ES2330738T3 - Vacuna contra septicemia rickettsial de salmonidos basada en arthrobacter. - Google Patents
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Abstract
Uso de células de Arthrobacter vivas en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de piscirickettsiosis en peces.
Description
Vacuna contra septicemia rickettsial de
salmónidos basada en Arthrobacter.
La presente invención trata del uso de una cepa
viva de Arthrobacter en la preparación de un medicamento
para tratar o prevenir septicemia rickettsial de salmónidos (SRS),
y de vacunas basadas en estas bacterias.
Piscirickettsia salmonis es una bacteria
intracelular estricta Gram negativa que provoca septicemia sistémica
(síndrome rickettsial de salmónidos, SRS o piscirickettsiosis) en
peces salmónidos. Bacterias similares a Piscirickettsia se
están reconociendo con frecuencia creciente en una variedad de otras
especies de peces, de aguas tanto dulces como saladas de todo el
mundo. La piscirickettsiosis y enfermedades similares a la
piscirickettsiosis han afectado a la productividad y la
rentabilidad de la piscicultura, a las especies compatibles con la
cría comercial y al transporte de peces de un lugar a otro. Solo la
industria de la piscicultura chilena atribuye a la
piscirickettsiosis de salmónidos unas pérdidas anuales de 150
millones de dólares de EE. UU. de A. En Chile, el síndrome ha
conducido a un cambio desde la especie más deseable comercialmente
salmón Coho al menos deseable pero más resistente a la
piscirickettsiosis salmón del Atlántico como la principal especie
cultivada.
Se han probado antimicrobianos como una terapia
para la SRS, pero sin un éxito consistente. Otras medidas sugeridas
incluyen intentos de reducir el estrés en los peces reduciendo la
densidad de carga y retirando peces muertos de los tanques sin
retraso. La solución más práctica para la SRS epidémica sería en
primer lugar encontrar una vacuna eficaz para prevenir la
enfermedad. Se ha observado que preparaciones de bacterina
desactivada procedentes de P. salmonis tienen algún efecto
protector, y pueden ser la única opción adecuada para la
coadministración en preparaciones oleosas multivalentes, pero son
relativamente costosas de producir a escala comercial. Todavía no
han llegado al mercado vacunas basadas en antígenos recombinantes
procedentes de P. salmonis.
De acuerdo con esto, existe una necesidad
urgente de disponer de una vacuna capaz de reducir
significativamente las mortalidades debidas a piscirickettsiosis en
peces. La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que un producto vacunal comercial existente es
notablemente eficaz para prevenir la enfermedad. Esta vacuna se
comercializa bajo el nombre "Renogen^{TM}" y comprende una
cepa viva no virulenta de Arthrobacter. Actualmente, esta
vacuna está indicada para proteger al salmón y otros peces de
piscifactoría contra la enfermedad renal bacteriana (BKD, por sus
siglas en inglés). Las características de esta cepa se describen en
WO 98/33884.
En un aspecto de la invención, se proporciona el
uso de células de Arthrobacter vivas en la preparación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de
piscirickettsiosis en peces. Los objetivos preferidos del
medicamento son peces salmónidos expuestos a riesgo de infección por
SRS. Las células de Arthrobacter proceden preferiblemente de
la cepa depositada bajo el número de registro ATCC 59921, o una cepa
equivalente.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona una composición vacunal que comprende células vivas de
Arthrobacter y antígeno de Piscirickettsia salmonis
desactivado, en donde la vacuna se proporciona opcionalmente en la
forma de un estuche que comprende un cultivo liofilizado de células
vivas de Arthrobacter y un diluyente estéril que comprende
el antígeno de P. salmonis desactivado.
La vacuna Renogen^{TM} se ha usado durante
algún tiempo para combatir la enfermedad renal bacteriana (BKD, por
sus siglas en inglés) en peces salmónidos. Esta vacuna es única ya
que es el primer cultivo vivo en haberse autorizado para el uso en
piscicultura, y comprende un cultivo vivo de Arthrobacter sp.
nov., depositado bajo el Nº de Registro ATCC 55921 en the American
Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209) el 20 de diciembre de 1996.
