ES2316364T3 - Citoquinas inactivas para la inmunizacion. - Google Patents

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ES2316364T3 ES00922696T ES00922696T ES2316364T3 ES 2316364 T3 ES2316364 T3 ES 2316364T3 ES 00922696 T ES00922696 T ES 00922696T ES 00922696 T ES00922696 T ES 00922696T ES 2316364 T3 ES2316364 T3 ES 2316364T3
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Abstract

Derivado de citoquina o de un fragmento de citoquina de fórmula Cy - (X - R)n en la que Cy representa una citoquina o un fragmento de citoquina, -(X-R) representa una función libre de un aminoácido que constituye la citoquina o el fragmento de citoquina, en la que X representa un grupo NH o un átomo de azufre, n representa un número entero comprendido entre 1 y 70, y R representa un grupo químico que conserva en dicho derivado de citoquina o en dicho fragmento unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o que bloquean dicha citoquina nativa y haciendo al mismo tiempo perder por lo menos 90% de las propiedades biológicas de dicha citoquina nativa, caracterizado porque: (i) R es un grupo carboxamida, N-alquilmaleimida, tionitrobenzoico o un radical formado por la reacción de una función tiol con el 4-cloro-7-sulfobenzofurazano de amonio, la N-[yodoetil]-trifluoroacetamida o la N-(6-[7-amino-4-metilcumarino-3-acetamido]hexil)-3''-(2''-piridilditio)propionamida, o (ii) R es un radical formado por la reacción de una función amino con el etilacetimidato, un anhídrido, el 2-iminotiolano-HCl, el N-succinimidilo S-acetiltioacetato, el sulfosuccinimidil-acetato, el sulfosuccinimidil-4- O-[4,4''-dimetoxitritil]butirato, el succinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato o el sulfosuccinimidil- 7-amino-4-metilcumarino-3-acetato, o el fenilglioxalo.

Description

Citoquinas inactivas para la inmunización.
La presente invención se refiere a nuevas citoquinas inactivas, que se pueden utilizar para unas inmunizaciones en el ser humano.
El documento PCT/FR92/00544 ha dado a conocer que era posible inmunizar al ser humano contra unas citoquinas después de haberlas inactivado o de haber inactivado unos fragmentos peptídicos nativos u homólogos mediante un tratamiento apropiado que conserva su inmunogenicidad. Este documento describe más específicamente el tratamiento químico de la citoquina o fragmento peptídico u homólogo con la ayuda de un aldehído o de \beta-propiolactona.
Estos compuestos han resultado muy activos. Se han usado en particular en el ámbito de ensayos químicos sobre unos pacientes infectados por el VIH, y éstos han mostrado un beneficio químico seguro (véase A. Gringeri et al. J of AIDS 20: 358-370-1999.
Pero estos compuestos, preparados mediante tratamiento con formaldehído, adolecen a veces de dificultades de producción, en particular en el plano de la estabilidad y de la reproductibilidad.
Sin embrago, el solicitante ha descubierto con sorpresa que ciertos tratamientos químicos permitían obtener unos compuestos que poseen la misma inmunogenicidad, en particular con una estabilidad y una reproductibilidad de preparación mayores.
Por eso, la presente solicitud tiene por objeto un derivado de citoquina o de fragmento de citoquina de fórmula
(I)Cy-(X-R)_{n}
en la que Cy representa una citoquina o un fragmento de citoquina, -(X-R) representa una función libre de un aminoácido que constituye la citoquina o el fragmento de citoquina, en la que X representa un grupo NH o un átomo de azufre, n representa un número entero comprendido entre 1 y 70, y R representa un grupo químico que conserva en dicha citoquina o en dicho fragmento unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o que bloquean dicha citoquina nativa y haciendo al mismo tiempo perder por lo menos 90% de las propiedades biológicas de dicha citoquina nativa, caracterizado porque:
(i)
R es un grupo carboxamida, N-alquilmaleimida, tionitrobenzoico o un radical formado por la reacción de una función tiol con el 4-cloro-7-sulfobenzofurazano de amonio, la N-[yodoetil]-trifluoroacetamida o la N-(6-[7-amino-4-metilcumarin-3-acetamido]hexil)-3'-(2'-piridilditio)propionamida.
\quad
La carboxamidación añade un radical carboxamida (tratamiento de la citoquina mediante la yodoacetamida, por ejemplo), la maleimidación añade a las cisteínas un radical N-alquilmaleimida, por ejemplo N-etilmaleimida (tratamiento de la citoquina mediante la N-etilmaleimida), la reacción de Ellman añade un radical tionitrobenzoico a la cisteína (tratamiento de la citoquina mediante ácido 5,5'-ditio-bis-[2-nitrobenzoico] o DTNB).
(ii)
R es un radical formado por la reacción de una función amino con el etilacetimidato, un anhídrido, el 2-iminotiolano-HCl, el N-succinimidilo S-acetiltioacetato, el sulfosuccinimidil-acetato, el sulfosuccinimidil-4-O-[4,4'-dimetoxitritil]butirato, el succinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato o el sulfosuccinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato o el fenilglioxalo.
