácidos de la forma natural (prototipo):mutante (forma no
natural) durante la mutagénesis de paso a través.
La Figura 11 ilustra las secuencias de
aminoácidos de la región diana (CDR2) de un grupo de polipéptidos
preparados mediante mutagénesis de paso a través, en la que se
empleó una relación 9:1 de aminoácidos de la forma natural
(prototipo):mutante (forma no natural) durante la mutagénesis de
paso a través.
La Figura 12 es una representación gráfica de
una distribución binomial para la que la probabilidad de éxito
p es 0,2.
La Figura 13 es una representación de una
distribución binomial para la que la probabilidad de éxito p
es 0,1.
La presente invención se refiere a métodos de
mutagénesis de paso a través, en los cuales se utiliza "dopaje"
para alterar la relación de las concentraciones de los productos
polipéptidos. En la mutagénesis de paso a través, se producen
bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican variantes de un
polipéptido (polipéptidos mutados), en los que los nucleótidos
naturales que forman los codones para un aminoácido dentro de una
región diana, son reemplazados con nucleótidos no naturales, lo que
da lugar a una mezcla de oligonucleótidos sintéticos diseñados para
producir variaciones de codones predecibles. La expresión de la
biblioteca de ácidos nucleicos proporciona un grupo de polipéptidos
en los que un aminoácido predeterminado se introduce en todas y cada
una de las posiciones de la región diana del polipéptido. El dopaje
permite la producción de mezclas de oligonucleótidos específicos en
relaciones particulares, para producir las combinaciones deseadas de
los productos polipéptidos.
La "mutagénesis de paso a través" se
describe en detalle en las Patentes de EE. UU. 5,830.650 y
5.798.208. La mutagénesis de paso a través es igualmente aplicable
a una amplia variedad de proteínas y polipéptidos, incluyendo
enzimas, inmunoglobulinas, hormonas, citoquinas, integrinas y otras
proteínas y polipéptidos. Para facilitar la discusión, aquí se
utiliza el término "polipéptido".
Se seleccionan una o más regiones dianas del
polipéptido. La región o regiones "diana" pueden ser una o más
regiones activas del polipéptido, tal como un lugar de unión de una
enzima o un asa hipervariable (CDR) de una inmunoglobulina;
alternativamente, el polipéptido entero puede ser la región
"diana". Las regiones del polipéptido que no están sujetas a
mutagénesis (es decir, aquellas localizadas fuera de la región
"diana", si es que alguna está fuera de la región diana), se
denominan aquí regiones "constantes". De forma importante,
varias regiones "diana" diferentes pueden someterse a
mutagénesis simultáneamente. El mismo aminoácido predeterminado o
uno diferente puede "pasarse a través" en cada región diana.
Esto permite la evaluación de sustituciones de aminoácidos en
regiones relacionadas conformacionalmente, tales como las regiones
que, después del plegamiento del polipéptido, se asocian para
proporcionar un lugar funcional tal como un lugar catalítico de una
enzima o el lugar de unión de un anticuerpo.
En la mutagénesis de paso a través, se genera un
grupo (biblioteca) de polipéptidos en el que un único aminoácido
predeterminado se incorpora al menos una vez dentro de cada posición
de la región o regiones diana de interés en el polipéptido. Los
polipéptidos que resultan de dicha mutagénesis (denominados aquí
"polipéptidos mutados"), difieren de los polipéptidos
prototipo en que tienen un único aminoácido predeterminado
incorporado en una o más posiciones con una o más regiones diana
del polipéptido, en lugar del aminoácido "natural" o prototipo,
que estaba presente en la misma posición o posiciones en el
polipéptido prototipo. El grupo de polipéptidos mutados incluye
polipéptidos individuales mutados para cada posición de la región o
regiones "diana" de interés; así, para cada posición en la
región diana de interés (por ejemplo, un lugar de unión o CDR), la
mezcla de polipéptidos mutados contiene polipéptidos que tienen o
bien un aminoácido encontrado en el polipéptido prototipo, o el
aminoácido predeterminado, y la mezcla de todos los polipéptidos
mutados contiene todas las variantes posibles. La mezcla de
polipéptidos mutados puede también contener polipéptidos que no
tienen ni el aminoácido predeterminado ni el aminoácido prototipo;
como se discutirá más adelante, si el codón que codifica el
aminoácido predeterminado requiere alteración de más de un
nucleótido para formar el codón que codifica el aminoácido
predeterminado, ciertos polipéptidos pueden contener aminoácidos que
están codificados por un codón formado por la inclusión de menos
que todos los cambios necesarios para proporcionar el aminoácido
predeterminado. Las proporciones de cada polipéptido dependen de
las relaciones de las concentraciones de los nucleótidos
disponibles durante la síntesis, como se describirá con más detalle
más adelante.
En la mutagénesis de paso a través, se
selecciona un aminoácido predeterminado para la región diana. Si el
polipéptido contiene más de una región diana, pueden utilizarse los
mismos aminoácidos predeterminados para cada región. El aminoácido
predeterminado puede ser un aminoácido natural. Los veinte
aminoácidos naturales difieren solo con respecto a su cadena
lateral. Cada cadena lateral es responsable de las propiedades
químicas que hacen a cada aminoácido único (véase, por ejemplo,
Principles of Protein Structure, 1988, por GE Schulz y RM Schirner,
Springer-Verlag). Cadenas laterales polares y
neutrales típicas son las de Cys, Ser, Thr, Asn, Gln y Tyr. Gly
también se considera un miembro en la frontera de este grupo. Ser y
Thr juegan un importante papel en la formación de puentes de
hidrógeno. Thr tiene una asimetría adicional en el carbono beta, y
por lo tanto solo se usa uno de los esteroisómeros. Las amidas
ácidas Gln y Asn también pueden formar puentes de hidrógeno, en los
que los grupos amido funcionan como donantes de hidrógeno y los
grupos carbonilo funcionan como receptores. Gln tiene un grupo CH2
más que Asn, lo que facilita que el grupo polar sea más flexible y
reduce su interacción con la cadena principal. Tyr tiene un grupo
hidroxilo muy polar (OH fenólico), que puede disociarse a valores
de pH elevados. Tyr se comporta de alguna manera como una cadena
lateral cargada; sus puentes de hidrógeno son bastante fuertes.
