CN1751064B - 节杆菌来源的hsp60 - Google Patents

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Abstract

分离并测序了来自节杆菌菌株的hsp60基因。认为其编码的蛋白质具有高度的免疫原性，尤其是在鱼类中，并且具有作为非特异性佐剂和异源抗原的佐剂载体的效用。

Description

节杆菌来源的hsp60
发明领域
本发明涉及来自棒杆菌(Corynebacteria)的热休克蛋白(hsp)基因及其编码的蛋白质。具体来说，它涉及节杆菌(Arthrobacter)属来源的分离的hsp60DNA序列和氨基酸序列及相关序列。另外，本发明涉及节杆菌hsp60作为佐剂或抗原载体在疫苗制剂(特别是鱼类疫苗)中的用途。
发明背景
针对胞内病原体的有效疫苗不仅会刺激经由第二类主要组织相容性复合体(MHC)途径的体液免疫应答，而且(更重要的是)还会通过第一类MHC途径的活化而诱导感染细胞的破坏。通过感染细胞中外源蛋白质的胞质降解，从而外源物质片段被转运到细胞表面以呈递给CD8+细胞毒性T细胞(CTL)，由此实现了后一种应答。不能激活MHC I途径是基于纯化重组抗原的疫苗的共同缺陷。
热休克蛋白是原核和真核细胞产生的分子伴侣蛋白质家族。它在多种胞内及胞间过程中发挥必要的作用，特别是在抗原加工及抗原片段向细胞表面的MHC I系统的呈递中。
活的无毒节杆菌(棒状菌科的成员)菌株已经以Renogen为名的疫苗上市，该疫苗旨在保护鲑鱼及其他养殖鱼类抵卸细菌性肾病(BKD，bacterial kidney disease)。该菌株的特征在WO 98/33884中公开。该疫苗其独特性在于它是第一种被批准在水产业中使用的活培养物。
令人惊讶的是，现在已经表明节杆菌hsp60可以在针对不同病原体的鱼类疫苗中得到有效的利用。
发明概述
第一个方面，本发明公开了一段分离的核酸序列，其含有节杆菌hsp60基因序列，或其片段或同源序列。该基因包括ORF、5’UTR及3’UTR，以及任何组成的启动子、增强子、调节、终止和定位元件。
第二个方面，本发明公开了一段分离的氨基酸序列，其包含节杆菌hsp60蛋白序列，或其免疫原性片段、同源序列或衍生物。
另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含编码节杆菌hsp60蛋白的核酸序列，或节杆菌hsp60多肽分子，或富集hsp60的节杆菌细胞提取物。该疫苗组合物可用于制备用于人的或兽医使用的药物，包括用于水产业。
本发明另一方面提供了包含本发明疫苗组合物和异源抗原或编码异源抗原的核酸序列的试剂盒，所述疫苗组合物、异源抗原或其核酸编码序列用于间隔、连续或同时施用。
本发明另一方面提供了编码完整或部分节杆菌hsp60蛋白与异源多肽的融合蛋白的核酸序列。也提供了融合蛋白本身。
本发明还提供了携带节杆菌hsp60序列(包括嵌合序列)的DNA表达载体，以及用这类DNA表达载体转化的宿主细胞。
本发明还有的方面提供了包含如下多肽的实体，所述多肽包含以共价或非共价方式结合于异源分子的完整或部分节杆菌hsp60蛋白。
本发明另一方面公开了节杆菌hsp60蛋白或核酸序列作为疫苗抗原、佐剂或异源分子载体的用途，目的在于治疗或预防动物疾病。也提供了针对节杆菌hsp60而产生的抗体以及它们在医疗上的用途。
另一方面，本发明提供了在动物中诱导或增强针对免疫原或半抗原的免疫应答的方法，该方法包括对所述动物施用包含本发明hsp60氨基酸序列的药物组合物，该hsp60氨基酸序列以共价或非共价方式连接于异源分子，其中异源分子含有所述免疫原或半抗原。
本发明另一方面提供了治疗或预防鱼类传染病的方法，其包括对鱼类施用含有本发明hsp60核酸序列或氨基酸序列的治疗组合物。
本发明另一方面提供了节杆菌hsp60启动子在体外或体内驱动异源基因表达的用途。
序列表说明
SEQ ID NO：1为从节杆菌ATCC 55921(nt.953-2578)中分离的hsp60基因的DNA编码序列(5’到3’)及5’UTR序列(nt.1-952)的一部分。
SEQ ID NO：2为从hsp基因序列SEQ ID NO：1的ORF预测的氨基酸序列。
发明详述
本发明中hsp60基因及其编码的分离或纯化蛋白质的新序列分别以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2提供。令人惊讶的是，我们发现节杆菌hsp60与分枝杆菌(Mycobacteria)共享一段刺激CTL的表位——特异的九肽(Mhsp65(369-377))。该表位序列为KLAGGVAVI。这强烈暗示节杆菌hsp60能激活MHC I类途径，并因此是非常有希望的免疫刺激剂。
本发明包括与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2基本同源的核酸序列和氨基酸序列。“基本同源”是指序列与参照序列比较时，具有至少60％的同源性，优选至少70％的同源性，更优选与参照序列有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同源性。
为了测定两段氨基酸序列或两段核酸序列的同源性百分比，按最适宜比对的目的排列序列(例如，为了与第二条氨基酸或核酸序列的最佳匹配，可以在第一条氨基酸或核酸序列中引入缺口，并且为了比对的目的，可以忽略缝隙中插入的非同源序列)。不需要两段序列有相同的长度。一般来说，用以比对的序列所跨越的长度是排列的完整程度。任选地，为比对目的而排列的参照序列长度至少是参照序列长度的30％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％、80％或90％。也可将同源性分析限制在参照序列的任何特定部分。
当第一条(参照)序列的某位点与另一序列的相应位点被同一氨基酸残基或核苷酸占据，则两分子在该位点是同源的(即在该位置具有同一性)。由于遗传密码的简并性，在核酸序列比对的情况中，比对的两分子中三联密码子(包括核苷酸)编码相同的氨基酸的位点也具有同源性。
