CN113493788B

CN113493788B - 一种分枝杆菌启动子库及其应用

Info

Publication number: CN113493788B
Application number: CN202110567959.3A
Authority: CN
Inventors: 郭铦; 周亚凤; 申兆兴
Original assignee: Shanghai Gene Optimal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Gene Optimal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113493788A

Abstract

本发明公开了一种分枝杆菌启动子库及其应用，所述分枝杆菌启动子库，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。本发明针对目前分枝杆菌启动子可选用少，以及因而以此为基础而开发的分子生物学研究工具(表达系统、诱导调控系统等)受限的问题，提供了一种新的分枝杆菌强启动子库。本发明解决了分枝杆菌启动子数目少、表达强度不理想等问题。本发明方法制备得到的分枝杆菌启动子库数目较多、表达强度较高、表达强度梯度范围较广。为开发新疫苗和新型分枝杆菌研究工具打基础。

Description

一种分枝杆菌启动子库及其应用

技术领域

本发明涉及分枝杆菌技术领域，具体地，涉及一种分枝杆菌启动子及其应用。

背景技术

结核病是由单一致病菌—结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种广泛存在且在很多情况下可致命的慢性传染病，一直以来严重危害人类健康。根据世界卫生组织发布的《2020年全球结核病报告》显示，2019年，全球新发结核病患者约996万人，发病率为130/10万，30个结核病高负担国家的新发患者数占全球患者总数的86％。自2020年初以来，新冠疫情对人类健康、社会和经济造成了巨大影响，并有可能在2021年及以后持续下去。即使有些影响得到了控制，仍将产生中、长期后果，包括对结核病流行和应对的影响，这一大流行有可能逆转2019年底前结核病所取得的进展。

由于结核病防治的重大科技瓶颈问题没有解决，致使全球近100年没有结核病预防的新疫苗、没有针对耐药结核病治疗的新药物。而造成这种局面的根本原因，就是由于缺乏有效的生物资源和研究工具，制约了科研人员对结核菌致病分子机制的深入研究。结核分枝杆菌中与免疫和毒力调控相关的蛋白的结构与功能的研究显得更为重要，可为潜在疫苗的设计和药物靶标的筛选提供依据。

目前，在分枝杆菌中过表达基因常用启动子为Phsp60/70启动子，该启动子在分枝杆菌中组成型表达热休克蛋白，在以此启动子为模板基础上开发了一些蛋白表达载体等等工具。但由于启动子数目较少、表达强度不理想等原因，导致科研工作者能够运用的探索工具也极度缺乏，限制了继续开发新的研究工具及手段，制约对结核菌致病分子机制的深入研究。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种分枝杆菌启动子库及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种分枝杆菌启动子库。

本发明的第二个目的是提供一种分枝杆菌启动子。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组菌株。

本发明的第五个目的是提供所述的分枝杆菌启动子在表达分枝杆菌蛋白中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种在分枝杆菌中构建不同表达强度的启动子库的方法。

本发明的第六个目的是提供一种表达系统。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

发明以分枝杆菌中常用强启动子Phsp60为基础启动子模板，删除多余的、无用的序列，同时对启动子核心序列进行多位点随机突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于其启动子序列的核心序列中的18个核苷酸是随机的，其启动子的强度会有差异，这就构成了一个有很多强度不同的启动子组成的库。该启动库中的中的启动子的强度有强有弱，最强的与最弱的启动子的强度差异大，之间的不同启动子按强度排列会形成一个强度梯度，这个梯度范围很大。

进一步用报告基因eGFP定量表征启动子的相对表达强度，该表征构件将被连接至骨架质粒pMV261(大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒)，序列信息为SEQ ID NO.2，图谱信息为图1，得到定量表征系统。该定量表征系统被转化至耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌中，通过流式细胞仪或酶标仪测定菌株荧光表达强度，从而相对定量表征启动子库中的各启动子表达强度，技术流程见图2。该分枝杆菌强启动子库可被用于分枝杆菌的表达系统的构建、新型疫苗的开发等领域。

因此本发明要求保护以下内容：

一种分枝杆菌启动子库，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。

一种分枝杆菌启动子，其序列为所述的启动子库中的启动子序列。

优选地，其序列核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。该启动子在分枝杆菌表达体系内启动子活性很强。