Ácidos polares neutrales se encuentran en la
superficie así como en el interior de las moléculas de proteínas.
Como residuos internos, generalmente forman puentes de hidrógeno con
cada uno de los otros o con el esqueleto del polipéptido. Cys puede
formar puentes disulfuro. Histidina (His) tiene una cadena lateral
aromática heterocíclica con un valor de pK de 6,0. En el intervalo
de pH fisiológico, su anillo imidazol puede estar no cargado o
cargado, después de tomar un ión hidrógeno de la solución. Como
estos dos estados son fácilmente alcanzables, His es de bastante
ayuda para catalizar reacciones químicas, y se encuentra en los
centros activos de muchas enzimas.
Asp y Glu están cargados negativamente a pH
fisiológico. Debido a su corta cadena lateral, el grupo carboxilo
de Asp es bastante rígido con respecto a la cadena principal; esto
puede explicar porqué el grupo carboxilo en muchos lugares
catalíticos está proporcionado por Asp mejor que por Glu. Los ácidos
cargados se encuentran generalmente en la superficie de una
proteína.
Lys y Arg se encuentran frecuentemente en la
superficie. Éstos tienen cadenas laterales largas y flexibles.
Tambaleándose en la solución que los rodea, aumentan la solubilidad
del glóbulo de proteína. En varios casos, Lys y Arg toman parte en
la formación de puentes de sal internos, o pueden ayudar en la
catálisis. Debido a su exposición en la superficie de las
proteínas, Lys es un residuo más frecuentemente atacado por enzimas
que o bien modifican la cadena lateral, o bien escinden la cadena
péptidica en el extremo terminal de los residuos de Lys.
En una realización preferida, el aminoácido
predeterminado es uno del siguiente grupo de aminoácidos: Ser, Thr,
Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys y Arg. Sin embargo, puede
seleccionarse cualquiera de los veinte aminoácidos naturales.
Durante la mutagénesis de paso a través, se
prepara una mezcla de oligonucleótidos (por ejemplo, cDNA), los
oligonucleótidos codificando todo o una parte (la "región o
regiones diana") del polipéptido de interés. Los polipéptidos
mutados pueden entonces prepararse utilizando una mezcla de
oligonucleótidos. En una realización, puede prepararse un ácido
nucleico que codifica un polipéptido mutado, uniendo secuencias de
nucleótidos que codifican regiones del polipéptido que no se
alcanzan mediante mutagénesis de paso a través (por ejemplo,
regiones constantes), con secuencias de nucleótidos que codifican
regiones del polipéptido que sí se alcanzan mediante la mutagénesis
de paso a través. Por ejemplo, en una realización, puede prepararse
un ácido nucleico que codifica un polipéptido mutado, uniendo
secuencias de nucleótidos que codifican las regiones constantes del
polipéptido, con secuencias de nucleótidos que codifican la región o
regiones diana. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que
codifican la región o regiones diana (por ejemplo, oligoucleótidos
que se someten a incorporación de nucleótidos que codifican el
aminoácido predeterminado), pueden insertarse individualmente en un
ácido nucleico que codifica el polipéptido prototipo, en lugar de la
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
de la región o regiones diana. Si se desea, pueden prepararse
secuencias de nucleótidos que codifican la región o regiones diana
que contienen lugares flanqueantes de reconocimiento para enzimas
de restricción (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nº
4.888.286), o pueden usarse lugares de reconocimiento para enzimas
de restricción naturales. La mezcla de oligonucleótidos puede
introducirse posteriormente clonándola en la posición apropiada
utilizando los lugares de enzimas de restricción.
Por ejemplo, puede prepararse una mezcla de
oligonucleótidos, en la que cada oligonucleótido contiene
nucleótidos que codifican la región diana natural del polipéptido
prototipo (o una parte de una diana del polipéptido prototipo), o
contiene uno o más nucleótidos formando un codón que codifica el
aminoácido predeterminado, en lugar de uno o más aminoácidos
naturales en la región diana. La mezcla de oligonucleótidos puede
producirse en una síntesis única, incorporando en cada posición del
oligonucleótido, un nucleótido requerido para la síntesis del
aminoácido presente en el polipéptido prototipo (denominado aquí
"nucleótido prototipo"), o (en lugar de dicho nucleótido), un
único nucleótido apropiado requerido para un codón del aminoácido
predeterminado (un "nucleótido predeterminado"), La síntesis
de la mezcla de oligonucleótidos puede llevarse a cabo utilizando
un sintetizador de DNA automático programado para proporcionar el
nucleótido prototipo o el nucleótido predeterminado, o una mezcla
de los dos nucleótidos, para generar una mezcla de oligonucleótidos
que contenga no solo los oligonucleótidos que codifican la región
diana del aminoácido prototipo, sino también oligonucleótidos que
codifican la región diana del polipéptido mutante.
Por ejemplo, pueden emplearse un total de 10
vasos de reactivos, cuatro de los cuales contienen las bases
individuales y las otras 6 que contienen todas las posibles mezclas
de dos bases de entre las 4 bases, para sintetizar cualquier mezcla
de oligonucleótidos para el proceso de mutagénesis de paso a través.
