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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Immunologie
und der Vakzinentechnologie. Die vorliegende Erfindung betrifft
insbesondere Verfahren der Anlieferung von Antigenen in Zellen zur Verstärkung ihrer
Immunreaktion zur Verwendung für
Impfungen und zur Prophylaxe.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Das
Wirtsimmunsystem stellt einen hochentwickelten Abwehrmechanismus
dar, der die Erkennung und Eliminierung von Fremdkörpern, wie
z.B. infektiösen
Agenzien oder Neoplasmen, aus dem Körper ermöglicht. Ist es korrekt funktionsfähig, so
unterscheidet ein kräftiges
Immunsystem zwischen fremden Eindringlingen und den eigenen Geweben
des Wirts. Die erste Reaktion auf Fremdkörper ist die Sekretion von
Antikörpern,
die in der Lage sind, mikrobielle Agenzien zu erkennen, aufzuhalten
und zu zerstören.
Diese Reaktion reicht jedoch oftmals nicht aus, da in einigen Fällen, wie
z.B. bei viralen Partikeln, die Pathogene in der Lage sind, der
B-Zellen-Antikörperreaktion
zu entkommen, indem sie schnell in Zielzellen eindringen, in denen
die Antikörper
sie nicht erreichen können.
Das Pathogen kann sich anschließend
intrazellulär
replizieren und andere periphere Zellen infizieren. Die Herausforderung
für Wissenschaftler
besteht nun darin, die T-Zellenreaktion gegen mikrobielle Agenzien
zu verstärken.
Die T-Zellenreaktion ist die Fähigkeit
des Immunsystems, eine spezielle Art von Lymphozyten [CD4+, CD8+]
zu produzieren, die in der Lage sind, spezifisch die infizierten Zellen
zu erkennen und diese zu zerstören.
Dieser Mechanismus der T-Zellenreaktion ergänzt die B-Zellen-Antikörper-Reaktion,
und es werden beide Mechanismen benötigt, um eine wirksame Immunreaktion
auszulösen. Eine
wirksame Vakzine gegen eine HIV-Infektion ist z.B. ein langwieriges
Verfahren, und zwar aufgrund der Schwierigkeit, eine CTL-Reaktion
gegen die verschiedenen Vakzinenkandidaten zu erzeugen.
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Dendritische
Zellen (DCs) sind wirksame antigen-präsentierende Zellen (APC), die
eine Immunreaktion gegen Peptid-Antigene initiieren, die mit Klasse-I
-und -II-MHC assoziiert sind (P.S. Freudenthal und R.M. Steinman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7698 (1990); R.M. Steinman, Ann.
Rev. Immune 9, 271 (1991)). DCs stellen eine kleine Unterpopulation
an weit verbreiteten, vom Knochenmark abstammenden Leukoyzten dar, welche
die einzigen natürlichen
antigen-präsentierenden
Zellen sind, die in der Lage sind, naive T-Zellen zu primen. Sie
aktivieren sowohl die CD4+- als auch die CD8+-T-Lymphozyten-Primär-Immunreaktion
und sind bei der Stimulation von sekundären Immunreaktionen zumindest
so wirksam wie andere APCs, wie z.B. Monozyten (Peters et al., Immunol.
Today L7, 273 (1997)).
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Um
T-Lymphozyten-Reaktionen zu stimulieren, müssen Peptidfragmente von Antigenen,
die in einer Vakzine enthalten sind, zuerst an peptidbindende Rezeptoren
gebunden sein (Haupt-Histokompatibilitätskomplex-[MHC-]Klasse-I- und
-II-Moleküle),
welche die antigenen Peptide auf der Oberfläche der antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) aufweisen. T-Lymphozyten produzieren einen Antigen-Rezeptor,
den sie verwenden, um die Oberfläche
von APCs auf die Gegenwart von fremden Peptiden zu beobachten. Aktuelle
Modelle der Antigen-Verarbeitung und der -Präsentation gegenüber T-Lymphozyten
deuten auf die Existenz von zwei Hauptwegen hin. Kurz gesagt werden
exogene Antigene in die endozytischen Kompartimente der APCs internalisiert,
wo sie zu Peptiden hydrolysiert werden, von denen einige an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden
werden. Die reifen MHC-Klasse-II/Peptid-Komplexe werden anschließend zur
Präsentation
gegenüber
den eingeschränkten
Klasse-II-CD4+-T-Lymphozyten an die Zelloberfläche transportiert.
Im Gegensatz dazu werden bei den MHC-Klasse-I-Molekülen endogene
Antigene vor ihrem Transport in das endoplasmatische Retikulum,
wo sie an entstehende MHC-Klasse-I-Moleküle binden, im Zytoplasma durch
die Wirkung eines proteolytisch aktiven Partikels abgebaut, das
als das Proteasom bekannt ist. Stabile Klasse-I/Peptid-Komplexe
werden durch den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche zu CD8+-CTL
transportiert. Da die CTL-Reaktion für den Schutz gegen viele virale
oder parasitäre
Infektionen und einige Tumorzellen essentiell ist, wurden einige
neue Vakzinen-Strategien vorgeschlagen: 1) Immunstimulierende Komplexe
(Takahasci et al., Nature 344, 873 (1990)); 2) antigengeladene,
pH-empfindliche Liposomen (Nair et al., J. Exp. Med. 175, 609 (1992));
3) rekombinante Bakterien, die fremde Antigene exprimieren (Turner
et al., Infect. Im mun. 61, 5374 (1993); Ikonomidis et al., J. Exp.
Med. 180, 2209 (1994)); 4) bakterielle Toxine, die an CTL-Epitope
fusioniert sind (Donnelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
3530 (1993)); 5) partikelförmige
Antigene (Schirmbeck et al., Eur. J. Immunol. 24, 2068 (1994), Layton
et al., J. Immunol. 151, 1097 (1993)); 6) Verwendung verschiedener
Vektoren (Schutze-Redelmeier et al., J. Immunology 157, 650–655 (1996);
Schluesener, J. Neurosci. Res. 46, 258–262 (1996)); und 7) nackte
DNA, die in Muskelzellen injiziert wird (Ulmer et al., Science 259,
1745 (1993)). Diese verschiedenen Strategien spiegeln die innewohnende
Schwierigkeit der intrazellulären
Anlieferung von Antigenen wider, um eine CTL-Reaktion auszulösen. In
vielen Fällen
zeigen diese Ansätze
eine schlechte In-vivo-Wirksamkeit und sind durch Sicherheitsbedenken,
Immunreaktionen gegen den Vektor und die Kosten eingeschränkt.