\vskip1.000000\baselineskip
R tiene ventajosamente un peso molecular comprendido entre 10 y 2.000, preferentemente entre 20 y 1.500, en particular comprendido entre 30 y 1.000, particularmente comprendido entre 40 y 500.
R es preferentemente un radical orgánico tal como se ha mencionado anteriormente.
El tratamiento de la citoquina mediante el etilacetimidato produce la amidinación de las funciones amino. A título de anhídrido que se puede utilizar se puede citar el anhídrido citracónico.
Como ya se ha mencionado, otros agentes reactivos pueden actuar sobre las funciones aminas, tal como por ejemplo el agente reactivo de Traut (tratamiento mediante el 2-iminotiolano-HCl), mediante la adición de un SH protegido por el N-succinimidilo S-acetiltioacetato, o el sulfosuccinimidil-acetato o el sulfosuccinimidil-4-O-[4,4'-dimetoxitritil]butirato, o también el succinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato o el sulfosuccinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato.
Estas desactivaciones químicas se obtienen mediante una modificación química de ciertos residuos de la citoquina que bloquea la función biológica de la citoquina nativa. Preferentemente se modifica el 50% de los grupos X anteriores, en particular el 70%, y particularmente la totalidad. Se pueden modificar al mismo tiempo los grupos en los que X representa NH y aquellos en los que X representa un átomo de azufre, o preferentemente sólo uno de estos dos grupos. "n" puede alcanzar hasta 10, por ejemplo, en el caso en el que X representa un átomo de azufre y por ejemplo hasta 70, por ejemplo, en el caso en el que X representa NH.
El compuesto inmunógeno según la invención puede estar constituido por la totalidad o por un fragmento de la citoquina y puede comprender, como es bien conocido por el experto en la materia, una o varias modificaciones en los aminoácidos de esta proteína o fragmento tales como unas deleciones, sustituciones, adiciones, o funcionalizaciones tales como la acilación de aminoácidos, en la medida en la que estas modificaciones permanecen en el marco especificado anteriormente (ausencia de toxicidad, caracteres inmunológicos). Por ejemplo, en general la sustitución de un residuo de leucina por un residuo de isoleucina no modifica dichas propiedades. Las modificaciones deben afectar gene-
ralmente a menos de 30% de los aminoácidos, preferentemente menos de 20% y muy particularmente menos de 10%.
Un fragmento puede comprender de 8 a 10 aminoácidos por ejemplo, preferentemente de 12 a 60 aminoácidos y en particular de 12 a 40 aminoácidos. Dicho fragmento puede comprender asimismo por el o por los lados C o N terminal de 1 a 5 aminoácidos suplementarios, es decir, diferentes del segmento de origen.
De manera general, en lo referente a las modificaciones, la homología o la similitud entre el inmunógeno modificado y la citoquina o parte de citoquina nativa, así como las dimensiones del compuesto inmunógeno, al igual que las modalidades de uso, o de acoplamiento del compuesto inmunógeno según la invención a una proteína inmunógena tal como el toxoide tetánico, se podrá hacer referencia en particular a los documentos WO-A-86/06414 o EP-A-0 220 273 o también PCT/US 86/00831.
La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de una citoquina o de un fragmento tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque se somete a dicha citoquina o a dicho fragmento a la acción de un agente reactivo capaz de injertar un grupo R sobre dicha citoquina o dicho fragmento, para obtener el compuesto esperado que se aísla.
Tal como lo muestran los ejemplos descritos en la parte experimental a continuación y realizados sobre unas citoquinas de origen humano, los nuevos productos obtenidos mediante estos tratamientos, denominados "quinoides", han perdido su actividad biológica natural, y son apropiados para inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero. Además, los anticuerpos obtenidos usando estos quinoides como inmunógenos reconocen la proteína nativa no activada.
Los ejemplos citados se refieren a las citoquinas, IFN\gamma, TNF\alpha, IL1, IL4, IL6, IL10, IL13, pero estas reacciones se pueden aplicar a todas las citoquinas (las interleuquinas IL1, IL2, IL3, etc., los Transforming Growth Factors - TGF - \alpha y \beta, los interferones \alpha, \beta, \gamma, \tau (tau), los Tumor Necrosis Factors - TNF \alpha y \beta, las quimioquinas, etc.). La citoquina o un fragmento peptídico homólogo se pueden producir mediante síntesis química o también mediante ingeniería genética. Mediante la expresión "fragmento peptídico homólogo" se entiende una secuencia peptídica que tiene similitud suficiente con la citoquina nativa para inducir unos anticuerpos cruzados que neutralizarán la actividad biológica de la citoquina nativa. Por ejemplo, el fragmento peptídico homólogo puede ser un mutante de la citoquina preparado mediante ingeniería genética. La ventaja de la desactivación química es que permitirá además estabilizar la molécula para obtener unas conformaciones y unas preparaciones reproducibles.