Por ejemplo, el sintetizador de DNA puede diseñarse para contener
las siguientes diez cámaras:
\vskip1.000000\baselineskip
Con esta preparación, cualquier nucleótido puede
ser reemplazado por alguna de las combinaciones de dos nucleótidos
en cualquier posición de la secuencia. Alternativamente, si es
posible la mezcla de bases individuales en las líneas del
sintetizador de oligonucleótidos, la máquina puede programarse para
tener dos o más reservorios de bases puras para generar la
proporción de nucleótidos deseada.
En métodos previamente descritos de mutagénesis
de paso a través (Patentes de EE. UU. 5,830.650 y 5.798.208), los
dos nucleótidos (es decir, el oligonucleótido natural (prototipo), y
el nucleótido no natural (predeterminado)), se utilizaban en
concentraciones aproximadamente iguales para la reacción, de tal
forma que tenían la misma posibilidad de incorporarse a una
secuencia en la posición. Asumiendo una relación 50/50 de
nucleótidos naturales y no naturales, si solamente se requiere un
cambio de base de ácido nucleico para mutar un codón natural en un
codón que codifica el aminoácido predeterminado, se podría esperar
que la mitad (50%) de las secuencias de ácido nucleico producidas
contendrían el codón que codifica el aminoácido predeterminado, y la
otra mitad (50%) contendría el codón que codifica el aminoácido
natural. De forma similar, si el número de cambios de base de ácido
nucleico requeridos para producir el codón que codifica el
aminoácido predeterminado es de dos, se podría esperar que el 25%
de las secuencias de ácido nucleico producidas contendrían el codon
que codifica el aminoácido predeterminado; y el 50% (2 x 25%)
contendría un codón que codifica aminoácidos adicionales
codificados por la preparación combinatoria de
nucleótidos.
nucleótidos.
En la presente invención, la relación entre las
concentraciones de los dos nucleótidos que están disponibles
durante la síntesis está alterada para aumentar la probabilidad de
que uno o el otro se incorpore al oligonucleótido. La relación es
mayor que 1:1. Realizaciones representativas incluyen una relación
mayor que 1:1; una relación igual o mayor que 4:1; una relación
igual o mayor que 7:1; y una relación igual o mayor que 9:1. Un
nucleótido "disponible" es un nucleótido que está presente
durante la síntesis de tal forma que puede incorporarse al
oligonucleótido durante la síntesis del oligonucleótido; por
ejemplo, un nucleótido que se libera desde un reservorio de un
sintetizador automático de oligonucleótidos, durante la síntesis del
oligonucleótido, está "disponible". La relación entre
nucleótidos prototipos disponibles y nucleótidos mutantes
disponibles está establecida de tal forma que más del 50% de los
nucleótidos y menos del 100% son los nucleótidos prototipos.
Preferiblemente, la relación está establecida de tal forma que el
porcentaje de nucleótidos prototipos es igual o mayor que 60%,
incluso más preferiblemente igual o mayor que 70%, e incluso más
preferiblemente igual o mayor que 80%. En realizaciones
particularmente preferidas, la relación está establecida de tal
forma que el porcentaje de nucleótidos prototipos sea igual o mayor
que 90%, igual o mayor que 95% o igual que 99%. Por ejemplo, la
relación 9:1, prototipo:mutante (es decir, 90% prototipo),
proporcionará una biblioteca que contiene primariamente cero, uno o
dos sustituciones de aminoácidos diana por región diana. En una
realización, la relación se determina utilizando una distribución
binomial que tiene en consideración la longitud de la región diana
y el grado deseado de éxito en la incorporación de nucleótidos que
codifican el aminoácido predeterminado, como se describe más
adelante en relación al análisis matemático del doping.
Para un polipéptido prototipo de longitud N que
se va mutar, utilizando mutagénesis de paso a través, bajo un punto
de vista probabilístico, la mutagénesis del polipéptido (con el
polipéptido entero como región diana), puede verse como un grupo de
N eventos de mutagénesis independientes, uno para cada posición del
aminoácido. Se asume que hay dos posibles resultados en cada
posición: "exitoso", que indica que en esa posición se ha
introducido el aminoácido predeterminado; y "no exitoso", que
indica que el aminoácido natural permanece, o que se ha introducido
un aminoácido alternativo ("no deseable"), que no es ni el
aminoácido predeterminado ni el aminoácido natural. Un aminoácido
"no deseable" ocurre, por ejemplo, cuando se introducen 2 ó 3
mutaciones en un codón. La probabilidad de un resultado exitoso se
define con la notación p(j), donde j es la
posición en la secuencia (1 \leq j \leq N). La
probabilidad de un resultado no exitoso en la misma posición
j es 1- p(j). El uso de paréntesis (en lugar
del más común subscrito), enfatiza la dependencia de esta
probabilidad en la posición j. De hecho, p(j)
es una función de posición j, siendo una función de la
mezcla base requerida para obtener el aminoácido predeterminado (1,
2 ó 3 sustituciones de base de nucleótidos).
