ES2336417T3 - Proteinas del estres de patogenos extracelulares como vacunas contra agentes infecciosos. - Google Patents

Abstract

Método para producir una composición de vacuna que comprende un determinante inmunogénico, que comprende las etapas de: - exponer a organismos patógenos fúngicos, protozoarios o procariotas a estímulos inductores de estrés suficientes para inducir la producción de complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos; - extraer los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos de los organismos tratados; y - utilizar los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico extraídos como determinante inmunogénico en la preparación de la composición de vacuna.

Description

Proteínas del estrés de patógenos extracelulares como vacunas contra agentes infecciosos.

La presente invención se refiere a una vacuna y un método para producir una vacuna, en particular a un método para producir una composición de vacuna que contenga proteínas inducidas por estrés de organismos patógenos extracelulares.

Antecedentes de la invención

Un componente importante de cualquier respuesta inmune humana es la presentación de los antígenos a las células T por las células presentadoras de antígenos (APCs), como los macrófagos, las células B o las células dendríticas. Los fragmentos de péptidos de los antígenos foráneos son presentado sobre la superficie de los macrófagos en combinación con moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), en asociación con moléculas helper, como las moléculas CD4 y CD8. Tales fragmentos de péptidos antigénicos presentados de esta manera son reconocidos por el receptor de las células T de las células T y la interacción de los fragmentos de péptidos antigénicos con el receptor de las células T resulta en una proliferación de las células T específicas de antígeno y la secreción de linfocinas por las células T. La naturaleza del fragmento de péptido antigénico presentado por las APCs resulta crítico en el establecimiento de la inmunidad.

Las proteínas de choque térmico (HSPs) forman una familia de proteínas altamente conservadas que se encuentran ampliamente distribuidas por los reinos animal y vegetal. En base a sus pesos moleculares, las HSPs se agrupan en seis familias diferentes: pequeñas (hsp 20-30 kDa); hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; y hsp100. Aunque las HSPs se identificaron originalmente en células sometidas a estrés térmico, se ha descubierto que se asocian con muchas otras formas de estrés como las infecciones, y son por lo tanto conocidas más comúnmente como proteínas del estrés (SPs). Por motivos prácticos, se utilizarán las iniciales SP para indicar en general las proteínas inducidas a partir de células sometidas a cualquier forma de estrés y las iniciales HSP se utilizarán para indicar aquellas específicamente inducidas por estrés térmico.

Los miembros de la familia hsp90 de los mamíferos incluyen la hsp90 (hsp83) citosólica y las homólogas del retículo endoplasmático hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94 (Erp99) y gp97, véase por ejemplo, Gething et al., (1.992) Nature 355:33-45. Los miembros de la familia hsp70 incluyen la hsp70 (p72) y la hsp70 (p73) citosólica, la homóloga del retículo endoplasmático BiP (Grp78), y la homóloga mitocondrial hsp70 (Grp75). Los miembros de la familia hsp60 de los mamíferos sólo se han identificado en la mitocondria. La última familia de HSPs también se encuentra en procariotas que sólo contienen otras tres familias principales de HSPs, las familias GroEL, GroES, DnaJ y DnaK. Al igual que en los eucariotas, se piensa que las HSPs procarióticas también funcionan en el plegamiento de las cadenas polipeptídicas nacientes durante la síntesis de proteínas.

En las células eucariotas que tienen organelos membranosos intracelulares, una de las funciones de las HSPs es de acompañar los fragmentos antigénicos desde un compartimiento celular a otro y presentar los fragmentos de péptidos a las moléculas MHC para su presentación sobre la superficie celular al sistema inmune. En el caso de células enfermas, las HSPs también acompañan a fragmentos de péptidos asociados a un tumor o virales hasta la superficie celular, Li and Sirivastave (1.994) Behring Inst. Mitt, 94:37-47 y Suzue et al., (1.997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13146-51. La función de acompañamiento se lleva a cabo a través de la formación de complejos entre las HSPs y los fragmentos de péptidos antigénicos y entre las HSPs y los fragmentos de péptidos asociados al tumor o virales en una reacción dependiente del ATP. Las HSPs forman complejos o se unen con un amplio espectro de fragmentos de péptidos de una manera dependiente del ATP. Parece que los péptidos unidos son una mezcla aleatoria de fragmentos de péptidos. No se han determinado las mezclas y las naturalezas exactas de los fragmentos de péptidos. Se ha observado la asociación de las HSPs con diversos fragmentos de péptidos también en tejidos normales y no es un fenómeno específico de tumor, véase Srivastava (1.994) Experimentia 50: 1054-60.

