BRPI0720111B1 - Vacina de salmonella - Google Patents

Description

(54) Título: VACINA DE SALMONELLA (51) Int.CI.: A61K 39/02; A61P 31/04 (30) Prioridade Unionista: 11/12/2006 US 60/869,524 (73) Titular(es): MERIAL, INC.

(72) Inventor(es): FRANÇOIS-XAVIER LE GROS; STEPHANE LEMIERE

Rela.t.ório Descritivo da Patente de Invenção para: VACINA

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA ’ ^;

Esse pedido reivindica benefício do pedido de patente provisório No. de Série 60/869.524, depositado em 11 de dezembro de 2006.

Todos os documentos aqui citados ou referenciados, e todos os documentos citados ou referenciados em documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e encartes de produto do fabricante para quaisquer produtos aqui mencionados ou em qualquer documento aqui incorporado por referência, são por meio desta aqui incorporados por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao campo de vacinação contra Salmonella em animais, particularmente em aves. A presente invenção também engloba kits e usos de vacinas ou composições imunogênicas de Salmonella.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Salmonella spp. são facultativos que causam sistêmicas, além de um patógenos intracelulares infecções localizadas ou estado portador crônico assintomático. Eles são de significância para a saúde pública e econômica global. Em aves, o tifo aviário e a ' - · ·' - ·«-·· ^,5>doênçá pülorurrí' cdrítíhúám a causar perdas econômicas nas partes do mundo onde as indústrias aviárias continuam a 1 intensificar e onde o alojamento lateralmente aberto é 5 comum. Uma variedade de sorotipos que causam gastrenterite humana está aumentando. Os custos ou impraticabilidade das melhorias na higiene e gerenciamento, juntamente com os crescentes problemas de resistência à antibióticos indica que a vacinação em aves se tornará mais atraente como um suplemento às medidas de controle existentes (Zhang-Barber

L. et al., Vaccine, 1999, 17(20-21): 2538-45).

Salmonella é uma das principais causas de doenças alimentares em humanos. De acordo com o relatório da comissão e zoonoses (European Commission: Trends and sources of zoonotic infections in animais, feed, food and man in the European Union and Norway in 2003), 135.546 casos humanos de salmonelose foram reportados em 2003 pelos

Estados membros da União Européia e Noruega.

A indústria aviária, especialmente na Europa e nos 20 Estados Unidos, está sendo altamente pressionada pelas autoridades sanitárias e consumidores para reduzir os riscos de contaminação humana com Salmonella de origem aviária, particularmente salmonelose (redução de patógeno e

APPCC nos EUA, Diretiva de Conselho 92/117/EEC na EU).

Uma vez que Salmonella infecta várias populações de •“arrímais (por *^sêx*empTb’, ‘‘rffámí feros, aves) , o risco de sofrer ·<

de- salmonelose sempre existe, qualquer que seja o país, a estação ou as práticas de manuseio dos alimentos.

A Salmonella spp. zoonótica, causa de infecção gastrintestinal humana, foi tratada com antimicrobianos existentes. Desde o início dos anos 90, cepas de Salmonella resistentes a uma faixa gama de antimicrobianos apareceram, tornando o tratamento da infecção menos eficiente e aumentando o risco humano de contrair uma infecção gastrintestinal causada por Salmonella spp.

Como nos anos anteriores, dominou a Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Enteritidis {Salmonella Enteritidis) , causando 61,8% (2002: 67,1%) de todos os casos notificados na União Européia e Noruega. As taxas nos países individuais variaram entre 87,9% na Áustria e 33,3% na França. Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhimurium {Salmonella Typhimurium) ficou em segundo lugar, causando 16,5% de todos os casos. AS taxas nos países individuais variaram entre 5,8% na Áustria e 28,7% na Irlanda. Como nos anos anteriores, depois da

Salmonella Enteritidis e da Salmonella Typhimurium, a maioria dos casos foram causados pela Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Virchow {Salmonella Virchow),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Infantis ('Salmonella Infantis) e Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Hadar (Salmonella Hadar). Cada um desses sorovares está envolvido em menos de 1% de todos os casos notificados.

A principal fonte de contaminação é através do consumo de ovos e de carne de aves. A redução de tais risos é conseguida através da combinação de formas, todas ao longo das cadeias de produção de ovos e carne, tais como uma boa avicultura, práticas de higiene e vacinação.

A legislação comunitária sobre higiene alimentícia e controle de zoonoses inclui uma variedade de cláusulas que visam controlar e prevenir a contaminação por Salmonella dos gêneros alimentícios. Acredita-se que medidas para reduzir a prevalência de Salmonella em animais vivos seja uma das formas mais eficazes de reduzir a contaminação de gêneros alimentícios e a quantidade de casos de salmonelose humana.

Em 2003, a nova Legislação Européia sobre zoonoses foi publicada; A Regulação 2160/2003 fornece as diretrizes dos alvos de redução de patógenos ao longo da cadeia alimentícia, principalmente para populações animais, e o estabelecimento de planos de controle nacionais para atender esses alvos. Salmonella spp. é o alvo primário, particularmente os sorotipos considerados como tendo ^'sT^gnrf icânciã’ para éG saúde pública. Os alvos serão estabelecidos progressivamente em diferentes populações de animais: bando de criação de Gallus gallus, galinhas para colocar ovos, frangos para assar, perus e porcos para abate. Até agora, os alvos foram somente estabelecidos para bandos de criação de Gallus gallus (Regulação 1003/2005) ; o alvo foi estabelecido como 1%, significando que até o final de 2009 a porcentagem máxima de bandos positivas para

Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella

Infantis, Salmonella Hadar e Salmonella Virchow no nível da

EU terá que ser de 1%.

Pelo que os criadores estão preocupados, a Regulação

1091/2005 proíbe o uso de antimicrobianos como medida de controle contra Salmonella, enquanto que o uso de vacinas é aceito e recomendado. As conclusões e recomendações do

Comitê Científico sobre Riscos Biológico, em uma solicitação da Comissão relacionada com o uso dos vacinadores para o controle de Salmonella em aves (The EFSA Journal (2004) 114, 1-74) são amplamente favoráveis ao uso de vacinas para controlar Salmonella no nível da granja.

Particularmente, as conclusões do comitê são, dentre outras, que:

• A base para o controle bem-sucedido de infecções por

Salmonella em granjas de aves são as boas práticas de cultura e higiene (incluindo todos os aspectos relacionados à ração, pássaros, manejo, limpeza e desinfecção, controle de roedores, etc.) assim como a testagem e remoção de bandos positivos da produção. A vacinação de galinhas é considerada como uma medida para aumentar a resistência de pássaros contra a exposição à Salmonella e para reduzir o caimento.

• Existem evidências experimentais e algumas de campo que um nível reduzido de excreção fecal e invasão sistêmica dos organismos de Samonella em pássaros vacinados irá resultar em uma contaminação reduzida dos ovos de galinha e do ambiente.

• Se um programa de controle estiver focando nos criadores de frangos em estágio de engorda ou em galinhas que põem ovos e a prevalência na criação for alta, a vacinação pode ser útil na redução do contágio e contaminação dos ovos. Se a prevalência na criação for baixa, a vacinação poderá não ser tão útil, porém ainda poderia ser usada como uma das medidas preventivas para manter uma baixa prevalência.

Existem mais de 2.000 sorovares da bactéria

Salmonella. - ' '

A classificação de Kauffman e White (http://en. wikipedia.org/wiki/Kauffman-White_classification) permite que variedades sorológicas do gênero Salmonella sejam diferenciadas umas das outras. Este esquema diferencia isolados pela determinação de quais antigenos de superfície são produzidos pela bactéria. Primeiramente, o antígeno tipo O é determinado. Os antigenos O são os polissacarídeos associados com o lipopolissacarídeo da membrana externa bacteriana. Uma vez determinado o grupo do antígeno O, o antígeno H é determinado. Os antigenos

H são proteínas associadas com os flagelos bacterianos.

Salmonellas existem em duas fases; uma fase móvel e uma fase não-móvel. Elas também são referidas como as fases específica e não-específica. Diferentes antigenos H são produzidos dependendo da fase na qual a Salmonella é encontrada. Cepas patogênicas de Salmonella typhi carregam um antígeno adicional, Vi assim chamado devido à virulência intensificada das cepas que produzem este antígeno, o qual está associado com uma cápsula bacteriana.

Seguindo a classificação de Kauffman e White, os grupo dos sorovares de Salmonella são formados.

Contra a colonização pelo grupo de C. Salmonella em galinhas, uma vacina atenuada foi desenvolvida, baseando-se em Salmonella Hadar cya suprimida/crp suprimida e em uma Salmonella Hadar phoP suprimida (Roland K. et al., Avian

Dis., 2004, 48(3): 445-52). Embora o derivado cya suprimido/crp suprimido tenha induzido níveis mais altos de anticorpo de soro, ele não forneceu uma resposta imune protetora contra a colonização por Salmonella Hadar.