两序列间的同源性百分比是序列间共有的同源位点数目的函数(即：同源性％＝同源位点数目/位点总数)。任选地，可使用数学算法完成序列比对和同源性百分比的测定。适当的算法已经整合入Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.215：430-10)的NBLAST和XBLAST程序中。
本发明的核酸序列还包括在严谨条件下与SEQ ID NO：1参照序列杂交的同源核酸序列。“严谨”的杂交条件在本发明中的意义按照Sambrook等人在《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，1.101-1.104中所述定义，即在55℃(优选62℃，最优选68℃)下以1×SSC缓冲液及0.1％SDS洗涤一小时后，特别是在55℃(优选62℃，最优选68℃)条件下以0.2×SSC缓冲液和0.1％SDS洗涤一小时后，仍可观察到阳性杂交信号。
本发明的序列包括参照核酸序列或氨基酸序列的片段。Hsp60核酸参照序列的“片段”是指包含该序列至少50个，任选至少75个或100个连续核苷酸的序列的任何部分。一类核酸片段的最大长度为600，优选最多300个核苷酸，更优选最多150个核苷酸。在一个实施方案中，本发明的核酸序列片段包含SEQ ID NO：1的ORF。在另一实施方案中，本发明的核酸序列片段编码hsp60的免疫原性蛋白质片段。
Hsp60蛋白的“片段”是指具有hsp60氨基酸参照序列的至少5个、10个、15个或者任选至少25、35或45个连续氨基酸的任一多肽分子。一类氨基酸片段的最大长度为200个氨基酸，优选最多100个氨基酸，更优选最多50个氨基酸。“免疫原性”蛋白质片段是一类蛋白质片段，它能诱导出中和病原体侵染性的抗体并/或介导抗体-补体或抗体依赖的细胞毒性，以保护免疫的宿主。优选的hsp60免疫原性片段包含氨基酸序列KLAGGVAVI这一九肽表位。
本发明的氨基酸序列还包括了SEQ ID NO：2氨基酸序列的衍生物或该序列的同系物。氨基酸序列的“衍生物”是指在氨基酸序列水平(如某些天然存在的氨基酸被人工的氨基酸替代物取代的同源序列)或3D水平与参照序列相关的序列，即与参照氨基酸序列有大致相同的形状和构象的分子。因此，衍生物包括突变体、模拟体、模拟表位(mimotope)、类似物、单体形式及功能等价物。氨基酸序列衍生物保留了如下能力，即诱导产生能识别鱼类病原体(如鲑鱼立克次体(R.salmoninarum))的抗原并与之(交叉)反应的抗体并/或在鱼类中诱导抵卸这些病原体感染的免疫应答。
具体而言，衍生物包括整合了不改变分子免疫特性的保守性氨基酸替换、删除、插入、翻转或添加的类似分子。保守性氨基酸替换包括丝氨酸/丙氨酸、丝氨酸/甘氨酸、天冬氨酸/甘氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、异亮氨酸/缬氨酸。
本发明的hsp60核酸序列可以整合hsp60基因的ORF，也可整合5’非翻译区(UTR)，或其任一部分。本发明包括SEQ ID NO：1中任何启动子、增强子、调节子、终止子和定位元件组分，及其结合异源基因的用途。特别的，本发明还延伸到DNA表达载体，所述载体包含与异源基因连接的节杆菌hsp60启动子序列(来自SEQ ID NO：1)或基本同源的序列，用于驱动该基因的表达。
本文提供的节杆菌hsp60序列列表(SEQ ID NO：1)为经基因组克隆鉴定在节杆菌中存在的基因序列。SEQ ID NO：2为从中推出的氨基酸序列。节杆菌源菌株培养物于1996年12月20日以登录号ATCC 55921保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)。
同属物种的hsp蛋白通常是高度保守的，因此预想其他棒状菌特别是其他节杆菌物种的天然hsp60基因和蛋白质序列分别与SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2不会有显著差异。故本发明也延伸至这些相关的hsp60分子。对一个棒状菌物种hsp60基因序列的认识有助于其他相关生物的相同基因的分离。分离这些基因的流程为本领域公知。
“分离”的hsp60基因或核酸序列应理解为意指以不同于节杆菌基因组中hsp60基因的天然形式存在的基因或序列。编码hsp60的DNA可从表达hsp60的细胞物质中制备的cDNA文库获得(hsp普遍存在且高丰度表达)。hsp60编码基因也可以从基因组文库(如按实施例1所述步骤)或经寡核苷酸合成获得。
可以通过适当的纯化方案，采用标准蛋白质纯化技术从细菌细胞源中分离天然hsp60蛋白。可通过如Western印迹或使用针对节杆菌ATTC55921hsp60抗原的抗体进行免疫沉淀来确证蛋白质的身份。可用N端氨基酸测序来测定部分或全长氨基酸序列。这使得可以设计探针，以有助于从cDNA或基因组文库中分离天然hsp60序列。
可以用为鉴定目的基因或其编码蛋白质而设计的探针(如hsp60抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)来筛选文库。例如，探针可设计成与本文公开的节杆菌基因部分同源。或者，探针也可与其他细菌hsp基因如弧菌(Vibrio)hsp60基因序列高度同源。用所选探针对cDNA或基因组文库实施的筛选可以使用标准流程，如Sambrook等在《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述。分离编码hsp60的基因的替代方案是使用PCR的方法(Sambrook等，见前文；Dieffenbach等，《PCR Primer：A LaboratoryManual》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)).
