ES2236705T3 - Complejos proteinicos de estres-peptido en calidad de vacunas profilacticas y terapeuticas contra agentes patogenos intracelulares. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA FAMILIA DE VACUNAS QUE CONTIENE COMPLEJOS PEPTIDO-PROTEINAS DE ESTRES QUE, AL ADMINISTRARSE A UN MAMIFERO, INICIAN UNA RESPUESTA DE LAS CELULAS T CITOTOXICAS CONTRA CELULAS INFECTADAS CON UN PATOGENO INTRACELULAR PRESELECCIONADO. TAMBIEN SE DESCRIBEN LOS METODOS PARA PREPARAR Y ADMINISTRAR VACUNAS QUE CONTIENEN DICHOS COMPLEJOS PEPTIDO-PROTEINAS DE ESTRES.

Description

Complejos proteínicos de estrés-péptido en calidad de vacunas profilácticas y terapéuticas contra agentes patógenos intracelulares.

Esta invención se refiere en general al campo del desarrollo de vacunas. De manera más particular, la invención se refiere al desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas eficaces frente a patógenos intracelulares.

El desarrollo de vacunas dirigidas frente a patógenos intracelulares, por ejemplo, virus, bacterias, protozoos, hongos, y parásitos intracelulares, es continuo. El desarrollo y el uso de las vacunas ha resultado ser muy útil en la prevención de la diseminación de enfermedades en el ser humano. Por ejemplo, en 1967 la viruela era endémica en 33 países y se notificaban de 10 a 15 millones de casos al año. En aquel momento la Organización Mundial de la Salud introdujo un programa para erradicar la viruela. Aproximadamente una década después se había erradicado con éxito la viruela de la población humana.

Teóricamente una vacuna ideal tiene una vida útil larga, es capaz de inducir con una sola dosis una inmunidad prolongada frente a un patógeno preseleccionado y todas sus variantes fenotípicas, es incapaz de producir la enfermedad frente a la que se dirige la vacuna, es eficaz tanto en el tratamiento como en la profilaxis, se prepara con facilidad y de manera económica usando metodologías estándar, y se puede administrar fácilmente sobre el terreno.

En la actualidad se han desarrollado cuatro clases principales de vacunas frente a las enfermedades de los mamíferos. Incluyen vacunas vivas atenuadas, vacunas muertas enteras, vacunas de vectores y vacunas de subunidades. Diversas publicaciones tratan sobre la preparación y utilidad de estas clases de vacunas. Véase, por ejemplo, Subbarao y col. (1992), en Genetically Engineered Vaccines, editado por Clardi y col., Plenum Press, Nueva York; y Melnick (1985), en High Technology Route to Virus Vaccines, editado por Dreesman y col., publicado por la Sociedad Estadounidense de Microbiología, cuyas descripciones se incorporan a esta solicitud como referencia. A continuación se presenta un sumario de las ventajas y desventajas de cada una de las cuatro clases de vacunas.

Las vacunas vivas atenuadas comprenden patógenos vivos pero atenuados, es decir, patógenos no virulentos, que han sido "inactivados" por medio de mutaciones genéticas. Las mutaciones impiden que los patógenos produzcan la enfermedad en el receptor de la vacuna. La principal ventaja de este tipo de vacuna es que el organismo atenuado estimula el sistema inmunitario del receptor de la misma manera que el patógeno de tipo natural, simulando la infección natural. Además, los patógenos atenuados se replican en la vacuna, por lo que presentan un aporte continuo de determinantes antigénicos al sistema inmunitario del receptor. En consecuencia, las vacunas vivas pueden inducir respuestas inmunitarias intensas y duraderas frente al patógeno de tipo natural. Además, las vacunas vivas pueden estimular la producción de anticuerpos que neutralizan el patógeno. También pueden inducir resistencia al patógeno en su punto natural de entrada en el huésped. Hasta la fecha se han desarrollado vacunas vivas atenuadas frente a viruela, fiebre amarilla, sarampión, parotiditis, rubéola, poliomielitis, adenovirus y tuberculosis.

Sin embargo, las vacunas vivas atenuadas tienen varios problemas inherentes. Primero, siempre existe el riesgo de que el patógeno atenuado pueda recuperar un fenotipo virulento. En el caso de la reversión fenotípica, la vacuna puede llegar a inducir la enfermedad frente a la que se pretendía que produjera inmunidad cuando se diseñó. Segundo, es caro y puede ser poco práctico desarrollar vacunas vivas dirigidas frente a patógenos que cambian de manera continua sus determinantes antigénicos. Por ejemplo, los investigadores no han podido desarrollar una vacuna viva práctica frente al virus gripal porque el virus cambia continuamente los determinantes antigénicos de las proteínas de la cubierta. Tercero, no se pueden desarrollar vacunas vivas atenuadas frente a infecciones producidas por retrovirus y virus transformantes. Los ácidos nucleicos de estos virus se pueden integrar en el genoma del receptor, con el riesgo potencial de inducir cáncer en el receptor. Cuarto, durante la fabricación de las vacunas vivas atenuadas se pueden copurificar los agentes adventicios que están presentes en las células en las que se fabrica la vacuna junto con el patógeno atenuado. Los virus extraños que se han detectado en las preparaciones de vacunas hasta la fecha incluyen el virus de la leucosis aviar, el papovavirus de los simios SV40 y el citomegalovirus de los simios. Quinto, las preparaciones de vacunas vivas pueden ser inestables, lo que limita su almacenamiento y su uso sobre el terreno. En la actualidad se están haciendo intentos de desarrollar agentes estabilizantes que mejoren la longevidad de las vacunas activas.

Las vacunas muertas enteras comprenden organismos enteros no viables. Los patógenos se inactivan de manera rutinaria mediante un tratamiento químico, por ejemplo, inactivación con formalina, o mediante un tratamiento con dosis letales de radiación. Se han desarrollado vacunas muertas enteras frente a tos ferina, tifus, fiebre tifoidea, fiebre paratifoidea, y particularmente frente a cepas del virus gripal.

En principio, habitualmente es seguro administrar vacunas muertas porque es poco probable que los organismos produzcan enfermedades en el huésped. Además, como el organismo está muerto las vacunas tienden a ser estables y tienen vidas útiles prolongadas. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas a las vacunas muertas enteras. Primero, es necesario un cuidado considerable en su fabricación para garantizar que no quedan patógenos vivos en la vacuna. Segundo, las vacunas de este tipo generalmente no estimulan de manera eficaz respuestas celulares y tienden a ser ineficaces frente a patógenos intracelulares. Tercero, la inmunidad que desencadenan las vacunas no viables habitualmente es poco duradera y se debe reforzar en una fecha posterior. Este proceso supone de manera repetida entrar en contacto con las personas que necesitan la vacunación y también plantea preocupaciones sobre la posibilidad de hipersensibilizar al individuo vacunado frente al patógeno de tipo natural.

Las vacunas de vectores, también conocidas como vacunas vivas de vehículo recombinante, se pueden preparar incorporando un gen que codifica un determinante antigénico específico de interés a un virus o bacteria vivo pero inofensivo. El organismo vector inofensivo, a su vez, se inyecta en el receptor diana. En teoría, el organismo vector recombinante se replica en el huésped, produciendo el determinante antigénico y presentándolo al sistema inmunitario del huésped. Se contempla que este tipo de vacuna será más eficaz que el tipo no replicativo de vacuna. Para que esta vacuna sea eficaz el vector debe ser viable, y debe ser no virulento de manera natural o debe tener un fenotipo atenuado.

Los vectores que se prefieren en la actualidad incluyen cepas específicas de: virus vacunal (viruela vacuna), adenovirus, virus adenoasociados, Salmonella y micobacterias. Las cepas vivas de virus vacunales y de micobacterias se han administrado con seguridad a seres humanos en forma de vacunas frente a la viruela y la tuberculosis (BCG), respectivamente. Se ha mostrado que expresan proteínas extrañas y que muestran poca o ninguna conversión a un fenotipo virulento. Actualmente se están desarrollando algunos tipos de vacunas de vectores que usan el vector BCG frente al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Por ejemplo, las proteínas antigénicas del VIH, gag, env, proteasa del VIH, transcriptasa inversa, gp120 y gp41, se han introducido, de una en una, en el vector BCG y se ha mostrado que inducen respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T frente a las proteínas del VIH en modelos animales (Aldovini y col. (1991), Nature 351,479-482; Stover y col. (1991), Nature 351:456-460; Colston (1991), Nature 351:442-443).

Las vacunas de vectores son capaces de transportar una pluralidad de genes extraños, lo que permite la vacunación simultánea frente a diversos determinantes antigénicos preseleccionados. Por ejemplo, los investigadores han introducido mediante ingeniería genética varios genes del VIH en el genoma del virus vacunal, creando de esta manera vacunas multivalentes que, por lo tanto, en teoría son capaces de estimular simultáneamente una respuesta frente a varias proteínas del VIH.

Las vacunas de vectores se asocian a varias desventajas. Primero, es necesario identificar cepas adecuadas de organismos viables pero no patógenos que pueden actuar como vehículos para los genes de interés. Segundo, las vacunas de vectores se pueden preparar sólo cuando se ha identificado y caracterizado un determinante antigénico potencialmente protector. Según esto, no se pueden preparar vacunas de vectores frente a patógenos cuyos determinantes antigénicos no se han identificado todavía o si son tan variables que no es práctica la perspectiva de identificar el determinante antigénico para cada variante. Tercero, los genes que codifican el determinante antigénico preseleccionado se deben transfectar y expresar de manera estable en el vehículo vivo preferido. En consecuencia, las metodologías necesarias para desarrollar este tipo de vacuna son laboriosas y llevan tiempo. Cuarto, todavía no se ha establecido que las vacunas de vectores recombinantes inmunizan de manera eficaz a un receptor frente a un patógeno preseleccionado.

Las vacunas de subunidades habitualmente comprenden un componente subcelular purificado a partir del patógeno de interés. La administración de vacunas de subunidades habitualmente es segura porque es poco probable que los componentes celulares produzcan enfermedad en el receptor. El componente subcelular purificado puede ser una fracción subcelular definida, una proteína, un ácido nucleico o un polisacárido purificado que tiene un determinante antigénico capaz de estimular una respuesta inmunitaria frente al patógeno. Los componentes antigénicos se pueden purificar a partir de una preparación del patógeno desorganizado. De manera alternativa, se pueden sintetizar las proteínas, los ácidos nucleicos o los polisacáridos antigénicos usando procedimientos bien conocidos en la materia. Las enfermedades que se han tratado con vacunas de subunidades incluyen cólera, difteria, hepatitis de tipo B, poliomielitis, tétanos y cepas específicas del virus gripal.

Sin embargo, las vacunas de subunidades se asocian a varias desventajas. Primero, es importante identificar y caracterizar el determinante antigénico protector. Este proceso puede ser laborioso y llevar tiempo. En consecuencia, no será práctico desarrollar vacunas de subunidades frente a patógenos que tienen determinantes antigénicos muy variables. Segundo, las vacunas de subunidades generalmente no estimulan de manera eficaz respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos y, por lo tanto, pueden no estimular de manera eficaz una respuesta inmunitaria frente a patógenos intracelulares. Tercero, la inmunidad que desencadenan las vacunas de subunidades habitualmente es breve, y, al igual que con las vacunas muertas enteras, se debe reforzar en una fecha posterior, lo que plantea las preocupaciones sobre la posibilidad de hipersensibilizar al individuo vacunado frente al patógeno de tipo natural.

Hasta ahora muchas de las vacunas enteras inactivadas y de las vacunas de subunidades no han sido lo suficientemente inmunógenas en sí mismas como para producir respuestas intensas y protectoras. En consecuencia, se han coadministrado inmunoestimulantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio, micobacterias intactas y/o componentes de micobacterias) con estas vacunas para reforzar la respuesta inmunitaria que estimula la vacuna. Recientemente algunos experimentos han mostrado que las proteínas del choque térmico de origen micobacteriano pueden actuar como vehículos de vacunas peptídicas, reforzando de esta manera la inmunogenia de los péptidos in vivo (Lussow y col. (1991), Eur J Immunol 21:2297-2302). Otros estudios han mostrado que la administración a ratones de una composición que comprende un péptido antigénico reticulado químicamente con una proteína de estrés de origen micobacteriano purificada estimula una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y no una respuesta temporal (mediada por células) frente al péptido antigénico (Barrios y col. (1992), Eur J Immunol 22:1365-1372). El documento WO-A-9402208 se refiere a vacunas que contienen proteínas del choque térmico.

