JP2005523026A - ウォークスルー突然変異誘発における「ドーピング」 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年4月17日に提出した米国特許仮出願第60/373,686号の恩典を主張する。上記出願の全内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
突然変異誘発は、タンパク質の構造および機能を研究する上での強力な手段である。変異は関心対照のタンパク質をコードするクローン化遺伝子のヌクレオチド配列内に作製することができ、改変した遺伝子を発現させてタンパク質の変異体を産生することができる。野生型タンパク質および作製した変異体の性質を比較することにより、結合および/または触媒活性等のタンパク質の構造の完全性および/またはタンパク質の生化学的機能に必須な個々のアミノ酸またはアミノ酸のドメインを同定することが可能である場合が多い。しかし、単一のタンパク質から作製され得る変異体の数により、情報価値のあるまたは所望の性質を有する変異体の選択が困難になる。たとえ選択した変異体が、タンパク質の特定の、推定的に重要な領域(例えば、タンパク質の活性部位のまたはその周囲の領域)内のみに変異を包含するとしてもである。例えば、特定のアミノ酸の置換、欠失、または挿入は、タンパク質に局所的なまたは全体的な影響を及ぼす可能性がある。タンパク質の突然変異誘発の影響を系統的に評価する手段の必要性が残っている。
本発明は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸にウォークスルー突然変異を誘発する方法に関する。本方法では、関心対象の野生型(原型)ポリペプチドにおいてアミノ酸の1つまたは複数の標的領域を選択する;代表的な標的領域には、例えば、抗体の超可変領域等のポリペプチドの機能的ドメインが含まれる。それぞれの標的領域に対して、原型アミノ酸の代わりに標的領域に取り込む1つまたは複数の所定のアミノ酸を選択する。それぞれの標的領域に対するヌクレオチド配列を含み、標的領域の各配列位置においてポリペプチドの原型アミノ酸の合成に必要なヌクレオチド(「原型ヌクレオチド」)または所定のアミノ酸の合成に必要なヌクレオチド(「所定のヌクレオチド」)を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合成する。合成過程では「ドーピング」を用いる;「ドーピング」とは、合成過程でオリゴヌクレオチドへの取り込みに利用可能な原型ヌクレオチドと所定のヌクレオチドの比率が1:1を超える、好ましくは4:1または4:1を超える、より好ましくは7:1または7:1を超える、さらにより好ましくは9:1または9:1を超えることを示す。1つの態様において、原型ヌクレオチドと所定のヌクレオチドの比率は、標的領域の長さおよび所定のアミノ酸をコードするヌクレオチドの取り込みにおける所望の成功度合いを考慮した二項分布を用いて決まる。
本発明は、ポリペプチド産物の濃度の比率を変えるために「ドーピング」を用いるウォークスルー突然変異法に関する。ウォークスルー突然変異誘発では、標的領域内のアミノ酸のコドンを形成する野生型ヌクレオチドが非野生型ヌクレオチドで置換されるポリペプチドの変種(変異ポリペプチド)をコードする核酸のライブラリーが産生され、予測可能なコドン変種を生じるように設計した合成オリゴヌクレオチドの混合物が得られる。核酸のライブラリーの発現により、ポリペプチドの標的領域のあらゆる位置に所定のアミノ酸が取り込まれた一組のポリペプチドが得られる。所望の組み合わせのポリペプチド産物を生じるには、ドーピングにより、特定の比率の特定のオリゴヌクレオチドの混合物を産生することができる。
「ウォークスルー突然変異誘発」 は、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,830,650号および第5,798,208号に詳細に記載されている。「ウォークスルー突然変異誘発」 は、酵素、免疫グロブリン、ホルモン、サイトカイン、インテグリン、および他のタンパク質またはポリペプチドを含む多種多様なタンパク質およびポリペプチドに同等に適用できる。考察を円滑化するため、本明細書では「ポリペプチド」 という用語を用いる。
この準備により、任意のヌクレオチドが配列の任意の位置において、2つのヌクレオチドの組み合わせのいずれか一方で置換され得る。または、オリゴヌクレオチド合成機において個々の塩基の混合が可能であるならば、純粋な塩基の2個またはそれ以上の容器から引き出すように合成機をプログラムし、所望の割合のヌクレオチドを生じることも可能である。
以前に記載されたウォークスルー突然変異誘発の方法では(米国特許第5,830,650号および第5,798,208号)、2つのヌクレオチド(すなわち、野生型(原型)ヌクレオチドおよび非野生型(所定の)ヌクレオチド)をほぼ同じ濃度で反応に使用し、そのためその位置の配列にどちらか一方が取り込まれる機会は同等であった。野生型と非野生型ヌクレオチドが50/50比であると仮定すれば、野生型コドンを所定のアミノ酸をコードするコドンに変異するのに1つの核酸塩基の変化のみが必要である場合、産生される核酸配列の半分(50%)が所定のアミノ酸をコードするコドンを含み、半分(50%)が野生型アミノ酸をコードするコドンを含むと予想される。同様に、所定のアミノ酸をコードするコドンを生じるのに必要な核酸塩基の変化の数が2つである場合、産生される核酸配列の25%が野生型アミノ酸をコードするコドンを含み;産生される核酸配列の25%が所定のアミノ酸をコードするコドンを含み;かつ50%(2×25%)がヌクレオチド配列の組み合わせによってコードされるさらなるアミノ酸をコードするコドンを含むと予想される。
