BR0312632B1 - Uso de células vivas e mortas de Arthrobacter contra septicemia rickettsiácea em salmonídeos, composição de vacina e kit, e uso dos mesmos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE CÉ- LULAS VIVAS E MORTAS DE ARTHROBACTER CONTRA SEPTICEMIA RICKETTSIÁCEA EM SALMONÍDEOS, COMPOSIçãO DE VACINA E KIT, E USO DOS MESMOS".

Campo da Invenção A presente invenção se refere ao uso de uma cepa viva de Art- hrobacter na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir septi- cemia rickettsiácea em salmonídeos (SRS) e a vacinas à base dessas bacté- Antecedentes da Invenção Piscirickettsia salmonis é uma bactéria intracelular obrigatória gram-negativa que causa sepíicemia sistêmica (síndrome rickettsiácea dos salmonídeos, SRS, ou piscirickettsiose) em peixe salmonídeo. Bactérias se- melhantes a Piscinckettsia são agora reconhecidos com crescente frequên- cia em uma variedade de outras espécies de peixes, tanto de água doce quanto de água salgada ao redor do mundo. Piscirickettsiose e doenças se- melhantes a piscirickettsiose têm afetado a produtividade e a lucratividade da aquacultura, as espécies compatíveis com cultura comercial e o transpor- te de peixe de um lugar para outro. A indústria de aquacultura chilena sozi- nha atribui à piscirickettsiose de salmonídeos perdas anuais de 150 milhões de dólares. No Chile, a síndrome tem levado a um deslocamento do salmão coho mais comercialmente desejável para o salmão do Atlântico menos de- sejável, porém mais resistente a piscirickettsiose como espécie primária cui- tivada.

Antimicrobianos têm sido testados como uma terapia para SRS, mas sem sucesso consistente. Outras medidas sugeridas incluem tentativas de reduzir tensão no peixe mediante redução de densidade de estoque e remoção de peixes mortos de tanques sem demora. A solução mais prática para a SRS epidêmica seria encontrar uma vacina eficaz para prevenir a doença em primeiro lugar. Preparações de bacterinas inativadas de P. sal- monis mostram apresentar algum efeito protetor, e poderão ser a única op- ção adequada para co-administração em preparações à base de óleo multi- valentes, mas são relativamente caras de produzir em uma escala comercial Vacinas à Base de antigenos recombinantes de P. salmonis não atingiram ainda o mercado.

Consequentemente, há uma necessidade urgente de tornar dis- ponível uma vacina capaz de reduzir significativamente mortalidades devido a piscirickettiose em peixe. A presente invenção baseia-se na surpreendente descoberta de que um produto de vacina comercial existente é notavelmente eficaz em prevenir a doença. Essa vacina é comercializada sob o nome "Renogen®' e compreende uma cepa viva não-virulenta de Arthrobacter.

Correntemente, essa vacina é indicada para proteger salmão e outros peixes cultivados contra doença renal bacteriana (BKD). As características dessa cepa são descritas in WO 98/33884, que é incorporada como referência nes- ta invenção.

Sumário da Invenção Em um aspecto da invenção, proporciona-se uso de células vi- vas de Arthrobacter na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de piscinckettsiose em peixe. Os alvos preferidos do medica- mento são peixes salmonídeos expostos a risco de infecção por SRS. As células de Arthrobacter são preferencialmente da cepa depositada sob nú- mero de acesso ATCC 55921, ou uma cepa equivalente.

Em um segundo aspecto da invenção, proporciona-se uma com- posição de vacina que compreende células vivas de Arthrobacter e um imu- noestimulante bacteriano morto, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto da invenção, proporciona-se uma composição de vaci- na que compreende material de células mortas de Arthrobacter e uso de ma- terial de células mortas de Arthrobacter como um imunoestimulante. O material de células mortas de Arthrobacter è preferencialmente proveniente da cepa depositada sob número de acesso ATCC 55921, ou uma cepa equivalente.

Em um outro aspecto ainda da invenção, proporciona-se uma composição de vacina que compreende células vivas de Arthrobacter e antí- geno inativado de Piscirickettsia salmonis, onde a vacina é opcionalmente proporcionada na forma de umk/íque compreende uma cultura de células vivas liofilizadas de Arthrobacter e um diluente estéril que compreende o an- tígeno inativado de Piscirickettsia salmonis.