En un contexto terapéutico, se ha propuesto utilizar las HSPs de mamíferos como vacunas. WO 97/10000 y WO 97/10001 describen que una mezcla de HSPs aislada de células cancerígenas o células infectadas por un virus son capaces de conseguir una inmunidad protectora o linfocitos T citotóxicos hacia el tumor análogo ó antígeno viral. Sin embargo, en contraposición, las HSPs aisladas de células normales son incapaces de conseguir tal inmunidad. En la actualidad se piensa que las HSPs no son inmunogénicas per se, pero pueden conseguir inmunidad debido a su asociación con los fragmentos de péptidos antigénicos específicos del virus o tumor que se generan durante el procesamiento de los antígenos. Concretamente, los fragmentos de péptidos asociados con las HSPs son inmunogénicos y son presentados a las células T. Las HSPs desprendidas de los fragmentos de péptidos asociados pierden su inmunogenicidad, véase Udono, H. and Srivastava, P. K., Journal of Experimental Medicine, 178, página 1391 ff, 1.993. Hasta la fecha, no se ha determinado la naturaleza de estos fragmentos de péptidos.

Actualmente se cree que la antigenicidad de las SPs no es el resultado de las SP per se, sino del complejo de fragmentos de péptidos asociados con la SP. Esta conclusión se basa en una serie de características de los complejos. No existen diferencias en la estructura de las SPs derivadas de las células normales y tumorales. Determinados complejos pierden su inmunogenicidad tras el tratamiento con ATP, Udono et al., (1.993) J. Exp. Med. 178:1391-96. Tal pérdida de la inmunogenicidad es debida a la disociación del complejo en sus componentes SP y fragmento del péptido. La inmunogenicidad de las preparaciones de SP depende de la presencia de células fagocíticas, como los macrófagos y otras APCs. En la actualidad se piensa que las SPs son captadas por los macrófagos. A continuación, aquellos fragmentos de péptidos asociados con las SPs son presentados por las moléculas MHC tipo I del macrófago. De esta manera, se inicia la respuesta de las células T.

En WO 95/24923El se ha descrito el uso de complejos HSP de mamíferos de células infectadas como vacunas contra patógenos intracelulares. Se han propuesto las HSPs aisladas de células infectadas por virus como fuente de péptidos antigénicos, que podrían ser presentadas a continuación a las células T. Esto necesita la producción y purificación de las HSPs de tales células. El uso de proteínas HSP como componentes de vacunas se ha descrito adicionalmente en WO 97/10000, WO 97/10001 y WO 97/100002. Estos describen que una mezcla de HSPs aislada de células cancerosas o de células infectadas por virus pueden conseguir una inmunidad protectora o linfocitos T citotóxicos hacia el tumor análogo ó antígeno viral. Además WO 98/34641 describe que inesperadamente se requieren pequeñas cantidades de HSPs para inmunizar a los animales contra antígenos virales o tumores.

Todos estos métodos de vacunas HSP utilizan HSPs de mamíferos de las especies a inmunizar para la vacunación de las especies de animales deseadas.

