CN100523192C - 来自感染因子的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生和分离特异性免疫原性内源性热激蛋白的方法，该蛋白通过用应激诱导刺激物处理胞外病原体而诱导，本发明还涉及由这类蛋白制备的疫苗。

Description

来自感染因子的疫苗

本发明涉及一种疫苗和一种生产疫苗的方法。更特别的，本发明涉及从胞外病原生物体生产含有应激诱导的蛋白质的疫苗组合物的方法。

发明背景

任何人体免疫应答的一重要组分是通过抗原呈递细胞(APCs)如巨噬细胞，B细胞或树突细胞，将抗原呈递到T细胞。外源抗原的肽片段与主要组织相容性复合物(MHC)分子一起经与辅助分子如CD4和CD8分子结合而呈递到巨噬细胞的表面。以这种方式呈递的这种抗原性肽片段，通过T细胞的T细胞受体识别。抗原性肽片段与T细胞受体的相互作用导致抗原特异性T细胞增殖及通过T细胞分泌淋巴因子。通过APCs呈递的抗原性肽片段的性质对建立免疫性是关键的。

热激蛋白(HSPs)形成一个高保守蛋白质家族，其广泛分布于植物和动物王国。基于其分子量，将HSPs分为6个不同家族：小型(hsp 20—30kDa)；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90；和hsp100。尽管HSPs最初是在进行热应激的细胞中鉴别的，但已经发现它们与其它形式的应激如感染相关，且因此更通常的已知为应激蛋白(SPs)。为方便起见，本文中缩写SP用于表示任何方法所产生的所有形式的应激蛋白，而缩写HSP用于表示那些通过热应激特异性诱导的蛋白质。

哺乳动物hsp90家族的成员包括胞质hsp90(hsp83)，和内质网相应物hsp90(hsp83)，hsp87，Grp94(Erp99)和gp97，见例如Gething等，(1992)，自然355：33—45。hsp70家族的成员包括胞质hsp70(p73)和hsp70(p72)，内质网相应物BiP(Grp78)，和线粒体相应物hsp70(Grp75)。hsp60家族成员只在线粒体中鉴别。该后一家族HSPs也在还含有三种其它主要HSPs家族GroEL，GroES，DnaJ和DnaK家族的原核生物中发现。

在具有胞内膜细胞器的真核细胞中，HSPs的一个作用是陪伴抗原性肽片段从一个细胞区室至另一个区室，并将肽片段呈递给MHC分子，以实现细胞表面呈递至免疫系统。在疾病细胞的情况下，HSPs还陪伴病毒或肿瘤相关的肽片段至细胞表面，见Li和Sirivastave(1994)，Behring Inst.Mitt，94：37—47，及Suzue等(1997)，美国科学院院报94：13146—51。陪伴功能是通过在ATP依赖型反应中，HSPs与抗原性肽片段之间，及HSPs和病毒或肿瘤相关的肽片段之间形成复合物而完成的。HSPs以ATP依赖型形式与广谱肽片段结合或复合。结合的肽是肽片段的随机混合物。此种肽片段的混合物和精确性质还未确定。HSPs与各种肽片段的结合已在正常组织中观测到，其不是肿瘤特异性现象，见Srivastava(1994)，Experimentia50：1054—60。

在治疗方面，已经提议将哺乳动物HSPs用作疫苗。WO 97/10000和WO 97/10001揭示了分离自癌细胞或病毒感染的细胞的HSPs混合物，能激发对同类肿瘤或病毒抗原的保护性免疫或胞毒性T淋巴细胞。然而相反，分离自正常细胞的HSPs不能激发这种免疫性。目前认为HSPs没有免疫原性，但由于其与在抗原加工期间产生的肿瘤或病毒特异性抗原性肽片段结合而能激发免疫性。具体地，与HSPs结合的肽片段是免疫原性的，并被呈递给T细胞。与肽片段剥离的HSPs丧失其免疫原性，见Udono，H.和Srivastava，PK.，实验医学杂志，178，p1391，1993。到目前为止，还未确定这些肽片段的性质。