Em um aspecto adicional da invenção, proporciona-se um méto- do de tratamento ou prevenção de piscirickettsiose em peixe, método este que compreende administrar a peixe com necessidade desse tratamento uma que compreende células vivas de Arthrobacter.

Descrição Detalhada da Invenção A vacina Renogen® tem estado em uso há algum tempo para combater Doença Renal Bacteriana (BKD) em peixe salmonídeo. Essa vaci- na é única pelo fato de que é a primeira cultura viva a ter sido licenciada pa- ra uso em aquacultura e compreende uma cultura viva de Arthrobacter sp. nov., depositada sob No. de Acesso ATCC 55921 com a Coleção de Cultu- ras Tipo Americano (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209) em 20 de dezembro de 1996. Arthrobacter não é patogênica a peixe; nem é o agente causador de BKD (que é Renibacterium salmoninarum).

Observou-se em um sítio em campo que uso de Renogen® em uma população de salmões sob risco de contrair BKD levou a uma dramática redução nas taxas de mortalidade em comparação com peixe não-tratado. O ganho médio de peso no grupo tratado com Renogen foi 18% maior do que no grupo de peixes não-tratados. SRS foi também comum no sítio, o que levou os presentes inventores a especular que Renogen® poderá ter conferi- do proteção oculta contra SRS, bem como contra BKD. A fim de testar esse conceito, peixes mantidos em tanque foram imunizados com Renogen® e subseqüentemente desafiados com P. salmo- nis, conforme descrito no Exemplo 2. No grupo de controle negativo, que tinha recebido injeções de solução salina, aproximadamente todos os peixes sucumbiram a SRS. Os grupos de teste que tinham recebido a vacina Reno- gen® exibiram taxas de mortalidade extremamente baixas após 471 gd (graus dias), equivalendo a entre 88 e 100 de sobrevivência percentual rela- tiva (RPS). Mesmo após 1.441 gd (equivalente a um ano em água do mar), os grupos de teste apresentaram uma RPS entre 69 e 85%, em comparação com apenas 48,6% no grupo "padrão ouro" de P. salmonis inativado.

Evidência adicional do potencial de vacinação com Renogen® é demonstrada pela reatividade cruzada de antígeno P. salmonis quando submetido a sonda com anticorpos policlonais de coelho anW-Arthrobacter (Exemplo 1).

Mostramos que Renogen® é mais eficaz do que qualquer outra vacina conhecida em prevenir SRS. Bactérias vivas Arthrobacter são sabi- das serem capazes de entrar em células e replicar por um período limitado de tempo. Os presentes inventores acreditam que isso permite que o pro- cessamento de antígenos tanto de carboidratos quanto de proteínas com suficiente homologia com epitopos de P. salmonis em células T proporcione um alto nível de proteção para dirigir desafio com P. salmonis virulento. A invenção, portanto, proporciona o uso de células de Arthrobac- ter na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de piscirickettsiose em peixe, em particular peixes salmonídeos, incluindo as espécies salmão e truta, particularmente salmão coho (Oncorhyncus kisut- ch), salmão Chinock (Oncorhyncus tshawytscha), salmão masu (Oncorhyn- cus masou), salmão rosa (Oncorhyncus gorbuscha), truta arco-íris (Onco- rhyncus mykiss) e salmão do Atlântico (Salmo salar). Entretanto, qualquer outra espécie de peixe suscetível a piscirickettsiose ou doença similar pode- rá beneficiar-se, tais como Tilapia sp., perca do mar negra (Dicentrarchus sp.), perca do mar branca (Atractoscion nobilis), garoupa, cichlids, etc.