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Zusätzlich zum
Immunsystem ist von Säugetieren
auch bekannt, dass sie kleine Peptide produzieren, die eine direkte
antimikrobielle Aktivität
besitzen. Die meisten dieser Peptide wirken, indem sie eine direkte Lyse
der Membran von Prokaryoten hervorrufen. Eine Hauptfamilie dieser
Peptide sind die β-strängigen Antibiotikapeptide,
die durch Disulfidbindungen gebunden sind. Mitglieder dieser Familie
umfassen die Defensine (Lehrer et al., Cell 64, 229–230 (1991);
Lehrer et al., Ann. Rev. Immunol. 11, 105–128 (1993)), Protegrine (Kokryakov
et al., FEBS 337, 231–236
(1993)) und Tachyplesine (Nakamura et al., J. Biol. Chem. 236, 16709–16713 (1988);
Miyata et al., J. Biochem. 106, 663–668 (1989)).
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Von
Peptiden dieser Klassen ist bekannt, dass sie in der Lage sind,
die Membranen von Säugetierzellen
zu durchdringen, obwohl die Peptide aufgrund von Unterschieden zwischen
bakteriellen und Säugetier-Zellmembranen
für Säugetierzellen
nicht toxisch sind.
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Die
PCT-Anmeldung WO-A-02/02595, veröffentlicht
am 10. 1. 2002, beansprucht das Prioritätsdatum vom 3. 7. 2000. Sie
wurde dem Europäischen
Patentamt in einer seiner Amtssprachen vorgelegt, und es wurde die
in Artikel 22, Absatz 1, oder Artikel 39, Absatz 1, des Kooperationsvertrags
festgelegte nationale Gebühr entrichtet.
Die Anforderungen von Artikel 158(2) EPÜ sind daher erfüllt.
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Der
Inhalt wird daher, so wie er eingereicht wurde, gemäß Artikel
54(3) und (4) EPÜ als
vom Stand der Technik, der für
den Bereich der Neuheit relevant ist, umfasst angesehen. Obwohl
diese frühere
Anmeldung ausführlich
das „lineare
Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids" der vorliegenden
Ansprüche
beschreibt, so betrifft diese frühere
Anmeldung doch nur Zusammensetzungen, die Konjugate des Derivats
mit „aktiven Substanzen" umfassen. Aus der
Beschreibung wird klar, dass die „aktiven Substanzen" pharmazeutische
Eigenschaften haben. Weiters betrifft diese frühere Anmeldung nicht explizit
Zusammensetzungen, die Konjugate des Derivats mit Antigenen umfassen.
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FR-A-2
767 323 offenbart (vgl. Beispiele) ein Konjugat eines Antigens (Biotin,
das unter Verwendung von Antikörpern
in den Beispielen detektiert wird), das an ein β-strängiges
Antibiotikapeptid gebunden ist.
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WO
099/07728 beschreibt eine Reihe an Derivaten dieser Peptide als
Vektoren für
die Einführung
von Substanzen in Zellen oder für
das Durchdringen der Blut-Gehirn-Schranke
von Substanzen. Diese Derivate umfassen lineare Derivate, in denen
die Peptide keine Disulfidbindungen aufweisen. Die Abwesenheit von
Disulfidbindungen entsteht durch die Substitution von Cystein-Resten
oder durch das Blockieren ihrer terminalen Thiol-Gruppen.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Anmelder fanden überraschenderweise
heraus, dass, wenn Peptidvektoren, die auf den Peptiden von WO 99/07728
basierten, verwendet wurden, um ein Antigen zu binden, das resultierende
Produkt durch antigen-präsentierende
Zellen aufgenommen werden kann, die anschließend in der Lage sind, das
Antigen zu verarbeiten und das Antigen in einer Art und Weise auf
ihrer Oberfläche
aufzuzeigen, die eine CTL-Reaktion erleichtert. Es wurde herausgefunden,
dass die CTL-Reaktion im Vergleich zu der Verwendung des Antigens alleine
verstärkt
wird.
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In
einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Konjugat eines Antigens
bereit, das an ein lineares Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids gebunden
ist, worin das Antigen ein Peptid, ein Vollprotein oder eine Proteinuntereinheit
der Gruppe bestehend aus einem Virusprotein, einem Bakterienprotein,
einem autologen Protein und einem Krebsprotein ist.
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Die
Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit,
die das Konjugat in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
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Die
Erfindung ermöglicht
ein Verfahren zur Verstärkung
einer Immunreaktion auf ein Antigen in einem Säugetier, wobei das Verfahren
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Konjugats des Antigens,
das an ein lineares Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids gekoppelt
ist, an ein Säugetier
umfasst.
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Die
Erfindung stellt auch die Verwendung eines Konjugats eines Antigens,
das an ein lineares Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids gebunden
ist, für
die Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer Immunreaktion auf
das Antigen in einem Säugetier
bereit.
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Die
Erfindung stellt auch ein Konjugat eines Antigens, das an ein lineares
Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids
gebunden ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung einer
Immunreaktion auf das Antigen in einem Säugetier bereit.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Aufnahme der Konjugate SynB3-fluNP und SynB4-fluNP durch K562-Zellen, zusammen
mit einem Kontroll-fluNP-Peptid. Die x-Achse zeigt die Zeit in Minuten,
und die y-Achse gibt die mittlere Fluoreszenz-Intensität an.
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2 zeigt
die CTL-Reaktionen, die bei Mäusen
ausgelöst
wurden, die mit Kontrollen ((a), (b) und (c)) und Konjugaten der
Erfindung ((d) und (e)) immunisiert wurden.
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3 zeigt
die Aufnahme der Konjugate SynB3-DVP und SynB4-DPV durch K562-Zellen, zusammen mit
einem Kontroll-DPV-Peptid. Die x-Achse zeigt die Zeit in Minuten,
und die y-Achse gibt die mittlere Fluoreszenz-Intensität an.
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4 zeigt
die CTL-Reaktionen, die bei Mäusen
ausgelöst
wurden, die mit Kontrollen und DPV-Konjugaten der Erfindung immunisiert
wurden.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Lineares Derivat eines β-strängigen Antibiotikapeptids
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Dieser
Begriff bezieht sich auf ein beliebiges β-strängiges Säugetier-Antibiotikapeptid,
das modifiziert wurde, um interne Disulfidbindungen zu entfernen,
die zwischen Cysteinresten gebildet wurden, und gegebenenfalls weiter
durch Substitution, Insertion oder Deletion so modifiziert wurde,
dass die Fähigkeit
des Peptids beibehalten wird, die Membran einer Säugetierzelle
zu durchdringen.