A fin de maximizar la respuesta inmunitaria anti-citoquina, se podrá combinar el uso de quinoides desactivados de manera diferente y que podrán ser complementarios en el plano de la reacción inmunitaria que éstos inducen: por ejemplo un quinoide preparado mediante un procedimiento que tiene como diana las cisteínas podrá ser asociado a un quinoide preparado según un procedimiento que tiene como diana los residuos de aminas.
Los quinoides se podrán asociar para luchar contra unas sobreproducciones de citoquinas, no sólo unos quinoides de la misma citoquina desactivados mediante unos procedimientos diferentes, sino también unos quinoides de citoquinas diferentes sobreproducidas en la misma enfermedad: por ejemplo en el caso del SIDA se podrá inmunizar usando unos quinoides combinados de IFN\alpha y de IFN\gamma, o en la poliartritis reumatoide usando unos quinoides de IL1 y de TNF\alpha.
Los compuestos objeto de la presente invención poseen unas propiedades farmacológicas muy interesantes. En particular, son interesantes para la inmunización activa anti-citoquina en los casos en los que unas enfermedades están asociadas a una sobreproducción de estas citoquinas.
Estas propiedades se ilustran a continuación en la parte experimental. Justifican el uso de los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente, a título de medicamento.
Por eso, la invención tiene asimismo por objeto los compuestos que responden a la fórmula I
(I)Cy-(X-R)_{n}
en la que Cy representa una citoquina o un fragmento de citoquina, -(X-R) representa una función libre de un aminoácido que constituye la citoquina o el fragmento de citoquina, en la que X representa un grupo NH o un átomo de azufre, n representa un número entero comprendido entre 1 y 70, y R representa un grupo químico que conserva en dicho derivado de citoquina o en dicho fragmento unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o bloquean dicha citoquina nativa y haciendo al mismo tiempo perder por lo menos 90% de las propiedades biológicas de dicha citoquina nativa, para su uso en un procedimiento de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, es decir, a título de medicamento.
Los medicamentos según la presente invención encuentran su uso en unos tratamientos tanto curativos como preventivos. De manera general, se pueden usar en las patologías asociadas a una sobreproducción, o producción no deseada de citoquina. Por ejemplo, el quinoide de TNF\alpha se puede usar en inmunización activa en la poliartritis reumatoide en la que ya ha mostrado que el bloqueo de TNF mediante unos anticuerpos (inmunización pasiva) o unos receptores disolubles limita la evolución de la enfermedad, o también en los cánceres cuando existe una sobreproducción de TNF\alpha y caquexia. El quinoide de IL1 también se puede usar en la poliartritis reumatoide en la que existe una sobreproducción de IL1. El quinoide de IFN\gamma se puede usar en el SIDA en el que existe una sobreproducción de IFN\gamma; se puede usar en la esclerosis en placas en la que se ha mostrado que la administración de IFN\gamma conlleva una agravación de la enfermedad, o también en la diabetes juvenil en la que se ha mostrado claramente en un modelo animal y también mediante unos estudios in situ en el ser humano que la destrucción de los islotes de Langerhans se debe a una sobreproducción de IFN\gamma. El quinoide de IFN\alpha se puede usar en el SIDA en el que su sobreproducción ha sido claramente establecida y en el que el beneficio clínico de la inmunización anti-IFN\alpha ha sido demostrado, o también en el lupus eritematoso del que se ha demostrado que se podía activar mediante inyección de IFN\alpha. El quinoide de IL6 se puede usar en el mieloma múltiple o la enfermedad de Castleman o ciertos melanomas en los que se ha demostrado que las células cancerígenas proliferan gracias a la IL6. Los quinoides de IL6 y de IL13, aislados o juntos, se pueden usar en unos casos de patologías alérgicas en las que se ha demostrado que estas citoquinas están sobreproducidas. Todos
estos ejemplos no limitativos muestran el amplio abanico de aplicaciones de los quinoides descritos en esta patente.
Al igual que para cualquier inmunización activa, el tratamiento puede usar sólo un fragmento de citoquina desactivada mediante los procedimientos mencionados anteriormente para suscitar la reacción inmunitaria que neutralizará la actividad biológica de la citoquina.
Los compuestos inmunógenos según la invención se pueden usar como sigue:
Se administra a un paciente un compuesto inmunógeno según la presente invención, por ejemplo por vía sub-cutánea o intramuscular, en cantidad suficiente para ser eficaz en el plano terapéutico, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. La dosis administrada puede estar comprendida, por ejemplo, entre 20 y 1.000 \mug por vía intramuscular en forma de emulsión agua/aceite, una vez al mes durante tres meses, y después periódicamente en función del porcentaje de los anticuerpos séricos inducidos, por ejemplo cada 2-6 meses.
Una composición según la invención se puede administrar por cualquier vía habitual en uso en el campo de las vacunas, en particular por vía sub-cutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía oral. También se puede citar la vía oro-mucosal o pernasal. La administración se puede realizar en una dosis única o repetida una o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo.
La invención tiene asimismo por objeto las composiciones farmacéuticas que contienen por lo menos un compuesto citado anteriormente, a título de principio activo.
