PT1204422E - Proteínas de choque de patogéneos extra-celulares como vacinas contra agentes infecciosos - Google Patents

Description

Descrição PROTEÍNAS DE CHOQUE DE PATOGÉNEOS EXTRA-CELULARES COMO VACINAS CONTRA AGENTES INFECCIOSOS.

Descrição A presente invenção refere-se a uma vacina e um método para produzir a vacina, mais especificamente um método para produzir uma composição de vacina que contém proteínas induzidas por choque a partir de organismos patogénicos extra-celulares.

Antecedentes da invenção

Um importante componente de qualquer resposta imunológica é a apresentação de antigéneos às células τ por antigéneos com células (APCs), tais como macrófagos, células B ou células dendriticas. Fragmentos de péptidos de antigéneos estranhos são exibidos na superfície do macrófago em combinação com moléculas de complexo principal de histocompatibilidade (CPH), em associação com moléculas ajudantes, tais como moléculas CD4 e CD8. Os tais fragmentos pépticos antigéneos apresentados neste modo são reconhecidos pelo receptor da célula T e a interacção dos fragmentos pépticos antigénicos com o receptor da célula T resulta numa proliferação de células T específicas antigénicas e a secreção de linfoquinas pelas células T. A natureza dos fragmentos pépticos antigénicos apresentados pelos APCs é crítico para a criação de imunidade.

As proteínas de choque térmico formam uma família de proteínas altamente conservadas que são amplamente distribuídas através do reino animal e vegetal. Na base do 1/17 seu peso molecular, as PCTs são agrupadas em 6 diferentes famílias: pequenas (pct 20-30kDa); pct40; pct60; pct70; pct90; e pctlOO. Apesar das PCTs serem originalmente identificadas em células sujeitas choque térmico, foram também encontradas associadas com muitas outras formas de choque tal como infecções, e são deste modo mais conhecidas como proteínas de choque (PCs). Para conveniência, as iniciais PC vão ser usadas para denominar em geral as proteínas induzidas a partir de células sujeitas a qualquer forma de choque e as iniciais PCTs vão ser usadas para denominar aquelas especificamente induzidas por choque térmico.

Os membros da família pct90 incluem pct90 citossólico (pct83) e o equivalente retículo endoplasmático pct90 (pct83), pct87, grp94 (Erp99) e gp97, ver como exemplo, Gething et al. (1992) Nature 355:33-45. Membros da família pct70 incluem pct70 citossólico (p73) e pct70 (p72), o retículo endoplasmático equivalente BiP (Grp78), e o equivalente mitrocondrial pct70 (Grp75) . Os membros da família mamífera pct60 foram apenas identificados nas mitocôndrias. A última família de PCTs é também encontrada procariontes os quais também contêm três outras grandes famílias de PCTs, o GroEL, GroES, DnaJ e DnaK. Assim como em eucariontes, os procariontes PCTs também se pensa que funcionem na dobragem de cadeias polipeptídicas nascentes durante a síntese de proteínas.

Em células eucarióticas que têm organelos membranares intercelulares, um dos papéis das PCTs é o de acompanhar os fragmentos de péptidos antigénicos de um compartimento celular para outro e apresentar os fragmentos peptídicos para as moléculas MHC para apresentação na superfície das células ao sistema imunitário. No caso de células doentes, 2/17 os PCTs também acompanham fragmentos de péptidos virais ou associados a tumores até à superfície da célula, Li e Sirivastave (1994) Behring Inst. Mitt, 94: 37-47 e Suzue et ai. (1997) Proc.Natl.Acad.Sei. USA 94: 13146-51. A função de acompanhamento é conseguida através da formação de um complexo entre PCTs e os fragmentos de péptidos antigénicos e entre PCTs e fragmentos de péptidos virais e associados a tumores numa reacção dependente em ATP. Os PCTs formam complexos ou ligam-se com um amplo espectro de fragmentos de péptidos num modo dependente de ATP. A ligação peptídica parece ser uma mistura aleatória de fragmentos de péptidos. As misturas ou natureza exacta dos fragmentos de péptidos não foram determinados. A associação de PCTs com vários fragmentos de péptidos foi observada com tecidos normais também e não é um fenómeno específico a tumores, ver Srivastava (1994) Experimentia 50: 1054-60.