Chacana et al. (Chacana P.A. et al., Avian Dis., 2006,

50(2): 280-3) demonstraram que a vacina atenuada de

Salmonella pode eliciar a imunidade cruzada contra membros do mesmo sorogrupo do esquema de Kauffmann-White. A proteção conferida por TAD Salmonella vac E, uma vacina de

Salmonella Enteritidis atenuada, foi explorada contra tifo aviário. Três grupos de galinhas que colocam ovos foram vacinados com diferentes cronogramas de vacinação iniciando no primeiro dia de vida, e depois foram infectados com 2 x 10⁵ UFC em uma cepa de Salmonella Gallinarum virulenta, ou na semana 28 ou na semana 52. A mortalidade, o contágio fecal e a invasão de órgãos de Salmonella Gallinarum foram avaliados. A vacina de Salmonella Enteritidis foi capaz de provocar a imunização cruzada contra Salmonella Gallinarum, ambas as cepas do grupo D de Salmonella, de acordo com a classificação de Kauffmann-White. Na semana 28, galinhas vacinadas com três doses orais ou com duas doses orais combinadas com úm’ã dose subcutânea foram protegidas pela vacina. Entretanto, na semana 52, quando as galinhas foram infectadas 36 semanas depois da imunização final, a vacina não foi capaz de conferir proteção.

Devido ao grande número de sorovares de Salmonella, existe uma necessidade por vacinas contra Salmonella que são capazes de induzir uma resposta imune protetora contra mais de um sorovar de Salmonella e/ou contra Salmonella de mais de um grupo da classificação de Kaufmann-White.

RESUMO DA INVENÇÃO

Consequentemente, a presente invenção se refere a uma estratégia de vacinação, a qual é baseada em pelo menos uma primeira administração de uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada e de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella inativada. Essa estratégia de vacinação é útil para prevenir o transporte de Salmonella homóloga e heteróloga em indivíduos vacinados.

Também é um objeto dessa invenção fornecer métodos de uso de vacinas ou composições imunogênicas para prevenir Salmonellas homólogas e/ou heterólogas em aves, em que pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada é administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vâ^ihã'^,5òu composição*·'imunogênica de Salmonella inativada algumas semanas depois, notadamente de 2 semanas a 18 semanas depois da única ou primeira administração inicial.

Também é um objeto dessa invenção fornecer métodos de uso de vacinas ou composições imunogênicas para prevenir o transporte de Salmonella homóloga e/ou heteróloga em aves, em que pelo menos uma primeira administração de uma vacina ou composição imunogênica do grupo D de Salmonella atenuada é administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma Salmonella inativada do grupo B e vacina ou composição imunogênica de Salmonella inativada do grupo D algumas semanas mais tarde, notadamente de 2 semanas a 18 semanas depois da única ou primeira administração inicial. Exemplos de Salmonellas dos grupos B e D são aqui fornecidos.

Também é um objeto dessa invenção fornecer kits para a vacinação de aves, compreendendo pelo menos dois frascos e um encarte de embalagem com instruções de administração, o primeiro frasco contendo uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada e o segundo fraco contendo uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella inativada. Opcionalmente, frascos adicionais podem ser incluídos, cujos frascos compreendem uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada para 'múlfipías Aadmirffstrações iniciais e/ou frascos compreendendo uma vacina ou composição imunogênica de

Salmonella inativada para várias administrações de reforço.

Pode-se notar que nessa descoberta e particularmente nas reivindicações, termos tais como compreende, compreendido, compreendendo e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na Lei de Patentes Americana;

por exemplo, eles podem significar inclui, incluído, incluindo e semelhantes; e aqueles termos tais como consistindo essencialmente de e consiste essencialmente de têm o significado designado a eles na Lei de Patentes

Americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, porém exclui elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Essas e outras modalidades são reveladas ou são óbvias a partir de e englobadas pela descrição detalhada a seguir. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada a seguir, dada a título de exemplo, e a qual não está pretendendo limitar a invenção nas modalidades específicas descritas, pode ser entendida juntamente com as figuras associadas, aqui incorporadas por referência, nas quais:

Figura 1 ilustra a porcentagem de reisolamento das dépâs deãafiáélãs^d^ Sdlmonella nos baços das gal/Enhas, de 4 a 7 dias depois do desafio.

Figura 2 ilustra os cálculos de cecos médios de cepas de Salmonella desafiadas em galinhas, 4 a 7 dias depois do desafio, e os desvios padrões.

Para a Figura 1 e a Figura 2, Controle é o grupo de controle não-vacinado, correspondendo a G.00; L+K é o grupo vacinado duas vezes, primeiramente com a vacina de

Salmonella atenuada e depois com a vacina de Salmonella inativada, correspondendo a G.01; Morto é o grupo vacinado somente com a vacina de Salmonella inativada, correspondendo a G.02.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos métodos de uso de vacinas ou composições imunogênicas em aves para aumentar a resposta imune contra pelo menos uma Salmonella heteróloga, em que pelo menos uma primeira administração de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada de um sorovar de Salmonella é administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente ou ... _A*yejí,e,^ina ri amente , a^ei^tá^el, e_w. pelo,, menos uma Salmonella inafiivada de um soròvar de Salmonella, algumas semanas de distância, notadamente de 2 semanas a 18 semanas de intervalo. A Salmonella atenuada e a Salmonella inativada podem ser do mesmo sorovar ou de diferentes sorovares. Uma

Salmonella heteróloga é uma bactéria diferente daquela usada nas vacinas ou composições imunogênicas administradas durante a administração inicial e durante a administração de reforço, por exemplo, Salmonella de outro sorovar ou de outro grupo de Salmonella de acordo com a classificação de

Kauffmann-White.

Os métodos da referida invenção podem ser usados em aves para proteger cruzadamente aves de uma doença causada por pelo menos uma Salmonella heteróloga e/ou para prevenir a condução de pelo menos uma Salmonella heteróloga em aves.

Os métodos da presente invenção também podem ser usados em aves para reduzir a quantidade de bactérias

Salmonella do grupo C no baço e/ou no ceco de aves 20 infectadas, notadamente para reduzir a quantidade de bactérias Salmonellas do grupo Cl e de Salmonellas do grupo

C2 no baço e/ou no ceco de aves infectadas ou para reduzir a quantidade de bactérias Salmonella do grupo B e de bactérias Salmonella do grupo C no baço e no ceco de aves infectadas. Exemplos de Salmonellas do grupo C são _;<.>f,o3jsne„ci.dos aqji·!*..*.·.;.., termo<composição imunogênica se refere a qualquer composição capaz, uma vez injetada em uma ave, para induzir ou estimular uma resposta imune contra Salmonella.

termo composição de vacina ou vacina se refere a qualquer composição capaz, uma vez injetada em um animal, especialmente em uma ave, para induzir ou estimular uma resposta imune protetora contra doenças causadas por

Salmonella e/ou para induzir ou estimular uma resposta imune protetora para prevenir ou reduzir a condução de

Salmonella em animais, especialmente em aves.

Um regime de dose inicial compreende pelo menos uma primeira administração e pelo menos uma administração de reforço usando pelo menos um polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno comum. A vacina usada na administração inicial pode ser de natureza diferente do que a usada em vacinas de reforço posteriores. A administração inicial pode compreender uma ou mais administrações.

Semelhantemente, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações.

Os métodos da invenção incluem pelo menos uma administração inicial e pelo menos uma administração de reforço a um animal, preferivelmente a uma ave, de uma quantidade eficaz da vacina ou composição imunogênica de

;.í.·-_Λ«acopdpifecom a· .Jmj&ençãp,.O animal pode ser macho ou fêmea.

......“ ' -«lí

Essa administírâção /pode ser notadamente feita por injeção d intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) ou através de administração intranasal ou oral, em que a administração oral inclui, porém não está limitada a, administração na ração ou em água de beber, géis ou sprays.

Excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser água, água para injeção, salina ou tampão. Um estabilizante pode ser adicionado à vacina ou composição imunogênica atenuada, tal como glicerina, solução de glicídio, como solução de sacarose.

A vacina ou composição imunogênica atenuada usada na primeira administração de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada. A Salmonella atenuada pode ser selecionada do grupo consistindo de Salmonella do grupo

De Salmonella do grupo B, preferivelmente dentre o grupo D consistindo de Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama,

Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella

Pullorum, e dentre o grupo B consistindo de Salmonella

Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona,

Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella

Indiana, Salmonella Saint-Paul e Salmonella Brandenburg. Em uma modalidade preferida, a vacina ou composição imunogênica atenuada usada na primeira administração de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada. Em outra modalidade preferida, a vacina ou composição imunogênica atenuada usada na administração inicial de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada. Em outra modalidade preferida, a vacina ou composição imunogênica atenuada usada na administração inicial de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada e pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada. Em uma modalidade mais preferida, a vacina ou composição imunogênica atenuada usada na administração inicial de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e Salmonella Enteriditis atenuada. Em outra modalidade mais preferida, a vacina ou , composição imunogênica atenuada usada na administração / inicial de acordo com os métodos da presente invenção 1 compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e

Salmonella Enteriditis atenuada e Salmonella Typhimurium atenuada.

Exemplos de vários grupos de classificação de

Salmonella Kauffman-White incluem os grupos A, B, Cl-3, D,

El-4, F, G, H e I, exemplos dos quais são fornecidos abaixo.

Por exemplo, o grupo A compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Paratyphi A (Salmonella

Paratyphi A), Salmonella Paratyphi A variante durazzo.

Por exemplo, o grupo B compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Paratyphi B (Salmonella

Paratyphi B), Salmonella Paratyphi B variante odense,

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Java (Salmonella Java), Salmonella enterica subespécie enterica 20 sorovar Typhimurium (Salmonella Typhimurium), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Braenderup (Salmonella

Braenderup), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Agona (Salmonella Agona), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Bredeney (Salmonella Bredeney),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Heidelberg (Salmonella Heidelberg), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Indiana (Salmonella Indiana), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Saint-Paul (Salmonella

Saint-Paul), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Brandenburg (Salmonella Brandenburg), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Limete (Salmonella

Limete), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar

Agama (Salmonella Agama), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Derby (Salmonella Derby), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Salinatis (Salmonella

Salinatis) e Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Stanley (Salmonella Stanley).