En estas composiciones, el principio activo está ventajosamente presente a unas dosis fisiológicamente eficaces; las composiciones citadas anteriormente contienen en particular una dosis inmunógena eficaz de por lo menos un principio activo anterior. El compuesto inmunógeno se puede acondicionar solo o en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como un adyuvante.
Estas composiciones farmacéuticas pueden ser en particular líquidas y presentarse en formas farmacéuticas habitualmente usadas en medicina humana para las vacunas, como por ejemplo las preparaciones inyectables en particular en forma de emulsión; éstas se preparan según los procedimientos habituales. El o los principios activos se pueden incorporar en la misma con unos excipientes usados habitualmente en estas composiciones farmacéuticas, tales como los vehículos acuosos, el fosfato de calcio, el alumbre, etc.
La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de una composición descrita anteriormente, caracterizado porque se mezcla, según unos procedimientos conocidos en sí, el o los principios activos con unos excipientes aceptables, en particular farmacéuticamente aceptables.
Por último, la invención tiene por objeto el uso de una citoquina o un fragmento de citoquina de fórmula
(I)Cy-(X-R)_{n}
en la que Cy representa una citoquina o un fragmento de citoquina, -(X-R) representa una función libre de un aminoácido que constituye la citoquina o el fragmento de citoquina, en la que X representa un grupo NH o un átomo de azufre, n representa un número entero comprendido entre 1 y 70, y R representa un grupo químico que conserva en dicha citoquina o en dicho fragmento unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o que bloquean dicha citoquina nativa y haciendo perder al mismo tiempo por lo menos 90% de las propiedades biológicas de dicha citoquina nativa, para la obtención de un medicamento destinado a luchar contra la sobreproducción de estas citoquinas nativas.
Además, la invención tiene por objeto un kit que comprende una composición farmacéutica vacunal que, además del principio activo (por ejemplo citoquina o fragmento de citoquina) puede comprender un adyuvante y/u otro inmunógeno con propiedades anti-sobreproducción de estas citoquinas nativas.
Las condiciones preferidas de realización de las citoquinas o fragmentos de citoquinas descritas anteriormente se aplican asimismo a los otros objetos de la invención previstos anteriormente.
Los ejemplos siguientes ilustran la presente solicitud.
Ejemplo 1 Tratamiento del IFN\gamma mediante maleimidación
Se pusieron 10 mg de IFN\gamma recombinante humano en disolución al 0,5 mg por ml en tampón fosfato 0,1 M pH 7. A esta disolución se ha añadido 1 mg de N-etilmaleimida. Después de 1 hora de reacción, se ha dializado la disolución contra PBS pH 7,2. El análisis del quinoide mediante gel de acrilamida muestra la misma banda a 17 KD comparada con el IFN\gamma nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Pérdida de la actividad biológica del IFN\gamma desactivado mediante maleimidación
Se ha ensayado a continuación el quinoide IFN\gamma para evaluar su actividad biológica. Existen varios ensayos biológicos de actividad del IFN\gamma. Unos ensayos de inducción de apoptosis, unos ensayos de inducción de antígenos de superficie tales como los MHC (complejo mayor de histocompatibilidad), pero también el ensayo de efecto antiviral sobre células MDBK.
El ensayo de medición de efecto antiviral tiene como objetivo evaluar la inhibición de la lisis de células MDBK en presencia de IFN\gamma. Este ensayo es muy sensible y permite medir unos picogramos de IFN\gamma.
Se hacen crecer unas células MDBK tripsinazas recientemente en medio RPMI, suero de ternera fetal al 5%, a la concentración de 30.000 células por pocillo. Después de por lo menos 6 horas, se lavan las células con RPMI, y después se añaden 50 ml de IFN\gamma diluido en RPMI en serie de diluciones a 1/2. Entonces, se incuba la placa a 37ºC 5% CO_{2} durante 18 a 24 horas.
Después de 18 a 24 horas, se recoge el sobrenadante de cada pocillo, se lavan las células, y se añaden 100 ml que contienen 100 DL50 (dosis letal 50%) de virus VSV diluido en RPMI. Se deja incubar así la placa durante 18 a 36 horas. El efecto lítico del virus se mide bajo microscopio y permite cuantificar (escala 1 a 4) a partir de qué dilución tiene lugar la lisis.
Para ensayar la actividad del quinoide comparado con el IFN\gamma nativo, se parte de disoluciones que contienen 100 ng/ml de estas moléculas. Se obtiene el siguiente resultado:
1
El quinoide ha perdido por lo tanto su actividad antiviral y es inactivo a un factor superior a 2^{8} en estas condiciones, lo que corresponde a una desactivación superior al 99%.