一种重组载体，为含有所述的分枝杆菌启动子的质粒。

优选地，所述质粒为大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒。

更优选地，所述大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒为pMV261或pMV361。

一种重组菌株，为含有所述的重组菌株的受体菌。

优选地，所述受体菌为结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。

所述的分枝杆菌启动子在表达分枝杆菌蛋白中的应用，也属于本发明的保护范围。

一种在分枝杆菌中构建不同表达强度的启动子库的方法，构建含有所述的启动子库的表达系统，转入分枝杆菌，定量检测表达效率。

一种表达系统，其包含所述的启动子库中的启动子序列。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明针对目前分枝杆菌启动子可选用少，以及因而以此为基础而开发的分子生物学研究工具(表达系统、诱导调控系统等)受限的问题，提供了一种新的分枝杆菌强启动子库以及一种启动子活性强的分枝杆菌表达系统启动子。本发明解决了分枝杆菌启动子数目少、表达强度不理想等问题。本发明方法制备得到的分枝杆菌启动子库数目较多、表达强度较高、表达强度梯度范围较广。为开发新疫苗和新型分枝杆菌研究工具打基础。

附图说明

图1为分枝杆菌启动子库系统质粒图谱。

图2为定量表征启动子库技术流程。

图3为耻垢分枝杆菌菌株的荧光强度检测。

图4为结核分枝杆菌菌株的荧光强度检测。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1分枝杆菌启动子库的设计

分枝杆菌中常用强启动子Phsp60为基础启动子模板，除多余的、无用的序列，构建启动子库，其中，

根据文献中(Stover C K,De L,Fuerst T R,et al.New use of BCG forrecombinant vaccines[J].Nature,1991,351(6326):456-460.)启动子Phsp60的5’-RACE结果，确定其转录起始位点(TSS)是两个相邻的G。转录起始位点之后至核糖体结合位点(RBS)之间是163个核苷酸，具有温度调控的作用，由于需要构建的是组成型表达启动子，不需要温度调控，因此这163bp是不需要的，进行删除；

核糖体结合位点之后至翻译起始位点之间是11个核苷酸，为了不影响转录后RNA的结构，保留这11bp的序列；

将启动子核心序列之间的18个核苷酸替换成任意核苷酸N，从而获得分枝杆菌启动子库，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。

SEQ ID NO.1：

GGTACCGTGACCACAACGACGCGCCCGCTTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGTTGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCCGGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTCGAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGAATAACGTTGGCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA。

实施例2定量表征分枝杆菌启动子库系统菌株构建

一、实验方法

1、目的基因eGFP、Phsp60M、Phsp60ML的引物设计、合成及扩增

目的基因eGFP(SEQ ID NO.10)、Phsp60M(SEQ ID NO.3)和Phsp60ML(SEQ IDNO.1)通过基因从头合成得到，以合成的质粒产物为模板，进行PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳分离目的DNA片段，使用Omega公司胶回试剂盒回收目的DNA片段备用。

其中，Phsp60M为Phsp60ML不含有18bp的启动子核心序列，作为对照。

其中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物进行PCR扩增eGFP基因；

使用核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物进行PCR扩增Phsp60M基因；

使用核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增Phsp60ML基因。

SEQ ID NO.4：

CGGTGCGGGGCTTCTTGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGAATAACGTTGGCCCGATC，

SEQ ID NO.5：

CGAAGTGATTCCTCCGGATCGGGCCAACGTTATTCTT，

SEQ ID NO.6：

ATCCAGCTGCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC，

SEQ ID NO.7：

GACATCGATAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC，

SEQ ID NO.8：

TCCGTGGCGCGGCCGCGGTACCGTGACCACAACGACGCG，

SEQ ID NO.9：

CGCCCTTGCTCACCATGAATTCTGCAGCTGGATCCGCAA。

2、pMV261-Phsp60ML-eGFP、pMV261-Phsp60M-eGFP和pMV261-Phsp60-eGFP重组质粒的构建

LB培养含pMV261质粒的大肠杆菌DH5α菌株，使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pMV261质粒使用KpnI/HindIII限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒。

胶回收的目的基因eGFP、Phsp60M DNA片段和线性化质粒pMV261，经30℃反应1小时(进行同源重组)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含100μg/ml硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜。挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养，菌液经擎科公司测序验证序列无突变。然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得pMV261-Phsp60M-eGFP重组质粒，经过测序后验证pMV261-Phsp60M-eGFP质粒构建成功。

将获得的pMV261-Phsp60M-eGFP重组质粒使用BsaI限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒。胶回收的目的基因Phsp60MLDNA片段和线性化质粒pMV261-Phsp60M-eGFP，放置于16℃金属浴连接2小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含100μg/ml硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜。挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养，菌液经擎科公司测序验证序列无突变。