Num contexto terapêutico, foi proposto usar-se PCTs mamíferos como vacinas. WO 97/10000 e WO 97/10001 descreve que uma mistura de PCTs isolados a partir de células cancerígenas ou viralmente infectadas são capazes de provocar imunidade protectora ou os linfócitos T citotóxicos para o tumor cognato ou antigénio virai. Contudo, em contraste, os PCTs isolados a partir de células normais não são capazes de solicitar imunidade. É agora pensado que os PCTs não são imunogénicos per se, mas são capazes de solicitar imunidade devido à sua associação com fragmentos de péptidos antigénicos específicos a tumores ou vírus que são gerados durante o processamento do antigénio. Especificamente, os fragmentos de péptidos associados com os PCTs são imunogénicos e são apresentados às células T. Os PCTs de fragmentos de péptidos associados perdem a sua imunogenicidade, ver Udono, H. e Srivastava, P. K., Journal of Experimental Medicine, 178, página 1391 ff, 1993. Até à 3/17 data, a natureza destes fragmentos de péptidos não foi determinado. É actualmente pensado que a antigenicidade do PCs resulta não da PC per se, mas do complexo de fragmentos de péptidos associados com o PC. Esta conclusão é baseada num número de caracteristicas dos complexos. Não existem diferenças nas estruturas dos PCs derivados de células normais e de tumores. Certos complexos perdem a sua imunogenicidade após o tratamento com ATP, Udono et al. (1993) J.Exp.Med. 178: 1391-96. Esta perda de imunogenicidade é devido à dissociação do complexo na sua PC e componentes do fragmento de péptido. A imunogenicidade de preparações PC depende da presença de células fagocíticas, tais como macrófagos, e outros APCs. É agora pensado que os PC são assimilados pelos macrófagos. Aqueles fragmentos de péptidos associados com os PCs são então apresentados por moléculas MHC classe I do macrófago. Neste modo, a resposta da célula T é iniciada. 0 uso de complexos-PCT mamíferos a partir de células infectadas como vacinas contra patogéneos intracelulares foi descrito em WO 95/24923. As PCTs isolados a partir de células viralmente infectadas foram sugeridos como fonte de péptidos antigénicos, os quais podem ser apresentados a células T. Isto necessita de produção e purificação das PCTs de tais células. 0 uso de proteínas PCT como componentes de vacinas foi também descrito em WO 97/10000, wo 97/10001 e WO97/100002. Estas descrevem que uma mistura de PCTs isoladas a partir de células cancerígenas ou viralmente infectadas são capazes de provocar imunidade protectora ou linfócitos T citotóxicos para o antigénio do tumor cognato ou virai. A WO 98/34641 também descreve que quantidades surpreendentemente baixas de PCTs são 4/17 necessárias para imunizar animais contra antigéneos tumorais ou virais.

Todas estas abordagens a vacinas PCT usam PCTs mamíferas da espécie a serem imunizadas para a vacinação da espécie animal desejada.

Os próprios PCTs de patogéneos extra-celulares têm também sido utilizados para imunizar espécies mamíferas porque os antigéneos per se não como portadores de fragmentos de péptidos excepto como conjugados ou proteínas de fusão hibrida. A WO 95/14093 descreve que o uso de PctA e B pilori Helicobacter como imunogéneos provoca uma boa resposta de anticorpos contra estas proteínas e que esta resposta é eficaz contra o organismo. Similarmente, a WO 96/40928 descreve que o uso de PCT 70 e 72 como imunogéneos provoca uma boa resposta de anticorpos contra estas proteínas e que esta resposta é eficaz contra o organismo. A WO 90/02564 descreve ainda que o uso de PCTs Tripanosonal, Micoplasmal ou Micobacterial, e especialmente PCT70, porque os imunogéneos provocam uma boa resposta dos anticorpos contra estas proteínas e que isto deveria ser eficaz contra os respectivos organismos. Alternativamente a US 5830475 usa proteínas expressas como fusões dos genes PCT M.Bovis como antigéneos e a US 5736164 usa epítopos de células-T de pct65 conjugado com antigéneos fracamente imunogénicos.