目前认为SPs的免疫原性不是得自SP本身，而是得自与SP结合的肽片段的复合物，此论点是基于复合物的一些特性。从正常和肿瘤细胞衍生的SPs的结构没有差别。某些SP与肽片段的复合物用ATP处理后丧失其免疫原性，Udono等，(1993)，实验医学杂志178：1391—96。免疫原性的这种丧失是由于复合物解离为其SP和肽组分所致。SP制备物的免疫原性依赖于吞噬细胞的存在，如巨噬细胞和其它APCs。目前认为SPs由巨噬细胞摄入，然后将那些与SPs结合的肽片段通过巨噬细胞的MHC I类分子呈递。以此方式，起始T细胞应答。

使用来自感染细胞的哺乳动物HSP复合物作为抗胞内病原体的疫苗见于WO95/24923揭示。已经提示将分离自病毒感染的细胞的HSPs作为抗原性肽的来源，其然后可被呈递给T细胞。这必须从这种细胞中生产和纯化HSPs。HSP蛋白用作疫苗成分的应用在WO97/10000，WO97/10001WO97/10002中进一步揭示。这些申请揭示分离自癌细胞或病毒感染的细胞的HSPs混合物能引发保护性免疫或抗同类肿瘤或病毒抗原的胞毒性T淋巴细胞。另外，WO98/34641揭示仅需要令人惊异地低的量的HSPs免疫动物抗肿瘤或病毒抗原。

所有这些HSP疫苗途径均使用来自待免疫物种的哺乳动物HSPs以接种所希望的动物物种。

来自胞外病原体本身的HSPs也已作为抗原用于免疫哺乳动物，但是不是作为抗原性肽片段的载体，而是作为共缀合物或杂种融合蛋白。因此，WO95/14093揭示了用Helicobacter pylori HspA和B作为免疫原可引发抗这些蛋白质的良好抗体应答，且这一应答有效抗该微生物。类似地，WO96/40928揭示了使用来自链球菌的HSP70和72引发抗这些蛋白质的良好抗体应答，且这一应答有效抗该微生物。另外，WO90/02564揭示了使用锥虫、枝原体或分枝杆菌的HSPs特别是HSP70作为免疫原引发抗这些蛋白质良好免疫应答，且这一应答应该有效抗各自微生物。另外，US5830475使用表达为牛分枝杆菌HSP基因的融合体的蛋白质作为抗原，US5736164使用与免疫原性差的抗原缀合的hsp65的T细胞表位。

然而，来自胞外原核和原生动物病原物的内源性SP复合物、特别是来自通过热激或其它应激处理的这些生物体的HSP复合物尚未被用作疫苗来免疫动物，特别是脊椎动物如哺乳动物、鸟类或鱼类以抗这些传染病病原体。

发明概述

因此，本发明的第一个方面是提供一种生产含有免疫原性决定簇的疫苗的方法，包括以下步骤：

a)使得胞外病原生物体接触应激诱导刺激物如热，该刺激物会诱导SP/抗原性肽片段复合物的产生；

b)从处理的生物体中提取内源性应激诱导的产物，尤其SP/抗原性肽片段复合物；和

c)使用提取的产物作为免疫原性决定簇，制备疫苗组合物。

令人惊奇的是用应激诱导刺激物处理胞外病原生物体产生的SPs复合物比SPs本身或衍生自未诱导的生物体的SPs具有更强的免疫原性。本发明的疫苗的一特别性质是与通过SPs本身接种诱导相比具有非常高的中和抗体效价及获得长期记忆。

本文所用术语“疫苗”是指刺激免疫系统使得其能更好地应答随后的感染的任何组合物。应意识到疫苗通常含有一免疫原性决定簇(应激诱导的SP复合物)和一佐剂，该佐剂非特异性地增强对该决定簇的应答。

本文所用术语“胞外病原生物体”是指导致脊椎动物疾病的任何胞外病原体，包括细菌、原核、原生动物和真菌物种。本发明方法可应用的胞外病原体的特异例子包括细菌如分枝杆菌特别是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，螺杆菌，链球菌，锥虫，枝原体；和原核病原体如埃希氏杆菌，特别是大肠杆菌，和沙门氏菌，特别是鼠伤寒沙门氏菌。