ウォークスルー突然変異誘発を用いて突然変異を誘発する長さNの原型ポリペプチドに関して、確率的観点に基づくと、(標的領域として全ポリペプチドを用いた)ポリペプチドの突然変異誘発は、各アミノ酸の位置についての非依存的突然変異誘発事象Nの一組として見ることができる。各位置において2つの結果が起こり得ると想定される:その位置において所定のアミノ酸が導入されたことを示す「成功」;および野生型アミノ酸が残るか、または所定のアミノ酸でも野生型のアミノ酸でもない代わりの(「望ましくない」)アミノ酸が導入されたことを示す「不成功」。例えば、コドン内に2ないし3塩基の変異が導入され得る場合に、「望ましくない」アミノ酸が生じる。成功を収める確率を概念p(j)(jは配列内の位置である(1≦j≦N))で示す。同じ位置jにおける不成功の結果が得られる確率は、1-p(j)である。(より一般的な下付き文字の代わりに)括弧を使用することにより、この確率の位置jに対する依存性を強調する。実際に、p(j)は位置jの関数であり、所定のアミノ酸を得るために必要な塩基混合物の関数である(1、2、または3ヌクレオチド塩基置換)。
である、長さNの配列内の変異アミノ酸の総数を表す離散確率変数とする。したがって、以下の集合を定義することができる。
部分集合指数が各集合の濃度を参照することに留意されたい。最も一般的な状況では、この種の分布を表す式は
であり、これは非依存的事象Nのうち成功k(すなわち所定のアミノ酸)を有する確率を表す。
この仮説では、関心対象の単一ポリペプチドの標準的なWTM(ドーピングなし)により、n=2M(Mは所定のヌクレオチド塩基の総数である)であるn個の変異ポリペプチド(「変種」とも称する)を含むライブラリーが得られることが予測される。各変種を有する確率は、その配列内のアミノ酸変異の種類に関係なく、1/n=一定である。これは、各コドンに導入される所定のヌクレオチドにより、上記のように距離に非依存的に、発生確率が一定(それぞれ50%、25%、12.5%)の2、4、または8アミノ酸という3つの異なる組のみを生じ得るためである。したがって、WTMにより生じる所与のライブラリー中に変異(所定の)アミノ酸Nすべてを有する変異ポリペプチド(変種)を見出す確率は、WTMにより生じる同じライブラリー中に変異(所定の)アミノ酸1つのみを有する別のポリペプチドを見出す確率と全く同じである。これはいくつかの理由で望ましくない。
この状況において、各置換アミノ酸の発生確率は、やはり配列内に導入するのに必要な塩基変異の数に依存する。しかし、ドーピングを用いることにより、ライブラリー中の変種は同じ確率を有さない。
式中、パラメータnおよびpはそれぞれ、標的配列の長さおよび事象の一つ一つに対する所望の成功確率である。0からnまでkを変動させると、平均値および分散が
X=np
Ex 2=np(1-p)
である典型的な分布が得られる。これらの分布を図12(p=0.2)および図13(p=0.1)に示す。一度パラメータ値を固定すると、所望のp値を得るために塩基混合比を変えることができる。野生型アミノ酸と所定のアミノ酸との距離に従い、異なる塩基混合比を用いることができる。例えば、以下の通りである。
p=0.25 n=10 X=2.5 Var(X)=1.87
p=0.2 n=10 X=2.0 Var(X)=1.6
p=0.3 n=10 X=3.0 Var(X)=2.1
このようにこれらの式を用いて、ウォークスルー突然変異誘発それぞれに対して変異ポリペプチドの所望のレベルを決定することができ、ウォークスルー突然変異誘発の過程でドーピングするための原型ヌクレオチドと変異体ヌクレオチドの比率をそれに応じて調整することができる。
次に上記のように、原型および変異体ポリペプチドをコードする核酸を含む核酸ライブラリーをそのようなオリゴヌクレオチドから調製することができ、その後標準的な技法を用いて、原型および変異体ポリペプチド自体を含むポリペプチドライブラリーを核酸から産生することができる。例えば、変異した免疫グロブリンをコードする核酸を、発現用の宿主細胞に導入することができる(例えば、Huse, W.D.ら、Science 246:1275 (1989);Viera, J.ら、Meth. Enzymol. 153:3 (1987)を参照のこと)。例えば大腸菌発現系で核酸を発現させることができる(例えば、Pluckthun, A.およびSkerra, A.、Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989);Skerra, A.ら、Biotechnology 9:23-278 (1991)を参照のこと)。核酸は、培地内に分泌しておよび/または細菌の細胞質内に発現され得る(例えば、Better, M.およびHorwitz, A.、Meth. Enzymol. 178:476 (1989)を参照のこと);または、酵母または哺乳動物細胞(例えば、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞)等の他の生物で核酸を発現させることもできる。