Por exemplo, o grupo Cl compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Paratyphi C (Salmonella

Paratyphi C) , Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Infantis (Salmonella Infantis), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Mbandaka (Salmonella Mbandaka),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Livingstone 20 (Salmonella Livingstone), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Virchow (Salmonella Virchow), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Ohio (Salmonella

Ohio), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar

Montevideo (Salmonella Montevideo)

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Tennessee (Salmonella

Tennessee) , Salmonella enterica subespécie enterica sorovar

Rissen (Salmonella Rissen), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Decatur (Salmonella Decatur), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Bareilly (Salmonella

Bareilly), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar

Menston (Salmonella Menston), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Oranienburg (Salmonella

Oranienburg) , Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Thompson (Salmonella Thompson).

Por exemplo, o grupo C2 compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Hadar (Salmonella Hadar),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Newport (Salmonella Newport), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Kottbus (Salmonella Kottbus).

Por exemplo, o grupo C3 compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Kentucky (Salmonella Kentucky),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Albany (Salmonella Albany).

Por exemplo, o grupo D compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhi (Salmonella Typhi),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Panama (Salmonella Panama), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Dublin (Salmonella

Dublin), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar

Gallinarum (Salmonella Gallinarum), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Pullorum (Salmonella Pullorum),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Ndolo (Salmonella Ndolo), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Miami (Salmonella Miami), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Sendai (Salmonella Sendai).

Por exemplo, o grupo El compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Give (Salmonella Give),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Anatum (Salmonella Anatum), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Londres (Salmonella Londres), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Meleagridis (Salmonella Meleagridis).

Por exemplo, o grupo E2 compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Cambridge (Salmonella

Cambridge), Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Newington (Salmonella Newington).

Por exemplo, o grupo E3 compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Minneapolis (Salmonella

Minneapolis).

Por exemplo, o grupo E4 compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Simsbury (Salmonella Simsbury),

Salmonella enterlca subespécie enterica sorovar Senftenberg (Salmonella Senftenberg).

Por exemplo, o grupo F compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Aberdeen (Salmonella Aberdeen).

Por exemplo, o grupo G compreende Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Cubana (Salmonella Cubana),

Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Poona (Salmonella Poona).

Por exemplo, o grupo H compreende Salmonella	enterica
subespécie enterica sorovar Heves (Salmonella	Heves),
Salmonella enterica subespécie enterica	sorovar

Onderstepoort (Salmonella Onderstepoort).

Por exemplo, o grupo I compreende Salmonella	enterica
subespécie enterica sorovar Brasil (Salmonella	Brasil),
Salmonella enterica subespécie enterica	sorovar
Hvittingfoss (Salmonella Hvittingfoss) .

Algumas vacinas de Salmonella atenuadas e algumas vacinas de Salmonella inativadas são comercialmente disponíveis.

As Patentes Americanas Nos. 7.045.122; 6.923.957;

6.905.691; 6.605.285; 5.843.426; 5.733.760; 5.424.065;

5.389.368; e 6.592.869 se referem às vacinas de Salmonella, incluindo vacinas atenuadas e inativadas.

Espécies de Salmonella podem ser racionalmente atenuadas pela introdução de mutações definidas nãoreversíveis no genoma para produzir cepas de vacinas vivas.

Vários genes foram identificados, os quais quando modificado irão atenuar as salmonelas. Particularmente, cepas de Salmonella abrigando mutações não-reversíveis nos genes envolvidos na via biossintética do pré-corismato produzem excelentes vacinas orais evocando fortes respostas imunológicas humorais, locais e celulares no hospedeiro (Chatfield S.N. et al., Vaccine, 1989, 7(6): 495-8;

Chatfield S.N. et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1993,

7(1): 1-7), em genes aro da via biossintética aromática (EP-B1-0322237), em mutantes RfaH reguladores transcricionais de Salmonella Typhimurium, os quais são eficientes como vacinas orais atenuadas contra salmonelose em camundongos (Nagy G. et al., Infect. Immun. , 2006,

74(10) : 5914-25) .

Salmonella pode ser atenuada pela modificação da estrutura do genoma da bactéria, tal como por supressão de parte de um gene de Salmonella, pela inserção da sequência de nucleotídeo heteróloga em um gene de Salmonella e/ou pela substituição de parte de um gene de Salmonella por uma sequência de nucleotídeos heteróloga. É possível atenuar Salmonella pela introdução de mutações que (i) confiram auxotrofia, (ii) interfiram com o metabolismo do açúcar e a biossíntese de lipopolissacarídeos ou (iii) afetem algumas formas globais de regular os genes necessários para uma total manifestação de virulência.

Por exemplo, Salmonella atenuada pode ser uma bactéria compreendendo pelo menos uma mutação direcionada no metabolismo de resistência à estreptomicina e rifampicina para a atenuação (EP-B1-0642796) , tal como a cepa atenuada de Salmonella Enteritidis Sm 24/Rif 12/Ssq (EP-B1-0642796);

Salmonella Enteritidis atenuada por uma primeira mutação na região regulatória de phoP causando a expressão constitutiva de um gene sob o controle da referida região e por uma segunda mutação em um gene pag ou prg (EP- Bl0563311); Salmonella Enteritidis por uma mutação nãoreversível no gene htrA (US-A-5.804.194); Salmonella atenuada que exibe auxotrofia à um ou mais fatores de crescimento selecionados do grupo consistido de fenilalanina, tirosina, triptofano e ácido paraaminobenzóico, de modo que ela é incapaz de crescer em meio mínimo na ausência do referido um ou mais fatores de crescimento (US-A-6.231.871), tal como a cepa de Salmonella

Typhimurium STM-1, depositada nos Laboratórios Analíticos do Governo Australiano sob o número de acesso N93/43266 (US-A-6.231.871); mutantes auxotróficos de Salmonella

Enteritidis derivados da mutagênese de N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina, tal como a cepa E 3/49, cepa 1/37, cepa C7/1, cepa C7/2, cepa C7/18, cepa 7/19, cepa El/23, cepa

El/25, cepa E2/7, cepa E3/44 e a cepa E3/51 (Martin G. et al., Berl. Münch. Tierárztl. Wschr., 1996, 109(10): 325-9);

Salmonella Typhimurium atenuada abrigando uma mutação nãoreversível em cada um dos genes aro discretos da via biossintética aromática, tal como aroA e aroC, aroA e aroD, aroA e aroE (EP-B1-0322237); derivado aroC geneticamente definido de Salmonella Enteritidis atenuada (Cepa LVR02, ver Betancor L. et al., Vet. Microbiol., 2005, 107(1-2):

81-9); e Salmonella Typhimurium atenuada com uma mutação que inativa um gene selecionado de: hupA, dksA, rfaY, sipC ou clpB (WO-Al-98/02523).

As mutações atenuantes podem também ser obtidas por inserção de um transposon. Por exemplo, o transposon na

EZ870 mutante é inserido em uma sequência de nucleotídeos de Salmonella Enteritidis que é homóloga (98,4% de pares de bases idênticos em uma sobreposição de 188 pb) para o gene spiC de Salmonella Typhimurium (número de acesso U51927,

Ochman H., Soncini F.C. Solomon F. e Groisman E.A., Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 7800- 7804, 1996). A Salmonella

Enteritidis EZ870 geneticamente modificada tem o número de depósito LMGP-18484 na Coleção de Culturas BCCM/LMG,

Laboratorium voor Microbiologie, Ledeganckstraat 35, B-9000

Gênty· Bélgica -(-W0'^Ã-9973^;7759) .

A vacina ou compbsição imunogênica inativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella inativada. A Salmonella inativada pode ser selecionada do grupo consistindo do grupo E de

Salmonella, grupo D de Salmonella, grupo C de Salmonella e grupo B de Salmonella, preferivelmente dentre o grupo consistindo do grupo El de Salmonella, grupo E4 de

Salmonella, grupo D de Salmonella, grupo Cl de Salmonella, grupo C2 de Salmonella, grupo C3 de Salmonella e grupo B de

Salmonella, e mais preferivelmente dentre o grupo El consistindo de Salmonella Anatum, dentre o grupo E4 consistindo de Salmonella Senftenberg, dentre o grupo D consistindo de Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama,

Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella

Pullorum, dentre o grupo Cl consistindo de Salmonella

Infantis, Salmonella Mbandaka, Salmonella Livingstone,

Salmonella Virchow, Salmonella Ohio, Salmonella Montevideo,

Salmonella Tennessee, Salmonella Rissen, dentre o grupo C2 consistindo de Salmonella Hadar, Salmonella Newport,

Salmonella Kottbus, dentre o grupo C3 consistindo de

Salmonella Kentucky, Salmonella Albany, e dentre o grupo B consistindo de Salmonella Typhimurium, Salmonella

Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney,

Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella

Saint-Paul e Salmonella Brandenburg.

Em uma modalidade preferida, a vacina ou composição imunogênica inativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo D inativada. Em outra modalidade preferida, a vacina ou composição imunogênica inativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada e pelo menos uma

Salmonella do grupo C inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo D inativada. Em uma modalidade mais preferida, a vacina ou composição imunogênica inativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e

Salmonella Typhimurium inativada e Salmonella Enteritidis inativada. Em outra modalidade mais preferida, a vacina ou composição imunogênicainativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos de uso da presente invenção compreende um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e

Salmonella Typhimurium inativada e Salmonella Enteritidis inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada. Em outra modalidade mais preferida, a vacina ou composição imunogênica inativada usada na administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção excipiente, diluente ou veículo ou veterinariamente aceitável e compreende farmaceuticamente um

Salmonella Typhimurium inativada e Salmonella Enteritidis inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo Cl inativada.