Renogen® baseia-se em uma cepa particular depositada de Art- hrobacter (ATCC 55921). Na realização da presente invenção, pode ser em- pregada essa cepa ou cepas equivalentes de Arthrobacter. Cepas equivalen- tes de Arthrobacter compartilham as características de identificação de Art- hrobacter ATCC 55921. Elas apresentam capacidades protetoras similares contra SRS. Uma espécie de Arthrobacter que apresenta uma seqüência de rDNA 16S idêntica ou uma seqüência de rDNA 16S que apresenta uma di- vergência de menos que 3% com a cepa ATCC 55921 é considerada como sendo equivalente. Essa seqüência de rDNA 16S está depositada sob núme- ro de acesso Genbank AF099202. Um outro método de definir uma cepa equivalente é através do ensaio RAPD usando o primer F12-373 (5’- ACGGTACCAG-3’), conforme descrito in Griffiths, SG e outros (1998), Fish & Shelefish Immunology 8: 607-619. Um fragmento distinto de cerca de 373 pb é gerado quando esse ensaio é realizado em Arthrobacter ATCC 55921 e cepas equivalentes. Um ensaio RAPD alternativo descrito na mesma publi- cação usando primers Rsxll-67f (5-CTGTGCTTGCACGGGGGATTA-3’) e Rsxll-284r (5’-GTGGCCGGTCACCCTCTCAG-3’) produz um fragmento de 260 pb quando realizado em Arthrobacter ATCC 55921 ou cepas equivalen- tes.

Espécies do gênero Arthrobacter são numerosas e abundantes em diversos habitats, incluindo ambientes marinhos. Muitas cepas de Art- hrobacter são disponíveis a partir de instituições depositárias comerciais. Não é indevidamente incômodo àquele versado escolher uma seleção de cepas conhecidas ou cepas recentemente isoladas para as características de identificação e/ou propriedades imunogênicas em relação a SRS identifi- cadas nesta invenção. Propriedades imunogênicas em relação a SRS po- dem ser identificadas pelos ensaios de seleção descritos no parágrafo pre- cedente e/ou pelos procedimentos experimentais descritos no Exemplo 1 e Exemplo 2. A via preferida de administração da vacina é por meio de injeção na cavidade peritoneal, mas outras opções de administração existem, inclu- indo oralmente na alimentação, por injeção intradérmica ou intramuscular ou por imersão em água do mar ou em água doce. Os peixes são usualmente anestesiados antes de receber a vacina por meio de injeção. Recomenda-se que os peixes tenham 10 gramas ou mais de peso corporal para administra- ção da vacina da invenção por injeção intraperitoneal. Para imersão ou ad- ministração oral, um peso corporal de pelo menos 2 gramas é preferido. A dosagem eficaz de vacina poderá variar dependendo do ta- manho e espécie do indivíduo, e de acordo com o modo de administração. A dosagem ótima pode ser determinada através do método das tentativas por um veterinário ou especialista em aquacultura. Uma faixa de dosagens ade- quada poderá ser de cerca de 102 a 109 ufc por dose unitária, preferencial- mente de cerca de 104 a 107 ufc por dose unitária, mais preferencial mente de cerca de 105 a 106 ufc por dose unitária, e, ainda mais preferencialmente, de cerca de 105 ufc por dose unitária. No entanto, doses maiores ou meno- res poderão também ser eficazes. Preferencialmente, uma dosagem única unitária é administrada ao peixe a ser tratado. Peixes menores poderão be- neficiar-se de uma dose de cerca de 104 a 107 ufc/ml com administração por submersão (imersão), por exemplo com um tempo de contato de cerca de 60 segundos. Para administração por imersão, a vacina poderá ser diluída em 1 a 10 volumes de água antes de adição a tanques ou gaiolas contendo pei- xes.

Um volume de dosagem preferido para injeções é de cerca de 0,05-0,5 ml, preferencialmente de 0,075-0,25 ml, mais preferencialmente de 0,1-0,2 ml, opcionalmente de cerca de 0,1 ml.

Devido à dependência de desenvolvimento de imunidade à tem- peratura da água, prefere-se que os peixes não sejam expostos a infecção por SRS até pelo menos 400 graus dias após vacinação com a vacina de Arthrobacter da invenção (graus dias = no. de dias x temperatura média da água em °C).

Em uma modalidade da invenção, células vivas de Arthrobacter são combinadas com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis em uma composição farmacêutica. Veículos/excipientes adequados incluem excipientes convencionais, e poderão ser, por exemplo, solventes tais como água, óleo ou solução salina, dextrose, glicerol, agentes de umectação ou emulsificação, agentes de formação de volume, revestimentos, aglutinantes, cargas, agentes de desintegração, diluentes, lubrificantes, agentes de tam- ponamento de pH ou adjuvantes convencionais tais como muramil dipeptí- deos, avridina, hidróxido de alumínio, óleos (por exemplo, óleo mineral), sa- poninas, copolímeros em bloco e outras substâncias conhecidas na técnica.