然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得pMV261-Phsp60ML-eGFP重组质粒(图1)，经过测序后验证pMV261-Phsp60ML-eGFP质粒构建成功。

pMV261质粒使用EcoRI/HindIII限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒，将目的基因eGFP与pMV261使用T4连接酶连接，放置于16℃金属浴连接2小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含100μg/ml硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜。挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养，菌液经擎科公司测序验证序列无突变，获得pMV261-Phsp60-eGFP质粒，作为阳性对照质粒。

3、分枝杆菌的转化与验证

取一管耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌感受态细胞与10μL pMV261-Phsp60ML-eGFP、pMV261-Phsp60M-eGFP和pMV261-Phsp60-eGFP重组质粒分别混合，放置10min，转入2mm电转杯中电击，电击参数是：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。电击完后，立即加入1ml预先放置室温下的7H9(BD，271310)+OADC液体培养基(BD，212351)，待37℃复苏过夜后，室温5000rpm离心10min，去掉大部分上清，剩余100～200μl重悬菌体涂平板，使用7H10+OADC固体培养基(含有相应的抗生素)培养，得到了耻垢分枝杆菌pMV261-Phsp60ML-eGFP、结核分枝杆菌pMV261-Phsp60ML-eGFP和结核分枝杆菌pMV261-Phsp60-eGFP。挑取平板上长出的部分单克隆菌落接种7H9+OADC液体培养基(含30μg/ml硫酸卡那霉素)，37℃摇床200rpm震荡培养1～2天，菌液经擎科公司测序验证序列无突变的分别命名为pMV261-Phsp60ML1-eGFP到pMV261-Phsp60ML41-eGFP(其对应的带有的启动子为Phsp60ML1到Phsp60ML41)。

实施例3耻垢分枝杆菌pMV261-Phsp60ML-eGFP的荧光强度检测

一、实验方法

将得到的阳性耻垢分枝杆菌转化子运用溶菌酶处理成原生质体，然后将原生质体状态的阳性耻垢分枝杆菌转化子通过流式细胞仪检测。

具体步骤如下：

1、耻垢分枝杆菌菌株的检测前预处理

收集1ml培养至对数生长期的实施例2制备得到待检测的耻垢分枝杆菌菌株pMV261-Phsp60ML-eGFP(pMV261-Phsp60ML1-eGFP到pMV261-Phsp60ML41-eGFP)、pMV261-Phsp60-eGFP和pMV261-Phsp60M-eGFP，用1ml MP buffer(MP buffer：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM MgSO₄，2mM CaCl₂ pH 7.5或7.8)洗涤菌体2次离心获得的菌体。用1ml MPbuffer(含有2mg/mL溶菌酶)重悬洗涤后的菌体，37℃反应60分钟。处理后菌体过脱脂棉球柱，放置4℃待检测。

2、耻垢分枝杆菌菌株的荧光强度检测

吸取100μl过滤后耻垢分枝杆菌原生质体，加入流式管中，再添加900μl已加PI(碘化丙啶)的MP buffer(PI终浓度5μg/ml)。室温(25℃)避光放置5分钟。流式细胞仪上样，检测参数设置FSC-487，SSC-276，FL1-473，FL2-427；threshold：FSC-328，SSC-321。进行检测记录数据。

二、实验结果

结果如图3所示和表1所示。

表1：

结果说明，在以耻垢分枝杆菌为宿主，检测所构建的启动子库的结果显示，该启动子库中的启动子表现出了不同的强度，且强度梯度范围广。其中，pMV261-Phsp60ML41-eGFP检测到的荧光值最强，说明其对应的启动子ML41有很强的启动子活性，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示。

SEQ ID NO.11：

GGTACCGTGACCACAACGACGCGCCCGCTTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGTTGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCCGGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTCGAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGAGTCTCCCTATCAGTAAGAATAACGTTGGCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA。

实施例4结核分枝杆菌pMV261-Phsp60ML-eGFP的荧光强度检测

一、实验方法

将得到的阳性耻垢分枝杆菌转化子运用超生分散仪处理成原生质体，然后超声分散仪处理后的阳性耻垢分枝杆菌转化子通过流式细胞仪检测。

具体步骤如下：

1、结核分枝杆菌菌株的检测前预处理

收集1ml培养至对数生长期的实施例2制备得到待检测的待检测结核分枝杆菌菌株pMV261-Phsp60ML-eGFP(pMV261-Phsp60ML1-eGFP到pMV261-Phsp60ML41-eGFP)、pMV261-Phsp60-eGFP和pMV261-Phsp60M-eGFP，用1ml MP buffer(MP buffer：50mM Tris-HCl，150mM NaCl,10mM MgSO₄,2mM CaCl₂ pH 7.5或7.8)洗涤菌体2次离心获得的菌体。用1ml MPbuffer重悬洗涤后的菌体，使用超声分散仪处理1分钟(超声处理10秒，间歇10秒)。处理后菌体室温放置待检测。