Blachere y col., marzo de 1993, J Cell Biochem, supl. 17D:124 (resumen NZ 502), describen que se pueden obtener linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos frente al virus gripal a partir del bazo de ratones inmunizados con la proteína gp96 obtenida de células infectadas con el virus gripal (PR8) o a partir de células transfectadas con el gen NP del virus gripal. Blachere y col., Journal of Immunotherapy 13:353-356, 1993, se refieren al mismo trabajo experimental usando células transfectadas con el gen NP del virus gripal, como se describe en el resumen de Blachere, y también se refieren al uso de la línea transformada con SV40 C57BL.6 SVB6, es decir, una línea celular murina infectada con SV40. Los LTC que se generan a partir de los bazos de ratones inmunizados con gp96 procedente de la línea celular infectada con SV40 SVB6 mostraron la reactividad de los LTC frente a SVB6, pero no frente a una línea celular singénica no transformada con SV40.

Sin embargo, como generalmente se piensa que son necesarias respuestas celulares para inmunizar frente a patógenos intracelulares (véase, por ejemplo,"Advanced Immunology", Male y col. (1991), Cower Medical Publishing; Raychaudhury y col. (1993), Immunology Today 14:344-348), se contempla que las vacunas convencionales de subunidades y las vacunas de organismos enteros inactivados pueden no estimular de manera eficaz respuestas inmunitarias, especialmente respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos, frente a patógenos intracelulares.

La invención se refiere a una vacuna de subunidades segura que comprende un complejo proteína de estrés-péptido para su administración a un mamífero y que es capaz de inducir, por medio de una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos, resistencia frente a la infección por un patógeno intracelular preseleccionado. Las vacunas que se preparan según la invención se pueden usar para desencadenar una respuesta inmunitaria frente a un patógeno intracelular cuyos determinantes antigénicos se han identificado, o que aún no se han identificado, o cuando no es práctico aislar y caracterizar cada uno de los determinantes antigénicos. Las vacunas que se preparan según la invención pueden ser eficaces profiláctica y terapéuticamente frente a patógenos preseleccionados.

La invención también se refiere a un procedimiento para inducir en un mamífero la resistencia a la infección por un patógeno intracelular mediante la administración al mamífero de una vacuna de subunidades proteína de estrés-péptido. La invención se refiere además a un procedimiento para producir rápidamente y de manera coste-eficaz cantidades comercialmente viables de las vacunas proteína de estrés-péptido procedentes de una célula o de una línea celular infectada con el patógeno intracelular o de manera alternativa procedentes de una célula o de una línea celular transfectada con un gen que codifica un determinante antigénico específico y que lo expresa. La invención se refiere además a un procedimiento para preparar una vacuna de subunidades inmunógena proteína de estrés-péptido reconstituyendo in vitro proteínas de estrés y péptidos inmunitariamente no reactivos para producir de esta manera complejos inmunorreactivos capaces de estimular una respuesta inmunitaria frente a un patógeno intracelular preseleccionado.

Éstos y otros objetos y características de la invención serán evidentes a partir de la descripción, de los dibujos y de las reivindicaciones que siguen.

La presente invención proporciona un complejo purificado e inmunógeno proteína de estrés de mamífero-péptido como se define en la reivindicación 1; el uso de un complejo purificado e inmunógeno proteína de estrés de mamífero-péptido para la fabricación de un medicamento como se define en la reivindicación 25; un proceso para producir un complejo no covalente purificado e inmunógeno como se define en la reivindicación 29; un complejo purificado e inmunógeno no covalente como se define en la reivindicación 35; un complejo para su uso como medicamento como se define en la reivindicación 39 o en la reivindicación 45; el uso de un complejo para la fabricación de un medicamento como se define en la reivindicación 40 o en la reivindicación 46; complejos purificados e inmunógenos proteína de estrés de mamífero-péptido como se define en la reivindicación 41 o en la reivindicación 42; una composición como se define en la reivindicación 47; y el uso de una composición como se define en la reivindicación 49.

Ahora se ha descubierto que cuando se aísla una vacuna de subunidades que contiene un complejo proteína de estrés-péptido a partir de células infectadas por un patógeno intracelular preseleccionado y después se administra a un mamífero, puede estimular de manera eficaz respuestas inmunitarias celulares frente a células infectadas por el mismo patógeno. De manera específica, la respuesta inmunitaria está mediada por la cascada de los linfocitos T citotóxicos que ataca selectivamente y destruye células que contienen los patógenos intracelulares.

Las vacunas que se preparan según las metodologías que se describen en esta solicitud proporcionan un enfoque alternativo para estimular la inmunidad celular, evitando de esta manera el uso de patógenos intracelulares vivos (atenuados o de otra manera). Además, las vacunas que se describen en esa solicitud son ideales para inducir respuestas inmunitarias frente a patógenos intracelulares que tienen determinantes inmunógenos definidos o todavía no definidos. Además, las vacunas se pueden usar para inducir respuestas inmunitarias frente a patógenos intracelulares cuyos determinantes antigénicos son variados o cambian de manera constante, lo que hace que no sea práctico el aislamiento y la caracterización de los determinantes antigénicos.

En un aspecto preferido, la invención comprende una vacuna que se puede administrar a un mamífero para inducir en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente a un patógeno intracelular preseleccionado. También se contempla que las vacunas pueden inducir en el mamífero, por medio de una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos, la resistencia a la infección por el patógeno intracelular preseleccionado. Las vacunas que se fabrican según los principios que se describen en esta solicitud contienen un complejo inmunógeno proteína de estrés-péptido que es capaz de estimular en el receptor una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos dirigida frente a las células que están infectadas por el patógeno de interés. Cuando se combina con un vehículo, un adyuvante o un excipiente farmacéuticamente aceptable, el complejo se puede administrar a un mamífero usando técnicas bien conocidas en la materia.

Se entiende que el término "vacuna", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier composición que contiene un complejo proteína de estrés-péptido que tiene al menos un determinante antigénico que, cuando se administra a un mamífero, estimula en el mamífero una respuesta inmunitaria frente al determinante antigénico.

Se entiende que el término "proteína de estrés", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier proteína celular que satisface los siguientes criterios. Es una proteína cuya concentración intracelular aumenta cuando una célula está expuesta a un estímulo estresante, es capaz de unirse a otras proteínas o péptidos, y es capaz de liberar las proteínas o péptidos unidos en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) o de un pH bajo. Los estímulos estresantes incluyen, aunque no se limitan a ellos, choque térmico, privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno e infección por patógenos intracelulares.

Tras la lectura de esta descripción, el técnico entenderá que se pueden usar otras proteínas de estrés recombinantes, que incluyen formas no nativas, análogos truncados, muteínas, proteínas de fusión, así como otras proteínas capaces de simular la unión a péptidos y las propiedades inmunógenas de una proteína de estrés, en la preparación de las vacunas formadas por proteína de estrés-péptido que se describen en esta solicitud.

Las primeras proteínas de estrés que se identificaron fueron las proteínas del choque térmico (PCT). Como indica su nombre, las PCT son inducidas por una célula en respuesta al choque térmico. Se han identificado tres familias principales de PCT, que se denominan PCT60, PCT70 y PCT90 porque sus pesos moleculares respectivos son de aproximadamente 60, 70 y 90 kDa. Posteriormente se encontró que muchos miembros de estas familias son inducidos en respuesta a otros estímulos estresantes, como los que se han mencionado más arriba.

Las proteínas de estrés se encuentran en todos los procariotas y eucariotas y muestran un notable nivel de conservación evolutiva. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de DnaK, la PCT70 de E.coli, tiene una identidad de aproximadamente 50% con las proteínas PCT70 de eucariotas (Bardwell y col. (1984), Proc Natl Acad Sci 81:848-852). De manera similar, las familias PCT60 y PCT90 también muestran unos niveles elevados de conservación intrafamiliar (Hickey y col. (1989) Mol. Cell Biol. 9:2615-2626; Jindal (1989) Mol. Cell Biol. 9:2279-2683). Además, se ha descubierto que las familias PCT-60, PCT-70 y PCT-90 están formadas por proteínas cuya secuencia está relacionada con la de las proteínas de estrés, de modo que, por ejemplo, tienen una identidad de aminoácidos mayor de 35%, pero cuyos niveles de expresión típicamente no se alteran en condiciones estresantes para la célula huésped. Un ejemplo de una proteína de este tipo incluye la proteína citosólica que se expresa de manera constitutiva CCT70, cuya secuencia se relaciona con la de la proteína inducida por el estrés PCT70. Según esto, se contempla que la definición de proteína de estrés, como se usa en esta solicitud, incluye otras proteínas, muteínas, análogos y variantes de los mismos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 35% a 55%, preferentemente de 55% a 75%, y más preferentemente de 75% a 95%, con miembros de las tres familias cuyos niveles de expresión en una célula son estimulados en respuesta a estímulos estresantes.

Se entiende que el término "péptido", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que está presente en una célula eucariótica infectada por un patógeno intracelular pero que no está presente en una célula similar cuando la célula no está infectada por el mismo patógeno. La definición incluye péptidos que se originan por el patógeno intracelular.

Se entiende que el término "complejo inmunógeno proteína de estrés-péptido", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier complejo que contiene una proteína de estrés y un péptido y que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los péptidos están asociados de manera no covalente a las proteínas de estrés. Los complejos pueden incluir, aunque no se limitan a ellos, los complejos PCT60-péptido, PCT70-péptido y PCT90-péptido. En un aspecto preferido de la invención se puede usar una proteína de estrés que pertenece a la familia PCT90, por ejemplo gp96, para generar una vacuna eficaz que contiene un complejo gp96-péptido. Como los péptidos se pueden disociar del complejo en presencia de ATP o de un pH bajo, los péptidos potencialmente antigénicos se pueden aislar a partir de las células infectadas por un patógeno intracelular preseleccionado. En consecuencia, se pueden identificar fácilmente los determinantes antigénicos para posiblemente cualquier patógeno intracelular de interés usando las metodologías que se describen en esta solicitud.

Se entiende que el término "linfocito T citotóxico", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier linfocito T que expresa el marcador de superficie celular CD8 y que es capaz de atacar selectivamente una célula diana que tiene en su superficie celular un complejo de histocompatibilidad de clase I y que está infectada por un patógeno intracelular. Se entiende que el término "respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos" se refiere a cualquier actividad citotóxica que está mediada por linfocitos T citotóxicos.

Se entiende que el término "patógeno intracelular", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier organismo viable, que incluye, aunque no se limita a ellos, virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos intracelulares, capaz de estar en el interior de una célula de un mamífero y de producir una enfermedad en el mamífero.

En un aspecto preferido de la invención, las vacunas proteína de estrés-péptido tienen una utilidad particular en el tratamiento de enfermedades humanas producidas por patógenos intracelulares. Se contempla que las vacunas que se desarrollen usando los principios que se describen en esta solicitud serán útiles para tratar enfermedades de otros animales, por ejemplo, de animales de granja que incluyen ganado vacuno, caballos, cabras, ovejas y cerdos, y de animales de compañía, que incluyen gatos y perros.

Se pueden preparar vacunas que estimulan las respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente a células infectadas por virus que incluyen, aunque no se limitan a ellos, hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, virus gripal, varicela, adenovirus, virus herpes simple de tipo I (VHS-I), virus herpes simple de tipo II (VHS-II), peste bovina (rinderpest), rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, papilomavirus, papovavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxackie, parotiditis, sarampión, rubéola, poliomielitis, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) y virus de inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2). También se pueden preparar vacunas que estimulen las respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente a células infectadas por bacterias intracelulares que incluyen, aunque no se limitan a ellas, Mycobacteria, Rickettsia, Mycoplasma, Neisseria y Legionella. También se pueden preparar vacunas que estimulan respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente a células infectadas por protozoos intracelulares que incluyen, aunque no se limitan a ellos, Leishmania, Coccidioa y Tripanosoma. Se pueden preparar vacunas que estimulan respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente a células infectadas por parásitos intracelulares que incluyen, aunque no se limitan a ellos, Chlamydia y Rickettsia.

En otra forma de realización preferida de la intención, la vacuna proteína de estrés-péptido también puede contener una cantidad terapéuticamente eficaz de una citocina. Como se usa en esta solicitud, el término "citocina" se refiere a cualquier polipéptido secretado que influye sobre la función de otras células que median una respuesta inmunitaria. En la actualidad las citocinas preferidas incluyen interleucina-1\alpha (IL-1\alpha), interleucina-1\beta (IL-\beta), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), interferón \alpha (IFN\alpha), interferón \beta (IFN\beta), interferón \gamma (IFN\gamma), factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), factor de necrosis tumoral \beta (TNF\beta), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento y transformación \beta (TGF-\beta). Se contempla que otras citocinas que todavía no se han descubierto pueden ser eficaces en la invención. Además, se pueden coadministrar antibióticos convencionales con el complejo proteína de estrés-péptido. Sin embargo, la elección de un antibiótico adecuado o de una combinación de los mismos dependerá de la enfermedad en cuestión.