Dejando a X ser la variable al azar
discreta que representa el número total de aminoácidos mutados en
una secuencia de longitud N, cuyo espacio de muestra es:
De este modo pueden definirse los siguientes
grupos:
Nótese que los índices de subgrupos se refieren
a la cardinalidad de cada grupo. En la situación más general la
ecuación que describe este tipo de distribución es:
que representa la probabilidad de
tener k éxitos (es decir, aminoácidos predeterminados), a
partir de N eventos
independientes
El número de variantes introducidas en cada
experimento debería considerarse también. La mutagénesis de paso a
través estándar (WTM) (es decir, sin dopaje), se llevó a cabo con
una relación de mezcla de bases fija de 50:50. Bajo esta situación,
p(j) puede asumir 3 posibles valores, dependiendo de
la distancia d entre el aminoácido predeterminado y el
aminoácido natural en la posición j, donde la distancia
d es el número de mutaciones de base requeridas para cambiar
del codón natural al codón predeterminado (codón que codifica el
aminoácido predeterminado):
Bajo esta hipótesis, la WTM estándar (sin
dopaje), de un polipéptido único de interés, se espera que
proporcione una biblioteca que contenga n polipéptidos
mutados (también denominados "variantes"), para los que n =
2^{M}, donde M es el número total de bases de
nucleótidos predeterminadas. La probabilidad de tener cada variante
es 1/n = constante, independiente del tipo de mutaciones de
aminoácidos en esa secuencia. Esto es debido a que los nucleótidos
predeterminados introducidos en cada codón pueden producir,
independientemente de la distancia, como se ha visto anteriormente,
solo tres grupos diferentes de 2, 4 u 8 aminoácidos, con una
probabilidad constante de ocurrencia (50%, 25%, 12,5%,
respectivamente). Por esta razón, la probabilidad de encontrar un
polipéptido mutado (variante) con todos los N aminoácidos mutados
(predeterminados) en una biblioteca dada producida mediante WTM, es
exactamente la misma que la de encontrar otro con solo un aminoácido
mutado (predeterminado) en la misma biblioteca producida por WTM.
Esto no es deseable por varias razones.
Primero, en la naturaleza es muy improbable (si
no imposible) encontrar un polipéptido con una secuencia diana
(incluso si es corta), después de que la evolución ha sustituido la
mayoría de sus residuos, sustituidos con el mismo (predeterminado)
aminoácido. Segundo, el número de variantes aumenta con una ley
exponencial de tipo 2^{M}, donde M es el número
total de bases mutadas (nucleótidos predeterminados), y en general
M aumenta con la longitud de la secuencia. Además, si se
pretende mutar al mismo tiempo varias regiones diana diferentes en
un polipéptido de interés (por ejemplo, todos los 6 CDRs de un
anticuerpo), es muy común obtener bibliotecas con un número muy
elevado de variantes. En estas situaciones, es de mucha ayuda
manejar números de variantes más pequeños, limitando las variantes
producidas a solo algunas de ellas deseables.
El dopaje permite la producción de bibliotecas
con un número menor de aminoácidos mutados (esto es, polipéptidos
mutados con un menor número de aminoácidos predeterminados
incorporados). El dopaje se consigue en el nivel de nucleótidos
utilizando diferentes relaciones en la mezcla de bases, y
manteniendo estas relaciones constantes a lo largo de la secuencia
donde se requieren las sustituciones. Esto significa que cada vez es
necesaria una mezcla de 2 bases en un codón, para incorporar
nucleótidos predeterminados para codificar los aminoácidos
predeterminados, se utiliza una relación en la mezcla de bases que
favorezca la presencia de los aminoácidos naturales (mediante la
incorporación de nucleótidos prototipo que codifican los aminoácidos
en el polipéptido prototipo), en lugar de una relación que
favorezca la presencia de los aminoácidos predeterminados (mediante
la incorporación de nucleótidos predeterminados que codifican los
aminoácidos predeterminados).
Utilizando esta aproximación, la probabilidad
p(j) de tener un aminoácido predeterminado en la
posición j (éxito) depende de la distancia entre el natural
y la diana. Por esta razón, se consideran las tres situaciones
diferentes (d = 1, 2 ó 3), cambiando los valores para filtrar
secuencias con alto número de variantes. Por ejemplo, la
información más adelante supone la utilización de una relación en la
mezcla de bases de natural (WT) a predeterminado (diana, TGT) de
WT:TGT = 9:1.
\newpage
En esta situación, cada aminoácido sustituido
todavía tiene una probabilidad de ocurrencia que depende del número
de mutaciones de bases requerido, para introducirlo en la secuencia.
Sin embargo, con el dopaje, las variantes en la biblioteca no
tienen la misma probabilidad de resultado.
Utilizando relaciones constantes en la mezcla de
bases, la mutagénesis mantiene constante la probabilidad de
ocurrencia de bases naturales y predeterminadas. Si la probabilidad
de ocurrencia de cada sustitución de aminoácido se mantiene, de tal
forma que la ocurrencia de cada variante depende solo del número de
sustituciones en la secuencia, entonces puede fijarse la
probabilidad deseada de cada ocurrencia para cada sustitución, y
puede prepararse la mutagénesis para utilizar diferentes relaciones
en las mezclas de bases, dependiendo de la distancia entre el
aminoácido predeterminado y el aminoácido natural. De esta forma, la
ocurrencia de cada variante dependerá solo del número de
sustituciones introducidas.
Por ejemplo, asumiendo ahora que p(j)
= p = constante, la ecuación presentada anteriormente toma un
formato llamado distribución binomial estándar, caracterizado por
la longitud de la secuencia diana y la probabilidad deseada de
éxito. La ecuación estándar de una distribución binomial es:
donde los parámetros n y
p son, respectivamente, la longitud de la secuencia diana y
la probabilidad deseada de éxito para cada evento
único.
Variando k de 0 a n, se obtiene la
distribución típica, donde la media y la varianza son:
- \underline{X} = np
- E^{2}_{x} = np (1-p)
Estas distribuciones se muestran en la Figura 12
(p=0,2) y la Figura 13 (p=0,1).
Una vez que el valor de los parámetros se ha
fijado, las relaciones en la mezcla de bases pueden alterarse para
obtener el deseado valor de p. Pueden utilizarse diferentes
relaciones en las mezclas de bases, según la distancia d
entre los aminoácidos naturales y predeterminados.