Contudo, complexos-PC endógenos de espécies patogénicas procariotas e protozoárias extra-celular, e mais especialmente complexos-PCT destes organismos tratados através de choque térmico e outros choques, não foram usados como vacinas para imunizar animais, principalmente 5/17 vertebrados tais como mamíferos, pássaros ou peixes contra este patogéneos de doenças infecciosas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

Deste modo, a partir de um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma vacina que contém um determinante imunogénico, compreendendo os passos de: a) Expondo organismos procarióticos, protozoários ou fúngicos ao estimulo induzido por choque, tal como o calor, o qual iria induzir a produção de complexos PC/fragmentos de péptidos antigénicos. b) Extraindo os complexos PC/fragmentos dos péptidos antigénicos, a partir dos organismos tratados; e C) Usando os fragmentos de proteínas de choque/fragmentos de péptidos antigénicos como o determinante imunogénico na preparação da composição da vacina. É surpreendente que o tratamento de organismos patogénicos procariótas, protozoários ou fúngicos com estímulo induzido por choque produz complexos PC que são mais imunogénicos do que os PCs ou PCs derivados de organismos não-induzidos. Uma propriedade particular das vacinas da invenção são os títulos neutralizadores de anticorpos excepcionalmente altos e a memória de longo prazo obtida quando comparada com aquela induzida pela imunização pelos PCs. 0 termo vacina é usado aqui para denotar qualquer composição que estimula o sistema imunitário de tal modo a que pode responder a subsequentes infecções. Será 6/17 compreendido que uma vacina normalmente contém um determinante imunogénico (os complexos SP induzidos com choque) 0 termo organismo patogénico extra-celular é usado aqui para denotar qualquer patogénico extra-celular que cause uma doença num vertebrado, incluindo espécies bacteriais, procarióticas, protozoárias e fúngicas. Exemplos específicos de patogéneos extra-celulares aos quais o método da invenção pode ser aplicado inclui bactérias tais como Mycobacteria sp.; e patogéneos procarióticos tais como Escherichia sp, notavelmente E coli, e Salmonela sp., notavelmente S typhimurium.

Os patogéneos extra celulares podem ser um na qual a aplicação de um choque externo induz a síntese de proteínas de choque. Contudo, é dentro do âmbito da presente invenção usar organismos patogénicos, por exemplo bactérias, as quais foram modificadas, por exemplo geneticamente modificadas, para produzir um organismo no qual a indução ou melhoramento da indução da síntese de proteínas de choque ocorre constitutivamente sem a necessidade de aplicar choques externos.

Também descrito aqui está um método para provocar uma resposta imunitária de um animal a uma infecção de um organismo patogénico intra-celular o qual compreende administrar uma vacina contendo um determinante imunogénico, caracterizado pelo facto de que o determinante imunogénico é um complexo fragmento péptidico antigénico/PC produzido in situ a partir de um patogéneo intra-celular cuja síntese é induzida por estímulos externos ou por modificações genéticas do patogéneo de modo a tornar a sua síntese constitutiva. 7/17