Se ha descubierto que la vacuna estimula la respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos a través de la cascada del complejo principal de histocompatibilidad (CPH) de clase I. Así, se contempla que se puede potenciar más la respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos mediante la coadministración de la vacuna con una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más citocinas que potencian o modulan las respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos.

En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un procedimiento para estimular en un mamífero una respuesta inmunitaria celular, específicamente una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos, frente a células infectadas por un patógeno intracelular preseleccionado. El procedimiento incluye la administración al mamífero de una vacuna hecha según los principios que se describen en esta solicitud en una cantidad suficiente como para desencadenar en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente al patógeno intracelular preseleccionado.

Se puede administrar la vacuna profilácticamente a un mamífero para estimular en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos que previene la posterior infección del mamífero por el patógeno intracelular. De manera alternativa, la vacuna se puede administrar terapéuticamente a un mamífero que tiene una enfermedad producida por un patógeno intracelular. Se contempla que la vacuna puede estimular una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente a células que ya están infectadas por el patógeno intracelular.

La dosis y los medios de administración de la familia de vacunas proteína de estrés-péptido dependerán necesariamente de la naturaleza del complejo, del patógeno intracelular y de la naturaleza de la enfermedad en cuestión. El complejo se debe administrar en una cantidad suficiente como para iniciar una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente al patógeno intracelular. En general, la cantidad de complejo proteína de estrés-péptido que se administra puede variar desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 \mug de complejo/kg de peso corporal del mamífero/inmunización, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 100 \mug de complejo/kg de peso corporal del mamífero/inmunización. Preferentemente se debe vacunar al receptor cuatro veces a intervalos semanales. Si es necesario, se pueden reforzar las respuestas en una fecha posterior mediante la administración posterior de la vacuna. Sin embargo, se contempla que la dosis y el régimen de vacunación óptimos se pueden determinar empíricamente para cada vacuna proteína de estrés-péptido por un técnico que usa procedimientos convencionales bien conocidos en la materia.

En otro aspecto, la invención proporciona diversas metodologías para preparar cantidades disponibles comercialmente de vacunas proteína de estrés-péptido que, cuando se administran a un mamífero, inducen en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente a células infectadas por el antígeno preseleccionado. En un enfoque, el complejo proteína de estrés-péptido se puede recoger usando metodologías convencionales de purificación de proteínas a partir de una muestra de tejido, de una célula aislada o de una línea celular inmortalizada infectada con el patógeno intracelular seleccionado, una célula aislada o una línea celular inmortalizada transfectada con un gen que codifica un determinante antigénico preseleccionado y que lo expresa. Posteriormente el complejo purificado se puede almacenar o se puede combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para su administración como vacuna.

De manera alternativa, el complejo proteína de estrés-péptido se puede preparar reconstituyendo un péptido potencialmente antigénico y una proteína de estrés in vitro. Por ejemplo, se puede eluir el péptido antigénico a partir de un complejo purificado proteína de estrés-péptido o de un complejo CPH-péptido usando metodologías bien conocidas en la materia. Específicamente, los péptidos se pueden eluir a partir del complejo proteína de estrés-péptido incubando el complejo en presencia de ATP o de un pH bajo. De manera alternativa, se pueden eluir los péptidos a partir del complejo CPH-péptido incubando el complejo en presencia de ácido trifluoroacético (TFA). Los péptidos resultantes se pueden purificar mediante HPLC de fase inversa y se puede determinar su secuencia de aminoácidos mediante metodologías estándar de secuenciado de proteínas. Posteriormente se pueden sintetizar péptidos de la secuencia definida usando metodologías convencionales de síntesis peptídica. Las proteínas de estrés se pueden purificar directamente a partir de las células que expresan de manera natural las proteínas de estrés. De manera alternativa, se pueden expresar proteínas de estrés recombinantes, que incluyen formas no naturales, análogos truncados, luteínas y proteínas de fusión, así como otros constructos capaces de simular la unión a péptidos y las propiedades inmunógenas de las proteínas de estrés, usando metodologías convencionales de ADN recombinante. Por ejemplo, se puede expresar una proteína de estrés recombinante a partir de ADN recombinante en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos, y se puede purificar a partir del sistema de expresión. Después se pueden combinar in vitro los dos componentes purificados para generar un complejo proteína de estrés-péptido sintético y completamente definido. Posteriormente se puede ensayar in vitro e in vivo la inmunogenia y la especificidad de los complejos recombinantes para identificar complejos candidatos útiles que estimulan respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente a un patógeno intracelular preseleccionado. Una vez que se han identificado, los complejos sintéticos se pueden preparar a cualquier escala, se pueden almacenar sin modificaciones o se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables para su administración a mamíferos.

Éstos y otros objetos y características de la invención, así como la propia invención, se comprenden de manera más completa a partir de la siguiente descripción, junto a los dibujos acompañantes, en los que:

La Figura 1 muestra la actividad específica de antígeno de linfocitos T citotóxicos de los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con un complejo gp96-péptido recogido de fibroblastos BALB/c transfectados con el gen de la nucleoproteína (NP) del virus gripal PR8. La actividad citotóxica se estudió midiendo la liberación de ^{51}Cr por los fibroblastos BALB/c que expresaban el gen NP (círculos sólidos), los fibroblastos BALB/c que expresaban el gen NP pero que habían sido tratados con antisuero K44 frente al CPH de tipo I (círculos vacíos) y de la línea celular 5117 singénica no transfectada con NP (asteriscos).

La Figura 2 muestra la actividad específica de antígeno de linfocitos T citotóxicos de los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con un complejo gp96-péptido recogido de células SVB6 transformadas con SV40. La actividad citotóxica se estudió midiendo la liberación de ^{51}Cr por las células SVB6 (círculos sólidos) y por una la línea celular singénica no transfectada con SV40, MCA (círculos vacíos).

La Figura 3A-3D muestra la actividad de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno de los esplenocitos procedentes de dos ratones inmunizados con un complejo PCT70-péptido reconstituido en el que el péptido tiene la secuencia SLSDLRGYVYQGL (ID. SEC. Nº 1). Antes de la de realizar el ensayo los esplenocitos procedentes de cada uno de los ratones se estimularon una vez (3A y 3C) o dos veces (3B y 3D) in vitro con células irradiadas letalmente y transfectadas con el péptido SLSDLRGYVYQGL (ID. SEC. Nº 1) y que lo expresaban. Se estudió la actividad citotóxica midiendo la liberación de ^{51}Cr por las células EL4 que expresaban el péptido (triángulos sólidos) y por las células EL4 que no expresaban el péptido (triángulos vacíos).

La invención se basa en el descubrimiento de que cuando se aísla un complejo proteína de estrés-péptido de una célula eucariótica infectada con un patógeno intracelular preseleccionado y después se administra a un mamífero, puede estimular una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos dirigida frente a células infectadas por el mismo patógeno. Este descubrimiento supone un avance significativo en el campo del desarrollo de vacunas.

Según la invención, se aprovecha el descubrimiento arriba mencionado para conseguir una familia de vacunas que se puede usar para inmunizar a mamíferos frente a enfermedades producidas por patógenos intracelulares. En principio, se pueden preparar vacunas frente a cualquier patógeno intracelular de interés, por ejemplo virus, bacterias, protozoos, hongos y parásitos intracelulares. Las metodologías genéticas útiles para preparar vacunas frente a todas estas clases de patógenos se analizan en detalle a continuación.

Como apreciará un experto en la materia, las vacunas proteína de estrés-péptido que se describen en esta solicitud tienen varias ventajas sobre las vacunas de que se dispone en la actualidad. Primero, las vacunas formadas por proteína de estrés-péptido proporcionan un enfoque alternativo para estimular la inmunidad celular y evitar el uso de patógenos intracelulares intactos (atenuados o de otra manera). Segundo, como las vacunas no contienen organismos intactos, se reduce el riesgo de producir la enfermedad frente a la que se pretende que la vacuna induzca inmunidad. Tercero, las vacunas que se describen en esta solicitud son ideales para inducir respuestas inmunitarias frente a determinantes antigénicos definidos aislados de un patógeno intracelular o determinantes antigénicos aún no definidos. Además, se pueden preparar vacunas que son eficaces frente a patógenos que normalmente escapan al sistema inmunitario presentando nuevas proteínas antigénicas de la cubierta, por ejemplo, el virus gripal. Cuarto, en principio se pueden preparar vacunas de este tipo frente a cualquier patógeno intracelular de interés. Quinto, las vacunas se pueden preparar sintéticamente usando las metodologías que se describen en esta solicitud, lo que proporciona vacunas completamente definidas que son adecuadas para su administración a seres humanos.

Se contempla que las vacunas se pueden administra profiláctica o terapéuticamente. Cuando se administra profilácticamente, la vacuna puede estimular en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos que permite que el individuo vacunado resista a la posterior infección por el patógeno intracelular. De manera alternativa, cuando se administra terapéuticamente, la vacuna puede estimular en el mamífero una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente a un patógeno que está infectando actualmente al mamífero y le está produciendo una
enfermedad.

El componente específico de la vacuna que induce en el receptor una respuesta específica mediada por linfocitos T citotóxicos frente al patógeno es un complejo proteína de estrés-péptido. El péptido puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que está presente en una célula eucariótica infectada por un patógeno intracelular pero que no está presente cuando esa célula no está infectada por el mismo patógeno. Esto incluye péptidos que se originan a partir del patógeno intracelular.

Los complejos inmunógenos se pueden purificar a partir de cualquier célula eucariótica, incluyendo tejidos enteros, células aisladas y líneas celulares eucarióticas inmortalizadas infectadas por el patógeno intracelular. Los complejos se pueden purificar usando técnicas convencionales de purificación de proteínas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, se contempla que se pueda recoger un complejo inmunógeno capaz de estimular una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente al virus gripal a partir de una línea celular eucariótica que está infectada por el virus gripal.

Además, se ha encontrado que se puede eluir el péptido del complejo proteína de estrés-péptido en presencia de ATP o de un pH bajo. Ni el péptido ni la proteína de estrés inducen por sí solos de manera eficaz una respuesta citotóxica mediada por linfocitos T. Sin embargo, se pueden aprovechar esas condiciones experimentales para aislar péptidos a partir de células infectadas que pueden contener determinantes antigénicos potencialmente útiles. Una vez que se ha aislado, se puede determinar la secuencia de aminoácidos de cada péptido antigénico usando metodologías convencionales de secuenciado de aminoácidos. En consecuencia, se pueden identificar fácilmente los determinantes antigénicos de potencialmente cualquier patógeno intracelular usando las metodologías que se describen en esta solicitud. Como se analiza en detalle más adelante, se puede aprovechar esta propiedad en la preparación de vacunas completamente sintéticas.

De manera similar, se ha encontrado que se pueden eluir péptidos potencialmente inmunógenos a partir de complejos CPH-péptido usando procedimientos bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Falk y col. (1990) Nature 348:248-251; Rotzsche y col. (1990) Nature 348:252-254; Elliott y col. (1990) Nature 348:195-197; Falk y col. (1991) Nature 351:290-296; Demotz y col. (1989) Nature 334:682-684; Rotzsche y col (1990) Science 249:283-287. Aunque los péptidos eluidos a partir de los complejos de CPH pueden definir un determinante antigénico potencialmente protector, se aprecia que la administración del péptido aislado en una vacuna convencional de subunidades puede no estimular de manera eficaz una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos en el receptor. En consecuencia, se contempla que los péptidos eluidos a partir de los complejos CPH-péptido se puedan reconstituir con una proteína de estrés, usando las metodologías que se describen en esta solicitud, para generar de esta manera un complejo proteína de estrés-péptido que es eficaz en la estimulación de una respuesta citotóxica mediada por linfocitos T capaz de atacar selectivamente y lisar células que expresan en péptido antigénico.

Se pueden definir las proteínas de estrés útiles en la práctica de la presente invención, como cualquier proteína intracelular que satisface los siguientes criterios. Es una proteína cuya concentración intracelular aumenta cuando una célula está expuesta a un estímulo estresante, se puede unir a otras proteínas o péptidos, y es capaz de liberar las proteínas o los péptidos unidos en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) o de un pH bajo.