Por ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
Así, utilizando estas fórmulas, puede
determinarse el nivel deseado de polipéptidos mutados para cada
mutagénesis de paso a través, y pueden ajustarse según esto las
relaciones entre nucleótidos prototipo y nucleótidos mutantes para
dopaje en la mutagénesis de paso a través.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Puede prepararse una biblioteca de ácidos
nucleicos, que contenga ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
prototipos y mutantes, a partir de dichos oligonucleótidos, como se
ha descrito previamente, y puede generarse una biblioteca de
polipéptidos que contenga los polipéptidos prototipos y mutantes por
sí mismos, a partir de los ácidos nucleicos, utilizando técnicas
estándar. Por ejemplo, pueden introducirse los ácidos nucleicos que
codifican las inmunoglobulinas mutadas, en una célula huésped, para
expresión (véase, por ejemplo, Huse WD et al., Science
246:1275 (1989); Viera J et al., Meth Enzymol 153:3 (1987)).
Los ácidos nucleicos pueden expresarse, por ejemplo, en un sistema
de expresión de E. coli (véase por ejemplo, Pluckthun A y
Skerra A, Meth Enzymol 178:476-515 (1989);
Skerra A et al., Biotechnology 9:23-278
(1991)). Pueden expresarse para secreción en el medio y/o en el
citoplasma de bacterias (véase por ejemplo, Better M y Horwitz A,
Meth Enzymol 178:476 (1989)); alternativamente, pueden
expresarse en otros
organismos tales como levaduras o células de mamífero (por ejemplo, células de mieloma o células de hibridoma).
organismos tales como levaduras o células de mamífero (por ejemplo, células de mieloma o células de hibridoma).
Los expertos en la técnica entenderán que pueden
emplearse numerosos métodos de expresión para producir las
bibliotecas aquí descritas. Fusionando los ácidos nucleicos a
elementos genéticos adicionales, tales como promotores,
terminadores, y otras secuencias adecuadas que facilitan la
transcripción y la traducción, puede conseguirse la expresión in
vitro (exposición de ribosomas) como la describieron Pluckthun
et al. (Pluckthun A y Skerra A, Meth Enzymol
178:476-515 (1989)). De forma similar, puede
obtenerse expresión en exposición de Fagos, expresión bacteriana,
células de insecto infectadas con baculovirus, hongos (levaduras),
expresión en células de planta o de mamífero, como se ha descrito
previamente (Antibody Engineering. R Konterman, S Dubel (eds),
Springer Lab manual, Springer-Verlag. Berlín,
Heildelberg (2001), Capítulo 1, "Recombinant Antibodies" por S
Dubel y RE Konterman, páginas 4-16). Bibliotecas de
scFV también pueden fusionarse con otros genes, para producir
proteínas quiméricas con restos de unión (Fv) y otras funciones,
tales como catalítica, citotóxica, etc. (Antibody Engineering. R
Konterman, S Dubel (eds), Springer Lab manual,
Springer-Verlag. Berlín, Heildelberg (2001),
Capítulo 41. "Stabilization Strategies and Application of
recombinant Fvs and Fv Fusion proteins", por U Brinkmann, páginas
593-615).
Los métodos de la invención permiten la
producción de polipéptidos mutantes en los que la presencia global
(paso a través) del aminoácido predeterminado está limitada a una o
dos posiciones por polipéptido mutado, dejando los restantes
aminoácidos en la región diana intactos, o tan cercanos como sea
posible a la secuencia prototipo. De esta forma, pueden producirse
variaciones químicas más precisas y específicas. Por ejemplo, para
conseguir una mejoría en la unión entre dos proteínas, o entre un
anticuerpo y un antígeno, se puede explorar el efecto sistemático
de la presencia de una cadena lateral hidrófoba a lo largo de las
regiones de unión (como las regiones "diana"), posición a
posición. De forma similar, seleccionando el aminoácido
predeterminado, un aminoácido con propiedades químicas específicas,
se puede estudiar el efecto de la carga (+ ó -), lipofilia,
hidrofilia, etc, sobre el proceso global de unión.
En una realización particular, el polipéptido de
interés es una inmunoglobulina. Como aquí se utiliza, el término
"inmunoglobulina" puede referirse a una inmunoglobulina de
longitud completa, así como a una de sus partes que contiene las
regiones variables (por ejemplo un fragmento Fab) de una
inmunoglobulina. La inmunoglobulina que es el polipéptido de
interés puede ser de cualquier especie que genere anticuerpos,
preferiblemente un mamífero, y particularmente un ser humano;
alternativamente, la inmunoglobulina de interés puede ser un
anticuerpo quimérico o una estructura de "consenso" o canónica
generada a partir de bancos de datos de aminoácidos para
anticuerpos (Kabat et al., ((1991) Sequences of proteins of
Immunological Interest, 5ª edición: US Department Of Health and
Human Services, Public Service, NIH)). La inmunoglobulina de interés
puede ser una inmunoglobulina natural (por ejemplo, una que se
aísla o puede aislarse de un organismo, tal como una inmunoglobulina
que puede encontrarse en una muestra fisiológica apropiada (por
ejemplo, sangre, suero, etc) de un mamífero, particularmente un ser
humano). Alternativamente, la inmunoglobulina de interés puede ser
una inmunoglobulina modificada (por ejemplo, una inmunoglobulina
previamente natural, a la que se han introducido alteraciones en una
o más regiones variables y/o regiones constantes).
