ES2398598T3 - Vacuna de salmonella en aves de corral - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna para su uso en la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedadcausada por al menos una Salmonella heteróloga y/o en la prevención del transporte de al menos unaSalmonella heteróloga en animales aviares, en la que la vacuna está formulada para la administración en laforma de un régimen de sensibilización-refuerzo que comprende al menos una primo-administración de unacomposición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptabledesde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D,administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composicióninmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el puntode vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos unaSalmonella inactivada del grupo D, en la que la primo-administración y la administración de refuerzo seadministran con un intervalo de entre 2 y 18 semanas.

Description

Vacuna de salmonella en aves de corral.

[0001] La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. de nº de serie 60/869.524 registrada el 11 de diciembre de 2006.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere al campo de la vacunación contra Salmonella en animales, en particular animales aviares. La presente invención comprende también kits y usos de composiciones inmunógenas o vacunas de Salmonella.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] Salmonella spp. son patógenos intracelulares facultativos que provocan infecciones localizadas o sistémicas, además de un estado de portador asintomático crónico. Tienen importancia económica y para la salud pública en todo el mundo. En aves de corral, la tifosis aviar y la pulorosis siguen provocando pérdidas económicas en aquellas partes del mundo en las cuales las industrias avícolas se están haciendo intensivas y en las que es común el uso de instalaciones abiertas. Diversos serotipos que causan gastroenteritis humana están también en aumento. Los costes o la impracticabilidad de mejoras en la higiene y la gestión junto con problemas crecientes de resistencia a los antibióticos indican que la vacunación en aves de corral se hará más atractiva como una medida auxiliar a las medidas de control ya existentes (Zhang-Barber L. y col., Vaccine, 1999, 17 (20 – 21): 2538 – 45).

[0004] La Salmonella es una de las causas principales de enfermedades transmitidas por el alimento en los seres humanos. Según el informe de la Comisión sobre zoonosis (European Commission: Trends and sources of zoonotic infections in animals, feed, food and man in the European Union and Norway in 2003), se han comunicado

1.335.546 casos humanos de salmonelosis en 2003 en los 15 Estados Miembros de la Unión Europea y Noruega.

[0005] La industria avícola, especialmente en Europa y en los Estados Unidos, se encuentra sometida a una fuerte presión por parte de las autoridades sanitarias y los consumidores para reducir los riesgos de contaminación humana con Salmonella de origen aviar, en particular salmonelosis (reducción de patógenos y HACCP en EE.UU., Directiva del Consejo 92/117/EEC en la UE).

[0006] Como la Salmonella infecta a numerosas poblaciones de animales (por ejemplo, mamíferos, aves), el riesgo de sufrir salmonelosis siempre existe, con independencia del país, la estación o las prácticas de manipulación de alimentos.

[0007] Las causas zoonóticas de Salmonella spp. de infección gastrointestinal humana se han tratado con los agentes antimicrobianos existentes. Desde principios de la década de 1990, han aparecido cepas de Salmonella resistentes a una diversidad de agentes antimicrobianos, lo que hace que el tratamiento de la infección sea menos eficiente y aumente el riesgo humano de contraer una infección gastrointestinal causada por Salmonella spp.

[0008] Como en años anteriores, dominó la Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Enteritidis (Salmonella Enteritidis), que causó el 61,8 % (2002: 67,1 %) de todos los casos notificados en la Unión Europea y Noruega. Los índices en los países individuales oscilaron entre el 87,9 % en Austria y el 33,3 % en Francia. La segunda fue la Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Typhimurium (Salmonella Typhimurium), que causó el 16,5 % de los casos. Los índices en los países individuales oscilaron entre el 5,8 % en Austria y el 28,7 % en Irlanda. Como en años anteriores, después de la Salmonella Enteritidis y la Salmonella Typhimurium, la mayoría de los casos fueron debidos a Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Virchow (Salmonella Virchow), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Infantis (Salmonella Infantis) y Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Hadar (Salmonella Hadar). Cada una de estas serovariedades está implicada en menos del 1 % de todos los casos notificados.