Arthrobacter no es patógena para los peces; ni es el agente
causal de la BKD (que es Renibacterium salmoninarum).
Se observó en una zona que el uso de
Renogen^{TM} en una población de salmones con riesgo de contraer
BKD conducía a una reducción drástica en las tasas de mortalidad en
comparación con los peces no tratados. La ganancia de peso media en
el grupo tratado con Renogen era 18% mayor que en el grupo de peces
no tratados. La SRS también era común en la zona, lo que condujo a
los presentes inventores a especular que Renogen^{TM} puede haber
conferido protección oculta contra SRS así como BKD.
Para probar este concepto, peces mantenidos en
tanques se inmunizaron con Renogen^{TM} y subsiguientemente se
estimularon con P. salmonis, según se describe en el Ejemplo
2. En el grupo de control negativo, que ha recibido inyecciones de
solución salina, casi todos los peces sucumbieron a la SRS. Los
grupos de prueba que habían recibido la vacuna Renogen^{TM}
exhibían tasas de mortalidad extremadamente bajas después de 471 dg
(días-grado), ascendiendo hasta entre 88 y 100 de
porcentaje de supervivencia relativo (RPS, por sus siglas en
inglés). Incluso después de
1441 dg (equivalentes a un año en agua marina), los grupos de prueba tenían un RPS de entre 69 y 85%, en comparación con solamente 48,6% en el grupo de "patrón oro" de P. salmonis desactivada.
1441 dg (equivalentes a un año en agua marina), los grupos de prueba tenían un RPS de entre 69 y 85%, en comparación con solamente 48,6% en el grupo de "patrón oro" de P. salmonis desactivada.
Una evidencia adicional del potencial para la
vacunación con Renogen^{TM} se demuestra por la reactividad
cruzada del antígeno de P. salmonis cuando se explora con
anticuerpos anti-Arthrobacter policlonales de conejo (Ejemplo
1).
Se ha observado que Renogen^{TM} es más eficaz
que cualquier otra vacuna conocida para prevenir la SRS. Se sabe
que las bacterias Arthrobacter vivas son capaces de entrar en
las células y replicarse durante un período de tiempo limitado. Los
presentes inventores creen que esto permite el procesamiento
antigénico de antígenos tanto de carbohidrato como de proteína con
una homología suficiente con epítopos de células T de P.
salmonis para proporcionar un alto nivel de protección frente a
la estimulación directa con P. salmonis virulenta.
Por lo tanto, la invención proporciona el uso de
células Arthrobacter en la preparación de un medicamento
para el tratamiento o la prevención de piscirickettsiosis en peces,
en particular peces salmónidos, incluyendo especies de salmón y
trucha, particularmente salmón Coho (Oncorhynchus kisutch),
salmón Chinook (Oncorhynchus tshawytscha), salmón masu
(Oncorhynchus masou), salmón rosa (Oncorhynchus
gorbuscha), trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y
salmón del Atlántico (Salmo salar). Sin embargo, puede
beneficiarse cualquier otra especie de pez susceptible de
piscirickettsiosis o una enfermedad similar, tal como, Tilapla
sp., corvina negra (Dicentrarchus sp.), corvina blanca
(Atractoscion nobilis), mero, cíclidos etc.
Renogen^{TM} se basa en una cepa depositada
particular de Arthrobacter (ATCC 59921). Al ejecutar la
presente invención, puede emplearse esta cepa o cepas equivalentes
de Arthrobacter. Cepas de Arthrobacter equivalentes
comparten las características identificativas de Arthrobacter
ATCC 59921. Presentan capacidades protectoras similares contra SRS.