Também descrito aqui é um organismo patogénico intracelular o qual tem a sua estrutura genética modificada para remover ou inibir a porção da sua estrutura genética a qual restringe ou inibe a síntese de proteínas de choque pelo organismo. 0 termos proteínas de choque e proteína de choque térmico, como usados aqui, é Standard na arte e incluem aquelas proteínas que compreendem as famílias GroEL, GroES e DnaK e DnaJ de PCTs bacterianos e famílias relacionadas em outros patogéneos extra-celulares. Estas famílias são denominadas com base no tamanho dos péptidos que codificam. As famílias estão bem conservadas entre espécies. Adicionalmente, muitas bactérias também expressam proteínas eucarióticas homólogas. Preferencialmente a vacina contém uma pluralidade de complexos PC/fragmentos de péptidos antigénicos derivadas do patogéneo. Preferíamos particularmente que as famílias de proteínas GroEL, GroES, DnaK e DnaJ sejam usadas como determinantes imunogénicos na presente invenção, em que DnaK e GroEL são as preferidas. 0 estímulo do choque ao qual o patogéneo extra-celular é exposto pode ser aplicado por qualquer técnica in vitro usada na arte de imunobiologia, por exemplo cultivação sob níveis limitados de nutrientes, ou choque osmótico de um patogéneo após ter sido cultivado até crescimento estacionário pela adição de altas concentrações de electrólitos tais como NaCl ao meio de cultivo. Preferimos aplicar o choque através do tratamento térmico do patogéneo a uma temperatura de 5-8°C acima do crescimento normal de temperatura do organismo. Tipicamente, o patogéneo será cultivado sob condições de crescimento convencionais até ao estado estacionário. Amostras da cultura do patogéneo activo podem ser retiradas e cultivadas de novo, mas a 8/17 temperatura de cultivo é aumentada durante o segundo estágio do cultivo a temperatura elevada necessária para induzir a produção de PCs. Sem ser restringido pela teoria, é pensado que o tratamento do patogéneo opera para induzir especificamente aqueles PCTs mais capazes de interagir com os péptidos antigénicos, ou para induzir aqueles PCTs que são mais facilmente fagocitados por APCs, ou ambos. As condições óptimas para induzir os PCs podem ser facilmente determinadas por simples tentativa e erro e o efeito de uma mudança de estimulo avaliada usando técnicas convencionais, tais como testes in vivo em animais ou outras técnicas, por exemplo aquelas descritas em "Current Protocols in Immunology", Wiley Interscience, 1997. A extracção e purificação de materiais proteicos induzidos a partir dos patogéneo extra-celulares pelo choque aplicado, notavelmente os complexos PC/fragmentos antigénicos, a partir do material patogénico extra-celular pode ser atingido usando qualquer técnica aceitável. Por exemplo, o organismo tratado pode ser irrompido por homogeneização ou fragmentação ultrasónica, seguido por centrifugação para obter uma preparação PC crude no precipitado. As preparações endógenas PC crude podem ser usadas directamente como a vacina da invenção. Opcionalmente, as preparações PC podem ser purificadas ainda mais através do uso de colunas ADP ligantes ou outros métodos adequados disponíveis para a pessoa com conhecimento na arte, ver por exemplo aquelas descritas em WO 97/10000 e WO 97/10001.

Será notado que o imunogénico específico PC/complexos de fragmentos péptidos antigénicos podem ser isolados da mistura de complexos produzidos a partir do choque dos organismos patogénicos extra-celulares para produzir uma 9/17 vacina com um patogéneo específico. Contudo, isto pode não ser necessário e a mistura de complexos pode ser usada para induzir amplo espectro. Se desejado, os fragmentos de péptidos antigénicos específicos podem ser recuperados do complexo, por exemplo por tratamento com ATP usando técnicas convencionais. 0 complexo PC/fragmento de péptido antigénico da vacina da presente invenção pode ser entregue em combinação com um adjuvante e num suporte aquoso. Adjuvantes adequados são facilmente identificados pela pessoa com conhecimento na arte, tal como adjuvante completo de Freunds's, adjuvante incompleto de Freund's, Quil A, Detox, ISCOMs ou esqualeno. Contudo, as composições de vacina da presente invenção podem também ser eficaz sem um adjuvante. A invenção também fornece um método para tratar um animal com uma vacina da invenção, administrando uma quantidade farmacologicamente aceitável da vacina da invenção, opcionalmente em combinação com um adjuvante, suficiente para provocar uma resposta imunitária no animal. 0 animal é tipicamente um humano. Contudo, a invenção pode ser aplicada a tratamentos de outros mamíferos tais como cavalos, gado, cabras, ovelhas ou suínos, e no tratamento de aves, principalmente aves domésticas tais como galinhas ou perus .