[0009] La fuente principal de contaminación es a través del consumo de huevos y carne de ave. La reducción de dichos riesgos se consigue a través de una combinación de medios a lo largo de todas las cadenas de producción de huevos y carne, por ejemplo, con buenas prácticas ganaderas e higiénicas y vacunación.

[0010] La legislación comunitaria sobre higiene alimentaria y control de las zoonosis incluye diversas disposiciones que persiguen controlar y prevenir la contaminación con Salmonella de los alimentos. Según se cree, las medidas para reducir la prevalencia de la Salmonella en los animales vivos es uno de los modos más eficaces de reducir la contaminación de los alimentos y el número de casos de salmonelosis humana.

[0011] En 2003, se publicó la nueva legislación europea sobre zoonosis; el Reglamento 2160/2003 proporciona la fijación de objetivos de reducción de patógenos a lo largo de la cadena alimentaria, principalmente para poblaciones animales, y el establecimiento de planes nacionales de control con el fin de cumplir con estos objetivos. Salmonella spp. es el objetivo principal, en particular los serotipos que se consideran de importancia para la salud pública. Los objetivos se fijarán progresivamente en diferentes poblaciones animales: manadas reproductoras de Gallus gallus, gallinas ponedoras, pollos de rápido crecimiento, pavos y cerdos para el sacrificio. Hasta ahora, sólo se han fijado objetivos para manadas reproductoras de Gallus gallus (Reglamento 1003/2005); el objetivo se ha establecido en el 1 %, lo que significa que para finales de 2009 el porcentaje máximo de manadas positivas para Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis, Salmonella Hadar y Salmonella Virchow en el ámbito de la UE será del 1 %.

[0012] En lo que respecta a los criadores, el Reglamento 1091/2005 prohíbe el uso de antimicrobianos como medida de control contra Salmonella, mientras que el uso de vacunas es aceptado y recomendado. Las conclusiones y recomendaciones del Panel Científico sobre Riesgos Biológicos en una petición de la Comisión relacionada con el uso de vacunas para el control de Salmonella en aves de corral (The EFSA Journal (2004) 114, 1

– 74) son ampliamente favorables hacia el uso de vacunas para controlar Salmonella en las explotaciones ganaderas. En particular, las conclusiones del panel son, entre otras, las siguientes:

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La base para el control exitoso de infecciones por Salmonella en explotaciones avícolas son las buenas prácticas ganaderas e higiénicas (incluidos todos los aspectos que cubren la alimentación, las aves, la gestión, la limpieza y la desinfección, el control de roedores, etc.) así como las pruebas y la eliminación de manadas positivas de la producción. La vacunación de los pollos se contempla como una medida para aumentar la resistencia de las aves contra la exposición a Salmonella y para reducir la presencia en la eliminación fecal.

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Existe evidencia experimental y cierta evidencia de trabajo de campo de que una reducción en el nivel de excreción fecal e invasión sistémica de organismos de Salmonella en aves vacunadas dará como resultado una menor contaminación de los huevos de consumo y el entorno.

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Si se establece un programa de control para criadores de aves para puesta / pollos de crecimiento rápido o gallinas ponedoras y la prevalencia en el grupo es elevada, la vacunación puede ser útil para reducir la contaminación de los huevos y la eliminación fecal. Si la prevalencia en el grupo es baja, la vacunación puede no resultar útil aun cuando todavía puede usarse como una de las medidas preventivas para mantener una baja prevalencia.

[0013] Existen más de 2.000 serovariedades de bacterias de Salmonella.