A Salmonella pode ser quimicamente inativada por tratamento com agentes inativadores, tais como formaldeído, etileneimina, derivados de amida de etilenimina (por exemplo, acetiletileneimina), propileneimina, βpropiolactona, timerosal, acetona ou inativação por calor.

Em uma modalidade preferida, o agente inativador é formaldeído.

Em certos aspectos, métodos preferidos de uso das vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma primeira administração de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada do grupo D, administrada em uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada e pelo menos uma

Salmonella inativada do grupo D, com um intervalo de algumas semanas, tal como de 2 semanas até 18 semanas de distância. Em uma modalidade particular desse método preferido, a bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são

Salmonella Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella Typhimurium e bactérias de

Salmonella do grupo D inativada são Salmonella Enteritidis.

Outros métodos preferidos de uso de vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma primeira administração de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada, pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo D inativada, algumas semanas de distância, notadamente de 2 semanas até 18 semanas de distância. Em uma modalidade particular desse método preferido, as bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são

Salmonella Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella Typhimurium, bactérias de

Salmonella do grupo D inativadas são Salmonella Enteritidis e bactérias Salmonella do grupo C2 inativadas são

Salmonella Hadar.

Outros métodos preferidos de uso das vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente .aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada, * ⁵'·' * W . .Çj ^jdêTLb^mèhos um^^Sã^mbhèldá do grupo Cl inativada, pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada e pelo menos uma

Salmonella do grupo D inativada, algumas semanas de distância, tal como de 2 semanas a 18 semanas de distância.

Em uma modalidade particular desse método preferido, as bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são Salmonella Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella Typhimurium, bactérias de Salmonella do grupo D inativadas são Salmonella Enteritidis, bactérias

Salmonella do grupo C2 inativadas são Salmonella Hadar e bactérias de Salmonella do grupo Cl inativadas são

Salmonella Virchow e/ou Salmonella Infantis.

Outros métodos preferidos de uso das vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D e pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada, administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo D inativada, algumas semanas de distância, tal como de 2 semanas a 18 semanas de distância. Em uma modalidade particular desse método preferido, as bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são

Salmonella Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B atenuadas são Salmonella Typhimurium, bactérias de

Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella Typhimurium e bactérias Salmonella do grupo D inativadas são Salmonella

Enteritidis.

Outros métodos preferidos de uso das vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada e pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada, administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada e pelo menos uma Salmonella do grupo D inativada, algumas semanas de distância, notadamente de 2 semanas a 18 semanas de distância. Em uma modalidade particular desse método preferido, as bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são

Salmonella Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B atenuadas são Salmonella Typhimurium, bactérias de

Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella

Typhimurium, bactérias Salmonella do grupo D inativadas são

Salmonella Enteritidis e bactérias Salmonella do grupo C2 inativadas são Salmonella Hadar.

Outros métodos preferidos de uso das vacinas ou composições imunogênicas em aves de acordo com a invenção compreendem pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica atenuada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada do grupo D e pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada, administrada a uma ave antes de pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica inativada, compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, pelo menos uma Salmonella do grupo B inativada, pelo menos uma Salmonella do grupo Cl inativada, pelo menos uma Salmonella do grupo C2 inativada e pelo menos uma

Salmonella do grupo D inativada, algumas semanas de distância, tal como de 2 semanas a 18 semanas de distância.

Em uma modalidade particular desse método preferido, as bactérias Salmonella do grupo D atenuadas são Salmonella

Enteritidis, bactérias de Salmonella do grupo B atenuadas são Salmonella Typhimurium, bactérias de Salmonella do grupo B inativadas são Salmonella Typhimurium, bactérias

Salmonella do grupo D inativadas são Salmonella

Enteritidis, bactérias Salmonella do grupo C2 inativadas são Salmonella Hadar e bactérias Salmonella do grupo Cl inativadas são Salmonella Virchow e/ou Salmonella Infantis.

.Adjuvante(s) pode(m) ser adicionado(s) à suspensão bacteriana, notadamente obtidos depois de cultivo e inativação. Um adjuvante pode ser escolhido dentre hidróxido de alumínio, saponina, qualquer emulsão água-emóleo ou emulsão óleo-em-água o qual é compatível com aves (ver, por exemplo, Herbert W.J., The Lancet, 16 de outubro de 1965: 771; Brugh M. et al., Am. J. Vet. Res., 1983,

44(1): 72-5; Boersma W.J.A. et al. , 44^th Forum in

Immunology, Characteristics and use of new-generation adjuvants, 503-511; Gast et al., Avian Diseases, 1993, 37 (4): 1085-91; Stone, Avian Diseases, 1993, 37: 399-405;

Stone et al., Avian Diseases, 1990, 34: 979-983; Stone et al., Avian Diseases, 1983, 27(3): 688-697; US-A-3.919.411;

WO-A-05/009462, todo aqui incorporados por referência).

Exemplos de adjuvantes incluem, porém não estão limitados, a emulsões óleo-em-água, água-em-óleo baseadas em óleo mineral e/ou óleo vegetal e tensoativos não-iônicos tais como copolímeros em bloco, Tween®, Span®. Tais emulsões são notadamente aquelas descritas na página 147 de

Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach,

Pharmaceutical Biotechnology, 1995, volume 6, editado por

Michael F. Powell e Mark J. Newman, Plenum Press, Nova York e Londres, ou emulsões TS, notadamente a emulsão TS6, e emulsões LF, notadamente a emulsão LF2 (para ambas as emulsões TS e LF, ver WO-A-04/024027). Outros adjuvantes adequados são, por exemplo, a vitamina E, saponinas e polímeros de ácido acrílico ou metacrílico reticulados, isto é, Carbopol® (Noveon; ver WO-A-99/51269; WO-A99/44633), Havlogen®, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach, Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, 1995, Plenum Press

Nova York), adjuvantes biológicos (por exemplo, C4b, notadamente C4b de murino (Ogata R T et al., J. Biol. Chem.

1989, 264(28): 16565-16572) ou C4b de equino, GM-CSF, notadamente GM-CSF de equino (US-A-6.645.740)), toxinas (por exemplo, toxinas de cólera CTA ou CTB, toxinas LTA ou

LTB termolábeis de Escherichia coli (Olsen C W et al.,

Vaccine, 1997, 15(10): 1149-1156; Fingerut E et al.,

Vaccine, 2005, 23(38): 4685-4696; Zurbriggen R et al.,

Expert Rev Vaccines, 2003, 2(2): 295-304; Peppoloni S et al., Expert Rev Vaccines, 2003, 2(2): 285-293)), e CpG (por exemplo, CpG #2395 (ver Jurk M et al·., Immunobiology 2004,

209(1-2): 141-154), CpG #2142 (ver SEQ. ID. NO: 890 em EPBl-1,221,955), CpG #2135, CpG #2007, CpG #2336). Polímeros do ácido acrílico ou metacrílico reticulado, especialmente reticulados por polialqueniléteres de açúcares ou polialcoóis são conhecidos sob o nome carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, de 2 de junho de 1996). Uma pessoa versada na técnica pode também se referir à Patente

Americana No. 2.909.462, a qual fornece tais polímeros acrílicos reticulados por um composto poliidroxila com pelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que oito dos tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais insaturado alifáticos com pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a átomos de carbono, por exemplo, grupos vinil, alil e outros etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados também podem conter outros substituintes, tais como metil.

Produtos vendidos com o nome Carbopol® (Noveon) são especialmente adequadas. Dentre eles, é feita referência ao

Carbopol 974P, 934P, 934, 940 e 971P.

As vacinas e composições imunogênicas de acordo com a invenção podem ser vantajosamente liofilizadas com um estabilizante. A liofilização pode ser feita de acordo com procedimentos de liofilização padrões bem conhecidos. Os estabilizantes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrana, trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T et al., Cryobiology 1983, 20(3): 318-23; Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5):

519-23), proteínas tais como peptona, albumina, lactalbumina ou caseína, proteína contendo agentes tais como leite desnatado (Mills C K et al., Cryobiology 1988,

25(2): 148-52; Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5):

569-75) e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino) . Um adjuvante pode ser usado para solubilizar as preparações liofilizadas.

Exemplos de óleo úteis incluem, porém não estão limitados, a óleo mineral, tal como óleo de parafina, Drakeol® 6VR, Marcol® 80; Marcol® 52; óleos terpênicos, tais como esqualeno e esqualano; óleos vegetais tais como óleo de soja, óleo de oliva, óleo de milho, óleo de jojoba, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de damasco, ó-l»êO -*de abaca-te/' óle*o de gérmen de trigo, óleo dê^l' eanola, óleo de linhaça e óleo de amendoeira; óleos de peixe, tal como óleo de tubarão, óleo de Hoplostethus atlanticus, óleo de Menhaden e óleo de fígado de bacalhau; óleos animais tais como óleo de marta, óleo de toicinho e óleo de gordura de galinha.