2、结核分枝杆菌菌株的荧光强度检测

吸取250μl超声分散仪处理后结核分枝杆菌菌体，加入96孔板。酶标仪上样，荧光检测参数设置：激发光485nm，发射光525nm。菌体浓度检测参数：600nm。记录数据。

二、实验结果

结果如图4所示和表2所示。

表2：

结果说明，在以结核分枝杆菌为宿主，检测所构建的启动子库的结果显示，该启动子库中的启动子同样表现出了不同的强度，且强度梯度范围广，与耻垢分枝杆菌相比，趋势一致。同样地，MV261-Phsp60ML41-eGFP检测到的荧光值最强，说明其对应的启动子ML41有很强的启动子活性，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 上海晶诺生物有限公司

<120> 一种分枝杆菌启动子库及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaccgtga ccacaacgac gcgcccgctt tgatcgggga cgtctgcggc cgaccattta 60

cgggtcttgt tgtcgttggc ggtcatgggc cgaacatact cacccggatc ggagggccga 120

ggacaaggtc gaacgagggg catgacccgg tgcggggctt cttgcacnnn nnnnnnnnnn 180

nnnnnaagaa taacgttggc ccgatccgga ggaatcactt cgca 224

<210> 2

<211> 5037

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctagccacc tgacgtcggg ggggggggaa agccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt 60

tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac 120

agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga 180

ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg 240

caatcaggtg cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccc atgcgccaga gttgtttctg 300

aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg 360

ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca 420

tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct 480

gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt 540

cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca 600

cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct 660

gttgaacaag tctggaaaga aatgcataat cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc 720

actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt 780

attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac 840

tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat 900

aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagaa 960

ttggttaatt ggttgtaaca ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcggcttt 1020

gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg 1080

cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc tacaacaaag 1140

ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt caggcctggt 1200

atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcacta gttccactga gcgtcagacc 1260