En una realización de la invención, la
inmunoglobulina de interés es un anticuerpo catalítico. Una
inmunoglobulina puede hacerse catalítica, o la actividad catalítica
puede aumentarse, mediante la introducción de aminoácidos adecuados
en el lugar de unión de la región variable de la inmunoglobulina
(región Fv) en los métodos aquí descritos. Por ejemplo, pueden
crearse triadas catalíticas modeladas después de las proteasas de
serina, en el segmento hipervariable de la región Fv de un
anticuerpo, y escrutarse para actividad proteolítica. Anticuerpos
catalíticos representativos incluyen óxidoreductasas, transferasas,
hidrolasas, lisasas, isomerasas y ligasas; estas categorías
incluyen proteasas, carbohidrasas, lipasas, dioxigenasas y
peroxidasas, así como otras enzimas. Estas y otras enzimas pueden
utilizarse para conversiones enzimáticas en el cuidado de la salud,
cosméticos, alimentos, elaboración de cerveza, detergentes, medio
ambiente (por ejemplo, tratamiento del agua residual), agricultura,
tinciones, textiles, y otros procesos químicos, tales como
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, conversiones de grasas,
carbohidratos y proteínas, degradación de contaminantes orgánicos y
síntesis de productos químicos. Por ejemplo, pueden prepararse
proteasas terapéuticamente activas, con actividad fibrinolítica, o
actividad contra las estructuras virales necesarias para la
infectividad, tales como proteínas de la cubierta viral. Dichas
proteasas podrían ser agentes anti-trombóticos o
anti-virales útiles contra virus tales como el del
SIDA, los rinovirus, la influenza o la hepatitis. Alternativamente,
en otro ejemplo, las oxigenasas (por ejemplo dioxigenasas), una
clase de enzimas que requieren un cofactor para la oxidación de
anillos aromáticos y otros dobles puentes, tienen aplicaciones
industriales en procesos de reducción biológica a pulpa, conversión
de biomasas en combustibles u otros productos químicos, conversión
de contaminantes de agua residual, bioprocesamiento del carbón, y
detoxificación de compuestos orgánicos peligrosos.
Los métodos de la invención pueden ser
particularmente útiles en la generación de bibliotecas universales
para inmunoglobulinas, como se discutió con mayor detalle en la
Solicitud de Patente de EE. UU. con Nº de Serie 60/373.558.
Las bibliotecas descritas aquí codifican, o
contienen, polipéptidos mutados que han sido generados de una forma
que permite el análisis sistemático y profundo de las regiones de
unión del polipéptido prototipo, y particularmente, de la
influencia de un aminoácido particular preseleccionado en la región
de unión. Las bibliotecas evitan problemas relativos al control o
predicción de la naturaleza de una mutación asociada con la
mutagénesis al azar; permiten la generación de información
específica sobre mutaciones muy particulares, que permiten una
interacción alterada del polipéptido de interés con otros agentes
(por ejemplo, ligandos, receptores, antígenos), incluyendo
múltiples interacciones mediadas por aminoácidos en las regiones de
unión variables del polipéptido de interés.
Las bibliotecas pueden escrutarse mediante
medios apropiados para polipéptidos particulares, tales como
inmunoglobulinas que tienen características específicas. Por
ejemplo, la actividad catalítica puede analizarse mediante ensayos
adecuados para la conversión de sustrato y la actividad de unión
puede evaluarse mediante inmunoensayos adecuados y/o cromatografía
de afinidad. Pueden diseñarse ensayos para estas actividades, en los
que una célula requiere la actividad deseada para el crecimiento.
Por ejemplo, en el escrutinio para inmunoglobulinas que tienen una
actividad particular, tal como la capacidad para degradar compuestos
tóxicos, la incorporación de niveles letales del compuesto tóxico
en las placas de nutrientes, permitirá el crecimiento solo de las
células que expresan una actividad que degrada el compuesto tóxico
(Wasserfallen A, Rekik M y Harayama S, Biotechnology
9:296-298 (1991)). Las bibliotecas también pueden
ser escrutadas para otras actividades, tales como una capacidad
para detectar o destruir patógenos. Pueden diseñarse ensayos para
estas actividades en los que el patógeno de interés se expone al
anticuerpo, y pueden seleccionarse los anticuerpos que demuestran la
propiedad deseada (por ejemplo, matar al patógeno).
Los siguientes Ejemplos se ofrecen con el
propósito de ilustrar la presente invención y no se han construido
para limitar el alcance de esta invención. Las enseñanzas de todas
las referencias citadas son de este modo incorporadas aquí en toda
su extensión.
Para analizar el efecto del dopaje sobre la
mutagénesis de paso a través, se llevó a cabo mutagénesis de paso a
través sobre tres de las regiones hipervariables o regiones que
determinan complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonal MCPC
603. El MCPC 603 es un anticuerpo monoclonal que se une a la
fosforilcolina. Esta inmunoglobulina es reconocida como un buen
modelo para investigar la unión y la catálisis porque la proteína y
su región de unión han sido bien caracterizados estructuralmente.
Los CDRs para el anticuerpo MCPC 603 han sido identificados. En la
cadena pesada, CDR1 abarca los aminoácidos 31-35,
CDR2 abarca los aminoácidos 50-69, y CDR3 abarca
los aminoácidos 101-111. En la cadena ligera, los
aminoácidos de CDR1 son 24-40, CDR2 abarca los
aminoácidos 55-62, y CDR3 abarca los aminoácidos
95-103.
Los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada (VH)
fueron los dominios seleccionados. La secuencia de aminoácidos
publicada de las regiones VH y VL del MCPC 603, pueden convertirse a
secuencia de DNA (Rudikoff S y Potter M, Biochemistry 13:4033
(1974)); alternativamente, puede utilizarse la secuencia de DNA
natural del MCPC 603 (Pluckthun A et al., Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol., Vol LII: 105-112 (1987)). Los
lugares de restricción pueden incorporarse en la secuencia para
facilitar la introducción de oligonucleótidos degenerados o las
secuencias degeneradas pueden introducirse durante el ensamblaje
del gen.