这些文库筛选方法鉴定的序列可与SEQ ID NO：1中公开的hsp60或公共数据库(如GenBank)中保存并提供的其他已知hsp序列进行比对和匹配。可以通过使用计算机软件程序(如BLAST、BLAST-2、ALIGN、DNAstar、INHERIT)进行序列比对来确定分子中限定区域或全长序列的序列身份(在氨基酸或核苷酸水平)，这些软件使用多种算法测量同源性。
节杆菌hsp60可以纯化或分离的形式作为佐剂结合抗原使用。此处“佐剂”定义为：在施用前与抗原混合或在同一位点分别施用后，能非特异性增强针对抗原的特异免疫应答的物质。在本发明的一方面中，分离或纯化的节杆菌hsp60蛋白作为动物疫苗(特别是鱼类疫苗)的佐剂使用。在一相关应用中，hsp60基因或其部分被置于DNA载体上以辅助核酸疫苗。在本发明范围内，提供的疫苗组合物包含与至少一种其他抗原或编码抗原的核酸序列结合的本发明氨基酸或核酸序列，以及一种或多种可药用赋形剂。其他抗原可以是重组或分离的单抗原，也可以是病原体来源的抗原分子的混合物。
节杆菌作为佐剂的用途允许医生和兽医不再使用传统的减毒活分枝杆菌佐剂，后者由于可能恢复为有毒的细菌菌株而使动物的健康面临风险。对于水产养殖业还有另外一个好处，对鱼类注射节杆菌hsp60核酸或分离的蛋白不会引起破坏外形的肿胀和结瘤，它们在使用传统佐剂时通常会出现，并降低了鱼类的经济价值。
节杆菌hsp60蛋白不但能有效的辅助含有其他抗原的疫苗，它本身也具有免疫原活性。节杆菌hsp60能够为预防或治疗多种人类及牲畜疾病的疫苗提供活性要素，这些疾病包括鱼类病原体引起的疾病，特别是(但不限于)SRS和BKD。本发明的另一方面，疫苗组合物含有分离或纯化的hsp60蛋白作为唯一抗原或免疫原性组分，伴以一种或多种可药用赋形剂。还提供含有表达载体的核酸疫苗组合物，该表达载体包含本发明hsp60核酸序列，其编码的抗原是该疫苗组合物唯一的抗原或免疫原性组分，并伴以一种或多种可药用赋形剂。
节杆菌hsp60的高免疫原性潜能提示了制备hsp60蛋白与异源分子的基因或肽共价缀合物(如嵌合体及融合体)的可能性，异源分子通常为(但不限于)非hsp蛋白(如半抗原)。在此种情况下，hsp60蛋白作为无需佐剂的携带者(carrier)刺激针对其携带异源分子的体液及细胞免疫应答。此处所使用“携带者”指包含T细胞表位的分子，当它与第二种分子共价连接后，有助于诱导和增强对第二种分子(可以为蛋白质、肽、寡核苷酸或寡糖)的免疫应答。
此种疫苗开发途径在目的抗原肽不太大且具弱免疫原性，而又可作为疫苗的合适靶标的情况下特别有利。Hsp60携带的异源分子是蛋白质半抗原和非蛋白质分子(如碳水化合物部分)是有利的。
此处使用的hsp60“融合蛋白”包含了与不同多肽(“异源多肽”)有效连接的hsp60多肽。“异源多肽”或“非hsp60多肽”指含有与hsp60基本非同源蛋白质相应的氨基酸序列的多肽。在hsp60融合蛋白中hsp60多肽可对应于hsp60蛋白的全长或一部分。在融合蛋白中，“有效连接”一词指hsp60多肽及非hsp60多肽彼此框内融合。非hsp60多肽可与hsp60多肽N端或C端融合，也可嵌入hsp60多肽中。
除了形成融合蛋白以外，还可通过共价或非共价键将hsp60多肽与异源分子连接。“异源分子”指除了hsp60蛋白以外的任何蛋白质、多肽、寡核苷酸或寡糖分子。例如，可以将化学间隔臂基团插入多肽之间，如创建具有hsp60-X-异源分子这一通式的分子，X为间隔臂基团，如一个或多个氨基酸的短序列。除了通过酰胺键在氨基酸直链上共价键连接外，hsp60多肽也可以通过如化学缀合或通过化学、光(如紫外光)或放射诱导交联而共价连接于非hsp分子。戊二醛及巯基结合的接头为合适的化学交联剂的实例。特别的可能为以商业试剂盒形式提供的EDC+NHS或sulfo-NHS、sulfo-SMCC、sulfo-SBED和SAED。
本发明优选的实施方案中，hsp60多肽与半抗原缀合。半抗原指能与抗体结合的低分子量物质(例如肽或寡糖)，它只有在与大的承载分子共价结合后才能诱导免疫应答。
通过与细胞裂解物、级分、提取物、病毒颗粒等体外络合，可以将hsp60与来自抗原细胞或颗粒的蛋白质完整群体缀合。
异源分子或多肽可以为任何来源，但最可能的是病原生物的组分。具体而言，它们可为来自病毒、细菌、原生动物、寄生虫或动物(特别是水生动物)真菌病原体的多肽。
通过将来自节杆菌的分离hsp60基因克隆进用于大量产生纯化或分离重组hsp60蛋白(或hsp60融合蛋白)的表达载体，可以常规方式利用此基因。纯化的hsp60抗原也可由非重组技术获得。该蛋白质是高丰度的，可用常规纯化方法从细胞中提取。另外，可使用标准肽合成技术化学合成hsp60蛋白或多肽。含有此纯化或分离的重组或非重组蛋白的疫苗称为基于抗原的疫苗。