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Ejemplo 3 Inmunogenicidad del IFN\gamma maleimidado
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 1 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyecta a unos ratones, por vía intramuscular (im), 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40, y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Los sueros se han ensayado con una dilución 1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6), se indican en la siguiente tabla:
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2 
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 4 Tratamiento del TNF\alpha mediante carboxamidación
Se han tratado 3 mg de TNF\alpha disueltos en 2 ml de tampón Tris 0,3 M, guanidina 6 M EDTA 10 mM, DTT 1 mM, mediante 107 ml de una disolución de yodoacetamida 0,5 M bajo una barrera de nitrógeno durante 1h30 a 37ºC. Después de bloquear la reacción mediante la adición de 2,5 ml de \beta-mercaptoetanol, la mezcla de reacción se ha dializado sucesivamente contra urea 8 M, 4 M, 2 M y contra tampón fosfato (PBS).
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Ejemplo 5 Pérdida de la actividad biológica del TNF\alpha preparado mediante carboxamidación
Existen varios ensayos que miden la actividad citotóxica del TNF\alpha sobre las líneas celulares, ya sea la línea L929 de ratón o la línea WEHI164. El principio del ensayo sobre la línea WEHI164 es que el TNF\alpha inducirá una lisis celular medida por cristal violeta.
Se depositan 50.000 células en unos pocillos de placas de 96 pocillos Costar, en 100 ml de RPMI SVF 10%. Se deja reposar durante 4 horas a 37ºC. A estos pocillos, se añaden entonces en triple 100 ml de RPMI que contienen unas diluciones crecientes de TNF\alpha nativo o desactivado. Las diluciones se realizan de 5 en 5. Después de 24 h a 37ºC, se recoge el sobrenadante y se fijan las células en cada pocillo con 200 ml de metanol durante 30 s. Después de haber recogido el metanol se añade cristal violeta en disolución al 1% durante 10 min. Se lavan a continuación los pocillos con agua destilada, y después se deja secar la placa volcándola sobre papel absorbente. Después del secado, se mide el marcado a 620 nm en un lector de placas.
El porcentaje de lisis se calcula mediante la fórmula:
% = (DO_{max}-DO_{exp}) / (DO_{max}-DO_{min}) X 100
en la que max corresponde a la ausencia de lisis (control RPMI solo) y min corresponde a la lisis máxima (HCL o TNF\alpha nativo en exceso).
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Los resultados (% de lisis) obtenidos para el TNF\alpha nativo y el TNF\alpha desactivado según el ejemplo 4 son los siguientes:
3
Se observa que sean cuales sean las dosis de TNF\alpha desactivado, ya no existe efecto lítico sobre las células (ruido de fondo), mientras que el TNF\alpha nativo es activo hasta una dilución de un factor 10^{5} con relación a la dilución inicial.
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Ejemplo 6 Inmunogenicidad del TNF\alpha carboxamidado
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 4 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyecta a unos ratones, (im), 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución 1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6), se indican en la siguiente tabla:
4
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados mediante el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 7 Tratamiento de la IL4 mediante el reactivo de Ellman
Se ha tratado 1 mg de IL4 en tampón fosfato 0,1 M, pH 8,0 mediante 4 mg de DTNB durante 30 min a temperatura ambiente, al abrigo de la luz. Después, se ha dializado la mezcla contra PBS.
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Ejemplo 8 Pérdida de la actividad biológica de la IL4 tratada mediante el reactivo de Ellman
La IL4 tiene numerosos efectos sobre la activación-diferenciación de los linfocitos B con la inducción de expresión de marcadores de superficie tal como el MHC de clase II, CD40, CD23 que se pueden evaluar mediante citofluorometría. En el presente experimento, se mide la proliferación de células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) activadas mediante fitohemaglutinina (PHA) e IL2, en presencia de diferentes concentraciones de IL4.
Los PBMC se purifican sobre gradiente de Ficoll. Se ponen en frasco 5 millones de células en 5 ml de RPMI, SVF%, con adición de PHA 1/1000, y el cultivo continúa durante 48 horas a 37ºC 5% CO_{2}. Se añade entonces IL2 a la concentración de 20 Ul/ml, y después de 48 h se centrifugan las células, se lavan y se concentran a 20.000 células por pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en presencia de RPMI, suero de ternera fetal (SVF) 5%, PHA 1/1000. A estos pocillos se añaden diferentes cantidades de IL4 diluida en RPMI. Se incuban entonces las placas durante 40 horas, después se añade la timidina tritiada, y después de 6 horas, se mide la proliferación celular evaluando la incorporación de timidina marcada en un contador \beta.
Los resultados de proliferación (cpm) obtenidos en presencia de IL4 nativa o desactivada según el ejemplo 7 son los siguientes:
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Se observa que la desactivación es eficaz incluso después de una dilución de un factor 1000, lo que demuestra una desactivación biológica de más de 99,9%.
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Ejemplo 9 Inmunogenicidad de la IL4 desactivada mediante el reactivo de Ellman
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 7 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente. Se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros a una dilución 1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
6
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 10 Tratamiento de la IL6 mediante amidinación
Se añaden a 4 ml de una disolución de IL6 a 1 mg/ml en tampón borato 0,1 M, pH 8,5 enfriada en un baño de hielo, bajo agitación, 40 ml de una disolución de etilacetimidato a 12,5 mg/ml en NaOH 5 N. La mezcla se agita durante 30 a 60 min, en el baño de hielo manteniendo al mismo tiempo el pH a 8,5 mediante adición de NaOH 0,1 N, después de lo cual la mezcla se dializa contra PBS.