Las propias HSPs de patógenos extracelulares también se han utilizado para inmunizar especies de mamíferos como antígenos per se pero no como portadores de fragmentos de péptidos antigénicos excepto como conjugados o proteínas de fusión híbridas. De esta manera WO 95/14093 describe que el uso de HspA y B de Helicobacter pylori como inmunógenos provoca una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esta respuesta resulta efectiva contra el organismo. De manera similar, WO 96/40928 describe que el uso de HSP 70 y 72 de Streptococcus provoca una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esta respuesta resulta efectiva contra el organismo. Además WO 90/02564 describe que el uso de HSPs de tripanosomales, micoplasmales o micobacteriales, y especialmente la HSP70, como inmunógenos provocan una buena respuesta de anticuerpos contra estas proteínas y que esto debería resultar efectivo contra los organismos respectivos. De manera alternativa US 5830475 utiliza las proteínas expresadas como fusiones de los genes HSP de M. bovis como antígenos y US 5736164 utiliza el epítopo de células T de hsp65 conjugado con antígenos pobremente inmunogénicos.

Sin embargo, los complejos SP endógenos de las especies patógenas protozoarias y procariotas extracelulares, y más especialmente los complejos HSP de estos organismos tratados por choque térmico u otros estreses, no se han utilizado como vacunas para inmunizar animales, en particular vertebrados como los mamíferos, aves o peces contra estos patógenos de enfermedades infecciosas.

Resumen de la invención

Por lo tanto, desde un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una vacuna que contiene un determinante inmunogénico, que comprende las etapas de:

a)

exponer a los organismos patógenos fúngicos, protozoarios o procariotas a estímulos inductores de estrés, como el calor, que inducirá la producción de complejos SP/fragmento de péptidos antigénicos;

b)

extraer los complejos SP/fragmento de péptidos antigénicos endógenos, de los organismos tratados; y

c)

utilizar los complejos proteína del estrés/fragmento de péptidos antigénicos extraídos como determinante inmunogénico en la preparación de la composición de la vacuna.

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Resulta sorprendente que el tratamiento de los organismos patógenos fúngicos, protozoarios o procariotas con estímulos que inducen estrés produzca complejos SP más inmunogénicos que las propias SPs o que las SPs derivadas de organismos no inducidos. Una propiedad particular de las vacunas de la invención son los títulos de anticuerpos neutralizantes excepcionalmente altos y la memoria a largo plazo obtenida en comparación con la inducida mediante inmunización por las propias SPs.

El término "vacuna" se utiliza en la presente memoria para indicar cualquier composición que simule el sistema inmune de manera que éste pueda responder mejor a infecciones posteriores. Debe entenderse que una vacuna suele contener un determinante inmunogénico (los complejos SP inducidos por estrés) y un adyuvante, que mejora de manera no específica la respuesta a ese determinante.

La expresión "organismo patógeno extracelular" se utiliza en la presente memoria para indicar cualquier patógeno extracelular que cause una enfermedad en un vertebrado, lo que incluye las especies bacterianas, procariotas, protozoarias y fúngicas. Ejemplos específicos de patógenos extracelulares a los que puede aplicarse el método de la invención incluyen bacterias como Mycobacteria sp., en especial M. bovis y M. tuberculosis, Helicobacter sp., Streptococcus sp., Trypanosoma sp., Mycoplasma sp., y patógenos procariotas como Escherichia sp., en especial E. coli, y Salmonella sp., en especial S. typhimurium.

El patógeno extracelular puede ser uno en el que la aplicación de un estrés externo induce la síntesis de proteínas del estrés. Sin embargo, está dentro del alcance de la presente invención utilizar organismos patógenos, por ejemplo bacterias, que hayan sido modificados, por ejemplo mediante ingeniería genética, para producir un organismo en el que la inducción o mejora de la inducción de la síntesis de las proteínas del estrés se de constitutivamente sin la necesidad de aplicar estreses externos.

También se describe en la presente memoria un método para provocar una respuesta inmune de un animal a la infección por un organismo patógeno intracelular que comprende administrar una vacuna que contenga un determinante inmunogénico, caracterizada porque el determinante inmunogénico es un complejo SP/fragmento de péptidos antigénicos producido in situ a partir del patógeno intracelular cuya síntesis se induce mediante estímulos externos o mediante una modificación genética del patógeno para hacer que su síntesis sea constitutiva.

También se describe en la presente memoria un organismo patógeno intracelular al que se ha modificado su estructura genética para eliminar o inhibir la parte de su estructura genética que restringe o inhibe la síntesis de las proteínas del estrés por ese organismo.