Exemplos de tensoativos usados nas vacinas de emulsão incluem Arlacel® 80 (monoleato de sorbitan), Tween® 80 (polissorbato 80) , Span® 80, Span® 85, Arlacel® 83 (sesquicleato de sorbitan), Arlacel® 85 (sesquioleato de sorbitan) e Tween® 61 (polioxietilenossorbitan), por exemplo. Surfactantes adequados para vacinas água-em-óleo animais e vegetais incluem amarelo bruto, e cera de abelha purificada, por exemplo. Além disso, os tensoativos adequados para vacinas contendo esqualeno e esqualano incluem Arlacel® e Tween® 80.

Preferivelmente, o adjuvante é um óleo para formar uma emulsão água-em-óleo compreendendo um óleo de parafina e tensoativos, notadamente um óleo de parafina, um poliol e éster do ácido graxo, e um poliol etoxilado e éster do ácido graxo.

Aves que podem ser vacinadas por um método da presente invenção incluem frangos (chickens), galinhas (hens), perus, patos, patinhos, gansos, gansinhos, galinhas d'angola, faisões, galinhas pequenas (bantams), codornizes e pombos.

Os métodos da presente invenção se referem à pelo menos uma administração inicial de uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella inativada. Uma ave de um dia de vida pode ser vacinada por um método de acordo com a presente invenção, em ouras palavras, a única ou a primeira administração inicial pode ser administrada a uma ave de um dia de vida. Preferivelmente, a única ou a primeira administração inicial é administrada a aves com de 1 a cerca de 28 dias de idade, e mais preferivelmente com 1 dia a cerca de 15 dias de idade. Quando pelo menos duas administrações iniciais são administradas, essas administrações iniciais são administradas preferivelmente com 2 a 4 semanas de intervalo. A administração de reforço é administrada de 2 a 18 semanas depois da única ou da primeira administração inicial, preferivelmente de 3 a 10 semanas depois da única ou da primeira administração inicial, e mais preferivelmente de 3 a 6 semanas depois da única ou da primeira administração inicial. Quando pelo menos duas administrações de reforço são administradas, essas administrações de reforço são administradas

- .preferúvelmentewieç^^awtLZ semanas de intervalo.

Em uma modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem duas administrações iniciais e duas administrações de reforço. As administrações iniciais são administradas preferivelmente com um intervalo de 2 a 4 semanas. A primeira administração de reforço é administrada com de 6 a 10 semanas de intervalo depois da administração inicial, e preferivelmente de 8 a 10 semanas depois da primeira administração inicial. A segunda administração de reforço é administrada de 14 a 18 semanas depois da primeira administração inicial, e preferivelmente de 15 a semanas depois da primeira administração inicial.

Em outra modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem duas administrações iniciais e uma administração de reforço. As administrações iniciais são administradas preferivelmente com intervalo de 2 a 4 semanas. A administração de reforço é administrada de 6 a semanas depois da primeira administração inicial, e preferivelmente de 6 a 16 semanas depois da primeira administração inicial, e mais preferivelmente de 11 a 16 semanas depois da primeira administração inicial.

Em outra modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem uma administração inicial e duas administrações de reforço. A primeira administração inicial é administrada de 2 a 10 semanas depois da administração inicial, e preferivelmente de 3 a 6 semanas depois da administração inicial. A segunda administração de reforço é administrada de 12 a 18 semanas depois da administração inicial, e preferivelmente de 14 a 16 semanas depois da administração inicial.

Em outra modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem uma administração inicial e uma administração de reforço. A administração de reforço é administrada de 2 a 18 semanas depois da administração inicial, e preferivelmente de 3 a 10 semanas depois da administração inicial, e mais preferivelmente de 3 a 6 semanas depois da administração inicial.

Vias adequadas de administração de vacinas ou composições imunogênicas de acordo com os métodos da presente invenção para administração inicial incluem vias orais, por exemplo, através da ingestão de água, ou vias oculares, por exemplo, por nebulização.

Doses de vacinas ou composições imunogênicas atenuadas para administração inicial de acordo com os métodos da presente invenção incluem de cerca de 0,1 mL até cerca de

2,0 mL, preferivelmente de cerca de 0,2 mL até cerca de 1,0 mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,4 mL até cerca de

0,6 mL. Essas doses têm de cerca de 10⁶ unidades formadoras de colônia por dose (UFC/dose) até cerca de IO¹⁰ UFC/dose o

de cada cepa de Salmonella, e preferivelmente de 10 unidades formadoras de colônia de cada cepa de Salmonella.

Quando uma vacina ou composição imunogênica atenuada é administrada com água para beber a uma ave, essas doses são diluídas de cerca de 1 mL até cerca de 5 mL de água de beber por ave.

Vias adequadas da administração das vacinas ou composições imunogênicas de acordo com os métodos da presente invenção para administração de reforço incluem vias subcutâneas (SC) e vias intramusculares (IM) . Uma vacina ou composição imunogênica de acordo com os métodos da presente invenção pode ser administrada por uma seringa com uma agulha ou por um aparelho sem agulhas (tal como, por exemplo, Pigjet, Avijet, Dermojet, Vitajet ou Biojector (Bioject, Oregon, EUA), ver US-A-2006/0034867).

Doses de vacinas ou composições imunogênicas inativadas para administração de reforço de acordo com os métodos da presente invenção podem ser de cerca de 0,05 mL até cerca de 2,0 mL, preferivelmente de cerca de 0,1 mL até cerca de 1,0 mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,2 mL até cerca de 0,4 mL. Essas doses têm de cerca de 10⁶ UFC/dose antes da inativação até cerca de 10^1θ UFC/dose antes da inativação de cada cepa de Salmonella, e preferivelmente de cerca de 10⁸ UFC/dose antes da inativação de cada cepa de Salmonella.

Outro aspecto da invenção é um kit para a vacinação de aves de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o kit compreende pelo menos dois frascos e um encarte de embalagem com instruções de administração, o primeiro frasco compreende uma vacina ou composição imunogênica de

Salmonella atenuada para administração inicial de acordo com os métodos da presente invenção e o segundo frasco compreende uma vacina ou composição imunogênica de

Salmonella inativada para administração de reforço e acordo com os métodos da presente invenção. Opcionalmente, o kit pode compreender frascos que compreendem uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella atenuada para várias administrações iniciais e/ou frascos que compreendem uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella inativada para várias administrações de reforço.

Em outra modalidade, o kit para vacinação de aves compreende pelo menos dois frascos e um encarte de embalagem com instruções de administração, o primeiro frasco compreendendo uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella do grupo D atenuada e o segundo frasco compreendendo uma vacina ou composição imunogênica de

Salmonella do grupo B inativada e Salmonella do grupo D inativada. Opcionalmente, o kit pode compreender frascos que compreendem uma vacina ou composição imunogênica de

Salmonella do grupo D atenuada para várias administrações iniciais e/ou frascos que compreendem uma vacina ou composição imunogênica de Salmonella do grupo B inativada e

Salmonella do grupo D inativada para múltiplas administrações de reforço.

A invenção será agora ainda descrita a título dos seguintes exemplos não-limitativos.

EXEMPLO 1:

Para a produção da vacina atenuada, um mutante duplo marcador auxotrófico de adenina/histidina da cepa do fago de Salmonella Enteritidis tipo 4 (PT4), derivada da mutagênese de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina foi usada. Essa cepa de Salmonella foi chamada de cepa E 3/49 (Martin G. et al., Berl. Münch. Tierârztl. Wschr., 1996,

109(10) : 325-9) . A cepa E 3/49 de Salmonella foi cultivada em meio nutriente contendo extrato de levedura, triptona,

Na₂HPO₄ x 2 H2O, MgSO₄ x 7 H₂O e água para injeção, pH 7,6 ±

0,2, por 18 - 24 horas a 37°C ± 1°C como uma cultura nãoaerada. As culturas foram estabilizadas com glicerina 10% vol., preenchidas em recipientes com alíquotas de 1,8 mL e armazenadas a -80°C ± 5°C.

mesmo meio nutriente adicionado de glicose foi usado para fermentação da cepa bacteriana. As culturas foram culturas não-aeradas pó 8 a 24 horas em cultuas de frasco de agitação por 8 a 16 horas a 37°C ± 1°C. 0 inoculo foi de

0,2 - 10 % em volume.

As culturas foram armazenadas por + 2°C até + 8°C por até 4 dias.

10 As	bactérias	obtidas foram coletadas	e	diluídas	com
salina	em tampão	fisiológico dependendo	da	contagem	de
organismos e em	solução de sacarose	20%	em volume

(concentração máxima de 60%) . O pH da vacina foi ajustado até 7,0 ± 0,5 com NaOH ou CH₃COOH.

A suspensão bacteriana foi a seguir liofilizada para armazenagem.

As bandejas foram esfriadas até 0°C passo a passo de baixo para cima. A vacina foi congelada no liofilizador em uma temperatura mínima de -40°C por aproximadamente 3-4 horas. Uma vez alcançado o vácuo necessário o processo de secagem principal foi iniciado (temperatura da bandeja controlada até um máximo de +10 °C) até a temperatura do produto de +5°C ser alcançada. A secagem secundária a seguir prosseguiu em uma temperatura de bandeja de máximo de +35°C por um máximo de 12 horas.

Depois da secagem, as garrafas foram preenchidas com nitrogênio estéril seco, foram automaticamente vedadas, lustradas e armazenadas em uma sala fria.

Na vacina atenuada obtida após a reconstituição em 0,5 mL de água de beber para aves, o título de Salmonella

Enteritidis atenuada foi de 10⁸ unidades formadoras de colônia (UFC) por dose.