As composições de vacinas podem ser administradas por qualquer meio adequado, tal como oralmente, por inalação, transdermicamente ou por injecção e em qualquer meio adequado. Contudo, é preferido administrar a vacina como uma composição aquosa através de injecção usando uma agulha adequada ou técnica sem agulha. 10/17

As vacinas podem conter qualquer concentração adequada de um complexo PC/fragmentos de péptidos antigénicos. Preferimos que o complexo PC seja administrado no leque de 10-600 pg, preferencialmente 10-100 pg, mais preferencialmente 25 pg, por Kg de peso corporal do animal a ser tratado. Será notado que a vacina pode ser aplicada com um tratamento inicial seguido por um ou mais tratamentos subsequentes na mesma ou diferente dosagem num intervalo entre 1 a 26 semanas entre cada tratamento para fornecer imunização prolongada contra o patogéneo.

Os seguintes exemplo são fornecidos para ilustrar mas não limitar a invenção.

Exemplo 1 Preparação de PCTs induzidos por calor:

As células do patogéneo Mycobac-terium Bovis (BCG) extra-celular foram criadas até à fase estacionária usando um meio de cultivação convencional a 37°C e choque térmico a 42°C durante 0.5hr ou a 39°C durante 5 horas e em cultura durante a noite para induzir a formação de um produto contendo uma proteína de choque térmico e fragmentos de péptido antigénico. As células do patogéneo são então lavadas em soro com fosfato (PBS) e re-suspenso em buffer de homogeneização, notavelmente um buffer hipotónico tal como 10 mM fosfato pH 7.4 com 2mM MgCl2. As células são então irrompidas usando qualquer técnica adequada: por exemplo usando um homogeneizador de células tal como French press, Ultraturrax ou misturador Waring; através de lise usando detergentes tais como Tween ou Triton; complemente lise a 37°C; ou por ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, por exemplo em nitrogénio líquido. A célula lisada é então tratada através de centrifugação, tipicamente a 3-5000g durante 5 minutos, para remover resto 11/17 de célula ou núcleo, seguido por uma centrifugação rápida, tipicamente 100,000g durante 15-30 minutos. O precipitado assim obtido contém, inter alia, a proteína de choque térmico e os fragmentos de péptido antigénico induzido pelo tratamento de choque térmico das células do patogéneo. Isto pode ser usado directamente para formar o componente activo da composição da vacina da invenção. O precipitado pode ser concentrado usando qualquer técnica adequado para produzir a composição da vacina. Alternativamente, o precipitado pode ser ainda mais processado por uma precipitação de sulfato de amónio o qual usa menos 20-70% de sulfato de amónio. Especificamente, 20% (w/w) de sulfato de amónio é adicionado a 4°C, a precipitação não é valorizada, seguida pela adição de mais sulfato de amónio para tornar a concentração 70% w/w. O precipitado de proteína é colhido por centrifugação e então dializado num buffer fisiológico, injectável adequado, tal como o soro, para remover o sulfato de amónio antes do uso. Será notado que o uso de PCTs isolados deste modo não estão purificados para homogeneidade, mas estão, contudo, adequados para uso como componente de vacina.

Se é necessária uma preparação de PCT mais pura, então as PCTs podem ser purificadas a partir do precipitado por afinidade cromotográfica nas matrizes portadores de difosfato adenosina, tal como ADP-agarose ou ADP-sefarose, por exemplo como descrito em WO 97/10000, WO 97/10001 e WO 97/10002.