Los aminoácidos predeterminados seleccionados
para la mutagénesis de paso a través, fueron los tres residuos de
la triada catalítica de las proteasas de serina, Asp, His y Ser. Asp
se seleccionó para VH CDR1, His se seleccionó para VH CDR2, y Ser
se seleccionó para VH CDR3.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La estructura del gen utilizado para la
mutagénesis de paso a través en los CDRs del MCPC se muestra en la
Figura 1; se muestran las posiciones o "ventanas" que van a
mutarse. Se entendía que el oligonucleótido sintetizado podía ser
mayor que la ventana mostrada para facilitar la inserción en la
construcción diana. La mezcla de oligonucleótidos correspondientes
al VH CDR1 se diseñó para sustituir cada uno de los aminoácidos
naturales (prototipo) con Asp (Figura 3a). Dos codones especifican
Asp (GAC y GAT). El primer codón de CDR1 no requiere ninguna
sustitución. El segundo codón (TTC, Phe) requiere sustituciones en
la primera (T a G) y en la segunda posición (T a A), para
convertirlo en un codón para Asp. El tercer codón (TAC, Tyr),
requiere solo una sustitución en la primera posición (T a G). El
cuarto codón (ATG, Met), requiere 3 sustituciones, la primera es A a
G, la segunda T a A y la tercera G a T. El quinto codón (GAG, Glu)
requiere solo una sustitución en la tercera posición (G a T). La
mezcla resultante de oligonucleótidos se expresa en la Figura 2.
A partir del código genético, es posible deducir
todos los aminoácidos que sustituirán los aminoácidos originales en
cada posición. Para este caso, el primer aminoácido siempre será Asp
(100%), el segundo será Phe (25%), Asp (25%), Tyr (25%) o Val
(25%), el tercer aminoácido será Tyr (50%) o Asp (50%); el cuarto
será Met (12,5%), Asp (12,5%), Val (25%), Glu (12,5%), Asn (12,5%),
Ile (12,5%) o Lys (12,5%); y el quinto codón será Glu (50%) o Asp
(50%). En total, pueden generarse 128 oligonucleótidos que
codificarán para 112 secuencias de proteínas diferentes. Entre las
112 diferentes secuencias de aminoácidos generadas, estarán la
secuencia natural (prototipo) (que tiene un residuo Asp en la
posición 31), y secuencias que difieren de la natural porque
contienen entre uno y cuatro residuos Asp en las posiciones
32-35, en todas las posibles permutaciones (véase
Figura 2). Además, algunas secuencias, con o sin sustituciones Asp,
contendrán un aminoácido que no es el natural ni Asp, en las
posiciones 32, 34 o ambas. Estos aminoácidos se introducen mediante
permutaciones de los nucleótidos que codifican el aminoácido
natural y el aminoácido preseleccionado. Por ejemplo, en la Figura
2, en la posición 32, se generan tirosina (Tyr) y valina (Val)
además del residuo natural fenilalanina (Phe), y del residuo
preseleccionado Asp.
El CDR2 de la región VH del MCPC 603 contiene 14
aminoácidos (55-68), como se muestra en la Figura 3,
La mezcla de oligonucleótidos se diseña para que cada aminoácido de
la secuencia natural sea reemplazado por histidina (His). Dos
codones (CAT y CAC) especifican His. Las sustituciones requeridas a
través de la secuencia de DNA natural son 25 en total. Así, la
mezcla de oligonucleótidos producida contendrá oligonucleótidos que
especifican 3,3 x 10^{7} diferentes secuencias de péptidos (véase
Figura 3).
El CDR3 de la región VH del MCPC 603 está
compuesto por 11 aminoácidos, como se muestra en la Figura 4. Se
diseña una mezcla de oligonucleótidos en la que cada aminoácido no
serina de la secuencia natural es reemplazado por serina (Ser),
como se describió anteriormente para el CDR1. Seis codones (TCX y
AGC, AGT) especifican Ser. Las sustituciones requeridas a través de
la secuencia natural son 12. Como resultado, la mezcla de
oligonucleótidos producida contiene 4096 oligonucleótidos
diferentes que, en este caso, codificarán 4096 secuencias de
proteínas. Entre estas secuencias estarán algunas que contienen un
único residuo de serina (además de la serina 105), en cualquiera de
las otras posiciones (101-104,
106-111), así como variantes con más de una serina,
en cualquier combinación (véase Figura 4).
Utilizando la mutagénesis de paso a través, se
fabricó una biblioteca de secuencias Fv que contenía varias
secuencias de proteína diferentes, incluyendo el prototipo y los
mutantes. Una proporción significativa de estas secuencias
codificarán la triada His, Ser, Asp, típica de las proteasas de
serina, en las posiciones deseadas dentro de las regiones
hipervariables diana. La mutagénesis de paso a través se llevó a
cabo mediante síntesis de la mezcla degenerada de oligonucleótidos
en un sintetizador de DNA automático, programado para proporcionar
un nucleótido a la cámara de reacción o una mezcla de dos
nucleótidos en una relación igual, mezclados antes de
proporcionarse a la cámara de reacción.
Cada mezcla de oligonucleótidos sintéticos se
insertó en el gen para la región variable de MCPC 603 respectiva.
Los oligonucleótidos se convirtieron en cadenas dobles mediante
técnicas enzimáticas (véase, por ejemplo, Oliphant, AR et
al., 1986, arriba), y después ligados en un plásmido con lugares
de restricción, que contenía el gen que codifica la proteína que se
quería mutar. Los lugares de restricción eran naturales o fabricados
mediante ingeniería genética.
Los genes mutantes de MCPC 603 construidos
mediante éstas y otras técnicas adecuadas descritas previamente, se
expresaron en un sistema conveniente de expresión de E. coli,
tal como el descrito por Pluckthun y Skerra (Pluckthun A y Skerra
A, Meth Enzymol 178:476-515 (1989); Skerra A et
al., Biotechnology 9:273-278 (1991)).