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Ejemplo 11 Pérdida de la actividad biológica de IL6 tratada mediante amidinación
El ensayo de medición de la actividad de la IL6 se basa en la medición de la proliferación de una línea celular dependiente de IL6 para su crecimiento. Se cultivan unas células 7TD1 en el medio de cultivo siguiente: medio de Eagle modificado según Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal, 1,5 mM de glutamina, 0,24 mM de asparagina, 0,55 mM de arginina, 50 mM de \beta-mercaptoetanol, 0,1 mM de hipoxantina y 16 mM de timidina. Estas células se cultivan normalmente en presencia de IL6 nativa a la concentración de 200 U/ml, es decir, del orden de 1 ng/ml de IL6.
Se lavan las células 2 veces en medio DMEM solo y se resuspenden en el medio de cultivo a la concentración de 20.000 células por ml. Se añaden 100 ml de estas células con unas series diluidas de IL6 (en el mismo volumen de 100 ml) o de muestra a ensayar.
Después de la incubación durante 3-4 días a 37ºC y 8% de CO_{2}, el número de células vivas se evalúa mediante colorimetría midiendo el nivel de hexosaminidasa (Landegren et al., J Immunol Méthods, 67, 379, 1984): para ello, se centrifugan las microplacas, se lavan las células dos veces en PBS para retirar el suero, se añade el sustrato colorante (1 volumen de p-nitrofenil-N-acetil-b-D-glucosaminida 7,5 mM 0,1 M de citrato de sodio pH 5, 1 volumen de Triton X100 al 0,5%) a 60 ml por pocillo. Después de la incubación durante 4 horas a 37ºC, se añade el revelador (0,1 M de glicina-NaOH, pH 10,4). El color se lee bajo absorbancia 405 nm con un control blanco a 620 nm.
Una unidad de IL6 corresponde a 50% de la proliferación máxima obtenida según el siguiente cálculo:
prolif max 50 = prolif de control + 1/2 (prolif max-prolif de control)
En el caso de las preparaciones del ejemplo 10, se han ensayado cada vez 5 ng de preparación en 100 ml y se han realizado las diluciones de 3 en 3. Las diluciones que proporcionan una unidad se indican en la siguiente tabla:
7
Estos resultados muestran la desaparición de la actividad biológica IL6 a más del 99,8% en el quinoide IL6 desactivado por amidinación comparado con la IL6 nativa.
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Ejemplo 12 Inmunogenicidad de la IL6 desactivada por aminidación
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 10 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución 1/500.
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Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
8
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 13 Tratamiento de la IL10 mediante alquilación reductiva
Se han adicionado 3 ml de IL10 a la concentración de 1 mg/ml en tampón borato 0,2 M de pH 9 bajo agitación con 1,5 mg de borohidruro de sodio en polvo. Se ha añadido a esta disolución una disolución de formaldehído al 37% en 5 porciones sucesivas de 15 ml en un periodo de 30 min. Se ha dializado la mezcla de reacción al final de este periodo contra PBS.
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Ejemplo 14 Pérdida de la actividad biológica de la IL10 desactivada mediante alquilación reductiva
La IL10 tiene una acción proliferativa sobre las células de la línea mastocitaria de ratones MC/9. Se cultivan unas células MC/9 en RPMI, 10% SVF, 2 mM de L-glutamina, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U/ml de GM-CSF a la concentración inicial de 2.10^{5}/ml. Después de 2 días las células se lavan y se resuspenden a 2.10^{5}/ml en RPMI, 10% SVF.
Se ponen 100 ml de células en unos pocillos de microplacas de cultivo de 96 pocillos. A estos pocillos, se añaden 100 ml de IL10 nativa o desactivada según el ejemplo 13 con unas diluciones diferentes. Las células se cultivan durante 40 horas, y después se añade la timidina tritiada, y después de 8 horas, se capta el ADN celular sobre filtro (MASH, Coulter) y se evalúa la proliferación celular en un contador \beta.
Los resultados de proliferación (cpm) obtenidos son los siguientes, en función de la cantidad de IL10 vertida por pocillo:
9
Estos resultados muestran bien que el quinoide IL10 ha sido efectivamente desactivado mediante la alquilación reductiva.
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Ejemplo 15 Inmunogenicidad de la IL10 desactivada mediante alquilación reductiva
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 13 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución 1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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10 
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 16 Desactivación del IFN\gamma mediante un anhídrido
Se ha adicionado el IFN\gamma en tampón fosfato 0,1 M, pH 8,1 a la concentración de 1 mg por ml, enfriado en un baño de hielo de una disolución de anhídrido maleico 1 M en dioxano redestilado. La adición se efectúa bajo agitación mediante pequeñas fracciones con intervalos de 5 min, manteniendo al mismo tiempo el pH a 8,0 mediante la adición de NaOH 0,05 N durante todo el tiempo de reacción. Se ha detenido la reacción después de haber continuado la agitación durante todavía 30 min mediante diálisis contra PBS.