EXEMPLO 2:

Para a produção da vacina inativada, duas cepas diferentes de Salmonella foram usadas, a cepa PT4 de

Salmonella Entritidis e a cepa DT104 de Salmonella

Typhimurium.

Cada cepa de Salmonella foi cultivada em caldo de soja tripticase em 0,25% de agar macio (TSA).

As bactérias obtidas foram coletadas, diluídas em água para injeção e congeladas em uma temperatura alvo de -70°C em bolsas na presença de crioprotetores (20% de glicerol e

5% de sacarose) para armazenagem.

Para a inativação da cepa PT4 de Salmonella

Enteritidis, as bolsas contendo a cepa PT4 de Salmonella

Enteritidis foram descongeladas, e a suspensão bacteriana foi transformada em um frasco estéril. O agente inativador, solução de formaldeído 35%, foi adicionado em uma concentração de 3,88% (volume de solução de formaldeído/volume de cultura) à suspensão bacteriana.

Depois da mistura por agitação, a suspensão foi transferida em outro frasco estéril. A inativação foi efetuada sob agitação por 24 horas a 24 °C.

Para inativação da cepa DT 104 de Salmonella

Typhimurium, o mesmo processo descrito para a cepa PT4 de

Salmonella Enteritidis foi efetuada.

As bactérias inativadas foram armazenadas a uma temperatura de +5°C +/- 3°C até o uso da formulação.

As bactérias de Salmonella Entritidis PT4 inativadas e as bactérias DT104 de Salmonella Typhimurium inativada foram misturadas e formuladas com um adjuvante de emulsão água-em-óleo compreendendo óleo de parafina, um poliol e éster de ácido graxo e um poliol etoxilado e éster de ácido graxo.

Um conservante foi usado no produto acabado (isto é, timerosal) em uma concentração final de 100 gg por mL.

Na vacina inativada, o titulo da cepa PT4 de Salmonella Enteritidis foi de 10⁸'³ UFD/dose antes da inativação, e aqueles da cepa DT 104 de Salmonella Typhimurium foi de 10⁸ UFC/dose antes da inativação.

EXEMPLO 3:

Galinhas SPF (livres de patógenos específicos) com 30 dias de vida foram aleatoriamente tomadas no dia DO do estudo, a seguir atribuídas aos três grupos de 10 galinhas cada.

Os grupos são definidos como a seguir:

- G.00 = grupo de controle.

- G.01 = vacina atenuada do exemplo 1 (1 dia de vida) + vacina inativada do exemplo 2 (21 dias de idade).

- G.02 = vacina inativada do exemplo 2 (21 dias de idade)

Depois da identificação, cada grupo foi alocado em unidades isoladas até o D53.

No DO, os animais do grupo G.01 foram vacinados com uma dose (pelo menos 10⁸ UFC) de vacina atenuada do exemplo

1 de 0,5 mL por via oral, distribuída diretamente na cavidade oral.

No D21, os animais de G.01 e G.02 foram vacinados com uma dose da vacina inativada do exemplo 2 por via intramuscular na região profunda muscular do peito, 0,3 20 mL/dose, título de Salmonella Enteritidis de 10⁸'³ UFC por dose antes da inativação, título de Salmonella Typhimurium de 10⁸ UFC por dose antes da inativação.

O grupo G.01 foi vacinado por último para evitar contaminação cruzada com a cepa da vacina atenuada.

Todos os grupos foram sangrados no D49 exatamente , .. _Aarxt.es do ,,des_eaf ip>,... a. ,.s,egui.r os. ...sorqs coletados foram testados para anticorpos específicos. Os grupos G.00, G.01 e G.02 foram testados pelo teste de IDEXX ELISA e pelo

Teste de Aglutinação Lenta (SAT).

No dia depois do desafio (D48), uma alíquota de

Salmonella Heidelberg {Salmonella do grupo B) foi descongelada em temperatura ambiente, a seguir suspensa em

100 mL de meio de caldo triptona soja Bio Mérieux (TSB) e incubada a 37 °C por 14 horas.

A suspensão bacteriana obtida foi centrifugada e o pellet da cepa foi semeado em TSB pré-aquecido fresco e incubado a 37 °C por um período de crescimento ótico (5 horas).

Tão logo o título da cultura de bactérias em desenvolvimento avaliado por densidade ótica (medido a 620 nm) foi alto o suficiente para ser uma suspensão com título de 10⁹ UFC/0,2 mL, esta foi usada para infecção em galinhas.

Diluições em série de 10 vezes em TSB dos inoculo foram semeadas em Agar Tripticase Soja (TSA) e incubadas 24 horas a 37 °C para contagem com três repetições.

No D49, todos os grupos foram desafiados com caldo de cultura de Salmonella Heidelberg, com titulo de 10⁸'⁹ UFC em

0,2 mL. Cada galinha foi infectada por via oral.

Quatro dias após a infecção (D53), todas as galinhas foram eutanasiadas. O baço e o ceco foram assepticamente retirados como amostras em cada galinha e colocados em tubos individuais previamente identificados. Os tubos, no final da coleta, foram processados para o reisolamento de

Salmonella.

- cada baço foi moido em 10 mL de seringa e foi diluído em 10 mL de água peptonada tamponada (BPW),

200 pL de diluição foram plaqueados em XLT4 + ampicilina (adicionando a uma taxa de 50 qg/mL) , meio para quantificação (a semeadura foi espalhada em agar). As placas foram incubadas a 37 °C por 48 horas.

Fase de pré-enriquecimento (PE)

- todo os baços diluídos foram a seguir incubados a

37°C por 16 - 20 horas,

- somente os baços negativos por método direto foram completamente continuados pelas fases seguintes.

Fase de enriquecimento (E) inoculação da suspensão de baço PE no caldo «R^ppãpOrt-Vasshliíadássv--so jaí .(RVS). em uma. proporção de 1:100 (5 μΐ em 500 gL) e incubação a 42 °C por 24 horas.

Isolamento seletivo

- plaqueamento da suspensão de baço E no meio XLT4 + ampicilina, a seguir incubação a 37°C por 48 horas - volume plaqueado de 10 μΐ,. As colônias de Salmonella típicas foram pretas ou de centro preto, e quando este tipo de colônia estava presente, a amostra foi classificada como sendo positiva.

Os resultado foram expressos em ucc (unidade de cultura celular)/órgão.

O conteúdo de ceco coletado (cerca de 1 g) foi assepticamente coletado em um tubo estéril, pesado e diluído na proporção de 1:10 peso/volume em BPW até 10e-7.

As diluições ΙΟ'², 10^-3, 10^-5 e 10⁷ foram incubadas a

37°C por 16-20 horas (PE) e adicionalmente tratadas para a fase de enriquecimento (E) e isolamento seletivo como para as amostras de baço.

As colônias de Salmonella foram identificadas e as placas positivas foram anotadas.

Os dados de reisolamento foram analisados como a seguir:

para o baço:

* ' ^J V /·* ' .* *

- as ambsühãh^rfê^a-fedsvas· depois do pré-enriquecimento e .· O* · Yi · enriquecimento foram-, contadas como 0 ucc/órgão,

- as amostras negativas no plaqueamento direto que foram positivas depois do pré-enriquecimento e enriquecimento foram contadas como 10 ucc/amostra, para conteúdo cecal:

- o resultado semi-quantitativo foi expresso em ucc/g de conteúdo de órgãos, baseando-se no método de diluição e positividade (isto é, 50 pL + 450 pL até diluições de IO^-2, 10’³, 10‘⁵ e 10^-7, quando positivas, até ΙΟ²’³, ΙΟ^3-3, 10⁵'³ e

IO^7-3 ucc/g de conteúdo cecal de Salmonella, respectivamente).

Os resultados dos titulo dos anticorpos específicos para todas as galinhas imunizadas e não-imunizadas, 4 semanas após a vacinação, estão resumidos na Tabela 1.

Os valores são expressos por títulos médios geométricos (GMT) para SAT e por títulos de média aritmética (AMT) por S/N e resultados de ELISA de

Salmonella Enteritidis IP.

Tabela 1:

Grupos	SAT - GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - AMT
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Proporção S/N	Unidades IP
G. 00	<10	0.72	28
G. 01	197	0.37	63
G.02	171	0.41	59

Os resultados sorológicos de SAT e ELISA obtidos do grupo não-vacinado foram constantemente negativos.

Em relação aos resultados SAT de Salmonella

Typhimurium, a vacina inativada sozinha apresentou soroconversão consistente (171 unidades SAT) com um surpreendente efeito sinergístico (15,2%) de vacina de

Salmonella Enteritidis atenuada no componente de Salmonella

Typhimurium (197 unidades SAT).

Em relação aos resultados de ELISA de Salmonella

Enteritidis de G.01 e G.02, o AMT apresentou valores de unidades IP superiores (6,8%) na vacina atenuada mais inativada do que somente a inativada, 63 e 59 respectivamente, com 10/10 indivíduos positivos por grupo.

A Tabela 2 resume os resultados do reisolamento de

Salmonella Heidelberg nos conteúdos de baço e cecal 4 dias após a infecção (expressos como positivo/total e como logio ucc/baço ou g).