胞外病原体可以是应用外部应激时诱导应激蛋白合成的病原体。但是，本发明范围包括使用已被修饰例如基因工程化的病原生物体如细菌，以产生这样的生物体，其中应激蛋白合成的诱导或诱导的增强组成型发生，无需施加外部应激。

因此，本发明的另一方面提供了引发动物对胞内病原生物体感染的免疫应答的方法，包括给予含有免疫原性决定簇的疫苗，其特征在于该免疫原性决定簇是从该胞内病原体原位产生的SP/抗原性肽片段复合物，其合成经外部应激刺激物诱导或经该病原体的遗传修饰而诱导，从而其合成是组成型的。

本发明还提供了这样的胞内病原生物体，其遗传结构已被修饰从而限制或抑制该生物体对应激蛋白的合成的那部分遗传结构已被除去或抑制。

本文所用术语“应激蛋白”和“热激蛋白”，包括那些包含细菌HSPs的GroEL，GroES，DnaK和DnaJ家族，和其它胞外病原体中的相关家族的蛋白质。这些家族是基于它们编码的肽的大小而命名的。这些家族在物种之间是高度保守的。另外，许多细菌也表达真核蛋白的同源物。优选地，本发明疫苗含有多个衍生自应激的病原体的SP/抗原性肽片段复合物。我们特别优选将GroEL，GroES，DnaK和DnaJ家族的蛋白质在本发明中用作免疫原性决定簇，最优选的是DnaJ和GroEL。

胞外病原体所接触的应激刺激物可提供免疫生物学中使用的任何合适体外技术施加，例如在有限营养水平下培养，或当病原体被培养至静止生长期时通过向培养基中添加高浓度电解质如NaC1而渗透休克。我们优选通过在比该生物体正常生长温度高5—8℃的温度下加热处理病原生物体而施加应激。典型地，病原体在常规生长条件下培养至静止状态。随后可取活性病原体培养物的样品再次培养，但是在第二个培养阶段培养温度升高至诱导SPs所需的温度。不拘泥于理论，据认为对病原体进行处理特异性诱导与来自病原体的抗原性肽最大程度相互作用的HSPs，或诱导最易于被APCs吞噬的HSPs，或两者均诱导。诱导SPs的最佳条件可易于通过简便的反复试验确定，以及通过用常规技术评价的刺激物的变化的作用而确定，如对动物进行体内实验，或通过其它方法例如“免疫学通用方法”，Wiley Interscience，1997所述方法确定。

可用任何适当的方法提取和纯化从胞外病原体经施加应激而诱导的蛋白质物质，尤其SP/抗原性肽片段复合物，使之与剩余的病原体材料分离。例如，可将处理的生物体通过均质化或超声片段化而破坏，随后离心在上清中获得粗制SP制备物。粗制的内源性SP制备物可直接用作本发明的疫苗。任选地，SP制备物可通过使用ADP结合柱或本领域技术人员已知的其它适当方法进一步纯化，见例如WO 97/10000和WO 97/10001所述。

应意识到特异性免疫原性SP/抗原性肽片段复合物可从胞外病原生物体的应激产生的复合物混合物中分离，以产生病原体特异性的疫苗。然而，通常不需要这样，且复合物混合物可用于诱导广谱免疫。如果需要，特异性抗原性肽片段可从复合物中回收，例如通过用常规方法经ATP处理而回收。

本发明疫苗的SP/抗原性肽片段复合物可与佐剂组合在水性载体中输送。本领域技术人员已知适当的佐剂，如Freund’s完全佐剂，Freund’s不完全佐剂，Quil A，Detox，ISCOMs或鲨烯。然而，本发明的疫苗组合物没有佐剂也可以是有效的。

本发明还提供了一种用本发明疫苗处理动物的方法，包括任选地与佐剂组合施用药物学可接受量的本发明疫苗，该量足以激发动物体内免疫应答。此动物典型地是人。然而，本发明还可用于处理其它动物，如马，牛，山羊，绵羊或猪，及可用于处理鸟类，尤其家禽如鸡或火鸡。