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Ejemplo 17 Inmunogenicidad del IFN\gamma desactivado por un anhídrido
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 16 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución
1/500.
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Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 18 Tratamiento de la IL13 mediante p-hidroxifenilglioxal
Se ha adicionado a una disolución de IL13 de 1 mg/ml en PBS, bajo agitación, 100 ml de una disolución de hidroxifenilglioxal a 20 mg/ml en el mismo tampón por ml de disolución de IFN\gamma. La reacción ha continuado durante 1 hora a la temperatura de 37ºC y se ha dializado la mezcla de reacción contra PBS.
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Ejemplo 19 Pérdida de la actividad biológica de la IL13 tratada mediante p-hidroxifenilglioxal
La IL13 tiene una actividad proliferativa sobre la línea humana eritroleucémica TF-1. Tal como en los experimentos anteriores, las células TF-1 se cultivan en RPMI, 5% de SVF, y después se reparten sobre unas microplacas a 10^{4} células por pocillo en 100 ml. A estos pocillos se añaden unas diluciones crecientes de IL13 nativa o desactivada según el ejemplo 18. Después de 40 horas, se añade la timidina tritiada. Después de 8 horas, se recoge el ADN de las células sobre filtro (MASH, Coulter) y se mide a continuación la radioactividad con contador \beta.
Los resultados de proliferación (en cpm) obtenidos con la IL13 son los siguientes:
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Se observa que la desactivación ha sido eficaz puesto que la IL13 nativa diluida 10^{4} veces (10 pg) es más activa que el quinoide con la misma concentración inicial no diluida (100 ng).
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Ejemplo 20 Inmunogenicidad de la IL13 desactivada mediante p-hidroxifenilglioxal
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 18 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución
1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 21 Desactivación de la IL4 mediante alquilación reductiva
Se ha añadido bajo agitación a una disolución de IL4 a la concentración de 1 mg/ml (5 ml) en tampón borato 0,2 M de pH 9, 1 mg de borohidruro de sodio y enseguida después 50 ml de disolución de formaldehído al 37% en 5 fracciones sucesivas a intervalos de 5 min. Después de la última adición del aldehído, se ha agitado la mezcla durante todavía 15 min antes de ser dializada contra PBS.
Se ha realizado el mismo ensayo que el descrito en el ejemplo 8 para medir la desactivación del quinoide IL4 mediante alquilación reductiva. El resultado obtenido fue similar al del ejemplo 8 puesto que las células estimuladas por IL4 nativa proliferaban y no las células estimuladas por el quinoide.
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Ejemplo 22 Inmunogenicidad de la IL4 desactivada mediante alquilación reductiva
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 21 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución
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Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
Ejemplo 23 Desactivación del TNF\alpha mediante el etilacetimidato
Se han añadido a 2 ml de una disolución de IFN\alpha a 1 mg/ml en tampón borato 0,1 M, pH 8,5 enfriada en un baño de hielo, bajo agitación, 50 ml de una disolución de etilacetimidato, HCl a 12,5 mg/ml en NaOH 5 N. Se ha seguido la reacción durante 1 h a 0ºC, bajo agitación, manteniendo al mismo tiempo el pH a 8,5 mediante la adición de NaOH diluida. Se detuvo la reacción mediante diálisis contra PBS.
La desactivación del TNF\alpha obtenido se ha evaluado según el mismo ensayo que el descrito en el ejemplo 5. Los resultados han sido similares y ya no había lisis de las células en presencia del quinoide.
Ejemplo 24 Inmunogenicidad del TNF\alpha desactivado mediante el etilacetimidato
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 23 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución 1/500.
Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 25 Tratamiento de la IL1 mediante carboximetilación
Se han disuelto 2 mg de IL1 en 2 ml de tampón Tris 0,3 M, pH 8 que contiene guanidina 6 M y ditiotreitol (DTT) 10 mM desaireados previamente mediante purga con nitrógeno. A esta disolución se han añadido 40 ml de una disolución de ácido yodoacético 0,5 M desaireado, y se ha incubado la mezcla de reacción durante 90 min a 37ºC bajo una barrera de nitrógeno. Entonces, se ha bloqueado la reacción mediante adición de 10 ml de una disolución 1:10 de \beta-mercaptoetanol. Se ha prolongado la incubación durante 1 hora más y se ha dializado la mezcla de reacción sucesivamente contra urea 8 M, 4 M, 2 M y por último contra PBS.
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Ejemplo 26 Pérdida de la actividad biológica de la IL1 tratada mediante carboximetilación
La actividad biológica de IL1 (IL1\alpha o IL1\beta) se puede demostrar usando las células de la línea de ratones NOB que se inducen para producir IL2 en presencia de IL1. Se cultivan las células en RPMI, 5% SVF. En fase de crecimiento, se lavan (centrifugación-lavado) y se resuspenden a la concentración de 10^{5} células/ml. Entonces, las células se alicuotan sobre unas microplacas a 100 ml por pocillo, y se les añaden 100 ml de IL1 nativa o tratada según el ejemplo 25 con diluciones crecientes. Entonces, se incuban las placas a 37ºC durante 36 horas y se mide la producción de IL2 en el sobrenadante mediante ELISA (Quantikine, R&D Diagnostics).