Tabela 2:

Grupos	Baço	Conteúdo cecal
-/Tot.	+/Tot. d. p.	+/Tot a. e.	logio ucc de baço	-/Tot.	+/Tot. diluição a.e.	logio ucc grama
-2	-3	-5	-7
G.OO	3/10	3/10	4/10	1.2	0/10	10/ 10	10/ 10	7/ 10	0/1 0	4.7
G.01	10/10	0/10	0/10	0.0	2/10	8/1 0	1/1 0	0/ 10	0/1 0	1.9
G. 02	8/10	1/10	1/10	0.3	0/10	10/ 10	8/1 0	1/ 10	0/1 0	3.5

negativos +: positivos

d.p.: plaqueamento direto

a.e. depois do enriquecimento

Conforme verificado na Tabela 3, 4 dias após a infecção a cepa desafio de Salmonella Heidelberg mostrou capacidade de alcançar e colonizar os órgãos internos do grupo de controle com 0/10 amostras negativas e uma quantidade de Salmonellas significativa de 10el,2 ucc/órgão e 10e4,7 ucc/g, no baço e no conteúdo cecal, respectivamente.

Em relação aos resultados do baço, a melhor proteção contra o desafio de Salmonella Heidelberg foi dada pela vacina inativada associada com vacina atenuada (G.01) com Δ 15 = 10¹'² ucc/baço em comparação com o grupo de controle.

Resultados significativos foram obtidos também no grupo

G:02 por vacina inativada usada sozinha (Δ = 10^o'⁹ ucc/baço em comparação com o grupo de controle).

Em relação aos resultados do conteúdo cecal, a vacina inativada associada com a vacina atenuada (G.01) demonstrou um nível muito bom de proteção com Δ de 10²'⁸ ucc/baço em

comparação	com o	grupo de controle
mostrou um	nível	significativo	de
cecal com Δ	= 101'2	em comparação	com ι
Os resultados	sorológicos	do

efeito sinergístico da injeção por vacina atenuada em 1 dia de vida na soroconversão da vacina inativada. O efeito de iniciação quantificável foi de 6,8% para o componente de

Salmonella Entritidis (63 unidades IP de ELISA) e surpreendentes 15,2% para o componente Salmonella

Typhimurium (197 unidades de SAT) em comparação com somente a vacina inativada.

A vacina inativada em associação com a vacina atenuada apresentou um efeito protetor completo para o baço e também contra a invasão do conteúdo cecal de Salmonella Heidelberg do que a vacina inativada sozinha, com Δ = 10¹'² ucc/baço e Δ = 10²'⁸ ucc/grama de conteúdo cecal, em comparação com os resultados do controle. Existe um claro aumento de proteção entre grupos induzido pela iniciação da vacina de

Salmonella Enteritdis atenuada na vacina de Salmonella

Enteritidis + Salmonella Typhimurium inativada.

EXEMPLO 4:

0 mesmo experimento descrito no exemplo 3 foi feito, exceto que a cepa Salmonella desafio não foi Salmonella

Heidelberg, mas sim Salmonella Infantis.

Os resultados dos títulos de anticorpo específico para todas as galinhas imunizadas e não-imunizadas, 4 semanas após a vacinação, estão resumidos na Tabela 3.

Os valores estão expressos pelos títulos médios geométricos (GMT) para SAT e pelos títulos médios aritméticos (AMT) para S/N e resultados de ELISA de

Salmonella Enteritidis IP.

Tabela 3:

Grupos	SAT - GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS
ELISA	- AMT
SALMONELLA. TYPHIMURIUM	Proporção S/N	Unidades IP
G. 00	<10	1,27	00
G. 01	184	0,40	60
G. 02	139	0,44	56

Os resultados sorológicos de ELISA e SAT obtidos do grupo não-vacinado foram constantemente negativos.

Em relação aos resultados SAT de Salmonella

Typhimurium, a vacina inativada sozinha apresentou soroconversão consistente (139 unidades SAT) com um surpreendente efeito sinergístico da vacina de Salmonella

Enteritidis atenuada no componente de Salmonella

Typhimurium (184 unidades SAT).

Em relação aos resultados de ELISA de Salmonella

Enteritidis G.01 e G.02, o AMT mostrou valores de unidades

IP superiores em vacinas atenuadas mais inativadas do que somente a inativada, 60 e 56 respectivamente, com 10/10 indivíduos positivos por grupo.

Tabela 4 resume os resultados de reisolamento de

Salmonella nos baços e conteúdos cecais 7 dias após a infecção (expressos como positivo/total e como logio ucc/baço ou g).

Tabela 4:

Grupos	Baço	Conteúdo cecal
-/Tot.	+/Tot. d. p.	+/Tot a. e.	logio ucc de baço	-/Tot.	+/Tot. diluição a. e.	logio ucc grama
-5	-7
G. 00	0/10	9/10	1/10	2,3	0/10	10/10	4/10	6,1
G.01	5/10	3/10	2/10	0,9	1/10	1/10	0/10	2,9
G.02	5/10	2/10	3/10	0,7	0/10	3/10	0/10	3,9

negativos +: positivos

d.p.: plaqueamento direto

a.e. depois do enriquecimento

Conforme verificado na Tabela 4, 7 dias após a infecção a cepa desafio de Salmonella Infantis mostrou capacidade de alcançar e colonizar os órgãos internos do grupo de controle com 0/10 amostras negativas e uma quantidade de Salmonellas significativa de 10²'³ ucc/órgão e 10⁶'¹ ucc/g, no baço e no conteúdo cecal, respectivamente.

Em relação aos resultados do baço, a melhor proteção contra o desafio de Salmonella Infantis foi dada pela vacina inativada associada com vacina atenuada (G.01) com Δ = 10¹'⁴ ccu/baço em comparação com o grupo de controle.

Em relação aos resultados do conteúdo cecal, a vacina inativada associada com a vacina atenuada (G.01) demonstrou um nivel muito bom de proteção com Δ de 10³'² ucc/baço em comparação com o grupo de controle. A vacina inativada mostrou um nível significativo de proteção de conteúdo cecal com Δ = 10²'² em comparação com o grupo de controle.

Os resultados sorológicos do grupo G.01 mostraram efeito sinergístico da injeção por vacina atenuada em 1 dia de vida na soroconversão da vacina inativada. O efeito de iniciação quantificável foi de 7% para o componente de

Salmonella Entritidis (60. unidades IP de ELISA) e 32% para ©><componente ‘sSaâunonetóai^Byphímurium (184 unidades SAT) em comparação com somentè a vacina inativada.

A vacina inativada em associação com a vacina atenuada apresentou um efeito protetor melhor na maior parte para proteção cecal (Δ = 10³'² ccu/grama) e uma proteção similar somente à vacina inativada nos baços com Δ = 10¹'⁴ ucc/órgão, em comparação com os resultados de controle.

EXEMPLO 5:

O mesmo experimento descrito no exemplo 3 foi feito, exceto que a cepa Salmonella desafio não foi Salmonella

Heidelberg, mas sim Salmonella Virchow.

Os resultados dos títulos de anticorpo específico para todas as galinhas imunizadas e não-imunizadas, 4 semanas após a vacinação, estão resumidos na Tabela 5.

Os valores estão expressos pelos títulos médios geométricos (GMT) para SAT e pelos títulos médios aritméticos (AMT) para S/N e resultados de ELISA de

Salmonella Enteritidis IP.

Tabela 5:

Grupos	SAT - GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - AMT
SALMONELLA TYPHIMURIUM	S/N Ratio	IP units
G. 00	<10	1,07	00
G. 01	160	0,44	56
G.02	149	0,50	50

Os resultados sorológicos de ELISA e SAT obtidos do grupo não-vacinado foram constantemente negativos.

Em relação aos resultados SAT de Salmonella

Typhimurium, a vacina inativada sozinha apresentou soroconversão consistente (149 unidades SAT) com um surpreendente efeito sinergístico da vacina de Salmonella

Enteritidis atenuada no componente de Salmonella

Typhimurium (160 unidades SAT).

Em relação aos resultados de ELISA de Salmonella

Enteritidis G.01 e G.02, o AMT mostrou valores de unidades

IP superiores em vacinas atenuadas mais inativadas do que somente na inativada, 56 e 50 respectivamente, com 10/10 indivíduos positivos por grupo.

Tabela 6 resume os resultados de reisolamento de

Salmonella Virchow nos baços e conteúdos cecais 4 dias após a infecção (expressos como positivo/total e como logio ucc/baço ou g).

Tabela 6:

Grupos	Baço	Conteúdo Cecal
-/Tot.	+/Tot. d. p.	+/Tot a. e.	logio ucc baço	-/Tot.	+/Tot. a. e. diluição	logio ucc grama
-5	-7
G.00	0/10	8/10	2/10	2,4	0/10	10/10	6/10	6, 5
G.01	9/10	0/10	1/10	0,1	0/10	5/10	1/10	4,5
G.02	6/10	2/10	2/10	0, 6	0/10	8/10	3/10	5,5

negativos +: positivos

d.p.: plaqueamento direto

a.e. depois do enriquecimento

Conforme verificado na Tabela 6, 4 dias após a infecção a cepa desafio de Salmonella Virchow mostrou capacidade de alcançar e colonizar os órgãos internos do grupo de controle com 0/10 amostras negativas e uma quantidade de Salmonellas significativa de 10²'⁴ ucc/órgão e

10⁶'⁵ ucc/g, no baço e no conteúdo cecal, respectivamente.

Em relação aos resultados do baço, a melhor proteção contra o desafio de Salmonella Virchow foi dada pela vacina inativada associada com vacina atenuada (G.01) com Δ = 10²'³ ucc/baço em comparação com o grupo de controle. Bons resultados foram conseguidos também no grupo G.02 pelo uso somente da vacina inativada (Δ = 10¹'⁸ ucc/baço em comparação com o grupo de controle).