Las primeras proteínas de estrés que se identificaron fueron las proteínas del choque térmico (PCT). Como indica su nombre, las PCT se sintetizan en una célula como respuesta a un choque térmico. Hasta la fecha se han identificado tres familias principales de PCT según su peso molecular. Las familias se han denominado PCT60, PCT70 y PCT90, donde los números indican el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en kDa. Posteriormente se encontró que muchos miembros de estas familias se inducían en respuesta a otros estímulos estresantes que incluyen, aunque no se limitan a ellos, privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno e infección por patógenos intracelulares. Véase, por ejemplo, Welch (mayo de 1993) Scientific American 56-64; Young (1990) Annu Rev Immunol 8:401-420; Craig (1993) Science 260:1902-1903; Gething y col. (1993) Nature 355:33-45; y Lindquist y col. (1988) Annu Rev Genetics 22:631-677. Según esto, se contempla que las proteínas de estrés que pertenecen a cualquiera de las tres familias pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.

Las principales proteínas de estrés se pueden acumular hasta alcanzar concentraciones muy elevadas en las células expresadas, aunque pueden aparecer a concentraciones bajas a moderadas en células que no han sido sometidas a estrés. Por ejemplo, la proteína PCT70 altamente inducible de mamíferos es apenas detectable a temperatura normal, aunque se convierte en una de las proteínas que se sintetizan de manera más activa en la célula después del choque térmico (Welch y col. (1985) J Cell Biol 101:198-211). Por el contrario, las proteínas PCT90 y PCT60 son abundantes a temperaturas normales en la mayor parte de las células de mamíferos, aunque no en todas, y son inducidas de manera adicional por el calor (Lai y col. (1984), Mol Cell Biol 4:2802-2810; van Bergen en Henegouwen y col. (1987), Genes Dev 1:523-531).

Las proteínas de estrés se encuentran entre las proteínas más conservadas que existen. Por ejemplo, la secuencia de DnaK, la proteína PCT90 de E. coli, tiene una identidad de aminoácidos de aproximadamente 50% con las proteínas PCT90 de eucariotas (Bardwell y col. (1984) Proc Natl Acad Sci 81:842-852). De manera similar, las familias PCT60 y PCT90 también muestran elevados niveles de conservación intrafamiliar (Hickey y col. (1989) Mol Cell Biol 9:2615-2626); Jindal (1989) Mol Cell Biol 9:2279-2283). Además, se ha descubierto que las familias PCT60, PCT70 y PCT90 están formadas por proteínas cuya secuencia se relaciona con la de las proteínas de estrés, de modo que, por ejemplo, su secuencia de aminoácidos tiene una identidad mayor del 35%, pero cuyos niveles de expresión típicamente no se alteran en condiciones estresantes para la célula huésped. Un ejemplo de una proteína de este tipo incluye la proteína citosólica que se expresa de manera consecutiva constitutiva CCT70, cuya secuencia de aminoácidos se relaciona con la de la proteína PCT70 inducida por el estrés. Por lo tanto, se contempla que la definición de proteína de estrés, como se usa en esta solicitud, incluye otras proteínas, muteínas, análogos y variantes de los mismos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 35% a 55%, preferentemente de 55% a 75%, y más preferentemente de 75% a 95%, con miembros de las tres familias cuyos niveles de expresión en una célula aumentan en respuesta a un estímulo estresante. A continuación se describe la purificación de las proteínas de estrés que pertenecen a estas tres familias.

Los complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido de la invención pueden incluir cualquier complejo que contiene una proteína de estrés y un péptido que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, de modo que en este complejo el péptido no está asociado de manera covalente a la proteína de estrés. Los ejemplos preferidos pueden incluir, aunque no se limitan a ellos, los complejos PCT60-péptido, PCT70-péptido y PCT90-péptido. Por ejemplo, una proteína de estrés denominada gp96 que está presente en el retículo endoplásmico de células eucarióticas y que se relaciona con la PCT90 citoplásmica, se puede usar para generar una vacuna eficaz que contiene un complejo gp96-péptido.

Ahora se ha identificado otra familia de proteínas del choque térmico de bajo peso molecular, que se denomina PCT25/PCT27. A continuación se analiza la purificación de estas proteínas. Se contempla que estas proteínas de bajo peso molecular también puedan ser útiles en la presente invención.

También se ha descubierto que los complejos proteína de estrés-péptido de la invención se pueden preparar a partir de células infectadas con un patógeno intracelular, así como a partir de células que han sido transformadas por un patógeno intracelular. Por ejemplo, se pueden aislar complejos inmunógenos de proteína de estrés-péptido a partir de células eucarióticas transformadas con un virus transformante como SV40, véase más abajo.

En un aspecto preferido de la invención, las vacunas purificadas proteína de estrés-péptido pueden tener una utilidad particular en el tratamiento de enfermedades humanas producidas por patógenos intracelulares. Sin embargo, se aprecia que las vacunas que se desarrollan usando los principios que se describen en esta solicitud serán útiles en el tratamiento de enfermedades de otros mamíferos, por ejemplo, animales de granja, incluyendo ganado vacuno, caballos, ovejas, cabras y cerdos, y animales de compañía, incluyendo gatos y perros, que de manera similar están producidas por patógenos intracelulares.

Según los procedimientos que se describen en esta solicitud, se pueden preparar vacunas que estimulan las respuestas citotóxicas mediadas por linfocitos T frente a células infectadas por virus que incluyen, aunque no se limitan a ellos, virus de la hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, gripe, varicela, adenovirus, VHS-I, VHS-II, peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, papilomavirus, papovavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxackie, parotiditis, sarampión, rubéola, poliomielitis, VIH-1 y VIH-2. De manera similar, también se pueden preparar vacunas que estimulan las respuestas citotóxicas mediadas por linfocitos T frente a las células infectadas por bacterias intracelulares, que incluyen, aunque no se limitan a ellas, Mycobacteria, Rickettsia, Mycoplasma, Neisseria y Legionella. Además, también se pueden preparar vacunas que estimulan las respuestas citotóxicas mediadas por linfocitos T frente a células infectadas por protozoos intracelulares que incluyen, aunque no se limitan a ellos, Leishmania, Coccidioa y Trypanosoma. Además, se pueden preparar vacunas que estimulan las respuestas citotóxicas mediadas por linfocitos T frente a células infectadas por parásitos intracelulares que incluyen, aunque no se limitan a ellos, Chlamydia y Rickettsia.

I. Propagación de células eucarióticas infectadas

Como apreciarán los expertos en la materia, los protocolos que se describen en esta solicitud se pueden usar para aislar complejos proteína de estrés-péptido a partir de cualquier célula eucariótica, por ejemplo, tejidos, células aisladas o líneas celulares eucarióticas inmortalizadas infectadas por un patógeno intracelular preseleccionado.

Cuando se usan líneas celulares animales inmortalizadas como fuente del complejo proteína de estrés-péptido, por supuesto es importante usar líneas celulares que se pueden infectar con el patógeno de interés. Además, es preferible usar células que proceden de la misma especie que el posible receptor de la vacuna.

Por ejemplo, a fin de preparar un complejo proteína de estrés-péptido para su administración a seres humanos que pueda ser eficaz frente al VIH-1, se puede propagar el virus en células humanas que incluyen, aunque no se limitan a ellas, linfocitos T CD4+, células HepG2 y células promonocíticas U937 humanas. A fin de preparar un complejo proteína de estrés-péptido para su administración a seres humanos que pueda ser eficaz frente al VIH-2, el virus se puede propagar en, por ejemplo, linfocitos T CD4+ humanos. De manera similar, los virus gripales se pueden propagar en, por ejemplo, líneas celulares de fibroblastos y células MDCK humanas, y las micobacterias se pueden cultivar en, por ejemplo, células de Schwann humanas.

Si los patógenos intracelulares no lisan las células infectadas, entonces las células infectadas se cultivan en las mismas condiciones que las células normales no infectadas. Por ejemplo, las micobacterias se pueden propagar en cultivos nerviosos de los ganglios sensitivos de ratones blancos suizos recién nacidos. Después se cultivan las células nerviosas en un medio de cultivo que contiene medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glucosa al 0,006%, suero bovino fetal al 20%, extracto de embrión de pollo al 10% y arabinósido de citosina. Después de 8 a 10 días se inoculan los cultivos con 5-8 x 10^{6} micobacterias aisladas a partir de nódulos recién extraídos de pacientes no tratados que tienen lepra lepromatosa. Las células infectadas se pueden cultivar a 37ºC durante hasta 6 semanas, y después se recogen las células infectadas y se aíslan los complejos proteína de estrés-péptido. Véase, por ejemplo, Mukherjee y col. (1985) J Clin Microbiol 21:808-814.

Por otro lado, si las células huésped son lisadas por el patógeno de interés (como en el caso del virus gripal), aún se sigue pudiendo cultivar las células en condiciones estándar excepto que las células se lavan y se recogen inmediatamente antes de la lisis de la célula huésped. Por ejemplo, durante la purificación de los complejos proteína de estrés-péptido procedentes de células infectadas por el virus gripal, los fibroblastos (u otros tipos celulares) se infectan durante una hora a 37ºC con 5-10 unidades formadoras de placa (UFP) de virus por célula. Las células infectadas se pueden cultivar en medio DMEM simple durante 24 horas a 37ºC. Después de 24 horas las células se lavan y se recogen antes de la lisis. Se pueden aislar los complejos proteína de estrés-péptido usando los procedimientos que se establecen más adelante.

Además, cuando se ha identificado el gen que codifica un determinante antigénico particular, el gen de interés se puede transfectar y expresar en una línea celular inmortalizada humana o de otro mamífero usando técnicas bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" (1989), eds. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA y Struhl K, Wiley Interscience. Las células transfectadas se pueden cultivar en condiciones estándar y después se pueden aislar los complejos.

II. Preparación de las proteínas de estrés y de los complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido

A continuación se presentan procedimientos para preparar complejos PCT70-péptido, complejos PCT90-péptido, complejos gp96-péptido, PCT70, PCT25/PCT27 y PCT60.

(a) Purificación de los complejos PCT70-péptido

Se vuelve a suspender un gránulo de células infectadas en tres volúmenes de tampón del lisis 1X formado por tampón de fosfato sódico 5 mM (pH 7), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Se sonica el gránulo sobre hielo hasta que se ha lisado >99% de las células, según se evalúa mediante examen microscópico. De manera alternativa, las células se pueden lisar mediante cizallamiento mecánico. En este procedimiento las células se vuelven a suspender en bicarbonato sódico 30 mM a pH 7,5 y PMSF 1 mM, se incuban sobre hielo durante 20 min y después se homogenizan en un homogenizador de tipo Dounce hasta que se lisa >95% de las células.

El lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 min para eliminar las células no lisadas, los núcleos y otros detritus. Después se vuelve a centrifugar el sobrenadante de esta etapa de centrifugación a 100.000 g durante 90 min.

El sobrenadante se mezcla durante 2-3 horas a 4ºC con Con A Sepharose equilibrada con STF que contiene Ca2^{+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Cuando se lisan las células mediante cizallamiento mecánico, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de continuar el procedimiento. Después se introduce la suspensión acuosa en una columna y se lava con tampón de lisis 1X. El material que no se une se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) frente a Tris-Acetato 10 mM a pH 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCl 10 mM y PMSF 1 mM. El dializado se centrifuga durante 20 min a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) y el sobrenadante resultante se aplica a una columna Mono Q FPLC (Pharmacia) equilibrada con Tris-Acetato 20 mM a pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 0,1 mM y 2-mercaptoetanol 15 mM. Después se eluyen las proteínas con un gradiente de NaCl de 20 mM a 500 mM. Las fracciones se caracterizan mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se realiza la inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-PCT70 adecuado (como el clon N27F3-4 de StressGen).

Se mezclan Las fracciones que tienen una inmunorreactividad intensa con el anticuerpo y se precipitan los complejos PCT70-péptido con sulfato amónico. El complejo se precipita en el intervalo de sulfato amónico de 50%-70%. Se recoge el gránulo de proteínas mediante centrifugación a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) y se lava con sulfato amónico al 70%. Después se solubiliza el gránulo y se elimina el sulfato amónico residual mediante filtración en gel en una columna Sephadex® G25 (Pharmacia).

El complejo PCT70-péptido se puede purificar hasta conseguir la homogeneidad aparente usando este procedimiento. Se puede purificar hasta 1 mg de complejo PCT70-péptido a partir de 1 g de células/tejido.

(b) Purificación de PCT70

El polipéptido PCT70 se puede purificar a partir del complejo PCT70-péptido mediante cromatografía en agarosa con ATP. Véase, por ejemplo, Welch y col. (1985) Mol Cell Biol 5:1229. Brevemente, se añade MgCl_{2} al complejo que se ha aislado previamente hasta una concentración final de 3 mM. Después se aplica el complejo a una columna de agarosa ATP (Sigma Chemical Co.) equilibrada con Tris-Acetato 20 mM a pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 0,1 mM, 2-mercaptoetanol 15 mM y MgCl_{2} 3 mM. La columna se lava de manera extensa con el tampón de equilibrio que contiene NaCl 0,5 mM, y después se lava con tampón sin NaCl. Después se eluye la proteína PCT70 a partir de la columna con tampón de equilibrio que contiene ATP 3 mM (Sigma Chemical Co.).