Las expresiones "proteínas del estrés" y "proteína de choque térmico", como se utilizan en la presente memoria, son estándares en la técnica e incluyen aquellas proteínas que comprenden las familias GroEL, GroES y DnaK y DnaJ de las HSPs bacterianas y las familias relacionadas en otros patógenos extracelulares. Estas familias se nombran en base al tamaño de los péptidos que codifican. Las familias están altamente conservadas entre las especies. Además, muchas bacterias también expresan homólogos de proteínas eucariotas. Preferentemente la vacuna contiene una pluralidad de complejos SP/fragmento de péptidos antigénicos derivados del patógeno estresado. Los investigadores prefieren que se utilicen las familias de proteínas GroEL, GroES, DnaK y DnaJ como determinantes inmunogénicos en la presente invención, siendo más preferibles las DnaJ y GroEL.

Los estímulos de estrés a los que se expone el patógeno extracelular pueden aplicarse mediante cualquier técnica in vitro adecuada utilizada en la técnica de la inmunobiología, por ejemplo el cultivo bajo niveles de nutrientes limitados, o choque osmótico de un patógeno una vez que ha sido cultivado hasta el crecimiento estacionario mediante la adición al medio de cultivo de concentraciones altas de un electrolito como NaCl. Preferimos aplicar el estrés mediante un tratamiento térmico del patógeno a una temperatura 5-8ºC por encima de la temperatura de crecimiento normal del organismo. Por lo general, el patógeno se cultivará bajo condiciones de crecimiento convencionales hasta el estado estacionario. A continuación pueden recogerse muestras del cultivo del patógeno activo y cultivarse nuevamente pero la temperatura de cultivo se aumenta durante la segunda fase de cultivo a la temperatura elevada requerida para inducir la producción de las SPs. Sin limitarse a la teoría, se piensa que el tratamiento del patógeno funciona bien para inducir específicamente aquellas HSPs más capaces de interactuar con los péptidos antigénicos, o inducir aquellas HSPs que son más fácilmente fagocitadas por las APCs, o ambos. Las condiciones óptimas para inducir las SPs pueden determinarse fácilmente mediante simple ensayo y error y evaluarse el efecto de un cambio de estímulos utilizando técnicas convencionales, como ensayo in vivo o en animales o mediante otras técnicas, por ejemplo las descritas en "Current Protocols in Immunology", Wiley Interscience, 1.997.

La extracción y purificación de los materiales de proteínas inducidos a partir de los patógenos extracelulares mediante el estrés aplicado, en especial los complejos SP/fragmento de péptidos antigénicos, del material patógeno extracelular restante puede obtenerse utilizando cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, puede alterarse el organismo tratado mediante homogeneización o fragmentación ultrasónica, seguido de centrifugación para obtener una preparación de SP cruda en el sobrenadante. Las preparaciones de SP endógena crudas pueden utilizarse directamente como la vacuna de la invención. Opcionalmente, las preparaciones de SP pueden purificarse adicionalmente mediante el uso de columnas de unión del ADP u otros métodos adecuados fácilmente disponibles para la persona experta en la materia, véase por ejemplo los descritos en WO 97/10000 y WO 97/10001.

Debe entenderse que los complejos SP/fragmento de péptidos antigénicos inmunogénicos específicos pueden aislarse a partir de la mezcla de complejos producidos estresando los organismos patógenos extracelulares para producir una vacuna específica para el patógeno. Sin embargo, esto no será necesario habitualmente y puede utilizarse la mezcla de complejos para inducir una inmunización de amplio espectro. Si se desea, los fragmentos de péptidos antigénicos específicos pueden recuperarse del complejo, por ejemplo mediante tratamiento con ATP utilizando técnicas convencionales.

El complejo SP/fragmento de péptidos antigénicos de la vacuna de la presente invención puede suministrase en combinación con un adyuvante y en un portador acuoso. Los adyuvantes adecuados se pondrán fácilmente de manifiesto para la persona experta en la materia, como el adyuvante completo de Freund, el adyuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs o escualeno. Sin embargo, las composiciones de la vacuna de la presente invención también pueden resultar efectivas sin un adyuvante.