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Die
Modifikation, Disulfidbindungen zu entfernen, kann durch chemisches
Blockieren der Thiolgruppe erreicht werden (z.B. durch Umwandlung
in eine R-Thio-Gruppe, wie z.B. Methyl-Thio) oder durch Substitution des
Cystein-Rests durch eine andere Aminosäure, wie z.B. Serin, Alanin
oder Glycin.
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Da
eine Disulfidbindung zwei Cystein-Reste erfordert, ist es natürlich möglich, einen
nicht modifizierten Rest im Peptid beizubehalten, obwohl dies nicht
der bevorzugte Weg ist, um die Bildung von Dimeren zu verhindern.
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In
einem Aspekt kann das lineare Peptid als ein Peptid mit folgender
Struktur definiert werden: Nter-Mid-Cter, wobei Mid ein Peptid der
Formel (I) ist:
X1/3-(X1/2 oder eine Bindung)-(X oder eine
Bindung)-X3-(X1 oder eine Bindung)-X1-X-X1/2-(X2/3 oder eine Bindung)-Db-(X2/3
oder eine Bindung)-X1/3 (Seq.-ID Nr. 1);
wobei Db entweder
X3-X3 oder X1-X1 ist; und
worin Nter entweder ein N-Terminus
oder
X1/X3-X1-X1/2-X1-X3 (Seq.-ID Nr. 2) ist; und
worin
Cter entweder ein C-Terminus oder
X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-X3
(Seq.-ID Nr. 3) ist.
worin:
- – jedes
X1, das identisch oder unterschiedlich sein kann, für einen
Aminosäurerest
steht, bei dem die Seitenkette nichtpolar ist;
- – jedes
X2, das identisch oder unterschiedlich sein kann, für einen
Aminosäurerest
steht, bei dem die Seitenkette polar ist;
- – jedes
X3, das identisch oder unterschiedlich sein kann, für einen
Aminosäurerest
steht, bei dem die Seitenkette basisch ist;
- – X
jedes beliebige von X1, X2 und X3 ist;
worin das Peptid
linear ist (d.h. keine intramolekularen Disulfidbindungen enthält) und
die Fähigkeit
beibehält, eine
Säugetiermembran
zu durchdringen; oder ein Fragment davon ist, das die Fähigkeit
beibehält,
eine Säugetiermembran
zu durchdringen.
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Beim
oben stehenden Peptid wird es bevorzugt, dass, wenn der als „X1 oder
eine Bindung" angegebene
Wert eine Bindung ist, es einen Rest X2 oder X3 an der Position
gibt, die als der erste Erscheinungsort (von der N- zu der C-terminalen
Richtung) von „X2/3
oder einer Bindung" angegeben
ist. Auf ähnliche
Art und Weise wird es, wenn es sich bei Letzterem um eine Bindung
handelt, bevorzugt, dass Ersterer X1 ist.
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Aminosäuren, die
nichtpolare Seitenketten aufweisen, umfassen Alanin, Glycin, Valin,
Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan,
Cystein, Norleucin, CysteinACm, Penicillamin,
Prolin, Norvalin, Phenylglycin, Abu, Amino-1-cyclohexancarbonsäure, Aib,
Carboxyl-2-aminotetralin, 4-Bromphenylalanin, tert-Leucin, 4-Chlorphenylalanin,
3,4-Dichlorphenylalanin, 4-Fluorphenylalanin, Homoleucin, 4-Methylphenylalanin,
1-Naphthylalanin, 2-Naphthylalanin, 4-Nitrophenylalanin, 3-Nitrotyrosin, 3-Pyridylalanin,
[2-Thienyl]alanin.
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Bevorzugte
Aminosäuren
mit nichtpolaren Seitenketten umfassen Glycin, Valin, Norvalin,
Leucin, Isoleucin, Norleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und
Tryptophan.
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Aminosäuren, die
eine polare Seitenkette aufweisen, umfassen Serin, Threonin, Tyrosin,
Asparagine, Glutamin, Citrullin, Homocitrullin, Isoasparagin, β-Homoglutamin, β-Homoglutamin, β-Glutamin, β-Homoserin, β-Homothreonin,
Homoserin, Isoserin.
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Bevorzugte
dieser Aminosäuren
sind Serin, Threonin, Tyrosin, Asparagine und Glutamine.
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Aminosäuren mit
einer basischen Seitenkette umfassen Arginin, Lysin, Histidin, Ornithin,
Diaminoessigsäure,
Diaminobuttersäure
und Diaminopropionsäure.
Bevorzugte dieser Aminosäuren
umfassen Arginin und Lysin. Arginin wird besonders bevorzugt.
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Daher
ist in einer bevorzugten Ausführungsform
X1 aus Glycin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Prolin,
Phenylalanin, Methionin und Tryptophan ausgewählt, X2 ist aus Serin, Threonin,
Tyrosin, Asparaginen und Glutamin ausgewählt, und X3 ist aus Arginin
und Lysin ausgewählt.
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In
einer bestimmten Unterklasse der oben genannten Formel kann das
Peptid ein Protegrin-Derivat mit folgender Formel sein:
R-(Xa)-R-L-X1/2-Y-X2/3-Db-(R
oder eine Bindung)-F-X1/2-X1/2-X2/3-X1/2-X1-R (Seq.-ID Nr. 4);
worin
Xa entweder X1-X1 oder eine Bindung ist, oder ein Fragment davon
von zumindest 7 Aminosäuren.
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Ist
Xa X1-X1, so sind die zwei Gruppen vorzugsweise dieselben.
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Noch
bevorzugter ist die Formel:
R-(Xa)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-Db-R-F-(G/S/A)-X1-(R/S)-(V/T)-G-R
(Seq.-ID Nr. 5);
und insbesondere wird es bevorzugt, wenn die
Formel Folgende ist:
R-(Xb)-R-L-(G/S/A)-Y-(R/S)-R-R-R-F-(G/S/A)-(T/I/V)-(R/S)-(V/T)-G-R
(Seq.-ID Nr. 6),
worin Xb entweder eine Bindung, A-A oder G-G
ist.