Se considera que una especie de Arthrobacter que tiene una
secuencia de rDNA 16S idéntica o una secuencia de rDNA 16S que
tiene una divergencia de menos de 3% con la cepa ATCC 59921 es
equivalente. Esta secuencia de rDNA 16S está depositada bajo el
número de registro del Genbank AF099202. Otro método para definir
una cepa equivalente es mediante el ensayo de RAPD que usa en
cebador F12-373
(5'-ACGGTACCAG-3'), según se
describe en Griffiths, SG et ál. (1998) Fish & Shellfish
Immunology 8: 607-619. Un fragmento distintivo de
aproximadamente 373 pb se genera cuando este ensayo se realiza sobre
Arthrobacter ATCC 59921 y cepas equivalentes. Un ensayo de
RAPD alternativo descrito en la misma publicación que usa los
cebadores Rsxll-67f
(5'-CTGTGCTTGCACGGGGGATTA-3')
y Rsxll-284r (5'-GTGGCCGGTCACCCTCTCAG-3') da un fragmento de 260 pb cuando se realiza sobre Arthrobacter ATCC 59921 o cepas equivalentes.
y Rsxll-284r (5'-GTGGCCGGTCACCCTCTCAG-3') da un fragmento de 260 pb cuando se realiza sobre Arthrobacter ATCC 59921 o cepas equivalentes.
Las especies del género Arthrobacter son
numerosas y abundantes en diversos hábitats, incluyendo ambientes
marinos. Muchas cepas de Arthrobacter están disponibles de
instituciones depositarias comerciales. No es demasiado engorroso
para el experto rastrear una selección de cepas conocidas o cepas
recientemente aisladas con respecto a las características
identificativas y/o las propiedades inmunogénicas hacia SRS
identificadas en la presente memoria. Las propiedades inmunogénicas
hacia SRS pueden identificarse mediante los ensayos de rastreo
descritos en el párrafo precedente y/o mediante los procedimientos
experimentales descritos en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2.
La ruta de administración preferida de la vacuna
es mediante inyección en la cavidad peritoneal, pero existen otras
rutas de administración, incluyendo la oral en el alimento, mediante
inyección intradérmica o intramuscular, o mediante inmersión en
agua marina o en agua dulce. Los peces se anestesian habitualmente
antes de recibir la vacuna mediante inyección. Se recomienda que
los peces tengan 10 gramos o más de peso corporal para la
administración de la vacuna de la invención mediante inyección
intraperitoneal. Para la administración mediante inmersión u oral,
se prefiere un peso corporal de al menos 2 gramos.
La dosificación eficaz de vacuna puede variar
dependiendo del tamaño y la especie del sujeto, y de acuerdo con el
modo de administración. La dosificación óptima puede ser determinada
a través de aproximaciones sucesivas por un especialista en
veterinaria o piscicultura. Un intervalo de dosificación adecuado
puede ser de aproximadamente 10^{2} a 10^{9} cfu por dosis
unitaria, preferiblemente de aproximadamente 10^{4} a 10^{7} cfu
por dosis unitaria, más preferiblemente de aproximadamente 10^{5}
a 10^{6} cfu por dosis unitaria, y lo más preferiblemente
aproximadamente 10^{5} cfu por dosis unitaria. Sin embargo,
también pueden ser eficaces dosis superiores o inferiores.
Preferiblemente, se administra una sola unidad de dosificación al
pez que ha de tratarse. Los peces menores pueden beneficiarse de
una dosis de aproximadamente 10^{4} a 10^{7} cfu/ml con
administración por baño (inmersión), por ejemplo con un tiempo de
contacto de aproximadamente 60 segundos. Para la administración por
inmersión, la vacuna puede diluirse en de 1 a 10 volúmenes de agua
antes de añadir a los tanques o las jaulas que contienen los
peces.
Un volumen de dosificación preferido para
inyecciones es aproximadamente 0,05-0,5 ml,
preferiblemente 0,075-0,25 ml, más preferiblemente
0,1-0,2 ml, opcionalmente aproximadamente 0,1
ml.
Debido a la dependencia del desarrollo de la
inmunidad con la temperatura del agua, se prefiere que los peces no
se expongan a infección por SRS hasta al menos 400
días-grado después de la vacunación con la vacuna de
Arthrobacter de la invención (días-grado =
nº de días x temperatura media del agua en ºC).
En una realización de la invención, células
vivas de Arthrobacter se combinan con un portador o vehículo
farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéutica.