De modo a determinar a imunogenicidade do complexo proteína de choque/fragmentos de péptidos antigénicos produzidos como descritos acima, deve ser usados testes de proliferação de células T. Testes adequados incluem a 12/17 reacção de limfócitos-mistos (MLR), testados por tiamidina de tritio; e teste de citotoxicidade para determinar a libertação de Cr das células alvo. Ambos estes testes são Standard na arte, ver "Current Protocols in Immunology", Wiliey Interscience, 1997. Alternativamente, a produção de anticorpos pode ser examinada, usando imunotestes Standard ou teste de lise de placa, ou ajudados por protecção intra-uterina de um feto, ver "Current Protocols in Immunology".

Exemplo 2 Imunização com PCTs induzidas; imunidade do receptor da vacina.

Composições de vacinas que tenham complexos PCT foram preparadas como descrito no Exemplo 1 acima, e ratos e coelhos foram vacinados pela injecção de 1-10 microgramas de um complexo de proteína de choque em soro com fosfato. Esta imunização inicial foi aumentada com doses idênticas de vacina um mês após a injecção primária. Indução de imunidade ao patogéneo foi testado por análise Western blot usando proteínas totalmente M.bovi. Títulos de anticorpos de 1:1-10,000 foram obtidos de forma consistente e a actividade das células T citotóxicas dirigidas contra as células infectadas com o patogéneo puderam também ser detectadas nos ratos imunizados. O uso em coelhos do M.bovis aos 6, 12 e 18 meses após a imunização inicial, resultou na produção de uma boa resposta de anticorpos com titulações de 1:1-10 000 indicando uma boa resposta de memória nos animais imunizados.

Exemplo 3 Comparação de péptidos associados em complexos PCT constituídos e induzidos.

Os Mycobacterium Tuberculosiswas cultivados até à saturação durante 3 dias a 37°C em meio de Sauton. 4ml 13/17 de alíquotas das culturas estacionárias foram usados para inocular 500ml de meio de Sauton num frasco cónico de 2 litros e as culturas deixadas crescer durante a noite a 30°C. As culturas de fase log foram elevadas a 40°C e deixadas a crescer durante mais 4 horas antes de as bactérias serem colhidas através de centrifugação a 10, 000 rpm durante 10 minutos. Os PCTs não-induzidos (constitutivos) foram isolados por centrifugação a partir da cultura de células inicial a 37°C.

Pellets de células das amostras centrifugadas foram ressuspensas numa solução lise contendo 0.5% Tween e PCTs preparadas a partir de células induzidas e não induzidas usando precipitação de sulfato de amónio como no Exemplo 1 acima. As PCTs purificadas foram ressuspensas em 10% ácido acético e fervidos durante 15 minutos para diluir os péptidos associados aos PCT. As PCTs desnaturadas foram peletizadas num Beckman Airfuge durante 30 minutos numa sala fria e os precipitados que contêm péptidos colhidos através de congelamento e analisado através de electroforese de zona capilar usando um sistema Beckman CZE. Os perfis CZE dos péptidos diluídos a partir das PCTs M. Tuberculosis constitutivo e induzido por calor foram significativamente diferentes indicando que podem transportar diferentes familias de péptidos associados. A imunização de ratos com as PCTs induzidas por calor deram uma imunidade significativamente melhor, como verificado por contagem de colónias nos pulmões, relativamente à provocação com material vivo do que imunização com PCTs constitutivas.