[0014] La clasificación de Kauffman y White (http://en.wikipedia.org/wiki/Kauffman-White_classification) permite diferenciar entre sí las distintas variedades serológicas del género Salmonella. Esta clasificación diferencia los aislados según la determinación de los antígenos de superficie que son producidos por la bacteria. En primer lugar, se determina el tipo de antígeno "O". Los antígenos "O" son los polisacáridos asociados con el lipopolisacárido de la membrana exterior bacteriana. Una vez que se ha determinado el grupo de antígeno "O", se determina el antígeno "H". Los antígenos "H" son proteínas asociadas con los flagelos bacterianos. Las Salmonellas existen en dos fases; una fase móvil y una fase no móvil. Estas se refieren también como fases específica y no específica. Se producen diferentes antígenos "H" dependiendo de la fase en la que se encuentra la Salmonella. Las cepas patógenas de Salmonella typhi llevan un antígeno adicional, "Vi", así denominado debido a la virulencia potenciada de las cepas que producen este antígeno, que está asociado con una cápsula bacteriana.

[0015] Según la clasificación de Kauffman y White, se forman grupos "O" de serovariedades de Salmonella.

[0016] Contra la colonización por la Salmonella del grupo C en pollos, se desarrolló una vacuna atenuada, basada en Salmonella Hadar de cya eliminado / crp eliminado y una Salmonella Hadar de phoP eliminado (Roland

K. y col., Avian Dis., 2004, 48 (3): 445 – 52). Aunque el derivado de cya eliminado / crp eliminado indujo niveles superiores de anticuerpo en suero, no proporcionó una respuesta inmunitaria de protección contra la colonización por Salmonella Hadar.

[0017] Chacana y col. (Chacana P.A. y col., Avian Dis., 2006, 50 (2): 280-3) demostraron que la vacuna atenuada de Salmonella puede desencadenar inmunidad cruzada contra miembros del mismo serogrupo de la clasificación de Kauffman-White. Se exploró la protección conferida por TAD Salmonella vac E, una vacuna de Salmonella Enteritidis atenuada, contra tifosis aviar. Se vacunó a tres grupos de gallinas ponedoras con diferentes planes de vacunación que comenzaron en el primer día de vida, y posteriormente se les inyectaron 2 x 105 UFC de una cepa virulenta de Salmonella Gallinarum, en la semana 28 o en la semana 52. Se valoró la mortalidad, la eliminación por vía fecal y la invasión en órganos de Salmonella Gallinarum. La vacuna contra Salmonella Enteritidis consiguió la inmunización cruzada contra Salmonella Gallinarum, las dos cepas de la Salmonella del grupo D, según la clasificación de Kauffman-White. En la semana 28, las gallinas vacunadas con tres dosis orales o con dos dosis orales combinadas con una dosis subcutánea estaban protegidas por la vacuna. Sin embargo, en la semana 52, cuando las gallinas fueron infectadas 36 semanas después de la inmunización final, la vacuna no pudo conferir protección.

Nassar y col. (Rev sci tech Off int Epiz, 1994) desvelan el uso de vacuna con organismos vivos e inactivada de fago tipo 4 de Salmonella enteritidis para inmunizar a gallinas ponedoras contra la infección experimental.

[0018] Debido al gran número de serovariedades de Salmonella, existe la necesidad de vacunas contra la Salmonella que sean capaces de inducir una respuesta inmunitaria de protección contra más de una serovariedad de Salmonella y/o contra Salmonella de más de un grupo de clasificación de Kauffman-White.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0019] En consecuencia, la presente invención se refiere a una estrategia de vacunación, que se basa en al menos una primo-administración de una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada y al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada. Esta estrategia de vacunación es útil para prevenir la presencia como portadores de Salmonella homóloga y heteróloga en sujetos vacunados.

[0020] La presente invención proporciona, en un aspecto, una composición de vacuna para su uso en la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedad causada por al menos una Salmonella heteróloga y/o la prevención del transporte de al menos una Salmonella heteróloga en animales aviares, en la que la vacuna está formulada para su administración en la forma de un régimen de sensibilización-refuerzo que comprende al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, en la que la primo-administración y la administración de refuerzo se administran con un intervalo de entre 2 y 18 semanas.