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Beispiele
von Peptiden mit der oben genannten Formel umfassen:
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-V-S-V-G-R
(Seq.-ID Nr. 7)
R-A-A-R-L-A-Y-R-L-L-R-F-A-I-R-V-G-R (Seq.-ID
Nr. 8)
R-A-A-R-L-G-Y-R-nL-nL-R-F-G-Z-R-V-G-R
(Seq.-ID Nr. 9)
R-G-G-R-L-S-Y-S-R-R-R-F-S-T-S-T-G-R (Seq.-ID
Nr. 10)
R-R-L-S-Y-S-R-R-R-F (Seq.-ID Nr. 11)
worin nL Norleucin und Z Norvalin ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Peptid ein Tachyplesin-Derivat
mit folgender Formel:
X1/X3-X1-X1/2-X1-R-X1-X1/2-X2-R-X1-X1-S/R-X2-Db-X2/3-X2/3
(Seq.-ID Nr. 12);
oder ein Fragment davon mit zumindest 7 Aminosäuren.
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Die
beiden Reste von Db sind vorzugsweise beide gleich.
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Diese
Formel ist vorzugsweise:
(K/R/A)-W-(S/A)-F-R-X1-(S/A)-Y-R-X1-X1-(S/R)-Y-Db'-(R/S)-(R/L/nL) (Seq.-ID Nr. 13),
worin Db' aus L-L, nL–nL und R-R (worin nL
Norleucin ist) ausgewählt
ist.
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Noch
bevorzugter ist die Formel:
(R/K/A)-W-(S/A)-F-R-V-(S/A)-Y-R-G-I-(S/R)-Y-R-R-R-Xc-(R/L)
(Seq.-ID Nr. 14).
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Beispiele
von Peptiden umfassen:
K-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (Seq.-ID
Nr. 15);
R-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (Seq.-ID Nr. 16);
K-W-A-F-R-V-A-Y-R-G-I-R-Y-L-L-R-L
(Seq.-ID Nr. 17); und
A-W-S-F-R-V-S-Y-R-G-I-S-Y-R-R-S-R (Seq.-ID
Nr. 18).
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Um
Zweifel zu vermeiden, wird in den oben stehenden Peptidformeln der
Standard-1-Buchstaben-Aminosäure-Code
verwendet, um die natürlich
vorkommenden Aminosäuren
darzustellen. Andere Buchstaben werden wie definiert verwendet.
Die Gegenwart alternativer Reste an einer Position wird mit „/" angegeben; daher
bedeutet X1/2, dass der Rest im Peptid entweder X1 oder X2 sein
kann, und auf ähnliche
Art und Weise bedeutet R/S, dass Arginin oder Serin an den angegebenen
Stellen auftreten können.
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Alle
Peptide der Erfindung können
Aminosäuren
in L-Konfiguration oder in D-Konfiguration
umfassen. Weiters können
diese L- oder D-Peptide in Retroform vor liegen, d.h. Sequenzen,
in denen die N-zu-C-terminate Anordnung umgedreht ist. Ein Beispiel
eines solchen Peptids ist:
R-S-R-R-Y-S-I-G-R-Y-S-V-R-F-S-W-A
(Seq.-ID Nr. 19),
wobei es sich um die Retroform des ersten
im vorhergehenden Absatz dargestellten und von Tachyplesin abstammenden
Peptids handelt.
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Fragmente
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Es
können
auch Fragmente der oben genannten Sequenzen verwendet werden, welche
die Fähigkeit des
Peptids beibehalten, eine Säugetiermembran
zu durchdringen. Im Allgemeinen sind die Fragmente zumindest 7 Aminosäuren lang.
Die Peptide weisen vorzugsweise einen Größenbereich von 7 bis 24 Aminosäuren auf,
wie z.B. eine Größe von 10
bis 24, z.B. 10 bis 20. Ein typischer Größenbereich innerhalb desselben
ist von 12 bis 20 Aminosäuren
lang.
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Basische Reste
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Peptide
und Fragmente der Erfindung enthalten eine Anzahl an Aminosäuren X3,
bei denen es sich vorzugsweise um Arginin oder Lysin handelt. Es
wird bevorzugt, dass die Peptide und Fragmente so ausgewählt werden,
dass sie zumindest 4, vorzugsweise zumindest 5 und insbesondere
bevorzugt zumindest 6, X3-Reste enthalten.
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N- und C-terminate
Extensionen der Peptide
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Peptide
(umfassend Fragmente) der Erfindung fungieren als Vektor für die Verstärkung einer
Immunreaktion auf ein Antigen. Ist das Antigen an den N- oder C-Terminus des Peptids
gebunden, so kann das Antigen direkt durch eine Amidbindung oder
indirekt durch einen Linker gebunden sein. In letzterem Fall kann
der Linker 1 bis 25 Aminosäuren
umfassen und kann aus jeder geeigneten Peptidsequenz bestehen. Der
Linker kann ein flexibler Linker jenes Typs sein, der verwendet
wurde, um Antikörper-Schwer-
und -Leicht-Ketten in einem Einzelketten-Antikörper aneinander zu binden.
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Ist
der N- oder C-Terminus des Peptidvektors nicht an das Antigen gebunden,
so kann er gegebenenfalls eine geringe Menge an zusätzlichen
Sequenzen enthalten, z.B. von 1 bis 25 Resten, die z.B. aus Gründen, die
nach dem Stand der Technik der Gentechnik als konventionell angesehen
werden, vorhanden sein können.
Die Sequenz kann z.B. eine kurze Markierung für Reinigungs- oder Identifikationszwecke
bilden, oder sie kann eine spaltbare Präsequenz zum Transport aus einer
Wirtszelle bilden, in der die Peptid-Antigen-Fusion erzeugt wird.
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Ist
der N-Terminus des Peptids nicht durch die Gegenwart zusätzlicher
Sequenzen verlängert
oder nicht an das Antigen gebunden, so umfasst der N-Terminus des
Peptids im Allgemeinen eine Aminogruppe, obwohl Modifikationen der
Gruppe, wie z.B. jene, die das Resultat chemischer Synthese des
Peptids sein können,
vorhanden sein können.
Auf ähnliche
Art und Weise kann der C-Terminus eines Peptids ein modifizierter Carboxy-Terminus
sein, z.B. eine amidierte Carboxygruppe oder dergleichen.
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Behält die Fähigkeit bei, eine Säugetiermembran
zu durchdringen
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Mit
diesem Ausdruck ist gemeint, dass das Peptid in der Lage ist, die
Zellmembran einer Säugetierzelle
in Kultur bei 37 °C
zu durchdringen, und zwar zumindest zu 50%, vorzugsweise zumindest
zu 75%, jener Durchdringung, die durch das Peptid SynB3 in einer
Konzentration von (beiden von) 1 μM,
gemessen nach 60 Minuten in der Kultur, erreicht wird. Die Säugetierzelle
kann eine Primärzelllinie,
eine Krebszelllinie oder eine beliebige Zelllinie sein, die im Allgemeinen
nach dem Stand der Technik erhältlich
ist, wie z.B. K562-Zellen.