Uma composição farmacêutica preferida compreende um diluente salino.

Tipicamente, vacinas são preparadas como soluções líquidas ou suspensões para injeção ou para liberação em água. Formas sólidas ade- quadas (por exemplo, pó) para dissolução ou suspensão em excipientes lí- quidos, ou para mistura com alimento sólido antes de administração, pode- rão também ser preparadas.

Preferencialmente, a vacina é uma cultura liofilizada. Nessa for- ma, a vacina é adequada para reconstituição com um diluente estéril. Por exemplo, células liofilizadas poderão ser reconstituídas em solução salina a 0,9% (opcionalmente proporcionada como parte do produto de vacina emba- lado). As composições farmacêuticas de vacina da invenção poderão ser administradas em uma forma para liberação imediata ou liberação prolonga- da.

Em uma modalidade, a vacina de Arthrobacter da invenção compreende um imunoestimulante. O imunoestimulante poderá ser qualquer imunoestimulante conhecido, mas ele é preferencial mente uma preparação bacteriana morta. Preferencialmente, o imunoestimulante é um material de células mortas de Arthrobacter, que é opcionalmente morto por meio de ca- lor e é opcionalmente proveniente de uma cultura de Arthrobacter ATCC 55921. Exemplos adequados de preparações bacterianas mortas incluem: "Peptimune" (uma cultura de Arthrobacter ATCC 55921 morta por meio de calor) e "Ultracorn" (lisato de Corynebacterium cutis submetido a ultra-som).

Uma dosagem ótima de imunoestimulante bacteriano morto é (por dose uni- tária de vacina) de 1 a 100 pg, preferencial mente na faixa de 5 a 50 pg, mais preferencial mente de 10 a 20 pg, e, opcionalmente, de cerca de 12 pg de matéria celular. O imunoestimulante bacteriano morto é opcionalmente dis- solvido ou suspenso em diluente estéril (por exemplo, solução salina) para mistura com células vivas liofilizadas de Arthrobacter. A invenção em um aspecto proporciona uma composição de va- cina que compreende células vivas de Arthrobacter e, adicionalmente, com- preende pelo menos um outro imunógeno (onde um "imunógeno" é definido como uma molécula tal como um antígeno capaz de elevar uma imunores- posta específica em um peixe). O imunógeno é opcionalmente selecionado do grupo que consiste em: antígeno inativado preparado de Piscirickettsia salmonis (P. salmonis)', um antígeno recombinante de P. salmonis; e um ve- tor de ácido nucléico que transporta um antígeno de P. salmonis passível de expressão. Em alguns exemplos, poderá ser desejável combinar a vacina Renogen® da invenção com uma vacina convencional para SRS (vacina de bacterina ou de antígeno recombinante de P. salmonis ou vacina de ácido nucléico) em um kit que compreende ambos os componentes para adminis- tração separada, seqüencial ou simultânea, para tratamento ou prevenção de SRS.

Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a uma vaci- na que compreende células vivas de Arthrobacter e antígeno inativado de P. salmonis, e, opcionalmente, material de células mortas de Arthrobacter como imunoestimulante. O antígeno de P. salmonis pode ser preparado por inati- vação usando qualquer agente de inativação conhecido, mas ele é preferen- cialmente preparado através de inativação com formalina. Antígeno de P. salmonis pode ser preparado a partir de qualquer isolato das bactérias. Op- cionalmente, cepa LF-89 depositada sob número ATCC VR-1361, ou uma cepa derivada dela, é usada para preparar o antígeno inativado.

Um procedimento adequado para inativar o antígeno de P. sal- monis é colher o sobrenadante de culturas de células CHSE-14 infectadas com P. salmonis e adicionar formalina (solução de formaldeído a 37%) até uma concentração final de 0,125% (v/v). A mistura fluido de cultura/formalina é agitada até homogeneidade e em seguida mantida a 4 ± 2°C com agitação constante por um mínimo de 72 horas. O material colhido inativado poderá ser concentrado por ultrafiltração estéril. Uma concentração final adequada da preparação de antígeno de P. salmonis definida por uma razão de imu- noensaio enzimático (EIA) expressa como OD405/490 do antígeno/OD4o5/49o padrão é de 1,5 ± 0,2 unidade. A combinação de componentes Arthrobacter e P. salmonis em uma única vacina leva a um aumento significativo de proteção contra SRS em comparação com a vacina de células vivas de Arthrobacter sozinha. Em um experimento de desafio de SRS similar àquele descrito no Exemplo 2, mostrou-se que a longo prazo (após 1.400 graus dias) a vacina bivalente adiciona mais de 20 pontos de RPS (sobrevivência percentual relativa) em comparação com a vacina viva monovalente de Arthrobacter.