“分离的”或“纯化的”蛋白质的定义是基本不含有细胞物质或hsp60蛋白来源细胞或组织中其他的污染蛋白质，或化学合成后基本不含有化学前体或其他化学物质。“基本不含有细胞物质”这一用语包括hsp60蛋白制剂，其中蛋白质分离自细胞组分，该细胞组分来自分离或重组产生所述蛋白质的细胞。在一实施方案中，“基本不含有细胞物质”这一用语包括非hsp60蛋白(此处也称为“污染蛋白质”)含量小于约30％(干重)的hsp60蛋白制剂，更优选污染蛋白质低于20％，甚至更优选污染蛋白质低于10％，最优选污染蛋白质低于5％。当重组产生hsp60蛋白或其生物活性部分后，还优选基本不含培养基，即：蛋白质制剂中培养基体积含量小于20％，优选小于10％，最优选小于5％。
“富集”hsp60的节杆菌细胞提取物也可作为分离或纯化的hsp60的替代物用于本发明的实施。“富集”细胞提取物可通过如下步骤获得：灭活或杀死节杆菌全细胞，裂解细胞，用常规方法分级得到的细胞溶胞产物，鉴定与其他级分相比含有更多hsp60蛋白的级分(如通过蛋白质印记)。也可通过在导致热休克蛋白提高表达的条件(即热或其他细胞应急条件)下培养节杆菌细胞，然后灭活或杀死细胞，并裂解细胞而制备富集hsp60的细胞提取物。任选分级得到的细胞提取物(裂解物)并鉴定富集hsp60的级分。
优选通过标准重组DNA技术产生本发明hsp60嵌合或融合蛋白。例如按照常规技术框内连接编码不同多肽序列的DNA片段，如通过平末端或黏性末端进行连接，限制性内切酶消化以获得适当的末端，适当填补黏性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，酶连接。另一实施方案中，融合基因也可由包括DNA自动合成仪在内的常规技术合成。另外，也可以使用能在两连续基因片段间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，连续的基因片段随后可退火结合并再次扩增，以产生嵌合的基因序列(如：参阅《Current Protocols in Molecular Biology》Ausubel等编John Wiley&Sons：1992)。
本发明另一方面涉及载体，尤其是包含hsp60(或其一部分)编码核酸序列的表达载体。本文中术语“载体”指能够转运与其相连的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，指可连接入附加DNA片段的圆形双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，附加DNA片段可被连接入病毒基因组中。某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常重组DNA技术中使用的表达载体为质粒形式。尽管如此，本发明意图包括具有等同功能的其他载体形式，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
本发明表达载体以适于核酸在宿主细胞中表达的形式含有本发明核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个与要表达的核酸序列有效连接的调节序列，调节序列的选择基于用于表达的宿主细胞。本发明表达载体可用于在意图接受hsp60抗原的受者中表达(作为DNA疫苗)，或在宿主生物中而不是最终受者中表达(用于产生重组抗原疫苗)。
在表达载体中，“有效连接”意指目标核苷酸序列以可使其表达的方式(如置于体外转录/翻译系统或在载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)与调节序列连接。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如多腺苷酸化信号)。这些调节序列可见于如Goeddel《GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185》，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。调节序列包括那些在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的和那些只在某些宿主细胞中指导表达的序列(如组织特异性调节序列)。本领域技术人员会理解，表达载体的设计依赖于如转化宿主细胞的选择、需要的蛋白质表达水平等因素；本发明表达载体可被引入宿主细胞而产生由本文所述核酸编码的、包括融合蛋白或肽在内的蛋白质或肽(如hsp60蛋白、hsp60突变形式、hsp60与异源肽的融合蛋白等)。
本发明另一方面涉及本发明重组表达载体引入其中的宿主细胞。宿主细胞可以为任何原核或真核细胞(包括多细胞真核生物中的真核细胞)。例如，hsp蛋白质可在大肠杆菌等细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他适合的宿主细胞为本领域技术人员所公知(如Goeddel，见前文)。可以设计重组表达载体使其在鱼类宿主细胞中表达(伴随DNA疫苗接种)。另外，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核细胞中的表达最通常是在大肠杆菌中完成，使用的载体包含指导融合或非融合蛋白表达的组成型或可诱导启动子。融合载体对其中编码的蛋白质添加一些氨基酸(通常在重组蛋白的氨基端)。在融和表达载体中，通常在融合部分和重组蛋白之间的结合处引入蛋白酶切割位点，以便将重组蛋白与融合部分分离，进而纯化融合蛋白。这些酶及其其识别序列包括凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶。常见的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.及Johnson，K.S.(1988)Gene67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)、pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白融合。