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Antigen
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Das
an das Peptid gebundene Antigen kann ein beliebiges Antigen sein,
gegen das erwünschterweise eine
Immunreaktion in einem Wirtsäugetier
hervorgerufen werden soll.
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Antigene umfassen Peptide,
Vollproteine und Proteinuntereinheiten.
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Die
Antigene sind viral, bakteriell oder stammen von autologen Proteinen
ab, z.B. zur Verwendung in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen
oder Krebsarten.
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Beispiele
für virale
Antigene umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Antigene, die vom
Influenzavirus; dem Adenovirus; den Hepatitis-A-, -B- und -C-Viren;
dem Gelbfiebervirus; dem Denguefiebervirus, HIV-1- und HIV-2; HSV1
und HSV2; dem Epstein-Barr-Virus; dem mit Retroperitonealfibromastose
assoziierten Herpes-Virus; dem menschlichen Papillomavirus; dem
Kaposisarkom-Herpesvirus und dem Zytomegalievirus (CMV) abstammen.
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Beispiele
für bakterielle
Antigene umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Antigene aus infektiösen Bakterien,
wie z.B. Mycobacterium tuberculosis, Acne vulgaris, Propionibacterium
acnes, Chlamydia trachomatis, Babesia microti, Ehrlichia risticii,
Borrelia burgdorferi, Leishmania aethiopica, Candida albicans, Mycobacterium
tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Staphylococcus
epidermis, Staphylococcus sapropyticus und Trypanosoma cruzi.
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Selbstantigene
umfassen Antigene, die auf Zellen aufscheinen, die mit dem Auftreten
von Autoimmunerkrankungen oder Krebs assoziiert sind. Beispiele
für Antigene
sind mit folgenden Krebsarten assoziiert: akuter myelogener Leukämie (AML),
akuter lymphozytärer
Leukämie
(ALL), chronischer myelogener Leukämie (CML), chronischer lymphozytärer Leukämie (CLL),
Haarzell-Leukämie,
Myelom und allen festen Tumoren aller Gewebearten.
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Die
begleitenden Beispiele zeigen die Verwendung eines Peptid-Antigens
mit nur 9 Aminosäuren
sowie eines 8,4-kDa-Proteins, das von M. tuberculosis abstammt.
Dementsprechend kann der Peptid-Vektor mit einer großen Bandbreite
an Antigenen verwendet werden, z.B. von einem einzelnen Peptid-Epitop
von etwa 6 Aminosäuren
bis zu Proteinen oder Untereinheiten davon mit zumindest 200 kDa,
obwohl vorzugsweise nicht mehr als 100 kDa.
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Antigene
umfassen auch DNA oder Oligonucleotide, die für DNA-basierte Impfungen verwendet
werden können,
wenn immunogene Proteine in in-vivo-transfizierten Zellen der Vakzinenrezipienten
in ihrer nativen Konformation aus antigenkodierender Expressionsplasmid-DNA
exprimiert werden.
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Säugetier
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Mit „Säugetier" ist ein beliebiges
Säugetier,
unter anderem ein Mensch, gemeint. Konjugate der Erfindung können in
der Veterinärmedizin
von Nutzen sein, z.B. für
die Impfung von Viehbeständen
und Geflügel oder
Haustieren, sowie auch in der Humanmedizin.
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Verstärkung der
Immunreaktion
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Konjugate
der Erfindung sind für
das Auslösen
einer Immunreaktion in einem bestimmten Säugetier von Nutzen, die stärker ist
als jene Immunreaktion, die man beim Säugetier durch die Verabreichung
einer Menge an nicht konjugiertem Antigen, die der Menge an Antigen
im Konjugat entspricht, erhalten würde. Die Fähigkeit eines Konjugats, dies
zu bewirken, kann durch eine Reihe verschiedener, nach dem Stand
der Technik bekannter Arten gemessen werden. Ein Test zur Messung
der CTL-Reaktion
in Mäusen,
wie er in den begleitenden Beispielen veranschaulicht ist, ist ein
solches Verfahren.
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Herstellung
von Konjugaten
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Konjugate
können
durch chemische Synthese oder unter Verwendung molekularbiologischer
Verfahren hergestellt werden. Die Antigen-Substanz kann in den Zusammensetzungen
gemäß der Erfindung
an einen Peptidvektor gebunden sein, und zwar durch ein beliebiges,
annehmbares Bindungsverfahren, das die chemische Natur sowie die
Größe und die
Anzahl aktiver und assoziierter Substanzen und Peptide in Betracht zieht.
Diese können
kovalente, hydrophobe oder ionische Bindungen oder spaltbare oder
nichtspaltbare Bindungen in den physiologischen Medien oder in den
Zellen sein.
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Die
Bindung kann an einer beliebigen Stelle im Peptidvektor erreicht
werden, in dem funktionelle Gruppen, wie z.B. -OH, -SH, -COOH, -NH2, natürlich
vorhanden sind oder in den diese eingeführt wurden. Daher kann ein
Antigen-Molekül
an den N-terminalen
oder C-terminalen Enden oder in den Peptid-Seitenketten an das Peptid
gebunden sein.
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Auf ähnliche
Art und Weise kann die Bindung an einer beliebigen Stelle im Antigen-Molekül erreicht werden,
bei dem z.B. funktionelle Gruppen, wie z.B. -OH, -SH, -COOH, -NH2, natürlich
vorhanden sind oder in das diese eingeführt wurden.
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Die
Bindung des Antigens kann auch durch nicht kovalente Mittel erfolgen.
Das Vektor-Peptid kann z.B. eine Gruppe (z.B. Streptavidin) umfassen,
die eine verwandte Gruppe bindet, die an das Antigen gebunden ist
(z.B. Biotin). Ionische Gruppen, die an den Peptid-Vektor und das
Antigen gebunden sind, stellen auch eine geeignete Bindung dar.
Der Linker kann so kreiert sein, dass der innerhalb einer APC spaltbar
ist, um die Verarbeitung und die Präsentation des Antigens zu erleichtern.
Eine Disulfidbindung kann z.B. verwendet werden, da diese Linker
im Allgemeinen in Plasma stabil und in der Zelle verringert sind.