Preferencialmente, essa vacina é produzida e vendida na forma de um kit que compreende uma cultura liofilizada de células vivas de Arthro- bacter, juntamente com um diluente estéril, tal como solução salina, em que o antígeno inativado de P. salmonis (e opcionalmente um imunoestimulante bacteriano morto) é dissolvido ou suspenso. Por exemplo, o antígeno de P. salmonis preparado, produzido conforme descrito acima, pode ser misturado com o diluente sob uma concentração entre cerca de 10 e cerca de 150 ml/litro, preferencialmente de cerca de 20 a cerca de 100 ml/litro, e, mais preferencialmente, de 75 ml/litro.

Está também dentro do escopo da invenção preparar vacinas multivalentes que compreendem células vivas de Arthrobacter e antígenos de patógenos diferentes de P. salmonis.

Todas as vacinas da invenção que incorporam células vivas de Arthrobacter não só protegem contra SRS como também dão origem a pro- teção de peixes contra infecção por BKD.

Exemplos Exemplo 1 Reatividade cruzada de antígeno de P. salmonis com anticorpos policlonais ar\W-Arthrobacter Aproximadamente 25 pg de células bacterianas de P. salmonis triplamente lavadas colhidas de cultura de células CHSE-214 foram mistura- dos com 100 pl de tampão de Laemmli e aquecidas a 95°C por 3 minutos. 10 μΙ de amostras foram carregados em um gel de acrilamida a 9% e submeti- dos a eletroforese sob 150 volts por 1 hora para separar as proteínas. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose a 100% usan- do um transblotter semi-seco (BIORAD). A transferência de proteínas foi rea- lizada sob 20 volts por 50 minutos. A mancha foi incubada com 20 μΙ de anticorpos policlonais de coelho anti-Arthrobacter por 45 minutos em 15 ml de solução salina de case- ína tris-borato a 1% (cTBS). A mancha foi então exposta a 5 μΙ de imunoglo- bulina fosfatase alcalina de cabra anticoelho (GAR-AP) e revelado. Diversas proteínas foram ressaltadas na mancha, indicando que anticorpos de proteí- nas an\\-Arthrobacter apresentam uma forte afinidade por certas proteínas de P. salmonis. Esse resultado foi também confirmado em um Western blot 2D.

Esse experimento mostra que certas proteínas de P. salmonis e Arthrobacter reagem de forma cruzada, indicando que essas proteínas de Arthrobacter podem aparelhar o sistema imune para produzir anticorpos po- tencialmente capazes de reconhecer e proteger contra bactérias virulentas de P. salmonis.