hsp60基因可整合到核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine，NAV)中，并由此使NAV被活体动物宿主细胞吸收，并在细胞溶胶中表达hsp60基因。胞内的hsp60抗原小肽被转运至细胞表面，并可在此与MHC I系统接触，因此NAV来源的hsp60抗原被理想地定位以诱发细胞免疫应答。
为在鱼类细胞中体内表达，可将插入DNA载体的hsp60基因直接对鱼接种(如口服、肌肉或腹膜内注射)。DNA疫苗接种也可在其他动物物种中进行。因而本发明一方面提供了包含可药用载体和DNA质粒的核酸疫苗，该质粒上编码hsp60的核酸序列有效连接于转录调节序列。转录调节序列包括启动子、多腺苷酸化序列及其他核苷酸序列，如含有未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸，或编码其他抗原蛋白质或佐剂细胞因子的核苷酸序列。真核或病毒转录调节序列的存在使hsp60基因可在鱼类细胞中表达。DNA质粒本身可在细菌细胞中复制以制备疫苗组合物，但通常缺乏允许hsp60基因在原核细胞中表达的转录调节序列。为达到最好的体内表达效果，可优选被接种鱼类内源性转录调节序列。例如，可考虑内源细胞因子或肌动蛋白基因启动子。DNA可以裸露形式存在，或者也可以与促进细胞吸收的试剂一起施用(如脂质体或阳离子脂类)。鱼类DNA疫苗接种技术在本文引用为参考的US 5,780,448中有更详细的阐述。
本发明还涉及使用hsp60蛋白与分子连接形成的缀合物产生该分子的单克隆或多克隆抗体的方法。在此实施方案中，在动物宿主中引入有效剂量(即可导致宿主免疫应答的剂量)的缀合物，使得宿主中产生针对该物质的抗体。从宿主中取出抗体，并以已知技术(如层析)纯化，由此产生多克隆抗体。另外，应用本发明方法产生的抗体也可用于生成可使用已知技术产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的一个实施方案中，使用节杆菌hsp60基因的启动子序列驱动异源基因(即除节杆菌hsp60编码基因以外的基因)表达。该启动子可插入生物染色体DNA中异源基因的上游、或插入染色体外的质粒或其他表达载体。例如，在需要过表达内源节杆菌基因或将外来基因插入节杆菌内源质粒的情况下，上游hsp60启动子能应答于热激等刺激而驱动该异源基因表达。
根据本发明方法制备的疫苗适于对任何拥有相当于哺乳动物体液和/或细胞免疫系统的动物种类施用。前述“动物”及“哺乳动物”包括人类。节杆菌hsp60可用来辅助任何哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类的疫苗。同样的，节杆菌hsp60在疫苗中可作为共价结合抗原的携带者，任选地排除任何常规佐剂(所谓的“非佐剂”疫苗)。节杆菌hsp60也可在疫苗中作为免疫原(任选地作为唯一的免疫原)使用以引起针对特定疾病的免疫应答，特别是鲑鱼立克次体败血症(Salmonid Rickettsial Septicemia，SRS)、细胞性肾病(BKD)及其他鱼类传染病。
术语“疫苗”以广义使用，不仅包括用于针对病原体免疫接种的组合物，而且包括抗肿瘤疫苗、基于自生抗原的疫苗(如用于化学去势(chemicalcastration))等。在兽医疫苗接种范围内，考虑接种的主要陆生动物种类包括牛、马、羊、猪及家禽。就水产业而言，本发明疫苗可用于有壳水生动物或有鳍鱼，特别是硬骨鱼类如鲑鱼、鳟鱼、鲤鱼、海鲷、海鲈、师鱼(yellowtail)、鲶鱼、大比目鱼、鳕鱼的治疗或任选地用于治疗其他水生物种如甲壳动物(如虾、对虾、龙虾、蟹)及软体动物(如牡蛎、贻贝)。疫苗中适宜与节杆菌hsp60序列结合的候选抗原没有限制。致病抗原可得自细菌、病毒、原生动物、线虫及真菌。特别集中于来自鱼类病原生物的抗原，特别是表面抗原。