(c) Purificación de los complejos PCT90-péptido

Se vuelve a suspender un gránulo de células infectadas en tres volúmenes de tampón de lisis 1X formado por tampón de fosfato sódico 5 mM (pH 7), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 2 mM y PMSF 1 mM. Se somete el gránulo de células a sonicación sobre hielo, hasta que se ha lisado >95% de las células, según se evalúa mediante examen microscópico. De manera alternativa, las células se pueden lisar mediante cizallamiento mecánico, como antes.

El lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 min para retirar las células no lisadas, los núcleos y otros detritus. El sobrenadante de esta etapa de centrifugación se vuelve centrifuga posteriormente a 100.000 g durante 90 min.

Después se mezcla el sobrenadante durante 2-3 horas a 4ºC con Con A Sepharose® equilibrada con STF que contiene Ca2^{+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Cuando se lisan las células mediante cizallamiento mecánico, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de continuar el procedimiento. Después se introduce la suspensión acuosa en una columna y se lava con tampón del lisis 1X. El material que no se une se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) frente a fosfato sódico 20 mM a pH 7,4, EDTA 0,1 mM, NaCl 250 mM y PMSF 1 mM. El dializado se centrifuga a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 20 min. El sobrenadante resultante se aplica a una columna Mono Q FPLC (Pharmacia) equilibrada con tampón de lisis y las proteínas unidas se eluyen con un gradiente de sal de 200 mM a 600 mM.

Las fracciones eluidas se caracterizan mediante SDS-PAGE y los complejos PCT90 se identifican mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-PCT90 (por ejemplo, 3G3 de Affinity Bioreagents). Se puede purificar PCT90 hasta conseguir la homogeneidad aparente usando este procedimiento. Se pueden purificar sistemáticamente aproximadamente 150-200 \mug de PCT90 a partir de 1 g de células/tejido.

(d) Purificación de los complejos gp96-péptido

Se vuelve a suspender un gránulo de células infectadas en 4 volúmenes de tampón formado por tampón de bicarbonato sódico 30 mM (pH 7,5) y PMSF 1 mM, y se permite que las células se hagan tumefactas sobre hielo durante 20 min. Después se homogeniza el gránulo de células en un homogenizador de tipo Dounce (el aclaramiento adecuado del homogenizador varía según el tipo celular) sobre hielo hasta que se lisa >95% de las células.

El lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 min para eliminar las células no lisadas, los núcleos y otros detritus. Después se vuelve a centrifugar el sobrenadante de esta etapa de centrifugación a 100.000 g durante 90 min. El complejo gp96-péptido se puede purificar a partir del gránulo de 100.000 g o del sobrenadante.

Cuando se purifica a partir del sobrenadante, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X y el sobrenadante se mezcla durante 2-3 horas a 4ºC con Con A Sepharose equilibrada con STF que contiene Ca2^{+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Después se introduce la suspensión acuosa en una columna y se lava con tampón del lisis 1X hasta que la DO_{280} disminuye al nivel basal. Después se lava la columna con ½ del volumen del lecho de la columna de \alpha-metilmanósido (\alpha-MM) al 10% disuelto en STF que contiene Ca2^{+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM, la columna se sella con un trozo de papel de parafina y se incuba a 37º durante 15 min. Después se enfría a temperatura ambiente y se retira el papel de parafina de la parte inferior de la columna. Se aplican cinco volúmenes de columna del tampón \alpha-MM y el eluato se analiza mediante SDS-PAGE. Típicamente el material resultante tiene una pureza de aproximadamente 60%-95%; sin embargo, esto depende del tipo celular y del cociente tejido:tampón de lisis usado. Después se aplica la muestra a una columna Mono Q FPLC (Pharmacia) equilibrada con tampón que contiene fosfato sódico 5 mM a pH 7. Después se eluyen las proteínas desde la columna con un gradiente de NaCl de 0-1 M y la fracción gp96 se eluye entre 400 mM y 550 mM de NaCl.

Sin embargo, este procedimiento se puede modificar con dos etapas adicionales, que se usan solas o en combinación, para producir de manera constante complejos gp96-péptido aparentemente homogéneos. Una etapa opcional supone una precipitación con sulfato amónico antes de la etapa de purificación con Con A, y la otra etapa opcional incluye purificación con DEAE-Sepharose después de la etapa de purificación con Con A pero antes de la etapa de Mono Q FPLC.

En la primera etapa opcional, el sobrenadante que se obtiene con la etapa de centrifugación 10.000 g se lleva a una concentración final de sulfato amónico de 50% mediante la adición de sulfato amónico. El sulfato amónico se añade lentamente a la vez que se agita suavemente la solución en un vaso de precipitación colocado en una bandeja de agua helada. La solución se agita durante aproximadamente 2 a 12 horas a 4ºC y la solución resultante se centrifuga a 6000 rpm (rotor Sorvall SS34). Se elimina el sobrenadante que se produce en esta etapa, se lleva a una saturación de sulfato amónico de 70% mediante la adición de una solución de sulfato amónico, y se centrifuga a 6000 rpm (rotor Sorvall SS34). Se recoge el gránulo resultante de esta etapa y se suspende en STF que contiene sulfato amónico al 70% a fin de lavar el gránulo. La mezcla se centrifuga a 6000 rpm (rotor Sorvall SS34) y el gránulo se disuelve en STF que contiene Ca2^{+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Se elimina el material no disuelto mediante una breve centrifugación a 15.000 rpm (rotor Sorvall SS34). Después se mezcla la solución con Con A Sepharose® y el procedimiento continúa como antes.

En la segunda etapa opcional, las fracciones que contienen gp96 y que se han eluido de la columna de Con A se mezclan y el tampón se intercambia por tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 y NaCl 300 mM mediante diálisis, o preferentemente mediante intercambio de tampones en una columna Sephadex® G25. Después del intercambio de los tampones la solución se mezcla con DEAE-Sepharose® equilibrada previamente con tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 y NaCl 300 mM. La solución de proteínas y las cuentas se mezclan suavemente durante una hora y se vierten en una columna. Después se lava la columna con tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 y NaCl 300 mM hasta que la absorbancia a 280 nm disminuye hasta el nivel basal. Después se eluye la proteína unida a la columna con cinco volúmenes de tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 y NaCl 700 mM. Las fracciones que contienen proteínas se mezclan y se diluyen con un tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 a fin de reducir la concentración de sal a 175 mM. Después se aplica el material resultante a una columna Mono Q FPLC (Pharmacia) equilibrada con tampón de fosfato sódico 5 mM a pH 7 y se eluye la proteína que se une a la columna Mono Q FPLC (Pharmacia), como se ha descrito antes.

Sin embargo, se aprecia que un experto en la materia puede evaluar, mediante experimentación sistemática, el beneficio de incorporar las etapas opcionales al protocolo de purificación. Además, también se aprecia que el beneficio de añadir cada una de las etapas opcionales dependerá de la fuente del material de partida.

Cuando la fracción gp96 se aísla a partir del gránulo 100.000 g, el granulo se suspende en cinco volúmenes de STF que contiene desoxicolato sódico al 1% y glucopiranósido de octilo al 1% (pero sin Ca2^{+} ni Mg^{2+}) y se incuba sobre hielo durante una hora. La suspensión se centrifuga a 20.000 g durante 30 min y el sobrenadante resultante se dializa frente a varios cambios de STF (también sin Mg^{2+} ni Ca^{2+}) para eliminar el detergente. El dializado se centrifuga a 100.000 g durante 9 min, se recoge el sobrenadante y se añade calcio de magnesio al sobrenadante para obtener concentraciones finales de 2 mM, respectivamente. Después se purifica la muestra mediante el procedimiento no modificado o modificado para aislar el complejo gp96-péptido a partir del sobrenadante 100.000 g, véase más arriba.

Los complejos gp96-péptido se pueden purificar hasta conseguir la homogeneidad aparente usando este procedimiento. Se pueden aislar aproximadamente 10-20 \mug de gp96 a partir de 1 g de células/tejido.

(e) Purificación de PCT25 y de PCT27

La purificación de los polipéptidos PCT25 y PCT27 se ha descrito previamente y, por lo tanto, no se analiza en detalle en esta solicitud. Véase, por ejemplo, Jakob y col. (1993) J Biol Chem 268:1517-1520, cuya descripción se incorpora a esta solicitud como referencia.

Brevemente, los lisados celulares se precipitan con sulfato amónico al 35%. El gránulo se recoge mediante centrifugación, se solubiliza en un tampón y se fracciona mediante cromatografía de intercambio iónico usando una columna DEAE-Sepharose® CL-6B (Pharmacia Biotechnology Inc.). Las proteínas se eluyen con un gradiente de NaCl de 50-200 mM. Las fracciones se combinan y se fraccionan mediante cromatografía de exclusión de tamaño en una columna de filtración de gel de Superose 6 (Pharmacia).

(f) Purificación de PCT60

La purificación de PCT60 se ha analizado en detalle previamente y, por lo tanto, no se analiza en detalle en esta solicitud. Véase, por ejemplo, Vitanen y col. (1992) J Biol Chem 267:695-698, cuya descripción se incorpora a esta solicitud como referencia.

Brevemente, se aplica un lisado de matriz mitocondrial a una columna Mono Q FPLC equilibrada con fosfato sódico 50 mM, MgCl_{2} 1 mM y EGTA 1 mM a pH 6,9. Las proteínas se eluyen con un gradiente de NaCl de 0-1 M. Las fracciones que contienen PCT65 se mezclan y se fraccionan mediante cromatografía en agarosa ATP, como se analiza más arriba.

III. Preparación de proteínas de estrés recombinantes

Se contempla que se pueden preparar proteínas de estrés recombinantes y variantes de secuencias de aminoácidos de las mismas usando metodologías convencionales de ADN recombinante. Por ejemplo, se pueden insertar ADN recombinantes que codifican una proteína de estrés conocida o un homólogo en una célula huésped adecuada, se puede expresar la proteína, se recoge, se renaturaliza si es necesario y se purifica. Las proteínas de estrés que se conocen en la actualidad en la materia se resumen en la Tabla 1, a continuación.

TABLA 1

1

Los procedimientos para manipular, amplificar y recombinar el ADN que codifica secuencias de aminoácidos de interés son generalmente bien conocidos en la materia, y por lo tanto no se describen en detalle en esta solicitud. También se conocen bien procedimientos para identificar y aislar genes que codifican miembros de las familias de las proteínas de estrés, y se describen en la patente y en otra bibliografía.

Según esto, la construcción de ADN que codifican constructos biosintéticos como se describe en esta solicitud se puede realizar usando técnicas conocidas que suponen el uso de varios enzimas de restricción que hacen cortes específicos en la secuencia del ADN para producir extremos romos o extremos adhesivos, ADN ligasas, técnicas que permiten la adición enzimática de extremos adhesivos al ADN de extremo romo, construcción de ADN sintéticos mediante el ensamblado de oligonucleótidos de longitud corta o media, técnicas de síntesis de ADNc, y sondas sintéticas para aislar genes de miembros de las familias de las proteínas de estrés. También se conocen, y se dispone de ellas, diversas secuencias de promotores y otras secuencias de ADN reguladoras que se usan para conseguir la expresión, y varios tipos de células huésped. Las técnicas convencionales de transfección, y las técnicas igualmente convencionales de clonado y de posterior subclonado del ADN, son útiles en la práctica de esta invención y son conocidas para los expertos en la materia. Se pueden usar varios tipos de vectores, como plásmidos y virus, incluyendo virus animales y bacteriófagos. Los vectores pueden aprovechar diversos genes marcadores que imparten a una célula transfectada con éxito una propiedad fenotípica detectable que se puede usar para identificar cuál de una familia de clones se ha incorporado con éxito al ADN recombinante del vector.