本发明的疫苗组合物可通过任何适当方法施用，如口服，吸入，经皮或通过注射和在任何适当载体介质中施用。然而，优选将疫苗以水性组合物形式通过用任何适当针头或无针方法注射。

本发明的疫苗可含有任何适当浓度的SP/抗原性肽片段复合物。我们优选是每kg经处理的动物体重施用10—600μg，更优选10—100μg，最优选25μg的SP复合物。应意识到本发明的疫苗可用作初始处理，随后进行一或多次相同或不同剂量处理，每次处理间隔1—26周，以提供对病原体的延长免疫作用。

以下实施例例证但非限制本发明。

实施例1：制备热诱导的HSPs

用常规培养基将胞外病原体牛分枝杆菌(BCG)的细胞在37℃培养至静止期，在42℃热激0.5小时，或在39℃热激5小时，并培养过夜以诱导含有热激蛋白和抗原性肽片段的产物的形成。然后将病原体细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗，并重悬于均质化缓冲液中，此均质化缓冲液特别是低渗缓冲液，如含有2mM MgCl₂的10mM磷酸盐，pH7.4。然后将细胞用任何合适技术破坏，例如用细胞匀浆机(例如French press，Ultraturrax或Waring搅拌机)，用去污剂如Tween或Triton裂解，在37℃补体裂解，或例如在液氮中重复冻融。然后将细胞裂解物通过离心处理，典型的在3—5000g离心5分钟，以除去细胞核和细胞碎片，随后在100000g高速离心15—30分钟。

这样获得的上清含有由病原体细胞的热激处理诱导的热激蛋白和抗原性肽片段。其可直接用于形成本发明疫苗组合物中活性成分。上清可用任何合适技术浓缩以产生疫苗组合物。或者上清可通过硫酸铵沉淀进一步加工，使用20—70％的硫酸铵。特别地，在4℃加入20％(w/w)硫酸铵，弃去沉淀，随后加入更多的硫酸铵使浓度达到70％w/w。通过离心收集蛋白质沉淀，然后用适当的生理学可注射的缓冲液如盐水透析，以在使用之前除去硫酸铵。应意识到以此方式分离的HSPs不是纯化为同质的，但仍然适用作疫苗成分。

如果需要更纯化的HSP制备物，然后可将HSP通过在携带腺苷二磷酸的基质如ADP-琼脂糖或ADP—琼脂糖凝胶上进行亲和层析从上清中纯化，这些方法例如WO97/10000，WO97/10001，WO97/10002所述。

为确定如上所述产生的应激蛋白/抗原性肽片段复合物的免疫原性，可使用T细胞增殖分析。适当的分析包括混合淋巴细胞反应(MLR)，通过含氚胸苷吸收分析；和胞毒性分析以确定从靶细胞中释放的⁵¹Cr，见“免疫学当前方案”，Wiley Interscience，1997。或者，可用标准免疫分析或噬斑裂解分析测试抗体产生，或通过胎儿子宫内保护确定，见“免疫学当前方案”。

实施例2：用诱导的HSPs免疫；在疫苗受体内的免疫性

含有HSP复合物的疫苗组合物如实施例1所述制备，将小鼠和兔通过注射1—10μg在磷酸盐缓冲液中的应激蛋白复合物进行接种，在初始注射一个月后用相同剂量的疫苗加强。由病原体诱导的免疫性用总牛分枝杆菌蛋白通过Western印迹分析。通常获得1：1—10000的抗体效价，抗病原体感染的细胞的胞毒性T细胞活性也可在免疫的小鼠中检测到。用固定的牛分枝杆菌在初次免疫后6，12和18个月攻击，导致效价为1：1—10000的良好抗体应答，表明在免疫的动物体内良好的记忆应答。

实施例3 在组成型和诱导的HSP复合物中结合的肽的比较

将结核分枝杆菌在37℃在Sauton’s培养基中生长3天至饱和状态。将4ml等分静止培养物用于接种在2升锥形瓶中的500mlSauton’s培养基，并将培养物在30℃生长过夜。然后将对数期培养物的温度提高至40℃，并再生长4小时，然后通过在10000rpm离心10分钟收集细菌。非诱导的(组成型)HSPs是在37℃从初始细胞培养物中通过离心分离的。