[0021] En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit o conjunto de vacunación para vacunación de animales aviares, que comprende al menos dos viales y un prospecto incluido en el envase con instrucciones de administración, en el que los al menos dos viales comprenden una Salmonella atenuada y una Salmonella inactivada, en el que el kit o conjunto de vacunación están ensamblados de forma operativa para realizar la administración de la vacuna a un animal de la familia aviar y para desencadenar una respuesta inmunitaria segura y protectora contra Salmonella, en el que el primer vial comprende una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D y el segundo vial comprende una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D.

[0022] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedad causada por al menos una Salmonella heteróloga y/o la prevención del transporte de al menos una Salmonella heteróloga en animales aviares, en la que la vacuna está formulada para su administración en forma de un régimen de sensibilización-refuerzo que comprende al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, en la que la primo-administración y la administración de refuerzo se administran con un intervalo de entre 2 y 18 semanas.

[0023] También es un objeto de esta descripción proporcionar procedimientos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas con el fin de prevenir la Salmonella homóloga y/o heteróloga en animales aviares, en los que se administra al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada unas semanas más tarde, en particular de 2 semanas a 18 semanas después de la única o primera primo-administración.

[0024] También es un objeto de esta descripción proporcionar procedimientos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas con el fin de prevenir el transporte de Salmonella homóloga y/o heteróloga en animales aviares, en los que se administra al menos una primo-administración de una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D unas semanas más tarde, en particular de 2 semanas a 18 semanas después de la única o primera primo-administración. En la presente memoria descriptiva se proporcionan ejemplos de los grupos B y D de Salmonella.

[0025] También es un objeto de esta descripción proporcionar kits para vacunación de animales aviares, que comprenden al menos dos viales y un prospecto incluido en el envase con instrucciones de administración, conteniendo el primer vial una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada y conteniendo el segundo vial una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada. Opcionalmente, pueden incluirse viales adicionales, viales que comprenden una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada para primo-administración múltiple y/o viales que comprenden una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada para administración de refuerzo múltiple.

[0026] Se observa que en esta descripción y en particular en las reivindicaciones términos como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la Ley de Patentes de EE.UU., por ejemplo, admiten elementos no enumerados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

[0027] Estas y otras formas de realización se desvelan o son evidentes a partir de, y están comprendidas por, la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0028] La siguiente descripción detallada, ofrecida a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a formas de realización específicas descritas, puede entenderse en conjunción con las figuras adjuntas, incorporadas como referencia en la presente memoria descriptiva, en las que:

La fig. 1 ilustra el porcentaje de reaislamiento de cepas de Salmonella de pruebas de provocación en el bazo de pollos, 4 a 7 días después de la prueba de provocación.

La fig. 2 ilustra las numeraciones medias en el ciego de cepas de Salmonella de pruebas de provocación en pollos, 4 a 7 días después de la prueba de provocación, y las desviaciones típicas.

[0029] En la fig. 1 y la fig. 2, "Control" es el grupo de control no vacunado, que corresponde a G.00; "A+I" es el grupo vacunado dos veces, primero con la vacuna a base de Salmonella atenuada y en segundo lugar con la vacuna a base de Salmonella inactivada, que corresponde a G.01; "Inactivada" corresponde el grupo vacunado sólo con la vacuna a base de Salmonella inactivada, que corresponde a G.02.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0030] La presente descripción se refiere a procedimientos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares con el fin de aumentar la respuesta inmunitaria contra al menos una Salmonella heteróloga, en los que se administra al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada de una serovariedad de Salmonella, a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada de una serovariedad de Salmonella, con un intervalo de unas semanas, en particular un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. La Salmonella atenuada y la Salmonella inactivada pueden proceder de la misma serovariedad o de serovariedades diferentes. Una Salmonella heteróloga es una bacteria diferente de las usadas en las composiciones inmunógenas o vacunas administradas durante la primo-administración y durante la administración de refuerzo, por ejemplo, Salmonella de otra serovariedad o de otro grupo de Salmonella según la clasificación de Kauffman-White.