Las moléculas de ADN que codifican proteínas de estrés potencialmente útiles se pueden obtener mediante diversos procedimientos. Los genes de interés se pueden purificar a partir de bibliotecas estándar de ADNc usando tecnologías de creación de colonias o de placas o usando metodologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), todas las cuales son bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Sambrook y col. (1989), Cold Spring Harbor Press, cuya descripción se incorpora a esta solicitud como referencia. De manera alternativa, los genes preferidos se pueden generar mediante el ensamblado de oligonucleótidos sintéticos que se producen en un sintetizador automatizado convencional de polinucleótidos, seguido de ligadura con ligasas adecuadas. Por ejemplo, se pueden sintetizar de manera semimanual fragmentos complementarios y solapados de ADN que comprenden 15 bases, usando química de fosforoamidita, de modo que se dejan sin fosforilar los segmentos terminales para impedir la polimerización durante la ligadura. Se deja que un extremo del ADN sintético tenga un "extremo adhesivo" correspondiente al punto de acción de una endonucleasa de restricción particular, y el otro extremo se deja con un extremo que corresponde al punto de acción de otra endonucleasa de restricción. De manera alternativa, este enfoque puede estar totalmente automatizado. El ADN que codifica los constructos biosintéticos se puede crear sintetizando fragmentos monocatenarios más largos (por ejemplo, de 50-100 nucleótidos de longitud) en, por ejemplo, un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Biosystems, y posteriormente ligando los fragmentos.

Posteriormente se pueden integrar los constructos de ADN recombinante en un vector de expresión y se pueden transfectar en una célula huésped adecuada para la expresión proteica. Los huéspedes útiles incluyen E. coli, Saccharomyces, el sistema célula de insecto/baculovirus, células de mieloma y otras distintas células de mamíferos. En E. coli y en otros huéspedes microbianos, los genes sintéticos se pueden expresar como proteínas de fusión. La expresión en eucariotas se puede conseguir mediante la transfección de secuencias de ADN que codifican la proteína biosintética de interés en una línea celular de mieloma o de otro tipo.

El vector puede incluir además varias secuencias para promover la expresión correcta de la proteína recombinante, incluyendo secuencias promotoras de la transcripción y secuencias de terminación, secuencias potenciadoras, secuencias de puntos preferidos de unión a ribosomas, secuencias guía preferidas de ARNm, secuencias preferidas de procesado de las proteínas, secuencias preferidas de señales para la secreción de proteínas, y similares. La secuencia de ADN que codifica el gen de interés también se puede manipular para eliminar secuencias potencialmente inhibidoras o para reducir al mínimo la formación no deseada de una estructura secundaria. La proteína recombinante también se puede expresar como una proteína de fusión. Después de su traducción, la proteína se puede purificar a partir las propias células o se puede recuperar a partir del medio de cultivo.

Por ejemplo, si el gen se va a expresar en E. coli, se puede clonar primero en un vector de expresión. Esto se consigue colocando el gen producido mediante ingeniería genética corriente abajo de una secuencia promotora como Trp o Tac, y un gen que codifica un péptido guía como un fragmento B (FB) de una proteína A. Las proteínas de fusión resultantes se acumulan en cuerpos refringentes en el citoplasma de las células, y se pueden recoger después de la rotura de las células mediante prensa de French o sonicación. Los cuerpos refringentes se solubilizan, y las proteínas expresadas se vuelven a plegar y se extienden mediante procedimientos que ya se han establecido para otras muchas proteínas recombinantes.

La expresión de los genes diseñados mediante ingeniería genética en células eucarióticas precisa el establecimiento de células y líneas celulares adecuadas que son fáciles de transfectar, que pueden mantener de manera estable el ADN extraño con una secuencia no reorganizada, y que tienen los componentes celulares necesarios para una transcripción, traducción, modificación postraduccional y secreción de la proteína eficientes. Además, también es necesario un vector adecuado que transporta el gen de interés. El diseño de vectores de ADN para su transfección en células de mamífero debe incluir secuencias adecuadas para promover la expresión del gen de interés como se describe más arriba, incluyendo secuencias adecuadas para el inicio de la transcripción y para su terminación, y secuencias potenciadoras, así como secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción, como la secuencia de consenso Kozak. Los vectores preferidos de ADN también incluyen un gen marcador y medios para amplificar el número de copias del gen de interés. En Genetic Engineering 7:91-127 (1988) se presenta una revisión detallada del estado actual de la producción de proteínas extrañas en células de mamífero, incluyendo células útiles, secuencias promotoras de la expresión de proteínas, genes marcadores y procedimientos de amplificación génica.

Los promotores de la transcripción que se han caracterizado mejor y que son útiles para expresar un gen extraño en una célula particular de mamífero son el promotor temprano SV40, el promotor de adenovirus (AdMLP),el promotor de la metalotioneína I de ratón (mMT-I), la repetición terminal larga (LRT) del virus del sarcoma de Rous (RSV), la repetición terminal larga del virus del tumor mamario murino (MMTV-LTR) y el promotor intermedio-temprano principal del citomegalovirus humano (hCMV). Las secuencias de ADN de todos estos promotores son conocidas en la materia y están disponibles comercialmente.

El uso de un gen DHFR seleccionable en una línea celular dhfr es un procedimiento bien caracterizado que es útil para la amplificación de genes en sistemas celulares de mamíferos. Brevemente, se proporciona el gen DHFR en el vector que transporta el gen de interés, y la adición de concentraciones crecientes del fármaco citotóxico metotrexato da lugar a la amplificación del número de copias del gen DHFR y del gen asociado de interés. El gen DHFR como gen marcador y seleccionable en líneas celulares de ovario de hámster chino (células CHO) transfectadas está particularmente bien caracterizado en la materia. Otros genes marcadores útiles incluyen los genes de la desaminasa de adenosina (ADA) y de la glutamina sintasa (GS).

La elección de las células/líneas celulares también es importante y depende de las necesidades del experimentador. Las células de riñón de mono (COS) proporcionan niveles elevados de expresión génica transitoria, lo que proporciona un medio útil para estudiar rápidamente la construcción de vectores y la expresión de los genes clonados. Las células COS se transfectan con un vector del virus de los simios 40 (SV40) que transporta el gen de interés. Las células COS transfectadas mueren finalmente, impidiendo de esta manera la producción a largo plazo del producto proteico deseado. Sin embargo, la expresión transitoria no precisa el laborioso procedimiento necesario para el desarrollo de una línea celular estable. Entre las líneas celulares establecidas, las células CHO pueden ser las que se han caracterizado mejor hasta la actualidad. Las células CHO son capaces de expresar proteínas de una amplia gama de tipos celulares. La aplicabilidad general de las células CHO y su producción con éxito a partir de diversas proteínas humanas en tipos celulares no relacionados pone de relieve la similitud subyacente de todas las células de los mamíferos.

Las diversas células, líneas celulares y secuencias de ADN que se pueden usar para la expresión en células de mamíferos de los constructos de proteínas de estrés recombinantes de la invención están bien caracterizadas en la materia y están fácilmente disponibles. También se pueden usar otros promotores, marcadores seleccionables, procedimientos de amplificación génica y células para expresar las proteínas de esta invención. Los detalles particulares de la transfección, expresión y purificación de las proteínas recombinantes están bien documentados en la materia y los conocen las personas que tienen conocimientos normales de la materia. Se pueden encontrar más detalles sobre los diversos aspectos técnicos de cada una de las etapas que se usan en la producción recombinante de genes extraños en sistemas de expresión de células de mamíferos en diversos libros de texto y manuales de laboratorio de la materia, como, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1989) eds. Ausubel y col., Wiley Interscience.

IV. Aislamiento de péptidos potencialmente inmunógenos

Como se ha mencionado previamente, se pueden aislar péptidos potencialmente inmunógenos a partir de complejos proteína de estrés-péptido o de complejos CPH-péptido. A continuación se presentan protocolos para aislar péptidos a partir de cada uno de estos complejos.

(a) Péptidos procedentes de complejos proteína de estrés-péptido

Se pueden usar los procedimientos para eluir el péptido a partir de un complejo proteína de estrés-péptido. Un enfoque supone incubar el complejo proteína de estrés-péptido en presencia de ATP, y el otro supone incubar los complejos en un tampón que tiene un pH bajo.

Brevemente, el complejo de interés se centrifuga en un dispositivo Centricon (Millipore) para eliminar cualquier material de bajo peso molecular asociado de manera laxa al complejo. La fracción de peso molecular elevado se puede eliminar y analizar mediante SDS-PAGE, mientras que la fracción de bajo peso molecular se puede analizar mediante HPLC, como se describe más abajo. En el protocolo de incubación con ATP, el complejo proteína de estrés-péptido de la fracción de elevado peso molecular se incuba con ATP 10 mM durante 30 min a temperatura ambiente. En el protocolo de pH bajo, se añade ácido acético al complejo proteína de estrés-péptido para dar una concentración final de 10% (vol/vol) y la mezcla se incuba en un baño de agua hirviendo durante 10 min. Véase, por ejemplo, Van Bleek y col. (1990) Nature 348:213-216, y Li y col. (1993) EMBO Journal 12:3143-3151.

Las muestras resultantes se centrifugan en un dispositivo Centricon 10, como se ha mencionado previamente. Se recuperan las fracciones de elevado y de bajo peso molecular. Se pueden volver a incubar los complejos proteína de estrés-péptido de elevado peso molecular restantes con ATP o con un pH bajo para eliminar cualquier péptido residual.

Las fracciones resultantes de bajo peso molecular se mezclan, se concentran mediante evaporación y se disuelven en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Después se fracciona el material disuelto mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de fase inversa usando, por ejemplo, una columna de fase inversa VYDAC® C18 equilibrada con TFA al 0,1%. El material unido se eluyó posteriormente revelando la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0% a 80% en TFA al 0,1% a una tasa de flujo de aproximadamente 0,8 ml/minuto. La elución de los péptidos se puede monitorizar midiendo la DO_{210} y se recogen las fracciones que contienen los péptidos.

(d) Péptidos procedentes de complejos CPH-péptido

El aislamiento de péptidos potencialmente inmunógenos a partir de moléculas de CPH es bien conocido en la materia y, por lo tanto, no se describe en detalle en esta solicitud. Véase, por ejemplo, Falk y col. (1990) Nature 348:248-251; Rotzsche y col. (1990) Nature 348:252-254; Elliott y col. (1990) Nature 348:195-197; Falk y col. (1991) Nature 351:290-296; Demotz y col. (1989) Nature 343:682-284; Rotzsche y col. (1990) Science 249:283-287.

Brevemente, los complejos CPH-péptido se pueden aislar mediante un procedimiento convencional de inmunoafinidad. Después se diluyen los péptidos a partir del complejo CPH-péptido incubando los complejos en presencia de TFA aproximadamente al 0,1% en acetonitrilo. Los péptidos extraídos se pueden fraccionar y purificar mediante HPLC de fase inversa, como antes.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos eluidos se pueden determinar mediante técnicas manuales o automatizadas de secuenciado de aminoácidos bien conocidas en la materia. Una vez que se ha determinado la secuencia de aminoácidos de un péptido potencialmente protector, se puede sintetizar el péptido en cualquier cantidad deseada usando síntesis convencional de péptidos u otros protocolos bien conocidos en la materia.

V. Síntesis de péptidos inmunógenos potencialmente útiles

Los péptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos que los que se han aislado más arriba se pueden sintetizar mediante síntesis de péptidos en fase sólida usando procedimientos similares a los que describe Merrifield (1963) Am J Chem Soc 85:2149. Durante la síntesis los aminoácidos protegidos en el extremo N-\alpha que tienen cadenas laterales protegidas se añaden de manera escalonada a una cadena polipeptídica en crecimiento unida por su extremo C-terminal a un soporte polimérico insoluble, por ejemplo, cuentas de poliestireno. Los péptidos se sintetizan uniendo un grupo amino de un aminoácido desprotegido en posición N-\alpha a un grupo \alpha-carboxilo de un aminoácido protegido en N-\alpha que ha sido activado haciéndolo reaccionar con un reactivo como diciclohexilcarbodiimida. La unión de un grupo amino libre al carboxilo activado da lugar a la formación de enlaces peptídicos. Los grupos protectores de
N-\alpha que se utilizan usan con más frecuencia incluyen Boc, que es lábil en medio ácido, y Fmoc, que es lábil en medio básico.

Brevemente, el aminoácido C-terminal protegido en N-\alpha se une primero a las cuentas de poliestireno. Después se elimina el grupo protector de N-\alpha. El grupo \alpha-amino desprotegido se acopla al grupo \alpha-carboxilo activado del siguiente aminoácido protegido en N-\alpha. Se repite el proceso hasta que sintetiza el péptido deseado. Después se escinden los péptidos resultantes del soporte de polímero insoluble y se desprotegen las cadenas laterales de los aminoácidos. Se pueden obtener péptidos de mayor longitud mediante condensación de los fragmentos de los péptidos protegidos. Los detalles de los productos químicos, resinas, grupos protectores, aminoácidos protegidos y reactivos adecuados son bien conocidos en la materia y, por lo tanto, no se analizan en detalle en esta solicitud. Véase, por ejemplo, Atherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), y Bodanszky, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2ª Ed., Springer-Verlag (1993).