La invención también proporciona un método para tratar un animal con una vacuna de la invención administrando una cantidad farmacéuticamente aceptable de la vacuna de la invención, opcionalmente en combinación con un adyuvante, suficiente para provocar una respuesta inmune en el animal. El animal es por lo general un ser humano. Sin embargo, la invención puede aplicarse también al tratamiento de otros mamíferos, como caballos, ganado, cabras, ovejas o cerdos, y para el tratamiento de aves, en particular aves de corral como gallinas y pavos.

Las composiciones de vacuna pueden administrarse por cualquier medio adecuado, como oralmente, por inhalación, transdérmicamente o por inyección y en cualquier medio portador adecuado. Sin embargo, es preferible administrar la vacuna como composición acuosa por inyección utilizando cualquier aguja adecuada o técnica sin aguja.

Las vacunas pueden contener cualquier concentración adecuada del complejo SP/fragmento de péptidos antigénicos. Preferimos que el complejo SP se administre en el intervalo de 10-600 \mug, preferentemente 10-100 \mug, más preferentemente 25 \mug, por Kg. de peso corporal del animal tratado. Debe entenderse que la vacuna puede aplicarse como tratamiento inicial seguido de uno o más tratamientos posteriores en una tasa de dosificación igual o diferente en un intervalo de 1 a 26 semanas entre cada tratamiento para proporcionar una inmunización prolongada contra el patógeno.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no para limitar la invención.

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Ejemplo 1 Preparación de HSPs inducidas térmicamente

Se cultivaron células del patógeno extracelular Mycobacterium bovis (BCG) hasta la fase estacionaria utilizando un medio de cultivo convencional a 37ºC y se chocaron térmicamente a 42ºC durante 0,5 hr. ó a 39ºC durante 5 hr. y se cultivaron toda la noche para inducir la formación de un producto que contenía proteína de choque térmico y fragmentos de péptido antigénico. A continuación se lavan las células del patógeno en tampón fosfato salino (PBS) y se resuspenden en un tampón de homogeneización, en particular un tampón hipotónico como 10 mM de fosfato a pH 7,4 con 2 mM de MgCl_{2}. A continuación se alteran las células utilizando cualquier técnica adecuada: por ejemplo utilizando un homogeneizador de células como una prensa francesa, Ultraturrax o Waring blender; mediante lisis utilizando detergentes como Tween o Triton; lisis complementaria a 37ºC; o mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación, p.ej., en nitrógeno líquido. A continuación se trata el lisado de células por centrifugación, por lo general a 3-5.000 g. durante 5 minutos, para eliminar los residuos celulares y nucleares, seguido de una etapa de centrifugación a alta velocidad, por lo general 100.000 g. durante 15-30 minutos.

El sobrenadante obtenido de esta manera contiene, entre otros, la proteína de choque térmico y los fragmentos de péptido antigénico inducidos por tratamiento de choque térmico de las células del patógeno. Esto puede utilizarse directamente para formar el componente activo de la composición de vacuna de la invención. El sobrenadante puede concentrarse utilizando cualquier técnica adecuada para producir la composición de vacuna. De manera alternativa, el sobrenadante puede procesarse adicionalmente mediante precipitación con sulfato de amonio que utiliza un corte de sulfato de amonio al 20-70%. Concretamente, se añade un 20% (p/p) de sulfato de amonio a 4ºC, se descarta el precipitado, seguido de la adición de más sulfato de amonio para llevar la concentración al 70% p/p. El precipitado de proteínas se cosecha por centrifugación y a continuación se dializa en un tampón inyectable fisiológicamente apropiado, como salino, para eliminar el sulfato de amonio antes de su uso. Debe entenderse que las HSPs aisladas de esta manera no se purifican a homogeneidad, pero sin embargo resultan adecuadas para su uso como componente de vacuna.