[0031] Los procedimientos de la descripción objeto pueden usarse en animales aviares con el fin de lograr la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedad causada por al menos una Salmonella heteróloga y/o la prevención del transporte de al menos una Salmonella heteróloga en animales aviares.

[0032] Los procedimientos de la presente descripción pueden usarse también en animales aviares con el fin de reducir el número de bacterias del grupo C de Salmonella en el bazo y/o en el ciego de animales aviares infectados, en particular la reducción del número de bacterias del grupo C1 de Salmonella y del grupo C2 de Salmonella en el bazo y/o en el ciego de animales aviares infectados o la reducción del número de bacterias del grupo B de Salmonella y de bacterias del grupo C de Salmonella en el bazo y en el ciego de animales aviares infectados. En la presente memoria descriptiva se proporcionan ejemplos de grupos C de Salmonella.

[0033] El término "composición inmunógena" se refiere a cualquier composición capaz, una vez que se ha inyectado en un animal aviar, de inducir o estimular una respuesta inmunitaria contra la Salmonella.

[0034] El término "composición de vacuna" o "vacuna" se refiere a cualquier composición capaz, una vez que se ha inyectado en un animal, especialmente un animal aviar, de inducir o estimular una respuesta inmunitaria de protección contra enfermedades causadas por Salmonella y/o de inducir o estimular una respuesta inmunitaria de protección para prevenir o reducir el transporte de Salmonella en animales, especialmente animales aviares.

[0035] Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos una primo-administración y al menos una administración de refuerzo que usan al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La vacuna usada en primo-administración puede ser de naturaleza diferente a la usada como una vacuna de refuerzo posterior. La primo-administración puede comprender una o más administraciones. Análogamente, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0036] Los procedimientos de la descripción incluyen al menos una primo-administración y al menos una administración de refuerzo a un animal, preferentemente aviar, de una cantidad eficaz de la composición inmunógena o vacuna según la descripción. El animal puede ser macho o hembra. Esta administración puede realizarse en particular mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o a través de administración intranasal u oral, en las que la administración oral incluye, pero no se limita a, administración en el pienso o en agua potable, geles o aerosoles.

[0037] Los excipientes, diluyentes o vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico o veterinario pueden ser agua, agua para inyección, suero salino o tampón. A la composición inmunógena o vacuna atenuada puede añadírsele un estabilizador, como glicerina, solución de glúcidos, como solución de sacarosa.

[0038] La composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada. La Salmonella atenuada puede seleccionarse entre el grupo que consiste en el grupo D de Salmonella y el grupo B de Salmonella, preferentemente entre el grupo D que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, y entre el grupo B que consiste en Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg. En una forma de realización preferida, la composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D. En otra forma de realización preferida, la composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo B. En otra forma de realización preferida, la composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella atenuada del grupo D y al menos una Salmonella atenuada del grupo B. En una forma de realización de la máxima preferencia, la composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y Salmonella Enteritidis atenuada. En otra forma de realización de la máxima preferencia, la composición inmunógena o vacuna atenuada usada en la primo-administración según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y Salmonella Enteritidis atenuada y Salmonella Typhimurium atenuada.

[0039] Entre los ejemplos de varios grupos de clasificación de Salmonella según Kauffman-White se incluyen los grupos A, B, C1-3, D, E1-4, F, G, H e I, de los cuales se proporcionan ejemplos a continuación.

[0040] Por ejemplo, el grupo A comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Paratyphi A (Salmonella Paratyphi A), Salmonella Paratyphi A variante durazzo.

[0041] Por ejemplo, el grupo B comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Paratyphi B (Salmonella Paratyphi B), Salmonella Paratyphi B variante odense, Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Java (Salmonella Java), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Typhimurium (Salmonella Typhimurium), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Braenderup (Salmonella Braenderup), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Agona (Salmonella Agona), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Bredeney (Salmonella Bredeney), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Heidelberg (Salmonella Heidelberg), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Indiana (Salmonella Indiana), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Saint-Paul (Salmonella Saint-Paul), Salmonella enterica subspecies entetica serovariedad Brandenburg (Salmonella Brandenburg), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Limete (Salmonella Limete), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Agama (Salmonella Agama), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Derby (Salmonella Derby), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Salinatis (Salmonella Salinatis), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Stanley (Salmonella Stanley).