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Es
ist möglich,
mehr als ein Antigen an jedes Vektor-Peptid zu koppeln und/oder
vice versa. Dies hängt in
gewissem Ausmaß von
der relativen Größe des Vektors
und des Antigens ab. Daher kann das Verhältnis der Peptid-Vektor-Moleküle zu den
Antigen-Molekülen pro
Konjugat von 10:1 bis 1:10 variieren, vorzugsweise von 5:1 bis 1:5.
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Werden
der Peptid-Vektor und das Antigen durch C- zu N-terminale Fusion
(in beliebiger Reihenfolge) verbunden, so kann die Fusion als ein
Einzelfusionsprotein mittels Rekombinationsverfahren erreicht werden.
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Dementsprechend
ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das für eine solche Fusion
kodiert. Bei der Nucleinsäure
kann es sich um DNAs oder RNAs handeln, und sie kann mit Kontrollsequenzen,
wie z.B. einem Promotor, assoziiert sein und/oder in Vektoren insertiert
sein. Der verwendete Vektor wird so ausgewählt, dass er mit dem Wirt,
in den er transferiert wird, kompatibel ist, um für die Expression
des Fusionsproteins zu sorgen. Die Herstellung dieser Vektoren und
die Produktion oder Expression von Peptiden oder Verbindungen mit
einer Typ-(II)-Formel
im Wirt kann unter Verwendung molekularbiologischer und gentechnischer
Verfahren erfolgen, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats,
wie es oben definiert wurde, bereit, wobei das Verfahren die Expression
einer Nucleinsäuresequenz
in einer Wirtszellenkultur, die für das Konjugat kodiert, sowie
das Gewinnen des Konjugats aus der Kultur umfasst.
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Zusammensetzungen
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Zusammensetzungen
der Erfindung umfassen Konjugate der Erfindung sowie einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger.
Zusammensetzungen können
für eine(n)
beliebige(n) Verabreichungsweg und Verabreichungsart hergestellt
werden. Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel
umfassen jene, die in Formulierungen verwendet werden, die zur oralen,
rektalen, nasalen, topischen (unter anderem buccalen und sublingualen),
vaginalen oder parenteralen (unter anderem subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen,
intrathekalen und epiduralen) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen
können leicht
in Einheitsdosierungsform hergestellt werden und können durch
ein beliebiges der nach dem Stand der Technik der Pharmazie wohlbekannten
Verfahren erzeugt werden. Diese Verfahren umfassen den Schritt des Kontaktierens
des Wirkstoffs mit dem Träger,
der einen oder mehrere Hilfsstoffe darstellt. Im Allgemeinen werden
die Formulierungen durch einheitliches und enges Kontaktieren des
Wirkstoffs mit flüssigen
Trägern
oder fein zerkleinerten festen Trägern oder beiden hergestellt
sowie, falls erforderlich, durch anschließendes Formen des Produkts.
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Für feste
Zusammensetzungen umfassen herkömmliche,
nicht toxische, feste Träger
z.B. pharmazeutische Qualitäten
von Mannit, Lactose, Cellulose, Cellulose-Derivaten, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin,
Talk, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen, die
verwendet werden können.
Die aktive Verbindung, wie sie oben definiert wurde, kann als Suppositorien
formuliert werden, z.B. unter Verwendung von Polyalkyleneglykolen,
acetylierten Triglyceriden und dergleichen als Träger. Flüssige, pharmazeutisch
verabreichbare Zusammensetzungen können z.B. durch Auflösen, Dispergieren
etc. einer aktiven Verbindung, wie oben stehend definiert, und gegebenenfalls
eines pharmazeutischen Adjuvans in einem Träger, wie z.B. Wasser, Salzlösung, wässriger
Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen, hergestellt werden,
um dadurch eine Lösung
oder eine Suspension zu bilden. Falls gewünscht kann die zu verabreichende
pharmazeutische Zusammensetzung auch geringe Mengen an nicht toxischen
Hilfssubstanzen enthalten, wie z.B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren,
pH-Puffer und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat,
Triethanolaminnatriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat
etc. Gegenwärtige
Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind für den Fachmann
bekannt oder offensichtlich; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. Auflage
(1975). Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung
enthält
auf jeden Fall eine Menge der aktiven Verbindung(en), die wirksam
ist, um die Symptome bei dem behandelten Individuum zu verringern.
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Dosierungsformen
oder Zusammensetzungen, die den Wirkstoff im Bereich von 0,25 bis
95% enthalten, wobei der Rest aus nicht toxischem Träger besteht,
können
hergestellt werden.
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Zur
oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare, nicht
toxische Zusammensetzung durch die Inkorporation eines beliebigen
der normalerweise verwendeten Exzipienten, z.B. pharmazeutische Qualitäten von
Mannit, Lactose, Cellulose, Cellulose-Derivaten, Natriumcrosscarmellose,
Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Glucose, Saccharose, Magnesium,
Carbonat und dergleichen, gebildet. Solche Zusammensetzungen weisen
die Form von Lösungen,
Suspensio nen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Retardformulierungen
und dergleichen auf. Diese Zusammensetzungen können 1%–95%, noch bevorzugter 2–50% und
insbesondere bevorzugt 5–8%,
Wirkstoff enthalten.
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Die
parenterale Verabreichung wird im Allgemeinen durch Injektion, entweder
subkutan, intramuskulär oder
intravenös,
charakterisiert. Injektionsmittel können in herkömmlichen
Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste
Formen, die vor der Injektion zur Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit
geeignet sind, oder als Emulsionen. Geeignete Exzipienten sind z.B.
Wasser, Salzlösung, Dextrose,
Glycerin, Ethanol oder dergleichen. Zusätzlich dazu können die
zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, falls gewünscht, auch
geringe Mengen an nicht toxischen Hilfsstoffen, wie z.B. Benetzungsmittel
oder Emulgatoren, pH-Puffer und dergleichen, wie z.B. Natriumacetat,
Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, Triethanolaminnatriumacetat
etc., enthalten.
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Ein
erst vor kurzem ausgearbeiteter Ansatz zur parenteralen Verabreichung
verwendet die Einpflanzung eines Systems mit langsamer Freisetzung
oder eiens Retardsystems, so dass ein konstanter Dosierungsspiegel
beibehalten wird. Siehe z.B. US-Patent
Nr. 3.710.795.
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Der
Prozentsatz der aktiven Verbindung, die in solchen parenteralen
Zusammensetzungen enthalten ist, ist in hohem Ausmaß von der
spezifischen Natur dieser sowie von der Aktivität der Verbindung und den Bedürfnissen
des Individuums abhängig.