Si se requiere una preparación de HSP más purificada, a continuación pueden purificarse las HSPs a partir del sobrenadante por cromatografía de afinidad en matrices que llevan adenosina difosfato, como la ADP-agarosa o la ADP-sefarosa, por ejemplo como se describe en WO 97/10000, WO 97/10001 y WO 97/10002.

Para determinar la inmunogenicidad de los complejos proteína del estrés/fragmento de péptidos antigénicos producidos como se ha descrito anteriormente, se pueden utilizar ensayos de proliferación de células T. Ensayos adecuados incluyen la reacción linfocitaria mixta (MLR), sometida a ensayo mediante la incorporación de timidina tritiada; y ensayos de citotoxicidad para determinar la liberación d e ^{15}Cr de las células diana. Ambos ensayos son estándares en la técnica, véase "Current Protocols in Immunology", Wiley Interscience, 1.997. De manera alternativa, se puede examinar la producción de anticuerpos, utilizando inmunoensayos estándares o ensayos de placas de lisis, o evaluar mediante la protección intrauterina de un feto, véase "Current Protocols in Immunology".

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Ejemplo 2 Inmunización con HSPs inducidas; inmunidad en el receptor de la vacuna

Se prepararon composiciones de vacuna que contenían complejos HSP según se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se vacunaron ratones y conejos mediante inyección de 1-10 microgramos del complejo de proteína del estrés en tampón fosfato salino. Esta inmunización inicial se potenció con dosis idénticas de la vacuna un mes después de la inyección primaria. Se sometió a ensayo la inducción de la inmunidad al patógeno mediante transferencia Western utilizando proteínas totales de M. bovis. Se obtuvieron los títulos de anticuerpos de 1:1-10.000 de manera rutinaria y también pudo detectarse la actividad de las células T citotóxicas dirigida contra las células infectadas por el patógeno en los ratones inmunizados. La confrontación de los ratones con M. bovis fija a períodos de 6, 12 y 18 meses tras las inmunizaciones iniciales resultó en la producción de unas respuestas de los anticuerpos buenas con títulos de 1:1-10.000 lo que indicaba unas respuestas de memoria buenas en los animales inmunizados.

Ejemplo 3 Comparación de los péptidos asociados en los complejos HSP inducidos y constitutivos

Se cultivó Mycobacterium tuberculosis hasta la saturación durante 3 días a 37ºC en medio de Sauton. Se utilizaron alícuotas de 4 ml de los cultivos estacionarios para inocular 500 ml de medio de Sauton en un matraz cónico de 2 litros y se realizó el cultivo durante toda la noche a 30ºC. A continuación los cultivos en fase exponencial se subieron a 40ºC y se cultivaron durante otras 4 horas más antes de cosechar las bacterias por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se aislaron las HS P no inducidas (constitutivas) por centrifugación a partir de los cultivos de células iniciales a 37ºC.

Se resuspendieron los precipitados de células de las muestras centrifugadas en solución de lisis que contenía Tween al 0,5% y se prepararon las HSPs a partir de células inducidas y no inducidas utilizando la precipitación con sulfato de amonio como en el Ejemplo 1 descrito anteriormente. Se resuspendieron las HSPs purificadas en ácido acético al 10% y se hicieron hervir durante 15 mins. para eluír los péptidos asociados a las HSPs. Se precipitaron las HSPs desnaturalizadas en una Airfuge de Beckman durante 30 mins. en una sala fría y se cosecharon los sobrenadantes que contenían los péptidos mediante liofilización y se analizaron mediante electroforesis capilar de zona utilizando un sistema CZE de Beckman. Los perfiles CZE de los péptidos eluídos a partir de las HSPs de M. tuberculosis inducidas térmicamente y constitutivas resultaron significativamente diferentes lo que indicaba que llevaban distintas familias de péptidos asociados. La inmunización de los ratones con las HSPs inducidas térmicamente dio una inmunidad significativamente mejor para la supervivencia, como se evaluó mediante conteos de colonias en pulmón, que la inmunización con las HSPs constitutivas.