Exemplo 2 Ação protetora de uma vacina de Arthrobacter contra SRS

Salmões coho (n = 110 por grupo de tratamento, peso médio de 10 g) foram mantidos sob condições normais de cultura em água de tanque de acordo com procedimentos padrões de operação a 12°C. Após uma se- mana de aclimatização, os Grupos 1, 2 e 3 foram vacinados intraperitoneal- mente com 0,1 ml de 105, 106 e 107 ufc/dose, respectivamente, de células liofilizadas de Arthrobacter sp. nov. (Renogen®) reconstituídas em diluente salino. Os Grupos 4 e 5 foram tratados de maneira idêntica ao Grupo 1, mas com a adição de 12,2 pg e 50 pg por dose, respectivamente, de "Peptimune" no diluente salino. Peptimune é uma preparação de Arthrobacter morto por meio de calor desenvolvida em cultura líquida (caldo MTSB) até uma densi- dade celular >1xE9 e padronizada através de ensaio protéico para adminis- trar 12 e 50 pg por dose. Os Grupos 6 e 7 foram controles positivos vacina- dos com bacterina de P. salmonis. A bacterina foi preparada do sobrenadan- te de uma cultura de células CHSE-14 infectada com cepa LF-89 do tipo P. salmonis, usando formalina 0,125% a 4°C por um período mínimo de 72 ho- ras. Concentração U/F foi empregada e o sobrenadante concentrado foi u- sado para incorporar 8 pg (de proteína) por 0,1 ml de dose. A vacina de bac- terina foi aplicada com Ultracorn (Virbac, França) sob 20 (Grupo 6) e 100 pg (Grupo 7) por peixe. Ultracorn é um imunoestimulante baseado em um lisato de Corynebacterium cutis submetido a ultra-som. Os antígenos foram emul- sificados com um igual volume de adjuvante de óleo mineral antes de inje- ção. O grupo de controle negativo (Grupo 8) recebeu uma injeção de solu- ção salina. A Tabela 1 resume os grupos de tratamento (volume de dose (0,1 mL por peixe) para 20 ml): Método do desafio Em 471 e 1.441 gd (graus dias) após vacinação, grupos em du- plicata de 25 peixes por tratamento foram desafiados com P. salmonis viru- lento por injeção intraperitoneal. P. salmonis virulento foi cultivado em célu- las CHSE-14 por um mínimo de 2-3 semanas. Sobrenadantes de cultura a- tingindo pelo menos 50% de CPE foram usados para as injeções i.p. As inje- ções de P. salmonis virulento foram dadas sob diluições de 10'2 ou mais sob 0,1 ml por peixe (n = 25). Os peixes desafiados foram mantidos a 12°C.

Antes do término do desafio 1, 10 peixes das populações sobre- viventes dos Grupos 1, 7 e 8 (somente 8 peixes foram sobreviventes nesse grupo) foram sacrificados e uma amostra de tecido esplênico e tecido renal de 0,5 g foi tomada, homogeneizada e diluída em 10 ml de meio de cultura de tecido. Um TCID50 foi determinado em placas de 96 cavidades contendo células confluentes CHSE-214. RESULTADOS E DISCUSSãO: Tabela 1: Mortalidade durante o teste de segurança de 28 d, mantido a 9- 12°C por todo o período de segurança e pré-desafio.

Durante o estudo de segurança, observou-se que os peixes no Grupo 3 sofreram alguma perda (6,3%) próximo do fim do período de segu- rança de 28 d. O investigador de laboratório tratou todos os peixes na popu- lação com um tratamento de formalina de três dias em relação a doença bacteriana das guelras. A mortalidade (3,6%) no Grupo 5 foi registrada du- rante o período inicial de três dias pv, indicando que a inclusão de Peptimu- ne como 40% do diluente foi um pouco tóxica. Nenhuma placa positiva foi cultivada das perdas durante o período de segurança, seja para a cepa de vacina viva, seja para quaisquer culturas bacterianas incidentais.

Tabela 2: Mortalidade Cumulativa e Sobrevivência Percentual Relativa de salmão coho (peso médio de 10 g) 471 gd pós-vacinação com células de Arthrobacter sp. nov. (Grupos 1-5), vacinas contra SRS inativadas, ou solu- ção salina quando desafiado com P. salmonis virulento por injeção intraperi- toneal (TCID5o 3 x 102,9 por peixe) a 12°C.

Em 471 gd pós-vacinação, os peixes no Grupo 1 apresentaram uma sobrevivência percentual relativa (RPS) de 97,6, um alto nível de prote- ção de infecção direta com P. salmonis por 32 dias, onde a mortalidade no grupo de controle com solução salina foi de 84%. Isso se comparou favora- velmente à proteção obtida de vacinação com as vacinas padrões inativadas (Grupos 6 e 7), que mostraram valores de RPS de 50 e 69%, respectivamente.

Análise TCIDgn de Peixes Sobreviventes nos Grupos 1.7 e 8 Nível de infecção por SRS nas amostras de tecido dos peixes sobreviventes do desafio em 471 gd (n = 7-10), 32 dias pós-infecção: O TCID5o dos peixes amostrados do grupo de Renogen® foi me- nor do que o do grupo de vacina inativada, e ambos foram menores do que os controles com solução salina. Isso não é de relevância clínica evidente, à medida que a contribuição dos grupos de alto título nega as dosagens meno- res ineficazes quando a média é tomada. Entretanto, o grupo de Renogen® apresentou os valores positivos percentuais mais baixos (<20%), na medida em que amostras com menos de 102 foram consideradas não ser clinicamente infectadas com SRS. Isso se compara às mesmas amostras do grupo de solu- ção salina, onde 50% dos peixes foram positivos para SRS, e favoravelmente ao grupo de vacina inativada com 44% dos peixes positivos para SRS.