[0042] Por ejemplo, el grupo C1 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Paratyphi C (Salmonella Paratyphi C), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Infantis (Salmonella Infantis), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Mbandaka (Salmonella Mbandaka), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Livingstone (Salmonella Livingstone), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Virchow (Salmonella Virchow), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Ohio (Salmonella Ohio), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Montevideo (Salmonella Montevideo), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Tennessee (Salmonella Tennessee), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Rissen (Salmonella Rissen), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Decatur (Salmonella Decatur), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Bareilly (Salmonella Bareilly), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Menston (Salmonella Menston), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Oranienburg (Salmonella Oranienburg), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Thompson (Salmonella Thompson).

[0043] Por ejemplo, el grupo C2 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Hadar (Salmonella Hadar), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Newport (Salmonella Newport), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Kottbus (Salmonella Kottbus).

[0044] Por ejemplo, el grupo C3 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Kentucky (Salmonella Kentucky), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Albany (Salmonella Albany).

[0045] Por ejemplo, el grupo D comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Typhi (Salmonella Typhi), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Enteritidis (Salmonella Enteritidis), Salmonella eraterica subspecies enterica serovariedad Panama (Salmonella Panama), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Dublin (Salmonella Dublin), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Gallinarum (Salmonella Gallinarum), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Pullorum (Salmonella Pullorum), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Ndolo (Salmonella Ndolo), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Miami (Salmonella Miami), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Sendai (Salmonella Sendai).

[0046] Por ejemplo, el grupo E1 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Give (Salmonella Give), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Anatum (Salmonella Anatum), Salmonella entericasubspecies enterica serovariedad London (Salmonella London), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Meleagridis (Salmonella Meleagridis).

[0047] Por ejemplo, el grupo E2 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Cambridge (Salmonella Cambridge), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Newington (Salmonella Newington).

[0048] Por ejemplo, el grupo E3 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Minneapolis (Salmonella Minneapolis).

[0049] Por ejemplo, el grupo E4 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Simsbury (Salmonella Simsbury), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Senftenberg (Salmonella Senftenberg).

[0050] Por ejemplo, el grupo F comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Aberdeen (Salmonella Aberdeen).

[0051] Por ejemplo, el grupo G comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Cubana (Salmonella Cubana), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Poona (Salmonella Poona).

[0052] Por ejemplo, el grupo H comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Heves (Salmonella Heves), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Onderstepoort (Salmonella Onderstepoort).

[0053] Por ejemplo, el grupo 1 comprende Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Brazil (Salmonella Brazil), Salmonella enterica subspecies enterica serovariedad Hvittingfoss (Salmonella Hvittingfoss).

[0054] Algunas vacunas a base de Salmonella atenuada y algunas vacunas a base de Salmonella inactivada están disponibles comercialmente.

[0055] Las patentes de EE.UU. nº 7.045.122; 6.923.957; 6.905.691; 6.605.285; 5.843.426; 5.733.760; 5.424.065; 5.389.368; y 6.592.869 se refieren a vacunas contra Salmonella, incluidas las vacunas atenuadas e inactivadas.

[0056] Las especies de Salmonella pueden ser atenuadas racionalmente mediante la introducción de mutaciones definidas de no reversión en el genoma para producir cepas de vacunas de organismos vivos. Se han identificado varios genes, que cuando mutan, atenuarán las Salmonellae. En particular, las cepas de Salmonella que contienen mutaciones de no reversión en genes implicados en la ruta biosintética pre-corismato forman excelentes vacunas orales que evocan intensas respuestas inmunitarias humorales, locales y celulares en el hospedador (Chatfield S.N. y col., Vaccine, 1989, 7 (6): 495 – 8; Chatfield S.N. y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1993, 7 (1): 1 – 7), en genes aro de la ruta biosintética aromática (documento EP-B1-0.322.237), en los mutantes RfaH de regulador transcripcional de Salmonella Typhimurium, que son eficaces como vacunas orales atenuadas contra salmonelosis en ratones (Nagy G. y col., Infect. Immun., 2006, 74 (10): 5914 – 25).