Portadores/vehículos adecuados incluyen excipientes convencionales,
por ejemplo, disolventes tales como agua, aceite o solución salina,
dextrosa, glicerol, agentes humectantes o emulsionantes, agentes de
aumento de volumen, revestimientos, aglutinantes, cargas,
desintegrantes, diluyentes, lubricantes, agentes tamponadores del
pH o adyuvantes convencionales tales como dipéptidos muramílicos,
avridina, hidróxido de aluminio, aceites (por ej. aceite mineral),
saponinas, copolímeros de bloques y otras sustancias conocidas en
la técnica. Una composición farmacéutica preferida comprende un
diluyente de solución salina.
Típicamente, las vacunas se preparan como
soluciones o suspensiones líquidas para inyección o para el aporte
en agua. También pueden prepararse formas sólidas (por ej. polvo)
adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos,
o para mezcladura con alimento sólido antes de la
administración.
Preferiblemente, la vacuna es un cultivo
liofilizado. En esta forma, la vacuna es adecuada para la
reconstitución con un diluyente estéril. Por ejemplo, las células
liofilizadas pueden reconstituirse en solución salina al 0,9%
(opcionalmente proporcionada como parte del producto vacunal
envasado). Las composiciones vacunales farmacéuticas de la
invención pueden administrarse en una forma para liberación
inmediata o liberación prolongada.
La vacuna de Arthrobacter también puede
comprender un inmunoestimulante. El inmunoestimulante puede ser
cualquier inmunoestimulante conocido, pero preferiblemente es una
preparación bacteriana muerta. Preferiblemente, el
inmunoestimulante es material de células de Arthrobacter
muertas, que opcionalmente se mata térmicamente y opcionalmente
procede de un cultivo de Arthrobacter ATCC 59921. Ejemplos
adecuados de preparaciones bacterianas muertas incluyen:
"Peptimune" (un cultivo de Arthrobacter ATCC 59921
muerto térmicamente) y "Ultracom" (lisado de
Corynebacterium cutis sometido a ultrasonicación). Una
dosificación óptima de inmunoestimulante bacteriano muerto es (por
dosis unitaria de vacuna) de 1 a 100 \mug, preferiblemente en el
intervalo de 5 a 50 \mug, más preferiblemente de 10 a 20 \mug y
opcionalmente aproximadamente 12 \mug de materia celular. El
inmunoestimulante bacteriano muerto opcionalmente se disuelve o
suspende en diluyente estéril (por ej. solución salina) para
mezclar con células de Arthrobacter vivas liofilizadas.
La invención, en un aspecto, proporciona una
composición vacunal que comprende células de Arthrobacter
vivas y que comprende además al menos otro inmunógeno (donde un
"inmunógeno" se define como una molécula tal como un antígeno
capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica en un pez).
El inmunógeno se selecciona opcionalmente del grupo que consiste
en: antígeno desactivado preparado a partir de Piscirickettsia
salmonis (P. salmonis); un antígeno de P.
salmonis recombinante; y un vector de ácido nucleico que porta
un antígeno de P. salmonis expresable. En algunos casos,
puede ser deseable combinar la vacuna Renogen^{TM} de la
invención con vacuna convencional para SRS (bacterina o vacuna
antigénica recombinante o vacuna de ácido nucleico de P.
salmonis) en un estuche que comprende ambos componentes para
administración separada, secuencial o simultánea, para el
tratamiento o la prevención de SRS.
En una realización preferida, la invención se
refiere a una vacuna que comprende células de Arthrobacter
vivas y antígeno de P. salmonis desactivado. El antígeno de
P. salmonis puede prepararse mediante desactivación usando
cualquier agente desactivante conocido, pero se prepara
preferiblemente mediante desactivación con formalina. El antígeno
de P. salmonis puede prepararse a partir de cualquier aislado
de la bacteria. Opcionalmente, la cepa LF-89
depositada bajo el número de ATCC VR-1361, o una
cepa derivada de la misma, se usa para preparar el antígeno
desactivado.