Exemplo 4 Uso de complexos procariotas induzidos como vacinas. 14/17 E.Coli (NCIMB estirpe 9484) e Salmonella typhimurium (estirpe 1344) foram cultivadas durante a noite a 37°C num meio LB. 4ml aliquotas das culturas estacionárias foram usadas para inocular 200 ml de meio LB num frasco cónico de 2 litros e as culturas deixadas crescer durante 3 horas a 30°C. As culturas de fase log foram elevadas a 40°C e deixadas a crescer durante mais 3 horas antes de as bactérias serem colhidas através de centrifugação a 10,000 rpm durante 10 minutos para dar origem a pellets de proteínas de choque térmico. Similarmente, pellets de proteínas de choque não térmico (constitutivas) foram preparadas a partir da cultura de células inicial a 37°C.

Pellets de células foram ressuspensas numa solução lisada contendo 0.5% Tween em lOmM Tris-HCl, ph8 e PCTs preparadas a partir de células induzidas e não induzidas usando precipitação de sulfato de amónio como no Exemplo 1 acima. A imunização de coelhos com os complexos PCT-péptidos intactos a partir de bactéria não induzida e induzida por calor mostrou 10-100 vezes mais titulações de anticorpos nos animais imunizados com PCTs a partir de bactéria induzidas por calor como verificado em testes dot-blot usando PCTs isoladas. Em experiências de controlo, os animais foram imunizados com a mistura reconstituída das PCTs desnaturadas e os péptidos diluídos preparados como descrito no Exemplo 3 acima para análise CZE. Surpreendentemente, não foram verificadas diferenças nas titulações dos anticorpos entre misturas reconstituídas preparadas a partir de complexos PCT constitutivos ou induzidos por calor indicando que as respostas imunitárias melhoradas vistas com complexos péptido-PCT induzido por calor foi devido aos complexos formados in situ e não simplesmente devido a uma propriedade do adjuvante do componente PCT. 15/17

Lisboa, 29 de Janeiro de 2010 16/17

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição

wo 9710000 A wo 9710001 A wo 9524923 A wo 97100002 A wo 9834641 A wo 9514093 A wo 9640928 A WO 9002564 A us 5830475 A US 5736164 A wo 9710002 A

Documentos que não Patentes citados na descrição • Gething et ai. Nature, 1992, vol. 355, 33-45 •Li; Sirivastave. Behring Inst. Mitt, 1994, vol. 94, 37-47 • Suzue et al. roc.Natl.Acad.Sei. USA, 1997, vol. 94, 13146-51 • Srivastava. Experimentia, 1994, vol. 50, 1054-60 • Udono, H.; Srivastava, P. K. Journal of Experimental Medicine, 1993, vol. 178, 1391 ff • Udono et al. J.Exp.Med., 1993, vol. 178, 1391-96 • Current Protocols in Immunology. Wiley Interscience, 1997 17/17

Claims (6)

1. Reivindicações 1. Um método para produzir uma composição de vacina compreendendo um determinante imunogénico, compreendendo os seguintes passos: Expondo organismos patogénicos procariotas, protozoários ou fúngicos ao estimulo de indução de choque suficiente para induzir a produção de complexos de proteínas de choque endógenas/fragmentos de péptidos antigénicos. Extraindo os complexos dos fragmentos dos complexos PC/fragmentos de péptidos antigénicos, a partir dos organismos tratados; e Usando os complexos de proteínas de choque/fragmentos de péptidos antigénicos como o determinante imunogénico na preparação da composição da vacina.
2. 2. Um método como reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o estímulo de indução de choque é o calor.
3. 3. Um método como reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de que o organismo patogénico é aquecido de 5 a 8°C acima da temperatura normal de cultivação do organismo.
4. 4. Um método como reivindicado um qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de que o organismo patogénico é um organismo patogénico bacterial.
5. 5. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que o organismo patogénico foi geneticamente modificado para 1/2 induzir ou melhorar a indução da sintese das proteínas de choque.
6. 6. Uso de uma composição de vacina produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 na preparação de uma composição de vacina para provocar uma resposta imune num animal contra o organismo patogénico a partir do qual o complexo de proteína de stress/fragmento antigénico, o qual é o determinante imunogénico na composição da vacina, é derivado. Lisboa, 29 de Janeiro 2010 2/2