Se consigue la purificación de los péptidos resultantes usando procedimientos convencionales, como HPLC preparatoria usando permeación en gel, cromatografía de partición y/o de intercambio iónico. La elección de las matrices y tampones adecuados es bien conocida en la materia y por lo tanto no se describe en detalle en esta solicitud.

VI. Reconstitución de los complejos proteína de estrés-péptido

Como apreciarán los expertos en la materia, los péptidos, ya se hayan aislado a partir los complejos usando los procedimientos arriba mencionados o se hayan sintetizado mediante síntesis química, se pueden reconstituir in vitro con diversas proteínas de estrés purificadas naturalmente o recombinantes para generar complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido. A continuación se describe un protocolo preferido para la reconstitución de una proteína de estrés y un péptido in vitro.

Antes de la reconstitución, las proteínas de estrés se tratan con ATP o con un pH bajo para eliminar cualquier péptido que pueda estar asociado a la proteína de estrés de interés. Cuando se usa el procedimiento de ATP, se elimina el exceso de ATP de la preparación mediante la adición de apiranasa, como se analiza en Levy y col. (1991) Cell 67:265-274. Cuando se usa el procedimiento de pH bajo, se reajusta el tampón a un pH neutro mediante la adición de reactivos que modifican el pH.

Se mezcla el péptido (1 mg) y la proteína de estrés tratada (9 mg) para obtener un cociente molar aproximado de 5 péptidos:1 proteína de estrés. Después se incuba la mezcla durante tres horas a temperatura ambiente en un tampón de unión que contiene fosfato sódico 20 mM, a pH 7,2, NaCl 350 mM, MgCl_{2} 3 mM y PMSF 1 mM. Las preparaciones se centrifugan a través con un dispositivo Centricon 10 (Millipore) para eliminar cualquier péptido no unido. La asociación de los péptidos a las proteínas de estrés se puede estudiar mediante SDS-PAGE y radioautografía cuando se usan péptidos radiomarcados para reconstruir los complejos.

Después de la reconstitución se pueden estudiar in vitro los complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido candidatos usando, por ejemplo, el ensayo del cultivo mixto de linfocitos y células diana (MLTC) que se describe más abajo. Una vez que se han aislado los posibles constructos inmunógenos se pueden caracterizar más en modelos animales usando los protocolos preferidos de administración y los excipientes que se analizan más abajo.

VII. Determinación de la inmunogenia de los complejos proteína de estrés-péptido

Se puede estudiar la inmunogenia de los complejos proteína de estrés-péptido purificados y reconstituidos usando el ensayo cultivo mixto de linfocitos y células diana (MLTC), que es bien conocido en la materia.

Brevemente, se infecta a ratones por vía subcutánea con los complejos proteína de estrés-péptido candidatos. A otros ratones se les inyectan otros complejos proteína de estrés-péptido o células infectadas completas que actúan como controles positivos para el ensayo. Se inyecta a los ratones dos veces, separadas entre sí 7-10 días. Diez días después de la última inmunización se extirpan los bazos y se liberan los linfocitos de los bazos resecados. Los linfocitos liberados se pueden volver a estimular in vitro mediante la adición posterior de células muertas que antes de la muerte habían expresado el complejo de interés.

Por ejemplo, se pueden estimular 8 x 10^{6} células inmunitarias del bazo con 4 x 10^{4} células tratadas con mitomicina C o irradiadas con radiación \gamma (5-10.000 rad) (las células se habían infectado con el patógeno intracelular o se habían transfectado con un gen adecuado) en 3 ml de medio RMPI que contiene suero bovino fetal al 10%. En algunos casos se puede incluir en el medio de cultivo un sobrenadante de cultivo mixto de linfocitos secundario al 33% como fuente de factores de crecimiento de linfocitos T. Véase, por ejemplo, Glasebrook y col. (1980) J Exp Med 151:876. A fin de estudiar la respuesta primaria de los linfocitos T citotóxicos después de la inmunización, se pueden cultivar las células esplénicas sin estimulación. En algunos experimentos también se pueden volver a estimular las células esplénicas de los ratones inmunizados con células antigénicamente distintas, para determinar la especificidad de la respuesta mediada por los linfocitos T citotóxicos.

Seis días después se estudian los cultivos para determinar su citotoxicidad en un ensayo de cuatro horas de liberación de ^{51}Cr. Véase, por ejemplo, Palladito y col. (1987) Cancer Res 47:5074-5079 y Blachere y col. (1993) J Immunotherapy 14:352-356. En este ensayo se añade el cultivo mixto de linfocitos a una suspensión de células diana para dar diferentes cocientes efector:diana (E:D) (habitualmente 1:1 a 40:1). Las células diana se marcan previamente incubando 1 x 10^{6} células diana en medio de cultivo que contiene 200 mCi de ^{51}Cr/ml durante una hora a 37ºC. Las células se lavan tres veces después de marcado. Se realiza cada punto del ensayo (cociente E:D) por triplicado y se incorporan controles adecuados para medir la liberación espontánea de ^{51}Cr (sin añadir linfocitos al ensayo) y la liberación al 100% (células lisadas con detergente). Después de incubar las mezclas celulares durante cuatro horas, se sedimentan las células mediante centrifugación a 200 g durante 5 min. Se mide la cantidad de ^{51}Cr liberada en el sobrenadante con un contador gamma. Se mide la citotoxicidad porcentual como cpm en la muestra en estudio menos cpm liberada de manera espontánea dividida por cpm total liberada con detergente menos cpm liberada de manera espontánea.

A fin de bloquear la cascada del CPH de clase I se añade un sobrenadante concentrado de hibridoma procedente de células del hibridoma K-44 (un hibridoma anti-CPH de clase I) a las muestras en estudio hasta una concentración final de 12,5%.

VIII. Formulación y regímenes de vacunación

Una vez que se han identificado los complejos proteína de estrés-péptido candidatos, se pueden administrar a un modelo animal o al posible receptor para estimular las respuestas mediadas por linfocitos T citotóxicos frente al patógeno intracelular preseleccionado. Los complejos proteína de estrés-péptido de la invención se pueden almacenar o se pueden preparar para su administración mezclándolos con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Estos materiales deben ser no tóxicos para el posible receptor a las dosis y concentraciones que se emplean.

Si el complejo es hidrosoluble entonces se puede formular en un tampón adecuado, por ejemplo suero salino tamponado con fosfato (fosfato sódico 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1) u otra solución fisiológicamente compatible. De manera alternativa, si el complejo resultante tiene una baja solubilidad en disolventes acuosos, entonces se puede formular con un agente tensioactivo no iónico como Tween o polietilenglicol.

Se pueden preparar soluciones útiles para la administración oral o parenteral mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la materia farmacéutica, descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed), Mark Pub., 1990. Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. En particular, las formulaciones para la administración directa pueden incluir glicerol y otras composiciones de elevada viscosidad. Los polímeros biocompatibles, preferentemente biorreabsorbibles, que incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, polibutirato, polilactida, poliglicolida y copolímeros de lactida/glicolida pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de los complejos proteína de estrés-péptido in vivo.

Las formulaciones para la administración mediante inhalación pueden contener como recipiente, por ejemplo, lactosa. Las soluciones acuosas pueden contener, por ejemplo, éter polioxietilen-9-laurílico, glucocolato y desoxicolato. Las soluciones oleosas pueden ser útiles para la administración en forma de gotas nasales. Se pueden aplicar geles por vía tópica intranasal.

Los compuestos que se proporcionan en esta solicitud se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante la mezcla con vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Además, las formulaciones pueden contener ocasionalmente uno o más adyuvantes. Los adyuvantes preferidos incluyen, aunque no se limitan a ellos, copolímeros tri-bloque de ácido plurónico, dipéptido de muramilo y sus derivados, endotoxina destoxificada, saponina y sus derivados como QS-21, y liposomas. La presente invención contempla además formulaciones de liberación sostenida en las que el complejo se libera a lo largo de un período prolongado de tiempo.

La dosis y el medio de administración de la familia de vacunas proteína de estrés-péptido preparadas según la invención dependerá necesariamente de la naturaleza del complejo, del patógeno intracelular y de la naturaleza de la enfermedad en cuestión. El complejo se debe administrar en una cantidad suficiente como para iniciar una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente al patógeno intracelular. También es probable que la dosis preferida del fármaco que se va administrar dependa de variables como el tipo de enfermedad, la edad, sexo y el peso del posible receptor, el estado de salud global del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación del compuesto, la presencia y tipos de excipientes de la formulación, y la vía de administración.

En términos generales, los compuestos de esta invención se pueden administrar en una solución acuosa fisiológica tamponada que contiene aproximadamente 0,001% a 10% p/v del compuesto para su administración parenteral. Las dosis típicas varían desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 \mug de complejo/kg de peso corporal del receptor/inmunización; y preferentemente varían desde aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 \mug de complejo/kg de peso corporal del receptor/inmunización. Se contempla que se administrarán entre aproximadamente 10 y aproximadamente 250 \mug de complejo por dosis a un ser humano que pesa aproximadamente 75 kg. Sin embargo, estas cantidades pueden variar según el excipiente que se coadministre con el complejo.

Las vacunas se pueden administrar usando protocolos estándar que incluyen, aunque no se limitan a ellos, administración intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, intravaginal, intrarrectal, oral, sublingual, transcutánea e intranasal. Preferentemente se debe vacunar al receptor cuatro veces a intervalos semanales. Si es necesario, se pueden reforzar las respuestas en una fecha posterior mediante la administración posterior de la vacuna. Se contempla que la dosis óptima y el régimen de vacunación se pueden determinar de manera empírica para cada vacuna proteína de estrés-péptido usando técnicas bien conocidas en la materia.

Se pueden administrar diversas citocinas, antibióticos y otros agentes bioactivos con los complejos proteína de estrés-péptido. Por ejemplo, se pueden coadministrar con los complejos varias citocinas conocidas, por ejemplo, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma, TNF-\alpha, TNF-\beta, G-CSF, GM-CSF y TGP-\beta, a fin de maximizar la respuesta biológica. Sin embargo, que prevé que otras citocinas aún no descubiertas pueden ser eficaces en la invención. Además, se pueden coadministrar antibióticos convencionales con el complejo proteína de estrés-péptido. La elección de los antibióticos adecuados también dependerá de la enfermedad en cuestión.

Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran la invención.

Ejemplo 1 Inmunogenia de los complejos proteína de estrés-péptido aislados a partir de células transfectadas con un gen que codifica un determinante antigénico

La Figura 1 muestra la actividad específica de antígeno de linfocitos T citotóxicos de los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con un complejo gp96-péptido recogido de fibroblastos BALB/c transfectados con el gen de la nucleoproteína (NP) del virus gripal PR8.

Brevemente, se aislaron las preparaciones gp96-péptido a partir de células BALB/c transfectadas con el gen NP del virus gripal PR8 y que lo expresaban. El complejo gp96-péptido se aisló a partir del sobrenadante 100.000 g mediante el protocolo de purificación no modificado del complejo gp60-péptido. Después se usaron las preparaciones para inmunizar ratones BALB/c "vírgenes". Se inyectó a los ratones dos veces por vía subcutánea con los complejos gp96-péptido a intervalos de 10 días. Se sacrificaron los ratones y se obtuvieron las células esplénicas. Se estimularon las células esplénicas in vitro dos veces con células BALB/c adicionales irradiadas letalmente y que expresaban el gen NP usando el cultivo mixto de linfocitos y células diana (MLTC) que se ha descrito más arriba. Seis días después se estudió la citotoxicidad de los cultivos usando el ensayo de liberación de ^{51}Cr. A fin de bloquear la cascada del CPH de tipo I se cultivaron las células esplénicas con el sobrenadante procedente del cultivo del hibridoma K-44 (que contenía inmunoglobulinas anti-CPH de tipo I).

Se estudió la actividad citotóxica midiendo la liberación de ^{51}Cr por fibroblastos BALB/c que expresaban el gen NP (círculos sólidos), por células BALB/c que expresaban el gen NP pero que habían sido tratadas con antisuero anti-CPH de tipo I (círculos vacíos) y por la línea celular singénica 5117 no transfectada con NP (asteriscos). Los bazos de los ratones inmunizados con el complejo gp96 mostraron una intensa actividad mediada por linfocitos T citotóxicos restringida por el CPH de clase I frente a las células BALB/c que expresaban el gen NP, pero no frente a la línea celular singénica 5117 no transfectada con NP. Además, el antisuero anti-CPH de tipo I bloqueó la respuesta. Por lo tanto, es evidente que la inmunización con un complejo proteína de estrés-péptido desencadena una respuesta específica mediada por linfocitos T citotóxicos frente al péptido del complejo, y que la cascada del CPH de clase I tiene una función integral en la estimulación de la respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos frente a las células infectadas por los patógenos intracelulares.