Hsp60氨基酸或核酸序列可结合来源于患病的有壳水生动物或有鳍鱼的细菌、原生动物、病毒或真菌抗原或与其缀合后用于疫苗组合物，这些抗原(或其编码序列)来自于：传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、传染性造血组织坏死病毒(IHNV)、虹彩病毒、神经坏死病毒(NNV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、黄头病毒(YHV)、桃拉综合症病毒(TSV)、白斑综合症病毒(WSSV)、鲑肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)(细菌性肾病BKD致病剂)、鲑鱼立克次体(Piscirickettsia salmonis)(鲑鱼立克次体败血症致病剂)、弧菌属某些种、气单胞菌属某些种(Aeromonas spp)、鲁氏耶尔森菌(Yersinia rukerii)、假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等。已有很多并仍不断增加的来自以上及其他病原生物的多肽被纯化和/或克隆并表达，并可用来在疫苗中与节杆菌hsp60或其编码序列缀合，或与其结合。优选的实例包括IPNV蛋白质VP1、VP2、VP3、NS及其核苷酸编码序列；WO 01/10469中公开的ISAV蛋白质，包括血凝素、核壳、聚合酶、片段7的P4及P5蛋白质及其核苷酸编码序列；WO 01/68865中公开的鲑鱼立克次体蛋白质包括OspA、IcmE及它们的核苷酸编码序列；野田村病毒蛋白质(如核壳)；SPDV结构多肽及它们的核苷酸编码序列(公开于WO 99/58639)。本发明优选的疫苗组合物包含携带与IPNVVP2序列或IPNVVP3序列框内融合的hsp60核苷酸序列的DNA表达载体。任选地，该疫苗包含一个携带hsp60-VP2融合蛋白的质粒和另一个携带hsp60-VP3融合蛋白的质粒。
Hsp60序列也可用于结合其他动物病原体及寄生虫抗原连接或与其缀合，包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV)、口蹄疫病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、3型副流感病毒(P13)、传染性牛鼻气管炎(IBR)、猪呼吸及生殖综合征病毒(PRRSV)、分枝杆菌、利什曼原虫(Leishmania)、埃里希氏体(Ehrlichia)、艾美球虫(Eimeria)、梭菌(Clostridia)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、支原体(Mycoplasma)(如牛支原体(M.bovis)、猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae))、钩端螺旋体(Leptospira)、短螺菌(Brachyspira)、沙门氏菌(Salmonella)、布鲁氏菌(Brucella)、新孢菌(Neospora)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、梭杆菌(Fusobacterium)、大肠杆菌、冠形病毒(Coronavirus)、曼氏溶血杆菌(Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、锥虫(Trypanosoma)、边虫(Anaplasma)、密螺旋体(Trponema)等。
本发明包括结合任何前述抗原或其编码序列的hsp60序列制备在疫苗组合物中的用途，该疫苗组合物用于治疗或预防这些抗原所来源的致病因子感染而引起的疾病。
在本发明一实施方案中，节杆菌hsp60蛋白或核酸序列包含于同时含有节杆菌hsp70蛋白或核酸序列的疫苗中。此二基因或抗原在单个疫苗组合物中的组合可以累加或协同地提高疫苗效力。节杆菌hsp70为2003年7月14日提交的共同未决申请PCT/EP03/07602的主题。
连同hsp60基因或蛋白质提供的疫苗抗原可与hsp60化学缀合(在一个嵌合体或融合蛋白中)，或二者以共存于单个疫苗组合物中的独立分子提供。另一选择为可以在试剂盒中提供hsp60基因或蛋白与抗原或编码抗原的核酸序列，用于间隔、连续或同时施用。连同hsp60基因或蛋白提供的疫苗抗原可为菌苗、细胞提取物、重组蛋白、质粒携带的基因或活的/减毒的病原体菌株。
本融合或分离的hsp60蛋白可以中性或盐形式免疫受者，单独或与可药用载体或赋形剂形成混合物施用均可。疫苗通常制备为溶液或悬液的液态形式，也可制备为适于在施用前溶解或混悬于液态载体的固体形式(如冻干的物质)。可乳化制剂或以脂质体载体包被活性成分。本发明药物组合物可以速释或延长释放的形式施用。
在疫苗组合物制备中与本发明抗原或核酸分子混合的可药用赋形剂或载体例如有水、盐水、右旋糖、甘油、辅助物质(如湿润剂或乳化剂，填充剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、pH缓冲剂)或佐剂，如胞壁酰二肽、阿夫立定、氢氧化铝、油类、皂苷类、阻段共聚物及其他本领域公知的物质。
为了免疫受者，可以胃肠外施用hsp60抗原或hsp融合蛋白或hsp60基因载体，通常于合适载体中肌内注射，但也可选择皮下途径、静脉注射、皮内或鼻内递送。在鱼类抗原免疫情况中，通常施用途径为腹膜腔注射、肌内注射、随饲料口服或浸渍。本发明优选的抗原疫苗组合物为适于注射或浸渍施用的形式。DNA疫苗接种通常经肌内注射。