Un procedimiento adecuado para desactivar el
antígeno de P. salmonis es recoger el sobrenadante de
cultivos de células CHSE-14 infectados con P.
salmonis y añadir formalina (solución de formaldehído al 37%)
hasta una concentración final de 0,125% (v/v). La mezcla de fluido
de cultivo/formalina se remueve hasta homogeneidad y a continuación
se mantiene a 42ºC con agitación constante durante un mínimo de 72
horas. El material recogido desactivado puede concentrarse mediante
ultrafiltración estéril. Una concentración final adecuada de la
preparación de antígeno de P. salmonis definida por una
relación del inmunoensayo enzimático (EIA, por sus siglas en
inglés), expresada como OD_{405/490} del antígeno/OD_{405/490}
del patrón, es 1,5 \pm 0,2 unidades.
La combinación de componentes de
Arthrobacter y P. salmonis en una sola vacuna conduce
a un aumento significativo de la protección contra SRS en
comparación con la vacuna de células de Arthrobacter vivas
sola. En un experimento de estimulación con SRS similar al descrito
en el Ejemplo 2, se observó que durante el largo plazo (por encima
de 1400 días-grado) la vacuna bivalente suma más de
20 puntos RPS (porcentaje relativo de supervivencia, por sus siglas
en inglés) en comparación con la vacuna de Arthrobacter viva
monovalente.
Preferiblemente, esta vacuna se produce y se
vende en la forma de un estuche que comprende un cultivo liofilizado
de células de Arthrobacter vivas, junto con un diluyente
estéril, tal como solución salina, en el que esta disuelto o
suspendido el antígeno de P. salmonis desactivado (y
opcionalmente un inmunoestimulante bacteriano muerto). Por ejemplo,
el antígeno de P. salmonis preparado elaborado como se
describe anteriormente puede estar mezclado con el diluyente en una
concentración de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150
ml/litro, preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente
100 ml/litro, y lo más preferiblemente 75 ml/litro.
Las vacunas que incorporan células de
Arthrobacter vivas no solo protegen contra la SRS sino que
también dan protección a los peces contra la infección por BKD.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 25 \mug de células bacterianas
de P. salmonis triplemente lavadas recogidas de un cultivo
de células CHSE-214 se mezclaron con 100 \mul de
tampón de Laemmli y se calentaron a 95ºC durante 3 minutos.
Muestras de 10 \mul se cargaron sobre un gel de acrilamida al 9% y
se sometieron a electroforesis a 150 voltios durante 1 hora para
separar las proteínas. Las proteínas se transfirieron a una membrana
de nitrocelulosa al 100% usando un "transblotter" semiseco
(BIORAD). La transferencia de proteínas se realizó a 20 voltios
durante 50 minutos.
La mancha se incubó con 20 \mul de anticuerpos
policlonales anti-Arthrobacter de conejo durante 45 minutos
en 15 ml de solución salina de trisborato de caseína (cTBS, por sus
siglas en inglés) al 1%. La mancha se expuso a continuación a 5
\mul de anti-(inmunoglubulina de conejo)
caprina-fosfatasa alcalina (GAR-AP,
por sus siglas en inglés), y se reveló. Varias proteínas destacaban
en la mancha, indicando que los anticuerpos proteínicos
anti-Arthrobacter tienen una fuerte afinidad hacia ciertas
proteínas de P. salmonis. Este resultado también se confirmó
en una transferencia Western bidimensional.
Este experimento muestra que ciertas proteínas
de P. salmonis y Arthrobacter reaccionan cruzadamente,
indicando que estas proteínas de Arthrobacter pueden cebar
el sistema inmunitario para producir anticuerpos potencialmente
capaces de reconocer y proteger contra bacterias virulentas P.
salmonis.
\vskip1.000000\baselineskip
Salmones Coho (n = 110 por grupo de tratamiento,
peso medio 10 g) se mantuvieron bajo condiciones de producción
normales en agua de tanque de acuerdo con procedimientos de
operación estándar a 12ºC. Después de una semana de aclimatación,
los Grupos 1, 2 y 3 se vacunaron intraperitonealmente con 0,1 ml de
10^{5}, 10^{6} y 10^{7} cfu/dosis, respectivamente, de
células de Arthrobacter sp. nov liofilizadas (Renogen^{TM})
reconstituidas en diluyente salino. Los Grupos 4 y 5 se trataron de
manera idéntica al Grupo 1, pero con la adición de 12,2 \mug y 50
\mug por dosis, respectivamente, de "Peptimune" en el
diluyente salino. Peptimune es una preparación de
Arthrobacter muertas térmicamente en cultivo líquido (caldo
MTSB) hasta una densidad celular de >1xE9, y estandarizada
mediante ensayo proteínico para administrar 12 y 50 \mug por
dosis. Los Grupos 6 y 7 eran controles positivos vacunados con
bacterina de P. salmonis. La bacterina se preparó a partir
del sobrenadante de un cultivo de células CHSE-14
infectadas con P. salmonis tipo cepa LF-89
usando formalina al 0,125% a 4ºC durante un período mínimo de 72 h.