1つの特定の態様において、関心対象のポリペプチドは免疫グロブリンである。本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、全長免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの可変領域を含むその一部(例えばFab断片)を指し得る。関心対象のポリペプチドである免疫グロブリンは、抗体を産生する任意の種、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒト由来であってよい;または、関心対象の免疫グロブリンは、キメラ抗体、または抗体に関するアミノ酸データバンクから作製される「共通」構造またはカノニカル構造であってもよい(Kabatら((1991) Sequences of proteins of Immunological Interest. 第5版、US Department Of Health and Human Services, Public Service, NIH.))。関心対象の免疫グロブリンは野生型免疫グロブリンであってよい(例えば、哺乳動物、特にヒトの適切な生理的試料(例えば、血液、血清等)に見出され得る免疫グロブリン等の、生物から単離されるまたは単離され得る免疫グロブリン)。または、関心対象の免疫グロブリンは改変したグロブリンであってもよい(例えば、1つもしくは複数の可変領域および/または定常領域に変異を導入した以前は野生型であった免疫グロブリン)。
本明細書に記載するライブラリーは、原型ポリペプチドの結合領域、特に特定の所定のアミノ酸が結合領域に及ぼす影響の系統的かつ徹底的解析を可能にするような様式で作製された変異ポリペプチドをコードするかまたは含む。このライブラリーにより、ランダム突然変異誘発に関連する変異の性質の調節または予測に関する問題が回避され;関心対象のポリペプチドの変動する結合領域内のアミノ酸による複数の相互作用を含む、関心対象のポリペプチドの他の薬剤(たとえば、リガンド、受容体、抗原)との相互作用の変化を可能にする非常に特異的な変異に関する具体的情報の創出が可能になる。
A. 材料および方法
ドーピングのウォークスルー突然変異誘発に及ぼす効果を評価するため、モノクローナル抗体MCPC 603の3つの超可変領域または相補性決定領域(CDR)に対してウォークスルー突然変異誘発を実施した。MCPC 603は、ホスホリルコリンに結合するモノクローナル抗体である。この免疫グロブリンは、タンパク質およびその結合領域が構造的によく特徴づけられているため、結合および触媒作用を研究するための優れたモデルとして認識されている。MCPC 603抗体のCDRは同定されている。重鎖では、CDR1はアミノ酸31位〜35位におよび、CDR2はアミノ酸50位〜69位、CDR3はアミノ酸101位〜111位におよぶ。軽鎖では、CDR1のアミノ酸は24位〜40位であり、CDR2はアミノ酸55位〜62位におよび、CDR3はアミノ酸95位〜103位におよぶ。
Claims (12)
- 以下の段階を含む、関心対象のポリペプチドをコードする核酸のウォークスルー突然変異を誘発する方法:
a) 該核酸にコードされる関心対象のポリペプチドにおいて、原型アミノ酸の1つまたは複数の標的領域を選択する段階;
b) それぞれの標的領域に対して、原型アミノ酸の代わりに標的領域に取り込む1つまたは複数の所定のアミノ酸を選択する段階;および
c) それぞれの標的領域に対するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合成する段階であって、各オリゴヌクレオチドが標的領域の各配列位置において、ポリペプチドの原型アミノ酸の合成に必要な原型ヌクレオチドまたは所定のアミノ酸の合成に必要な所定のヌクレオチドのいずれかを含み、かつ、合成の際利用可能な原型ヌクレオチドと利用可能な所定のヌクレオチドの比率が1:1を上回る段階。 - オリゴヌクレオチドを含む核酸の発現ライブラリーを作製する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 比率が4:1以上である、請求項1記載の方法。
- 比率が7:1以上である、請求項1記載の方法。
- 比率が9:1以上である、請求項1記載の方法。
- 標的領域がポリペプチドの機能ドメインを含む、請求項1記載の方法。
- 標的領域が免疫グロブリンの触媒部位を含む、請求項1記載の方法。
- 標的領域が抗体の超可変領域を含む、請求項1記載の方法。
- 所定のアミノ酸がSer、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys、His、Glu、Asp、Lys、またはArgである、請求項1記載の方法。
- 利用可能な原型ヌクレオチドと利用可能な所定のヌクレオチドの比率が、標的領域の長さ、および所定のアミノ酸をコードするヌクレオチドの取り込みにおける所望の成功度合いを考慮した二項分布を用いて決まる、請求項1記載の方法。
- 請求項1記載の方法により調製した核酸のライブラリー。
- 請求項11記載の核酸を発現させることにより調製したポリペプチドのライブラリー。
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