Ejemplo 2 Inmunogenia de los complejos proteína de estrés-péptido aislados a partir de células transformadas con SV40

La Figura 2 muestra la actividad específica de antígeno mediada por linfocitos T citotóxicos de los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con el complejo gp96-péptido recogido a partir de células SVB6 transformadas con SV40.

Brevemente, los complejos gp96-péptido se aislaron a partir de células SVB6 transformadas con SV40 y se usaron para inmunizar ratones "vírgenes" (57BL/6). El complejo gp96-péptido se aisló a partir del sobrenadante 100.000 d mediante el protocolo de purificación no modificado del complejo gp60-péptido. Se inyectó dos veces a los ratones por vía subcutánea con el complejo a intervalos de 10 días. Se sacrificó a los ratones, se aislaron las células esplénicas y se estimularon in vitro con el procedimiento MLTC mediante la adición de células SVB6 transformadas con SV40 e irradiadas letalmente. Seis días después se estudió la citotoxicidad de las células usando el ensayo de liberación de ^{51}Cr. Se ensayó la actividad citotóxica midiendo la liberación de ^{51}Cr a partir de las células SVB6 (triángulos sólidos) y a partir de una línea celular singénica no transfectada con SV40 (triángulos vacíos). También se estudió la actividad mediada por el CPH de clase I añadiendo a las células esplénicas inmunoglobulinas anti-CPH de clase I procedentes de la línea celular del hibridoma K-44.

Las células esplénicas aisladas a partir de ratones inmunizados con el complejo gp96-péptido mostraron una intensa actividad restringida por el CPH de clase I frente a las células SVB6 transfectadas con SV40, pero no frente a las células no transfectadas.

Ejemplo 3 Reconstitución in vitro de los complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido

Las Figuras 3A-3D muestran las actividades específicas de antígeno mediadas por linfocitos T citotóxicos de los esplenocitos procedentes de dos ratones inmunizados con el complejo PCT70-péptido reconstituido.

Brevemente, se purificó la PCT70 que no formaba complejos mediante el procedimiento que se ha descrito más arriba, y se sintetizó el péptido (SLSDLRGYVYQGL, ID. SEC. Nº 1) mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Se mezcló el péptido (1 mg) y la proteína PCT70 (9 mg) y se incubaron durante tres horas a temperatura ambiente en un tampón de unión que contenía fosfato sódico 20 mM a pH 7,2, NaCl 350 mM, MgCl_{2} 3 mM y PMSF 1 mM. La preparación resultante se centrifugó en un dispositivo Centricon 10 (Millipore®) para eliminar el péptido no unido.

El complejo resultante se usó para inmunizar a dos ratones "vírgenes". Se aislaron las células esplénicas a partir de los ratones y se estimularon dos veces in vitro usando el procedimiento MLTC mediante la adición de células EL4 irradiadas letalmente y transfectadas con un minigén que codificaba el péptido SLSDLRGYVYQGL (ID. SEC. Nº 1), y que lo expresaban. Se estudió la citotoxicidad de las células esplénicas de ambos ratones después de las primeras (3A y 3C) y segundas (3C y 3D) estimulaciones mediante el ensayo de liberación de ^{51}Cr. Se midió la liberación de ^{51}Cr por las células EL4 (triángulos vacíos) y por las células EL4 transfectadas con el péptido SLSDLRGYVYQGL (ID. SEC. Nº 1) y que lo expresaban (triángulos sólidos). Los resultados muestran que se pueden reconstituir in vitro con éxito las proteínas de estrés y los péptidos para dar complejos inmunógenos específicos proteína de estrés-péptido.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(I)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: FACULTAD DE MEDICINA MOUNT SINAI

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(B)

CALLE: 1 GUSTAVE L. LEVY PLACE

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(C)

CIUDAD: NUEVA YORK

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(D)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

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(E)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 10029

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(F)

TELÉFONO: 212-241-0826

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(G)

TELEFAX:

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(H)

TÉLEX:

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(II)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS PROTEÍNA DE ESTRÉS-PÉPTIDO COMO VACUNAS PROFILÁCTICAS Y TERAPÉUTICAS FRENTE A PATÓGENOS INTRACELULARES

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(III)

NO. DE SECUENCIAS: 1

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(IV)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: ADMINISTRADOR DE LA PATENTE, TESTA HURWITZ & THIBEAULT

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(B)

CALLE: 53 STATE STREET, EXCHANGE PLACE

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(C)

CIUDAD: BOSTON

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(D)

ESTADO: MA

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 02109

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(V)

IMPRESO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE

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(B)

ORDENADOR: COMPATIBLE CON PC IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-2/M. S.-DOS

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(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PATENTIN RELEASE Nº 1.0, VERSIÓN NÚMERO 1.25

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(VI)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NO. DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(VIII)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: PITCHER, EDMUND R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 27.829

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: ARM-001

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(IX)

INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TEL.: (617) 248-7000

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(B)

TELEFAX: (617) 248-7100

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(2) INFORMACIÓN DE LA ID. SEC. Nº 1:

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(I)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 13 AMINOÁCIDOS

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(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

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(C)

TIPO DE HEBRA: SENCILLA

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

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(II)

TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

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(IX)

CARACTERÍSTICAS:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: PÉPTIDO

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1... 13

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(D)

OTRA INFORMACIÓN:/ETIQUETA IGUAL PÉPTIDO 1/NOTA IGUAL "ANTES PÉPTIDO ANTIGÉNICO 1"

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(XI)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:

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\sa{Ser Leu Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}

Claims (50)

1. Un complejo purificado e inmunógeno proteína de estrés-péptido procedente de un mamífero, comprendiendo dicho complejo una proteína de estrés de un mamífero asociada de manera no covalente a un péptido que comprende un determinante antigénico de un patógeno intracelular, para su uso como medicamento.

2. Un complejo según la reivindicación 1, para su administración a un mamífero para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad producida por dicho patógeno.

3. Un complejo según la reivindicación 2, en el que dicha profilaxis o tratamiento desencadena una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos.

4. Un complejo según la reivindicación 3, en el que dicha profilaxis o tratamiento desencadena una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos mediada por el complejo principal de histocompatibilidad de clase I.

5. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha proteína de estrés es un miembro de una familia de proteínas de estrés seleccionada de PCT60, PCT70 y PCT90.

6. Un complejo según la reivindicación 5, en el que dicha proteína de estrés es gp96.

7. Un complejo según la reivindicación 5, en el que dicha proteína de estrés es PCT60.

8. Un complejo según la reivindicación 5, en el que dicha proteína de estrés es PCT70.

9. Un complejo según la reivindicación 5, en el que dicha proteína de estrés es PCT90.

10. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho patógeno es un virus.

11. Un complejo según la reivindicación 10, en el que dicho virus se selecciona entrel virus de la hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus gripal, varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (VHS-I), herpes simple de tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, papilomavirus, papovavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxackie, parotiditis, sarampión, rubéola, poliomielitis, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) y virus de inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2).

12. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho patógeno es una bacteria.

13. Un complejo según la reivindicación 12, en el que dicha bacteria se selecciona entre Mycobacteria, Rickettsia, Neisseria y Legionella.

14. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho patógeno es un protozoo.

15. Un complejo según la reivindicación 14, en el que dicho protozoo se selecciona entre Leishmania, Trypanosoma y Coccidioa.

16. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el que dicho patógeno es un parásito intracelular.

17. Un complejo según la reivindicación 16, el que dicho parásito se selecciona entre Chlamydia y Rickettsia.

18. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha proteína de estrés es una proteína de estrés humana.

19. Un complejo según la reivindicación 2 o según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 18 cuando depende directa o indirectamente de la reivindicación 2, en el que dicha proteína de estrés de mamífero es una proteína de estrés humana.

20. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para su administración a un mamífero en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 \mug de complejo por cada kg de peso corporal de mamífero por administración.

21. Un complejo según la reivindicación 20, en el que dicha cantidad está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 \mug de complejo por kg de peso corporal de mamífero por administración.

22. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para su uso con una citocina.

23. Un complejo según la reivindicación 22, en el que dicha citocina se selecciona entre IL-1\alpha, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma, TNF-\alpha, TNF-\beta, G-CSF, GM-CSF y TGF-\beta.

24. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que dicho complejo y cualquier citocina que se usa están en forma de una composición con un vehículo, un adyuvante y un excipiente farmacéuticamente adecuados.

25. Uso de un complejo purificado e inmunógeno proteína de estrés de mamífero-péptido para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad en un mamífero producida por un patógeno intracelular, comprendiendo dicho complejo una proteína de estrés de mamífero asociada de manera no covalente a un péptido que comprende un determinante antigénico de dicho patógeno.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que dicha profilaxis o tratamiento es como se define en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4 frente a un patógeno intracelular.

27. Uso según la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que dicho complejo es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 21, de modo que dicho medicamento comprende además una citocina según se define en la reivindicación 22 o en la reivindicación 23.

28. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que el mamífero es un ser humano.

29. Un procedimiento para producir un complejo purificado, inmunógeno y no covalente de una proteína de estrés de mamífero-péptido que comprende un determinante antigénico de un patógeno intracelular, que comprende la formación de un complejo entre dicha proteína de estrés de mamífero y dicho péptido in vitro.

30. Un procedimiento según la reivindicación 29, en el que los componentes del complejo son los que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19.

31. Un procedimiento según la reivindicación 29 o la reivindicación 30, en el que dicha proteína de estrés se aísla en presencia de ATP antes de la formación de dicho complejo.

32. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que dicha proteína de estrés se trata con un pH bajo antes de dicha formación del complejo.

33. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que dicho péptido se obtuvo eluyendo el péptido de un complejo CPH-péptido aislado de una célula eucariótica infectada con dicho patógeno o transfectada con un gen que codifica dicho determinante antigénico.

34. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en el que se purifican los complejos resultantes.

35. Un complejo purificado inmunógeno y no covalente de una proteína de estrés de mamífero y un péptido según se define en la reivindicación 1, que se puede obtener formando un complejo entre dicha proteína de estrés de mamífero y dicho péptido in vitro.

36. Un complejo según la reivindicación 35, en el que los componentes del complejo son los que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19.

37. Un complejo según la reivindicación 35 o la reivindicación 36, producido mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34.

38. Un complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, y una citocina según se define en la reivindicación 22 o en la reivindicación 23.

39. Un complejo para su uso como medicamento, según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38.

40. Uso de un complejo para la fabricación del medicamento según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, complejo que es según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38.

41. Complejos purificados inmunógenos formados por proteína de estrés de mamífero-péptido como se definen en la reivindicación 1, habiendo sido aislados dichos complejos a partir de una célula eucariótica infectada con dicho patógeno intracelular o transfectada con un gen que codifica un determinante antigénico de dicho patógeno intracelular, y siendo dicha proteína de estrés de mamífero un miembro de una familia de proteínas de estrés seleccionada de PCT60, PCT70 y PCT90 distinta de gp96 de la familia PCT90.

42. Complejos purificados inmunógenos proteína de estrés de mamífero-péptido según se definen en la reivindicación 1, habiendo sido aislados dichos complejos a partir de una célula eucariótica infectada con dicho patógeno o transfectadas con gen que codifica un determinante antigénico de dicho patógeno pero que no está presente en dicha célula cuando dicha célula no está infectada por dicho patógeno ni está transfectada con dicho gen, siendo dicha proteína de estrés gp96 y siendo dicho patógeno una bacteria, un protozoo, un parásito intracelular o un virus seleccionado del virus de la hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, varicela, adenovirus, virus herpes simple de tipo I (VHS-I), virus herpes simple de tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, papilomavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxackie, parotiditis, sarampión, rubéola, poliomielitis, virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) o virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2).

43. Complejos según la reivindicación 41, en los que los componentes son los que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 18.

44. Complejos según la reivindicación 42, en los que los componentes son los que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 13, 15, 17 y 19.

45. Un complejo para su uso como medicamento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, complejo que es el que se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44.

46. Uso de un complejo para la fabricación del medicamento, según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, complejo que es el que se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44.

47. Una composición que comprende un complejo purificado inmunógeno proteína de estrés de mamífero-péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y 35 a 37, o complejos purificados inmunógenos proteína de estrés de mamífero-péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, y un vehículo, coadyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

48. Una composición según la reivindicación 47, que también comprende una citocina según se define en la reivindicación 22 o en la reivindicación 23.

49. Uso de una composición según la reivindicación 47 o la reivindicación 48 para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad en un mamífero producida por un patógeno intracelular.

50. Uso según la reivindicación 49, en el que el mamífero es un ser humano.