Se empleó la concentración U/F y el sobrenadante concentrado se usó
para incorporar 8 \mug (proteína) por dosis de 0,1 ml. La vacuna
de bacterina se aportó con Ultracom (Virbac, Francia) en 20 (Grupo
6) y 100 \mug (Grupo 7) por pez. Ultracorn es un inmunoestimulante
basado en un lisado de Corynebacterium cutis sometido a
ultrasonicación. Los antígenos se emulsificaron con un volumen
igual de adyuvante de aceite mineral antes de la inyección. El grupo
de control negativo (Grupo 8) recibía una inyección de solución
salina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página
siguiente)
\newpage
La Tabla 1 resume los grupos de tratamiento
(volumen de la dosis (0,1 ml por pez) para 20 ml):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A los 471 y 1441 dg (días-grado)
después de la vacunación, grupos duplicados de 25 peces por
tratamiento fueron estimulados con P. salmonis virulenta
mediante inyección intraperitoneal. La P. salmonis virulenta
se cultivó sobre células CHSE-14 durante un mínimo
de 2-3 semanas. Se usaron para las inyecciones i.p.
sobrenadantes de cultivo que alcanzaban al menos 50% de CPE. Las
inyecciones de P. salmonis virulenta se administraron con
diluciones de 10^{-2} o más en 0,1 ml por pez (n = 25). Los peces
estimulados se mantuvieron a 12ºC.
Antes de la terminación de la estimulación 1, 10
peces de las poblaciones supervivientes del Grupo 1, 7 y 8 (solo 8
peces eran sobrevivientes en este grupo) se sacrificaron y una
muestra de tejido esplénico y renal de 0,5 g se tomó, se
homogeneizó y se diluyó en 10 ml de medio de cultivo tisular. Se
determinó una TCID_{50} sobre placas de 96 pocillos que contenían
células CHSE-214 confluentes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el estudio de seguridad, se observó que
los peces del Grupo 3 sufrían alguna pérdida (6,3%) cerca del final
del período de seguridad de 28 d. El investigador de laboratorio
trataba a todos los peces de la población con un tratamiento de
tres días de formalina para la enfermedad branquial bacteriana. La
mortalidad (3,6%) en el Grupo 5 se registró durante el período
inicial de tres días después de la vacunación, indicando que la
inclusión de Peptimune como 40% del diluyente era algo tóxica. Las
placas no positivas se cultivaron a partir de las pérdidas durante
el período de seguridad, bien para la cepa vacunal viva o bien para
cualesquiera cultivos bacterianos incidentales.
A los 471 dg después de la vacunación, los peces
del Grupo 1 tenían un porcentaje de supervivencia relativo (RPS,
por sus siglas en inglés) de 97,6, un alto nivel de protección de la
infección directa con P. salmonis a lo largo de 32 días,
donde la mortalidad en el grupo de control de solución salina era
84%. Esto se comparó favorablemente con la protección acumulada a
partir de la vacunación con las vacunas desactivadas estándar
(Grupos 6 y 7), que mostraban valores de RPS de 50 y 69%,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Nivel de infección con SRS en las muestras de
tejido de los peces supervivientes a partir de la estimulación de
471 dg (n = 7-10), 32 días después de la
infección:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La TCID_{50} de los peces muestreados del
grupo de Renogen^{TM} era inferior que la del grupo de vacuna
desactivada, y ambas eran inferiores que los controles de solución
salina. Esto no es de una importancia clínica evidente, ya que la
contribución de los grupos de alta concentración anula las
dosificaciones infectivas inferiores cuando se promedian. Sin
embargo, el grupo de Renogen^{TM} tenía el porcentaje de positivos
más bajo (< 20%) ya que no se consideraba que las muestras con
menos de 10^{2} estuvieran clínicamente infectadas con SRS. Esto
se compara con las mismas muestras procedentes del grupo de control
con solución salina en el que 50% de los peces eran positivos con
respecto a SRS, y favorablemente con el grupo de vacuna desactivada
con 44% de los peces positivos con respecto a SRS.