[0057] La Salmonella puede ser atenuada por modificación de la estructura del genoma de las bacterias, por ejemplo, por deleción de parte de un gen de Salmonella, por inserción de secuencia de nucleótidos heteróloga en un gen de Salmonella, y/o por sustitución de parte de un gen de Salmonella por secuencia de nucleótidos heteróloga. Es posible atenuar la Salmonella mediante la introducción de mutaciones que (i) confieren auxotrofia, (ii) interfieren con el metabolismo de los azúcares y la biosíntesis de lipopolisacáridos o (iii) afectan a algunos medios globales de regulación de los genes necesarios para una exposición completa de la virulencia.

[0058] Por ejemplo, la Salmonella atenuada pueden ser bacterias que comprenden al menos una mutación de una alteración metabólica de la resistencia a la estreptomicina y a la rifampicina para la atenuación (documento EP-B1-0.642.796), como, por ejemplo, la cepa atenuada de Salmonella Enteritidis Sm 24/Rif 12/Ssq (documento EPB1-0.642.796); Salmonella Enteritidis atenuada por una primera mutación en la región reguladora phoP que provoca expresión constitutiva de un gen bajo el control de dicha región y por una segunda mutación en un gen pag o prg (documento EP-B1-0.563.311); Salmonella Enteritidis atenuada por una mutación de no reversión en el gen htrA (documento US-A-5.804.194); Salmonella atenuada que muestra auxotrofia para uno o más factores de crecimiento seleccionados entre el grupo que consiste en fenilalanina, tirosina, triptófano y ácido para-aminobenzoico, de manera que es incapaz de crecimiento en un medio mínimo en ausencia de dichos uno o más factores de crecimiento (documento US-A-6.231.871), como, por ejemplo, Salmonella Typhimurium cepa STM-1, depositada en Australian Government Analytical Laboratories según el número de referencia N93143266 (documento US-A6.231.871); mutantes auxótrofos de Salmonella Enteritidis obtenidos a través de mutagenia de N-metil-N’-nitro-Nnitrosoguanidina, como la cepa E 3/49, la cepa 1/37, la cepa C7/1, la cepa C7/2, la cepa C7/18, la cepa C7/19, la cepa E1/23, la cepa E1/25, la cepa E2/7, la cepa E3/44 y la cepa E3/51 (Martin G. y col., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., 1996, 109 (10): 325 – 9); Salmonella Typhimurium atenuada que contiene una mutación de no reversión en cada uno de dos genes aro discretos de la ruta biosintética aromática, como aroA y aroC, aroA y aroD, aroA y aroE (documento EP-B1-0.322.237); derivado de aroC definido genéticamente de Salmonella Enteritidis atenuada (cepa LVR02, véase Betancor L. y col., Vet. Microbiol., 2005, 107 (1 – 2): 81 – 9); y Salmonella Typhimurium atenuada que tiene una mutación que inactiva un gen seleccionado entre: hupA, dksA, rfaY, sipC o clpB (documento WO-A198/02.523).

[0059] Las mutaciones de atenuación pueden obtenerse también por inserción de un transposón. Por ejemplo, el transposón en el mutante EZ870 se introduce en una secuencia de nucleótidos de Salmonella Enteritidis que es homóloga (98,4 % de pares de bases idénticos en una superposición de 188 pb) al gen spiC de Salmonella Typhimurium (Número de referencia U51927, Ochman H., Soncini F.C. Solomon F. y Groisman E.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7800 – 7804, 1996). La Salmonella enteritidis EZ870 modificada genéticamente tiene el número de depósito LMGP-18484 en la BCCM/LMG Culture Collection, Laboratorium voor Microbiologie, Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica (documento WO-A-99/37.759).