将来自离心的样品的细胞沉淀再悬浮于含有0.5％Tween和HSPs的裂解液中，HSPs是如实施例1所述用硫酸铵沉淀从诱导的和非诱导的细胞中制备的。将纯化的HSPs再悬浮于10％乙酸中，并煮沸15分钟以洗脱HSP结合的肽。将变性的HSPs在冷室中在Beckmanairfuge中沉淀30分钟，并通过冻干收集含有肽的上清，用BeckmanCZE系统通过毛细管区带电泳分析。洗脱自组成型和热诱导的结核分枝杆菌HSPs的肽的CZE图明显不同，表明它们携带不同家族的结合肽。用热诱导的HSPs免疫的小鼠与用组成型HSPs免疫的小鼠相比，对活体攻击具有明显较好的免疫性，这是通过肺部集落计数确定的。

实施例4：使用诱导的原核HSP复合物作为疫苗

将大肠杆菌(NCIMB菌株9484)和鼠伤寒沙门氏菌(菌株1344)，在LB培养基中在37℃生长过夜。将4ml等分静止培养物用于接种在2升锥形瓶中的200ml LB培养基，并将培养物在30℃生长3小时。然后将对数期培养物的温度提高至40℃，并再生长3小时，之后通过在10000rpm离心10分钟收集细菌，以得到热激蛋白的沉淀。相似的，未热激的(组成型)蛋白沉淀是在37℃从初始细胞培养物中制备的。

将细胞沉淀再悬浮于含有在10mM Tris—HCl，pH8中的0.5％Tween和HSPs的裂解液中，HSPs是如实施例1所述用硫酸铵沉淀在诱导的和未诱导的细胞中制备的。用来自未诱导的和热诱导的细菌的完整HSP肽复合物免疫兔，示出用来自热诱导的细菌的HSPs免疫的动物中抗体效价提高10—100倍，这是用分离的HSPs在斑点印迹分析中确定的。在对照实验中，将动物用变性的HSPs和如实施例3所述制备的从其中洗脱的肽的重配混合物免疫，进行CZE分析。令人惊奇的，在制备自组成型或热诱导的HSPs复合物的重配混合物之间，抗体效价没有差别，这表明用天然热诱导的HSP—肽复合物可见的增强免疫应答是由于原位形成的复合物所致，而不是简单的由于HSP组分自身的佐剂性质所致。

Claims (8)

1、一种生产含有免疫原性决定簇的疫苗的方法，包括以下步骤：

-使得选自牛分枝杆菌(Mycobacterium Bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)、大肠杆菌(E.Coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的胞外病原生物体接触应激诱导刺激物，该应激诱导刺激物会诱导应激蛋白/抗原性肽片段复合物的产生，其中所述应激诱导刺激物选自：

对于牛分枝杆菌，在42℃加热0.5小时，或在39℃加热5小时，

对于结核分枝杆菌，在40℃加热4小时，和

对于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，在40℃加热3小时；

-从处理的生物体中提取内源性应激诱导的产物；和

-使用提取的产物作为免疫原性决定簇制备疫苗组合物，

其中免疫原性决定簇的活性成分主要由一或多种休克蛋白/抗原性肽片段复合物组成。

2、权利要求1的方法，其特征在于免疫原性决定簇是热激蛋白/抗原性肽片段复合物的混合物。

3、前述任一项权利要求的方法，其特征在于胞外病原生物体已被修饰而诱导或增强对应激蛋白合成的诱导。

4、前述任一项权利要求的方法，其特征在于其是体外进行的。

5、一种用权利要求1-4任一项的方法产生的疫苗组合物。

6、权利要求5的疫苗组合物，其特征在于所述组合物还含有该免疫原性决定簇的佐剂。

7、权利要求5或6的疫苗组合物，其特征在于所述组合物是水性组合物。

8、权利要求5-7任一项的疫苗组合物在制备用于在动物中引发免疫应答的药物中的用途。