Después de un período transcurrido de 1140 dg,
se determinó la respuesta temporal de la protección observada en el
período de ensayo inicial (471 dg). Los resultados de la segunda
estimulación en la que se observaba un nivel de 72% de mortalidad
en el grupo de control con solución salina indican que el nivel de
protección todavía es alto con peces tratados con Renogen^{TM}
(69,4% de RPS), con alguna indicación de que una dosificación
superior puede mejorar la protección a largo plazo (10^{6} y
10^{7} cfu/dosis tenían una RPS de 85,8 y 81,7, respectivamente).
La adición del inmunoestimulante Peptimune en 12 y 50 \mug al
diluyente proporcionaba una mejora en la eficacia del producto a la
dosis (76,1 y 79,7%, respectivamente). La pérdida accidental de la
vacuna de referencia estándar (grupo 6) permitía la comparación con
el Grupo 7 solamente, y este grupo tenía una RPS de 48,6%.
Renogen proporcionaba una protección
significativa contra la estimulación directa con P. salmonis
a los 471 dg y a los 1441 dg después de la vacunación. La vacuna
era superior a la protección proporcionaba por la vacuna oleosa
estándar. Se pudo demostrar que menos peces supervivientes en el
grupo de Renogen^{TM} estaban clínicamente infectados con P.
salmonis. El estudio demuestra que la vacuna viva de
Arthrobacter sp. nov. proporciona un grado de protección
alto contra infección por P. salmonis, y que se muestra que
el efecto protector es a largo plazo. La inclusión de una
preparación de Arthrobacter muerta tenía un efecto
inmunoestimulante que daba como resultado tasas de supervivencia
mejoradas.
Claims (10)
1. Uso de células de Arthrobacter vivas
en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la
prevención de piscirickettsiosis en peces.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que los peces son peces salmónidos incluyendo especies de salmón y
trucha.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la piscirickettsiosis es septicemia
rickettsial de salmónidos (SRS).
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que las células de Arthrobacter
son de la cepa depositada bajo el número de registro ATCC 55921 o
una cepa equivalente con capacidades inmunoprotectoras contra
piscirickettsiosis en peces.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los peces se seleccionan del
grupo que consiste en: salmón Coho (Oncorhyncus kisutch),
salmón Chinook (Onchorhynchus tshawytscha), salmón Masu
(Onchorhyncus masou), salmón rosa (Onchorhynchus
gorbuscha), trucha arco iris (Onchorhyncus mykiss) y
salmón del Atlántico (Salmo salar).
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el medicamento comprende además
antígeno o antígenos de Piscirickettisia salmonis.
7. Una composición vacunal que comprende células
de Arthrobacter vicas y que comprende además al menos otro
inmunógeno, en la que dicho inmunógeno se selecciona del grupo que
consiste en: antígeno desactivado preparado a partir de P.
salmonis; un antígeno de P. salmonis recombinante y un
vector de ácido nucleico que porta un antígeno de P.
salmonis expresable.
8. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 7, que comprende células de Arthrobacter vivas
y un antígeno de P. salmonis desactivado mediante
formalina.
9. Un estuche que comprende una primera vacuna
que comprende células de Arthrobacter vivas y una segunda
vacuna que comprende un inmunógeno seleccionado del grupo que
consiste en antígeno desactivado preparado a partir de P.
salmonis; un antígeno de P. salmonis recombinante y un
vector de ácido nucleico que porta un antígeno de P.
salmonis expresable; para la administración separada, secuencial
o simultánea a peces.
10. Un estuche de acuerdo con la reivindicación
9, que comprende células de Arthrobacter vivas liofilizadas
y un diluyente estéril que comprende antígeno de P. salmonis
desactivado.
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