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 1320

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 1380

ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 1440

tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 1500

tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 1560

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 1620

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt 1680

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 1740

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 1800

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 1860

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 1920

cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 1980

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcaac gcgtgagccc 2040

accagctccg taagttcggg tgctgtgtgg ctcgtacccg cgcattcagg cggcaggggg 2100

tctaacgggt ctaaggcggc gtgtacggcc gccacagcgg ctcttagcgg cccggaaacg 2160

tcctcgaaac gacgcatgtg ttcctcctgg ttggtacagg tggttggggg tgctcggctg 2220

tcgctggtgt ttcatcatca gggctcgacg ggagagcggg ggagtgtgca gttgtggggt 2280

ggcccctcag cgaaatatct gacttggagc tcgtgtcgga ccatacaccg gtgattaatc 2340

gtggtttatt atcaagcgtg agccacgtcg ccgacgaatt tgagcagctc tggctgccgt 2400

actggtccct ggcaagcgac gatctgctcg aggggatcta ccgccaaagc cgcgcgtcgg 2460

ccctaggccg ccggtacatc gaggcgaacc caacagcgct ggcaaacctg ctggtcgtgg 2520

acgtagacca tccagacgca gcgctccgag cgctcagcgc ccgggggtcc catccgctgc 2580

ccaacgcgat cgtgggcaat cgcgccaacg gccacgcaca cgcagtgtgg gcactcaacg 2640

cccctgttcc acgcaccgaa tacgcgcggc gtaagccgct cgcatacatg gcggcgtgcg 2700

ccgaaggcct tcggcgcgcc gtcgatggcg accgcagtta ctcaggcctc atgaccaaaa 2760

accccggcca catcgcctgg gaaacggaat ggctccactc agatctctac acactcagcc 2820

acatcgaggc cgagctcggc gcgaacatgc caccgccgcg ctggcgtcag cagaccacgt 2880

acaaagcggc tccgacgccg ctagggcgga attgcgcact gttcgattcc gtcaggttgt 2940

gggcctatct tcccgccctc atgcggatct acctgccgac ccggaacgtg gacggactcg 3000

gccgcgcgat ctatgccgag tgccacgcgc gaaacgccga atttccgtgc aacgacgtgt 3060

gtcccggacc gctaccggac agcgaggtcc gcgccatcgc caacagcatt tggcgttgga 3120

tcacaaccaa gtcgcgcatt tgggcggacg ggatcgtggt ctacgaggcc acactcagtg 3180

cgcgccatgc ggccatctcg cggaagggcg cagcagcgcg cacggcggcg agcacagttg 3240

cgcggcgcgc aaagtccgcg tcagccatgg aggcattgct atgagcgacg gctacagcga 3300

cggctacagc gacggctaca actggcagcc gactgtccgc aaaaagcggc gcgtgaccgc 3360

cgccgaaggc gctcgaatca ccggactatc cgaacgccac gtcgtccggc tcgtggcgca 3420

ggaacgcagc gagtggttcg ccgagcaggc tgcacgccgc gaacgcatcc gcgcctatca 3480

cgacgacgag ggccactctt ggccgcaaac ggccaaacat ttcgggctgc atctggacac 3540

cgttaagcga ctcggctatc gggcgaggaa agagcgtgcg gcagaacagg aagcggctca 3600

aaaggcccac aacgaagccg acaatccacc gctgttctaa cgcaattggg gagcgggtgt 3660

cgcgggggtt ccgtgggggg ttccgttgca acgggtcgga caggtaaaag tcctggtaga 3720

cgctagtttt ctggtttggg ccatgcctgt ctcgttgcgt gtttcgttgc gtccgttttg 3780

aataccagcc agacgagacg gggttctacg aatcttggtc gataccaagc catttccgct 3840

gaatatcgtg gagctcaccg ccagaatcgg tggttgtggt gatgtacgtg gcgaactccg 3900

ttgtagtgct tgtggtggca tccgtggcgc ggccgcggta ccgtgaccac aacgacgcgc 3960

ccgctttgat cggggacgtc tgcggccgac catttacggg tcttgttgtc gttggcggtc 4020

atgggccgaa catactcacc cggatcggag ggccgaggac aaggtcgaac gaggggcatg 4080

acccggtgcg gggcttcttg cacnnnnnnn nnnnnnnnnn naagaataac gttggcccga 4140

tccggaggaa tcacttcgca atggccaaga caattgcgga tccagctgca gaattcatgg 4200

tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 4260

acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 4320

agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 4380

tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 4440

acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 4500

aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 4560

accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 4620

tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 4680

tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 4740

actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 4800

tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 4860

tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaaagc 4920

ttatcgatgt cgacgtagtt aactagcgta cgatcgactg ccaggcatca aataaaacga 4980

aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatgccat catggccgcg gtgatca 5037

<210> 3

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaccgtga ccacaacgac gcgcccgctt tgatcgggga cgtctgcggc cgaccattta 60

cgggtcttgt tgtcgttggc ggtcatgggc cgaacatact cacccggatc ggagggccga 120

ggacaaggtc gaacgagggg catgacccgg tgcggggctt gagacctttt ttttggtctc 180

agatccggag gaatcacttc gcaatggcca agacaattgc ggatccagct gcagaattc 239

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtgcgggg cttcttgcac nnnnnnnnnn nnnnnnnnaa gaataacgtt ggcccgatc 59

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaagtgatt cctccggatc gggccaacgt tattctt 37

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccagctgc agaattcatg gtgagcaagg gcgaggagc 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacatcgata agcttttact tgtacagctc gtccatgcc 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccgtggcgc ggccgcggta ccgtgaccac aacgacgcg 39

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcccttgct caccatgaat tctgcagctg gatccgcaa 39

<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 11

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtaccgtga ccacaacgac gcgcccgctt tgatcgggga cgtctgcggc cgaccattta 60

cgggtcttgt tgtcgttggc ggtcatgggc cgaacatact cacccggatc ggagggccga 120

ggacaaggtc gaacgagggg catgacccgg tgcggggctt cttgcactcg agtctcccta 180

tcagtaagaa taacgttggc ccgatccgga ggaatcactt cgca 224

Claims

1.一种分枝杆菌启动子，其特征在于，所述分枝杆菌启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示。

2.一种含有权利要求1所述分枝杆菌启动子的质粒，其特征在于，所述质粒为大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒。

3.根据权利要求2所述的质粒，其特在在于，所述大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒为pMV261或pMV361。

4.一种表达系统，其特征在于，其包含权利要求1所述的分枝杆菌启动子。