有效剂量可依赖于受者的种类和大小而变化，并取决于施用模式。医生或兽医可反复试验确定最佳剂量。Hsp60抗原单独剂量通常在每千克体重约0.01到1000μg范围内，优选每千克0.5到500μg，更优选每千克0.1到100μg。对于DNA疫苗，从每只动物10pg质粒的最小剂量到高达1000μg的剂量，可允许抗原在体内表达。
作为本发明一部分而公开的新抗原也可用于筛选病原蛋白质的抗体及筛选毒性和环境胁迫效应(toxic and environmental stress effect)。本发明此外还包括了这些抗原的诊断用途，如用于制备有助于检验动物致病生物存在的诊断试剂盒。
本发明也包含针对本文公开的纯化的hsp60抗原和/或hsp60融合蛋白产生的抗体。此类抗体可预期在疾病控制及鱼类健康中具有诊断和治疗应用。多克隆抗体及单克隆抗体都可用于这一方面。以蛋白质免疫小鼠等动物的流程以及选择产生免疫原特异性单克隆抗体的杂交瘤选择的流程为本领域公知(例如见Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497)。夹层测定法及ELISA可能被作为诊断方法的特例提到。
本发明的hsp60核酸序列有诊断应用，例如在用于PCR扩增分析法的引物设计中。
实施例
实施例1：来自节杆菌ATCC 55921基因组的hsp60基因的分离及测序
将5毫升节杆菌ATCC 55921培养物在含卡那霉素(30μg/ml)的LB中于30℃过液振荡生长。然后根据产品说明书使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra)或Instagene TM Resin进行DNA提取。
使用保守的分枝杆菌序列进行的PCR
几种分枝杆菌及链霉菌hsp60(groEL)序列在核苷酸水平上最具相似性的区域用来设计节杆菌hsp60基因PCR及测序的引物。选择的引物包括groEL-OFP(5’-GTCCGTCGCGGGCACT-3’)，groEL-1F(5’-CCCACGATCACCAACGA-3’)，groEL-1R(5’-CCTCGATGCGGTGCTTG-3’)，groEL-2R(5，-CCTTGTCCATSGCCTCg-3’)。这些引物用于在50℃或60℃退火温度及不同镁及DMSO用量条件下的PCR反应中扩增节杆菌DNA。分别使用OFP/2R及1F/1R引物扩增约595bp及0bp的DNA片段。使用QiagenPCR纯化试剂盒(根据产品说明书)提纯PCR产物，并用用于PCR的每个引物，根据产品说明书使用BigDye引物化学(Applied Biosystems)测序。简言之，使用ABI PRISM(8μl)BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction混合物，约600ng DNA模板、3.2pmol适当引物、加ddH2O至20μl制备延伸反应混合物。测序循环的条件如下：热循环仪设置为由96℃10s，50℃5s，60℃4min组的25个循环。测序显示该片段与几种分枝杆菌的groEL基因具有高度同源性，并以此作为基因组步查的起点。
基因组步查
基因组步查用于延伸已鉴定序列的5’及3’端。如《Genome Walker》手册(Clontech)中描述的，根据前文所述hsp60类似序列设计引物。最初建立了4个基因组文库(Dral，EcoRV，Pvull，Stul)，其后又建立了另外三个文库(Alul，Scal，SnaF1)。所有文库及随后的PCR反应如《GenomeWalker》手册中所述。为延伸基因序列进行了数轮基因组步查。
使用Genecode’s Sequencher软件将序列排列成重叠群。使用重叠序列的Genbank搜索确定重叠群含有hsp60基因。
可以发现节杆菌hsp60蛋白(及基因)与其他种属特别是细菌物种的同系物具有相似性。
实施例2：基于与hsp60基因融合的IPNV核酸疫苗
将在流动淡水中饲养的大西洋鲑(Salmo salar)鱼苗(pre-smolts)(35-40g)用稀释于洁净池水的苯佐卡因麻醉。接种前将6条鱼以致死的过量麻醉剂处死，并从尾静脉取血得到免疫前血清。
将50μl核酸疫苗及PBS对照在背部左侧紧贴背鳍下肌内注射，以接种。每次重复接种40尾鱼(每组80尾，分在两水箱中)。接种后将鱼放回淡水并分配到其正确的水箱中。
测试的核酸疫苗为：pUKrsxHSP60-ipnVP2及pUKrsxHSP60-ipnVP3。这些质粒分别携带了在CMV启动子控制下的节杆菌hsp60全长编码序列与IPNV VP2或IPNV VP3框内融合的产物。单独测试了PUKrsxHSP60-ipnVP2，并一起测试了两个质粒。
为了比较，也制备了另一质粒，它含有与先前研究已知能加强VP2组分约20％免疫效力的序列3’端融合的IPN VP2蛋白(即“黄金标准”(goldstandard)的基于VP2的IPNV核酸疫苗)。
接种后六周将鱼转移至海水中。攻击(challenge)前一天每个重复组中取4条鱼采集血清样本。同时取注射位点肌肉样本并福尔马林固定以寻找疫苗的存在。攻击后21天从每个重复组中取最多四条存活鱼的血清样本。攻击后每天将死鱼立即移出，采集肾脏样本冻存待ELISA分析。