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Ejemplo 4 Uso de los complejos de HSP procarióticas inducidas como vacunas

Se cultivaron E. coli (cepa NCIMB 9484) y Salmonella typhimurium (cepa 1344) durante toda la noche a 37ºC en medio LB. Se utilizaron alícuotas de 4 ml de los cultivos estacionarios para inocular 200 ml de medio LB en un matraz cónico de 2 litros y se realizó el cultivo durante 3 hrs. a 30ºC. A continuación se subieron los cultivos en fase logarítmica a 40ºC y se cultivaron durante otras 3 hrs. antes de cosechar las bacterias por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos para producir precipitados de proteínas por choque térmico. De manera similar, se prepararon precipitados de proteínas no sometidas a choque térmico (constitutivas) a partir de los cultivos celulares iniciales a 37ºC.

Se resuspendieron los precipitados de células en solución de lisis de Tween al 0,5% en 10 mM de Tris-HCl, pH 8 y se prepararon las HSPs a partir de células inducidas y no inducidas utilizando la precipitación con sulfato de amonio como en el Ejemplo 1 descrito anteriormente. La inmunización de los conejos con los complejos HSP-péptido intactos a partir de bacterias no inducidas e inducidas térmicamente mostró unos títulos de anticuerpos 10-100 veces mayores en los animales inmunizados con HSPs de bacterias inducidas térmicamente como se evaluó en los ensayos de dot blot utilizando las HSPs aisladas. En experimentos de control, se inmunizaron los animales con la mezcla reconstituida de las HSPs desnaturalizadas y se prepararon los péptidos eluídos a partir de ellas como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3 para los análisis CZE. Inesperadamente, no se vio diferencia entre los títulos de anticuerpos entre las mezclas reconstituidas preparadas a partir de complejos HSPs inducidos térmicamente o constitutivos lo que indica que las respuestas inmunes potenciadas vistas con los complejos HSP-péptido inducidos térmicamente nativos se debía a los complejos formados in situ y no de debía simplemente a una propiedad adyuvante del propio componente HSP.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias_{r} no deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la OEP se exime de toda responsabilidad. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9710000 A

\bullet WO 9640928 A

\bullet WO 9710001 A

\bullet WO 9002564 A

\bullet WO 9524923 A

\bullet US 5830475 A

\bullet WO 97100002 A

\bullet US 5736164 A

\bullet WO 9834641 A

\bullet WO 9710002 A

\bullet WO 9514093 A

Literatura (no patentes) citada en la descripción

\bulletGething et al. Nature, 1992, vol. 355, 33-45

\bulletLi; Sirivastave. Behring Inst. Mitt, 1994, vol. 94, 37-47

\bulletSuzue et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 13146-51

\bulletSrivastava. Experimentia, 1994, vol. 50, 1054-60

\bulletUdono, H.; Srivastava, P. K. Journal of Experimental Medicine, 1993, vol. 178, 1391 ff

\bulletUdono et al. J.Exp.Med., 1993, vol. 178, 1391-96

\bulletCurrent Protocols in Immunology. Wiley Interscience, 1997.

Claims (6)

1. Método para producir una composición de vacuna que comprende un determinante inmunogénico, que comprende las etapas de:

-

exponer a organismos patógenos fúngicos, protozoarios o procariotas a estímulos inductores de estrés suficientes para inducir la producción de complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos;

-

extraer los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico endógenos de los organismos tratados; y

-

utilizar los complejos proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico extraídos como determinante inmunogénico en la preparación de la composición de vacuna.

2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el estímulo inductor de estrés es el calor.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el organismo patógeno se calienta de 5ºC a 8ºC por encima de la temperatura normal de cultivo del organismo.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organismo patógeno es un organismo patógeno bacteriano.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el organismo patógeno se ha modificado genéticamente para inducir o potenciar la inducción de la síntesis de proteínas del estrés.

6. Uso de una composición de vacuna producida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición de vacuna para provocar una respuesta inmune en un animal contra el organismo patógeno a partir del cual se deriva el complejo proteína del estrés/fragmento de péptido antigénico, que es el determinante inmunogénico de la composición de vacuna.