Die Prozentsätze
des Wirkstoffs von 0,1% bis 10% in Lösung sind verwendbar, wobei
diese höher
sind, wenn es sich bei der Zusammensetzung um einen Feststoff handelt,
der anschließend
auf die oben genannten Prozentsätze
verdünnt
wird. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise 0,2–2% des
Wirkstoffs in Lösung.
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Dosierungen
und Verabreichungswege
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Das
Konjugat der Erfindung, z.B. in der Form einer oben beschriebenen
Zusammensetzung, kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden,
z.B. durch orale, rektale, nasale, topische (unter anderem buccale und
sublinguale), vaginale oder parenterale (unter anderem subkutane,
intramuskuläre,
intravenöse,
intradermale, intrathekale und epidurale) Verabreichung.
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Die
wirksame Menge des zu verabreichenden Konjugats der Erfindung liegt
letztendlich im Ermessen des Arztes, wobei der Schweregrad der Erkrankung
eines bestimmten Individuums (z.B. eines menschlichen Patienten
oder eines Tiermodells) sowie der Gesamtzustand des Individuums
in Betracht gezogen wird. Geeignete Dosen liegen typischerweise
im Bereich von 1 μg
bis 10 mg des Antigens, noch bevorzugter zwischen 10 μg und 1 mg
des Antigens und insbesondere bevorzugt zwischen 100 μg und 1 mg
des Antigens.
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Um
eine Immunreaktion bei einem Säugetier
hervorzurufen, kann das Konjugat in Wiederholungsdosen verabreicht
werden, z.B. um Booster-Dosen in sich wiederholenden Zeitabständen bereitzustellen.
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Das
Konjugat kann verwendet werden, um die Immunität von Patienten mit einer bestimmten
Erkrankung zu stärken
oder um eine Immunreaktion gegen eine bestimmte Erkrankung hervorzurufen.
Das Konjugat stellt vorzugsweise eine schützende Immunreaktion gegen
die Erkrankung bereit.
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Andere
Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nach der Lektüre der folgenden
Beispiele erkennbar, welche die Herstellung von Verbindungen mit
einer Typ-(II)-Formel,
in denen ein Peptid-Epitop und Protein-Antigene an Peptid-Vektoren
gekoppelt wurden, sowie ihre Verbesserung der Zellaufnahme und der CTL-Reaktion
gemäß der Erfindung
betreffen.
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BEISPIELE
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ARBEITSVORSCHRIFTEN
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Peptid-Synthese
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Alle
Peptide wurden gemäß der Fmoc-tBu-Strategie
unter Verwendung von AMS 422 (ABIMED, Deutschland) synthetisiert.
Die Markierung des N-Terminus der Peptide mit der NBD-Sonde (4-Fluor-7-nitrobenzofurazan)
wurde erreicht, wie anderswo beschrieben (Gazit et al., Biochemistry
34, 11479–11488
(1995)). Die Peptidreinigung wurde mittels Umkehrphasen-HPLC erreicht.
Die Reinigung lag bei über
95% für
alle Peptide, und zwar durch das Kriterium der UV-Absorption bei
220 nm und 460 nm.
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Bindung von
SynB-Vektoren an das rekombinante Protein rDPV
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Das
N-terminale Amin des rDPV-Proteins wurde erstmals mit 2-Iminithiolan
(2IT) derivatisiert, um ein freies Thiol aufzuweisen und gleichzeitig
die positive Ladung beizubehalten. Übermäßiges 2-IT-Reagens wurde aus
dem Protein mittels Gelfiltration entfernt. Das 2IT-rDPV wurde anschließend mit
einem thiopyridinium-aktivierten 3MP-SynB-Peptid inkubiert, um die
Bildung einer Disulfidbindung durch die Ersetzen von Thiopyridinium
aus dem 3MP-Peptid durch das freie Thiol von 2IT-DPV zu ermöglichen.
Das ersetzte Thiopyridinium wurde durch Gelfiltration aus dem Protein-Konjugat entfernt.
Alle Derivatisierungsschritte wurden unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie
beobachtet.
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Zellaufnahme
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Die
Zellassoziation wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung
eines FACScans (Becton Dickinson, USA) gemessen. Freie oder vektorisierte
Verbindungen wurden mit K562-Zellen (5 × 105 Zellen
pro ml) in Optimem-Medium bei 37 °C
für verschiedene
Zeitspannen inkubiert.
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Danach
wurden die Zellen zwei Mai gewaschen und anschließend in
0,5 ml eiskaltem PBS zur FACS-Analyse resuspendiert. Die zellassoziirten
Fluorophore wurden bei 488 nm angeregt, und die Fluoreszenz wurde
bei 525 nm gemessen. Ein Histogramm der Fluoreszenzintensität pro Zelle
(1 × 104) wurde erhalten, und der berechnete Mittelwert
dieser Verteilung (mittlere Fluoreszenzintensität) wurde als für die Menge des
zell-assoziierten Peptids repräsentativ
angesehen.
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In-vivo-Modellsysteme
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Mäuse (Balb/c)
wurden entweder mit freien oder mit vektorisierten Antigenen immunisiert,
und jeder Formulierung waren 15 μg
Heparin beigemischt. Die Reagenzien wurden gemischt und anschließend zur
subkutanen Immunisierung in jeder Flanke verwendet. Die Mäuse wurden
an Tag 0 immunisiert, und nach 3 Wochen wurden die Mäuse getötet, es
wurden die Milzen entfernt und einzelne Zellsuspensionen hergestellt.
Drei Tage später
wurden stimulierte, von Balb/c abstammende LPS-Blasten (unter Verwendung
von Dextransulfat und LPS) bestrahlt und mit dem Antigen inkubiert.
Milzzellen (6 × 10
6/ml) und LPS-Blasten (3 × 10
6/ml)
wurden zusammen 7 Tage lang inkubiert. Die zytotoxische T-Zellen-Aktivität wurde
an Tag 6 unter Verwendung von Cr
51-markierten
P815-Zellen gemessen, die entweder ungepulst oder gepulst waren
und das Antigen als Ziel hatten. An Tag 7 wurden die verbleibenden
Zellen erneut mit antigen-gepulsten P815-Zellen mit der Zugabe von
20 U/ml IL-2 stimuliert. Bei allen Daten sind die nicht spezifischen
Anti-P815-Zellen-CTL abgezogen. BEISPIEL
1: ANLIEFERUNG EINES PEPTID-EPITOPS
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Zellaufnahme
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Das
Flu-NP-Epitop wurde an SynB3- und SynB4-Vektoren konjugiert. Zuerst
verglichen die Erfinder die Zellaufnahme von freiem und konjugiertem
Flu-NP. Das Flu-NP-Epitop
wurde an SynB3- und SynB4-Vektoren konjugiert und mit einer fluoreszierenden
Gruppe (NBD) markiert. Die Verbindungen wurden mit K562-Zellen über verschiedene
Zeitspannen inkubiert, und die Zellaufnahme wurde unter Verwendung
der Durchflusszytometrie gemessen.