Se utilizó un programa de ordenador diseñado
para predecir la distribución de mutantes, para verificar los
efectos del "dopaje" sobre la relación entre bases naturales y
mutantes, y los aminoácidos resultantes. El programa se utilizó
para verificar los efectos del dopaje sobre el mutante
VH-CDR2 (Asp). Los resultados generados utilizando
una relación de 1:1 natural (prototipo):mutante (tipo no natural),
se muestran en la Figura 8; los resultados utilizando una relación
de 4:1 se muestran en la Figura 9; y los resultados utilizando una
relación de 9:1 se muestran en la Figura 10. Puede observarse que la
distribución se altera dramáticamente con la alteración de la
relación.
Los métodos descritos anteriormente se
utilizaron también para generar un grupo de mutantes del anticuerpo
MOPC 603, utilizando una relación de 9:1 a favor del tipo natural.
Se generaron veinte nuevas colonias, y los datos de la secuencia se
muestran en la Figura 11. Los resultados confirman que la biblioteca
contenía primariamente cero, una o dos sustituciones de aminoácidos
diana en la región diana.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Crea, Roberto
\hskip1cm Cappuccilli, Guido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> "DOPING" EN LA MUTAGENESIS DE
PASO A TRAVÉS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2345.2002003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US03/11935
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-04-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/373.686
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-04-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión
4,0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Tyr Met Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
Val Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Phe Asp
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacttctaca tggag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgackwckacr wkgak
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 2, Xaa = PHE, ASP,
TYR o VAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 3, Xaa = TYR o
ASP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 4, Xaa = MET, ASP,
VAL, GLU, ASN, ILE o LYS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 5, Xaa = GLU o
ASP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1),,,,(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaacaagt atactactga atacagcgct tctgttaaag gt
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipsrtmacmaky atmmtmmtsa kyacmrcsrt ymtswtmams rt
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 1, Xaa = GLY, HIS,
ARG o ASP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 2, Xaa = ASN o
HIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 3, Xaa = LYS, HIS,
ASN o GLY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 4, Xaa = TYR o
HIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 5, Xaa = THR, HIS,
ASN o PRO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 6, Xaa = THR, HIS,
ASN o PRO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 7, Xaa = GLU, HIS,
ASP o GLN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 8, Xaa = TYR o
HIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 9, Xaa = SER, HIS,
ARG o ASN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 10, Xaa = ALA, HIS,
ASP o PRO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 11, Xaa = SER, HIS,
PRO o TYR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 12, Xaa = VAL, HIS,
ASP o LEU
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 13, Xaa = LYS, HIS,
ASN o GLN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 14, Xaa = GLY, HIS,
ARG o ASP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1),,,,(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactactatg gcagcacttg gtacttcgac ggt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiparctmctmtr cgacgastts gtmctyckmc kyt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 1, Xaa = ASN o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 2, Xaa = TYR o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 3, Xaa = TYR o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 4, Xaa = GLY o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 6, Xaa = THR o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 7, Xaa = TRP o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 8, Xaa = TYR o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 9, Xaa = PHE o
SER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 10, Xaa = ASP, SER,
ALA o TYR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la posición 11, Xaa = VAL, SER,
ALA o PHE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1),,,,(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Tyr Met Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Tyr Met Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Ile Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Glu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Asp Asp Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Asp Met Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Tyr Val Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Asp Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Val Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Asp Lys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Asp Asp Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Lys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Asp Met Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Asp Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Asp Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Asp Asp Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Tyr Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Asp Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asn His Asn Pro Thr Glu Tyr His His Ser
Val Gln Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His His His His Thr Gln His Arg Ala Ser
Asp Asn Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
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\sa{Asp Asn Asn Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Ala Ser
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\sa{Gly Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser
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\sa{Asp Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
Val Lys Gly}
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\sa{Gly Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
Val Gln Gly}
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Leu Lys Gly}
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\sa{Gly Asn Lys Tyr Thr Asn Glu Tyr Asn Ala Ser
Asp Lys Arg}
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<400> 86
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\sa{Gly Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Arg Ala Ser
Val Gln Asp}
Claims (6)
1. Un método de mutagénesis de paso a través de
un ácido nucleico que codifica un polipéptido prototipo de interés,
que comprende:
- a)
- seleccionar una o más regiones diana de aminoácidos prototipo en el polipéptido prototipo de interés, codificado por el ácido nucleico;
- b)
- para cada una de las regiones diana, predeterminar un aminoácido para que se incorpore a la región diana, en lugar de los aminoácidos prototipos; y
- c)
- sintetizar una mezcla de oligonucleótidos que contiene una secuencia de nucleótidos para cada región diana, donde cada oligonucleótido contiene, en cada posición de secuencia en la región diana, un nucleótido que se requiere para la síntesis del aminoácido prototipo del polipéptido, o un nucleótido predeterminado que se requiere para la síntesis del aminoácido predeterminado, donde, durante la síntesis, la relación entre nucleótidos prototipo disponibles y nucleótidos predeterminados disponibles, es igual o mayor que 4:1, donde dicha relación se determina mediante el uso de la distribución binomial y donde dicha distribución de probabilidad tiene en consideración el número (N) de aminoácidos en la región o regiones diana, y la probabilidad (P) de éxito en incorporar los nucleótidos que codifican el aminoácido predeterminado, y donde X (número total de aminoácidos mutados en una secuencia de longitud N), es menor que N.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la generación de una biblioteca de expresión de
ácidos nucleicos que contiene dichos nucleótidos.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la relación es igual o mayor que:
- a)
- 7:1; ó
- b)
- 9:1.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
la región diana contiene:
- a)
- un dominio funcional del polipéptido;
- b)
- un lugar catalítico de una inmunoglobulina; o
- c)
- una región hipervariable de un anticuerpo.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
el aminoácido predeterminado es Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His,
Glu, Asp, Lys o Arg.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
la distribución binomial está representada por la ecuación:
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