Em relação aos resultados do conteúdo cecal, a vacina

-inativada a-ssocaíadaMcom a> vacina atenuada (G.01) demonstrou um nível muito bom de proteção com Δ de IO²'⁰ ucc/baço em comparação com o grupo de controle. A vacina inativada mostrou um nível significativo de proteção de conteúdo cecal com Δ = IO^1,0 em comparação com o grupo de controle.

Os resultados sorológicos do grupo G.01 mostraram o efeito sinergístico da injeção da vacina atenuada em 1 dia

de vida na	soroconversão	da	vacina inativada. 0	efeito de
10 iniciação	quantificável	foi	de 12% para o	componente
Salmonella	Entritidis	(56	unidades IP de	ELISA) e
surpreendentemente 7,4%	para o componente	Salmonella

Typhimurium (160 unidades SAT) em comparação com somente a vacina inativada.

A vacina inativada juntamente com a vacina atenuada apresentou um efeito protetor melhor na maior parte para proteção do baço, porém também contra a invasão do conteúdo cecal de Salmonella Virchow do que somente a vacina inativada, com Δ = 10²'³ ucc/baço e Δ = IO²'⁰ ucc/grama de conteúdo cecal, em comparação com os resultados de controle.

EXEMPLO 6:

mesmo experimento como descrito no exemplo 3 foi feito, exceto que a cepa Salmonella desafio não foi

Salmonella Heidelberg, mas sim Salmonella Hadar. A titulação do inóculo do desafio final foi de 10⁹ UFC/0,2 mL.

Os resultados dos títulos de anticorpo específico para todas as galinhas imunizadas e não-imunizadas, 4 semanas após a vacinação, estão resumidos na Tabela 7.

Os valores estão expressos pelos títulos médios geométricos (GMT) para SAT e pelos títulos médios aritméticos (AMT) para S/N e resultados de ELISA de

Salmonella Enteritidis IP.

Tabela 7:

Grupos	SAT - GMT	SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - AMT
SALMONELLA TYPHIMURIUM	Proporção S/N	Unidades IP
G. 00·	<10	0,88	12
G. 01	211	0,42	58
G. 02	171	0,49	51

Os resultados sorológicos de ELISA e SAT obtidos do grupo não-vacinado foram constantemente negativos.

Em relação aos resultados SAT de Salmonella

Typhimurium, a vacina inativada sozinha apresentou soroconversão consistente (171 unidades SAT) com um surpreendente efeito sinergístico da vacina de Salmonella

Enteritidis atenuada no componente de Salmonella

Typhimurium (211 unidades SAT).

Em relação aos resultados de ELISA de Salmonella

Enteritidis G.01 e G.02, o AMT mostrou valores de unidades

IP superiores (6,8%) em vacinas atenuadas mais inativadas do que somente na inativada, 58 e 51 respectivamente, com

10/10 indivíduos positivos por grupo.

Tabela 8 resume os resultados de reisolamento de

Salmonella Hadar nos baços e conteúdos cecais 4 dias após a infecção (expressos como positivo/total e como logio ucc/baço ou g).

Tabela 8:

Grupos	Baço	Conteúdo cecal
-/Tot.	+/Tot. d. p.	+/Tot a. e.	logio ucc baço	-/Tot.	+/Tot. a. e. diluição	logio ucc grama
-5
G. 00	2/10	4/10	4/10	1,3	0/10	9/10	5,1
G.01	6/10	0/10	4/10	0,4	0/10	5/10	4,3
G.02	3/10	4/10	3/10	1,1	0/10	5/10	4,3

negativos +: positivos

d.p.: plaqueamento direto

a.e. depois do enriquecimento

Conforme verificado na Tabela 8, 4 dias após a infecção a cepa desafio de Salmonella Hadar mostrou capacidade de alcançar e colonizar os órgãos internos do grupo de controle com 2/10 e 0/10 amostras negativas e uma quantidade de Salmonellas significativa de 10¹'³ ucc/órgão e 10⁵'¹ ucc/g, no baço e no conteúdo cecal, respectivamente.

Em relação aos resultados do baço, a melhor proteção contra o desafio de Salmonella Hadar foi dada pela vacina inativada associada com vacina atenuada (G.01) com Δ = 10°'⁹ ucc/baço em comparação com o grupo de controle. Resultados limitados foram conseguidos também no grupo G.02 pelo uso somente da vacina inativada (Δ = 10°'² ucc/baço em comparação com o grupo de controle).

Em relação aos resultados do conteúdo cecal, a vacina inativada associada com a vacina atenuada (G.01) ou com a vacina inativada (G.02) demonstrou um nivel igual de proteção com Δ de 10^o'⁸ ucc/baço em comparação com o grupo de controle.

Os resultados sorológicos do grupo G.01 mostraram o efeito sinergistico da injeção da vacina atenuada em 1 dia de vida na soroconversão da vacina inativada. O efeito de iniciação quantificável foi de 14% para o componente

Salmonella entritidis (58 unidades IP de ELISA) e surpreendentemente 23% para o componente Salmonella

Typhimurium (211 unidades SAT) em comparação com somente a vacina inativada.

A vacina inativada juntamente com a vacina atenuada apresentou um efeito protetor melhor contra a invasão do conteúdo cecal de Salmonella Hadar do que somente a vacina inativada, em comparação com os resultados de controle.

Tabela 9 resume os resultados dos exemplos 3 a 6 considerando o isolamento de Salmonella no baços de galinhas infectadas depois do desafio com Salmonella de sorovar heterólogo.

Tabela 9:

Quantidade de amostras de baço para isolamento positivo/negativo depois do desafio, para vários tratamentos
Grupos de tratamento	Baços positivos	Baços negativos	Total
Atenuado + inativado	10	30	40
Somente inativado	18	22	40
Total	28	52	80

Esses resultados apresentam uma diferença significativa com risco de 6,5% com o teste K2 e uma diferença significativa a 5% de um risco unilateral com o teste de Fischer exato, entre o grupo vacinado duas vezes de acordo com um método da presente invenção (por exemplo, primeiramente com a vacina de Salmonella atenuada e depois com a vacina de Salmonella inativada) e o grupo vacinado somente com a vacina de Salmonella inativada.

0 método usando uma administração inicial com uma vacina de Salmonella Enteritidis atenuada (grupo D) aumenta a eficácia da vacina inativada oleosa bivalente de

Salmonella Enteritidis/Salmonella Typhimurium contra um desafio com sorovar heterólogo do grupo B, e assim como dos grupos Cl e C2 os quais não estavam presentes nas fórmulas de vacina que foram utilizadas. Essa intensificação é significativamente mostrada pela redução da invasão do baço depois do desafio com Salmonella, de um sorovar heterólogo, por comparação com o grupo vacinado duas vezes de acordo com um método da presente invenção e o grupo vacinado somente com a vacina de Salmonella inativada.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Kit ou conjunto para vacinação de animais compreendendo pelo menos dois frascos e um folheto de embalagem com instruções para administração caracterizado pelo fato de que o primeiro frasco compreende uma composição imunogênica ou vacina de Salmonella do grupo D atenuada e o segundo frasco compreende uma vacina ou composição imunogênica compreendendo uma Salmonella do grupo B inativada e uma Salmonella do grupo D inativada, com os quais o kit ou conjunto de vacinação é operativamente montado para executar a administração da vacina a um animal da família das aves.
2. 2. Kit ou conjunto de vacinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois frascos contêm uma composição imunogênica ou vacina de Salmonella do grupo D atenuada para múltiplas administrações iniciais e uma composição imunogênica ou vacina de Salmonella do grupo B inativada e Salmonella do grupo D inativada para a administração de múltiplas doses de reforço.
3. 3. Uso de uma composição imunogênica atenuada compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para administração de dose inicial a um animal.
4. 4. Uso de uma composição imunogênica inativada compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo

   Petição 870180024395, de 26/03/2018, pág. 11/13 menos uma Salmonella inativada caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para administração de dose reforço a um animal.
5. 5. Uso de uma composição imunogênica inativada compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella inativada caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para administração de dose inicial a um animal.
6. 6. Uso de uma composição imunogênica atenuada compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável e pelo menos uma Salmonella atenuada caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para administração de dose reforço a um animal.

   7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o animal é uma ave. 8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7 , caracterizado pelo fato de que a pelo

   menos uma Salmonella atenuada ou a pelo menos uma Salmonella inativada é selecionada do grupo B.
7. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a Salmonella do grupo B é selecionada do grupo compreendendo Salmonella typhimurium, Salmonella braenderup, Salmonella agona, Salmonella bredeney, Salmonella heidelberg, Salmonella indiana, Salmonella saint-paul e Salmonella brandenburg.
8. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9,

   Petição 870180024395, de 26/03/2018, pág. 12/13 caracterizado pelo fato de que pelo menos uma Salmonella do grupo B atenuada ou inativada é Salmonella typhimurium.
9. 11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma Salmonella atenuada ou inativada é selecionada de Salmonella do grupo D.
10. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a Salmonella do grupo D é selecionada do grupo compreendendo Salmonella enteritidis, Salmonella panama, Salmonella dublin, Salmonella gallinarum e Salmonella pullorum.
11. 13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a que pelo menos uma Salmonella do grupo D atenuada ou inativada é Salmonella enteritidis.

    Petição 870180024395, de 26/03/2018, pág. 13/13

    1/1

    Iog10 CCU/mL Porcentagem de amostras positivas

    100%

    80%

    60%

    40%

    20%

    0% □Controle □L+K □Morto

    S. Heidelberg

    S. Infantis

    S. Virchow

    S. Hadar cepas desafiadas