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Die
Inkubation von Zellen mit dem freien Flu-NP-Epitop führte zu
einer sehr geringen Aufnahme, wie durch den Mittelwert der Fluoreszenzintensität zu beurteilen
ist (1). Die Bindung des flu-NP-Peptid-Antigens mit
entweder SynB3- oder SynB4-Vektoren
erhöhte
seine Zelldurchdringung jedoch signifikant. Die Zelldurchdringung
erfolgte während
der ersten 30 Minuten sehr schnell und blieb danach auf einem Plateauwert stehen.
Die Verstärkung
der Internalisierung war 2 bis 5-mal so hoch, in Abhängigkeit
vom verwendeten Vektor. Nach 45 Minuten war die Zellaufnahme von
SynB4/flu-NP etwa 5fach höher
als jene, die bei freiem flu-NP beobachtet wurde.
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Immunisierungsstudien
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Balb/c-Mäuse (H-2d,
weiblich, 6–8
Wochen) wurden auf intradermalem Weg (Schwanzansatz) mit äquimolaren
Mengen von entweder freiem oder konjugiertem flu-NP-Peptid immunisiert.
Speziell erhielt jede Maus 25 μg
flu-NP-Peptid, entweder frei, gemischt mit unvollständigem Freund-Adjuvans
(IFA) oder konjugiert. Konjugierte Peptidgruppen erhielten auch
15 μg Heparin.
Die Milz wurde nach drei Wochen entnommen. Die CTL-Reaktionen wurden
unter Verwendung des 51Cr-Freisetzungstests
mit Splenozyten, die zwei Runden an In-vitro-Stimulierung mit freiem
Peptid erhalten hatten, gemessen.
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2 zeigt
die Resultate des flu-NP-Experiments. Insbesondere naive Mäuse sowie
Mäuse,
die nur flu-NP-Peptid erhalten hatten, waren nicht in der Lage,
spezifische CTL-Reaktionen hervorzubringen (a bzw. b). Zwei von
drei Mäusen,
die mit flu-NP-Peptid
in IFA immunisiert worden waren, zeigten schwache CTL-Reaktionen
(c). Im Gegensatz dazu zeigten alle Mäuse, die mit entweder SynB3/flu-NP-
(d) oder SynB4/flu-NP-Konjugaten (e) immunisiert worden waren, spezifische
CTL-Reaktionen,
wobei fünf
der sechs Mäuse
starke CTL-Reaktionen aufwiesen. 2 zeigt,
dass jene Reaktionen, die durch flu-NP-Peptid-Konjugate ausgelöst werden,
deutlich stärker
sind als jene, die von freiem Peptid oder freiem Peptid in IFA,
einem starken Adjuvans, hervorgebracht wurden.
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BEISPIEL
2: ANLIEFERUNG EINES REKOMBINANTEN PROTEIN-ANTIGENS
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Zellaufnahme
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Die
Erfinder banden auch rDPV-Protein an SynB3- und SynB4-Vektoren.
Das Bindungsverfahren ist in den Arbeitsvorschriften beschrieben.
Zuerst verglichen die Erfinder die Zellaufnahme von freiem und gebundenem
rDPV. Das rDPV wurde mit einer fluoreszierenden Gruppe (NBD) markiert,
um seine Aufnahme zu messen. Die Verbindungen wurden mit K562-Zellen
verschiedene Zeitspannen lang inkubiert, und die Zellaufnahme wurde
unter Verwendung der Durchflusszytometrie gemessen.
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Die
Inkubation der Zellen mit dem freien rDPV führte zu einer sehr geringen
Aufnahme, wie durch den Mittelwert der Fluoreszenzintensität zu beurteilen
ist (1). Die Bindung des rDPV-Proteins mit entweder SynB3-
oder SynB4-Vektoren erhöhte
seine Zelldurchdringung jedoch signifikant. Die Verstärkung der
Internalisierung war 3 bis 7-mal so hoch, in Abhängigkeit vom verwendeten Vektor.
Wie beim Peptid-Epitop beobachtet, verstärkte der SynB4-Vektor die rDPV-Zelldurchdringung
etwas besser als SynB3. Die Zellaufnahme von rDPV-SynB3 erreichte
schneller eine Sättigung
als jene mit rDPV-SynB4 (30 Minuten vs. 100 Minuten).
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Immunisierungsstudien
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C57BI/6/c-Mäuse (weiblich,
6–8 Wochen)
wurden auf intradermalem Weg (Schwanzansatz) mit 5 μg von entweder
DPV-Protein, SynB3/rDPV-Konjugat oder SynB4/rDPV-Konjugat immunisiert.
Das Injektionsvolumen betrug 100 μl
und enthielt auch 15 μg
Heparin. Die Tiere wurden an Tag 0 und an Tag 21 immunisiert, wobei
ihre Milz an Tag 42 zur Messung der DPV-spezifischen CTL-Reaktionen
entnommen wurde. Die CTL-Reaktionen wurden unter Verwendung des 51Cr-Freisetzungstests mit Splenozyten, die
zwei Runden an In-vitro-Stimulierung erhalten hatten, gemessen.
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4 zeigt
die mittleren CTL-Reaktionen für
dieses rDPV-Experiment. Naive Mäuse
(Rauten) waren nicht in der Lage, eine spezifische CTL-Reaktion
hervorzubringen (wobei eine wirksame Reaktion als > 10% spezifische Lyse
definiert wird), während
Mäuse,
die nur rDPV-Protein erhielten, eine schwache CTL-Reaktion aufwiesen
(Kreise). Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die entweder mit dem SynB3/rDPVoder
dem SynB4/rDPV-Konjugat immunisiert worden waren, starke CTL-Reaktionen
(umgedrehte Dreiecke bzw. Quadrate). 4 zeigt
daher, dass jene Reaktion, die durch rDPV-Konjugate ausgelöst wird,
deutlich stärker
ist als jene, die von freiem Peptid hervorgebracht wurde.
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