Los resultados obtenidos (en densidad óptica) para la IL1 y el quinoide del ejemplo 25 son los siguientes:
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Se observa por lo tanto que el quinoide ha perdido su actividad con relación a la IL1 nativa en más de un factor 1000.
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Ejemplo 27 Inmunogenicidad de la IL1 carboximetilada
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 25 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución
1/500.
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Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
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Ejemplo 28 Desactivación del IFN\alpha mediante maleimidación
Se han añadido bajo agitación a 1,7 ml de una disolución de IFN\alpha a 1 mg/ml en un tampón Tris 30 mM, EDTA 1 mM, de pH 7,8, 50 ml de una disolución de ácido \beta-maleimidapropiónico a 2 mg/ml en el mismo tampón. Después de la reacción, durante 15 min a temperatura del laboratorio, la mezcla de reacción ha sido dializada contra
PBS.
El grado de desactivación del IFN\alpha maleimidado ha sido evaluado mediante el ensayo de inhibición de la lisis de las células MDBK mediante el virus VSV (el mismo ensayo que para el IFN\gamma en el ejemplo 2). La actividad biológica del quinoide se inhibía a más del 99,9% comparado con el IFN\alpha nativo.
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Ejemplo 29 Inmunogenicidad del IFN\alpha maleimidado
Se han usado unos quinoides preparados según el ejemplo 28 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el usado habitualmente: se inyectan a unos ratones (im) 100 ml de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 mg de producto el día 0, con recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 mg los días 21 y 35. El suero de los ratones se extrae los días -2 y 40 y se analiza mediante ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína nativa (no tratada químicamente) y con quinoide. Se han ensayado los sueros con una dilución
1/500.
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Los resultados, expresados en densidad óptica, obtenidos sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se indican en la siguiente tabla:
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Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el quinoide producen unos anticuerpos capaces de reconocer de la misma manera la proteína nativa y el quinoide. Por otro lado, esto confirma la inocuidad de la inmunización por los quinoides puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.

Claims (7)

1. Derivado de citoquina o de un fragmento de citoquina de fórmula
Cy-(X-R)_{n}
en la que Cy representa una citoquina o un fragmento de citoquina, -(X-R) representa una función libre de un aminoácido que constituye la citoquina o el fragmento de citoquina, en la que X representa un grupo NH o un átomo de azufre, n representa un número entero comprendido entre 1 y 70, y R representa un grupo químico que conserva en dicho derivado de citoquina o en dicho fragmento unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o que bloquean dicha citoquina nativa y haciendo al mismo tiempo perder por lo menos 90% de las propiedades biológicas de dicha citoquina nativa, caracterizado porque:
(i)
R es un grupo carboxamida, N-alquilmaleimida, tionitrobenzoico o un radical formado por la reacción de una función tiol con el 4-cloro-7-sulfobenzofurazano de amonio, la N-[yodoetil]-trifluoroacetamida o la N-(6-[7-amino-4-metilcumarino-3-acetamido]hexil)-3'-(2'-piridilditio)propionamida, o
(ii)
R es un radical formado por la reacción de una función amino con el etilacetimidato, un anhídrido, el 2-iminotiolano-HCl, el N-succinimidilo S-acetiltioacetato, el sulfosuccinimidil-acetato, el sulfosuccinimidil-4-O-[4,4'-dimetoxitritil]butirato, el succinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato o el sulfosuccinimidil-7-amino-4-metilcumarino-3-acetato, o el fenilglioxalo.
2. Derivado de citoquina o un fragmento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha citoquina o dicho fragmento es o procede de IFN\gamma, TNF\alpha, IL1, IL4, IL6, IL10, IL13, de las interleuquinas -IL1, IL2, IL3, de los Transforming Growth Factors \alpha y \beta, de los interferones \alpha, \beta, \tau (tau), de los Tumor Necrosis Factors -\alpha y \beta, y de las quimioquinas.
3. Procedimiento de preparación de una citoquina o de un fragmento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se somete a dicha citoquina o a dicho fragmento a la acción de un agente reactivo capaz de injertar un grupo R sobre dicha citoquina o sobre dicho fragmento, para obtener el compuesto esperado que se aísla.
4. Derivado de citoquina o fragmento según la reivindicación 1 ó 2, para su uso en un procedimiento de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal.
5. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene a título de principio activo por lo menos una de las citoquinas o de los fragmentos según la reivindicación 1 ó 2, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. Vacuna, caracterizada porque contiene a título de principio activo por lo menos una de las citoquinas o de los fragmentos según una de las reivindicaciones 1 ó 2.
7. Uso de una citoquina o de un fragmento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, para la obtención de un medicamento destinado a luchar contra la sobreproducción de dicha citoquina nativa.
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