由于与已经腹膜内注射致病IPNV(106cfu)攻击的标记同胞鱼共栖，攻击在转移至海水4-6周后发生。试验于20周后结束。
结果表明所有基于IPNV的VP2序列的核酸疫苗在面临病毒攻击时都具有保护作用，包括hsp60-VP2融合物。
实施例3：ISAV疫苗中的重组Hsp60
实验前一周使大西洋鲑的幼鲑适应于提供通气的充分流动水(10℃)的0.5m贮藏水箱，并在整个实验过程中每天喂养。每组55尾鱼分开到25个水箱中的2个，以提供重复处理组。大西洋鲑幼鲑在ISAV攻击后死亡率约为60-80％。
将鱼麻醉后腹膜内注射接种0.2ml盐水或0.2ml含有特定重组蛋白的盐水。阴性对照为注射PBS(盐水)。处理组为：(A)His标记的纯化节杆菌hsp60重组蛋白，12μg；(B)His标记的ISAV重组核壳体蛋白质(NC)，12μg；(C)His标记的纯化节杆菌hsp60重组蛋白(12μg)，混合His标记的ISAV NC(12μg)；(D)His标记的ISAV NC(12μg)交联的His标记的纯化节杆菌hsp60重组蛋白(12μg)。
处理组D接受了共价交联蛋白质。根据标准方案，使用EDC及sulfo-NHS作为交联剂。
采用共栖攻击(cohabitation challenge)，在少量鱼腹腔内注射0.1ml培养的致病ISAV(每条鱼约104TCID50)并加入处理鱼的各水箱中。每天监控各水箱中的死亡数。
通过在特定时间点比较不同处理组与对照的死亡率来评估相对存活百分比。

Claims (26)

1.编码节杆菌hsp60的分离核酸序列，其选自如SEQ ID NO：1所示的核酸序列，或者SEQ ID NO：1中953-2578位核苷酸的ORF，或者编码SEQ ID NO：2的核酸序列。
2.分离hsp60核酸序列，其来自以登录号ATCC 55921保藏的活的无毒节杆菌菌株。
3.嵌合核酸序列，其含有与异源编码序列框内融合的权利要求1或2中的分离核酸序列。
4.根据权利要求3的嵌合核酸序列，其中所述异源编码序列编码来自动物病原体的抗原。
5.含有权利要求1-4中任一项核酸序列的DNA表达载体，其中所述核酸序列有效连接于转录调节序列。
6.用权利要求5的DNA表达载体转化的宿主细胞。
7.分离的节杆菌hsp60氨基酸序列，其如SEQ ID NO：2所示。
8.分离hsp60氨基酸序列，其来自以登录号ATCC 55921保藏的活的无毒节杆菌菌株。
9.通过将根据权利要求7或8的分离的氨基酸序列整合九肽序列KLAGGVAVI而形成的氨基酸序列。
10.根据权利要求7-9中任一项的氨基酸序列与异源分子共价或非共价连接而形成的缀合分子。
11.根据权利要求10的缀合分子，其为融合蛋白。
12.根据权利要求10或权利要求11的缀合分子，其中所述异源分子选自细菌、病毒、真菌、原生动物、线虫和肿瘤的抗原。
13.权利要求1-4中任一项的核酸分子编码的分离氨基酸序列。
14.编码权利要求7-9中任一项的分离氨基酸序列的分离核酸序列。
15.编码权利要求10-12中任一项的缀合分子的分离核酸序列。
16.疫苗组合物，其含有权利要求1-4中任一项的核酸序列，或权利要求5的DNA表达载体，或权利要求7-9中任一项的氨基酸序列，或权利要求10-12中任一项的缀合分子，及可药用载体。
17.根据权利要求16的疫苗组合物，其还含有至少一种异源抗原或编码异源抗原的核酸序列。
18.含有根据权利要求16或权利要求17的疫苗组合物以及异源抗原或编码异源抗原的核酸序列的试剂盒。
19.根据权利要求1或2的核酸序列，或根据权利要求7-9中任一项的氨基酸序列在制备非特异性疫苗佐剂中的用途。
20.针对权利要求7-9中任一项的氨基酸序列或者权利要求10-12中任一项的缀合分子产生的单克隆抗体。
21.根据权利要求1-4中任一项的核酸序列，或根据权利要求5的DNA表达载体，或根据权利要求7-9中任一项的氨基酸序列，或者权利要求10-12中任一项的缀合分子的用途，用于制备使动物对传染病免疫的药物。
22.根据权利要求21的用途，其中所述动物为硬骨鱼。
23.根据权利要求22的用途，其中所述药物为用于预防或治疗以下任一项的疫苗：细菌性肾病(BKD)、鲑鱼立克次体败血症(SRS)、传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)。
24.根据权利要求1-4中任一项的核酸序列，或根据权利要求5的DNA表达载体，或根据权利要求7-9中任一项的氨基酸序列，或权利要求10-12中任一项的缀合分子在制备诊断传染病或环境胁迫的药物中的用途。
25.根据权利要求20的单克隆抗体在制备用于诊断或治疗传染病的药物中的用途。
26.制备根据权利要求16或17的疫苗组合物的方法，其包含将所述氨基酸序列或所述核酸分子与可药用赋形剂混合的步骤和任选地混合所述异源抗原或编码异源抗原的所述核酸序列的步骤。
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