Tabela 3: Mortalidade Cumulativa e Sobrevivência Percentual Relativa de salmão coho (peso médio de 10 g) 1.441 gd pós-vacinação com células de Arthrobacter sp. nov. (Grupos 1-5), vacinas contra SRS inativadas, ou solu- ção salina quando desafiado com P. salmonis virulento por injeção intraperi- toneal (TCID50 3 x 102,9 por peixe) a 12°C.

Nota: Os peixes de apoio no Grupo 6 destinados ao estudo de eficácia a longo prazo foram perdidos devido a interrupção acidental do fluxo de água nesse tanque (17).

Após um período decorrido de 1.140 gd, foi avaliada a resposta de duração da proteção observada no período de teste anterior (471 gd). Os resultados do segundo desafio onde um nível de 72% de mortalidade foi ob- servado no grupo de controle com solução salina indicam que o nível de pro- teção é ainda alto com peixes tratados com Renogen® (69,4% de RPS), com alguma indicação de que uma dosagem maior poderá aperfeiçoar a proteção a longo prazo (106 e 107 ufc/dose apresentaram RPS de 85,8 e 81,7, respec- tivamente). A adição do imunoestimulante Peptimune sob 12 e 50 pg ao di- luente proporcionou um aperfeiçoamento na eficácia do produto sob dose (76,1 e 79,7%, respectivamente). A perda acidental da vacina de referência padrão (Grupo 6) permitiu comparação apenas com o Grupo 7, e esse grupo apresentou uma RPS de 48,6%. CONCLUSÕES: Renogen proporcionou significativa proteção contra desafio dire- to com P. salmonis em 471 gd e em 1.441 gd pós-vacinação. A vacina foi superior à proteção proporcionada pela vacina padrão com óleo. Demons- trou-se que peixes com menor sobrevivência no grupo de Renogen™ foram clinicamente infectados com P. salmonis. O estudo demonstra que vacina viva de Arthrobacter sp. nov. proporciona um alto grau de proteção contra infecção por P. salmonis e que o efeito protetor mostra ser de longo prazo.

Inclusão de uma preparação morta de Arthrobacter na vacina apresentou um efeito imunoestimulante, resultando em taxas de sobrevivência aperfeiçoa- das.

Claims (11)

1. Uso de célula viva de Arthrobacter, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de piscirickettsiose em peixe.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peixe é um peixe salmonídeo.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a piscirickettsiose é septicemia rickettsiácea em salmonídeo (S- RS).

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula de Arthrobacter é da cepa depositada sob número de acesso ATCC 55921 ou uma cepa equivalente.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesl a 4, caracterizado pelo fato de que o peixe é salmão coho (Oncorhyncus kisutch).

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende adicionalmente antígeno(s) de Piscirickettsia salmonis.

7. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que com- preende células vivas de Arthrobacter e que compreende adicionalmente pelo menos um outro imunógeno, sendo que o imunógeno é selecionado do grupo que consiste de: antígeno inativado preparado de P. salmonis; um an- tígeno recombinante de P. salmonis; e um vetor de ácido nucléico que trans- porta um antígeno de P. salmonis passível de expressão.

8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizada pelo fato de que compreende células vivas de Arthrobacter e um antígeno de P. salmonis inativado por formalina.

9. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira vacina que compreende células vivas de Arthrobacter e uma segunda vacina que compreende um imunógeno selecionado do grupo que consiste de: an- tígeno inativado preparado de P. salmonis; um antígeno recombinante de P. salmonis; e um vetor de ácido nucléico que transporta um antígeno de P. salmonis passível de expressão; para administração separada, sequencial ou simultânea a peixe.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende células vivas de Arthrobacter liofilizadas; e um diluente estéril que compreende antígeno inativado de P. salmonis.

11. Uso de uma composição de vacina, como definida na reivin- dicação 8, ou de um kit, como definido na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para proteção de peixes contra infecções por SRS e BKD.