[0060] La composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella inactivada. La Salmonella inactivada puede seleccionarse entre el grupo que consiste en grupo E de Salmonella, grupo D de Salmonella, grupo C de Salmonella y grupo B de Salmonella, preferentemente entre el grupo que consiste en grupo E1 de Salmonella, grupo E4 de Salmonella, grupo D de Salmonella, grupo C1 de Salmonella, grupo C2 de Salmonella, grupo C3 de Salmonella y grupo B de Salmonella, y más preferentemente entre el grupo E1 que consiste en Salmonella Anatum, entre el grupo E4 que consiste en Salmonella Senftenberg, entre el grupo D que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, entre el grupo C1 que consiste en Salmonella Infantis, Salmonella Mbandaka, Salmonella Livingstone, Salmonella Virchow, Salmonella Ohio, Salmonella Montevideo, Salmonella Tennessee, Salmonella Rissen, entre el grupo C2 que consiste en Salmonella Hadar, Salmonella Newport, Salmonella Kottbus, entre el grupo C3 que consiste en Salmonella Kentucky, Salmonella Albany, y entre el grupo B que consiste en Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg.

[0061] En una forma de realización preferida, la composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente

o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D. En otra forma de realización preferida, la composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella inactivada del grupo B, al menos una Salmonella inactivada del grupo C y al menos una Salmonella inactivada del grupo D. En una forma de realización de máxima preferencia, la composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y Salmonella Typhimurium inactivada y Salmonella Enteritidis inactivada. En otra forma de realización de máxima preferencia, la composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de uso de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y Salmonella Typhimurium inactivada y Salmonella Enteritidis inactivada y al menos una Salmonella inactivada del grupo C2. En otra forma de realización de máxima preferencia, la composición inmunógena o vacuna inactivada usada en la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y Salmonella Typhimurium inactivada y Salmonella Enteritidis inactivada y al menos una Salmonella inactivada del grupo C2 y al menos una Salmonella inactivada del grupo C1.

[0062] La Salmonella puede ser inactivada químicamente por tratamiento con agentes de inactivación, como formaldehído, etilenimina, derivados de amida de etilenimina (por ejemplo, acetiletilenimina), propilenimina, 1propiolactona, timerosal, acetona o inactivación por calor. En una forma de realización preferida, el agente de inactivación es formaldehído.

[0063] En determinados aspectos, los procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, por ejemplo, un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium y las bacterias de Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis.

[0064] Otros procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B, al menos una Salmonella inactivada del grupo C2 y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, en particular un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis y las bacterias de Salmonella del grupo C2 inactivadas son Salmonella Hadar.

[0065] Otros procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B, al menos una Salmonella inactivada del grupo C1, al menos una Salmonella inactivada del grupo C2 y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, por ejemplo, un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las

bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo C2 inactivadas son Salmonella Hadar y las bacterias Salmonella del grupo C1 inactivadas son Salmonella Virchow y/o Salmonella Infantis.

[0066] Otros procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D y al menos una Salmonella atenuada del grupo B, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, por ejemplo, un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B atenuadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium y las bacterias de Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis.

[0067] Otros procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D y al menos una Salmonella atenuada del grupo B, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B, al menos una Salmonella inactivada del grupo C2 y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, en particular un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B atenuadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis y las bacterias de Salmonella del grupo C2 inactivadas son Salmonella Hadar.

[0068] Otros procedimientos preferidos de uso de composiciones inmunógenas o vacunas en animales aviares según la descripción comprenden al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico

o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D y al menos una Salmonella atenuada del grupo B, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, al menos una Salmonella inactivada del grupo B, al menos una Salmonella inactivada del grupo C1, al menos una Salmonella inactivada del grupo C2 y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, con un intervalo de unas semanas, por ejemplo, un intervalo de 2 semanas a 18 semanas. En una forma de realización en particular de este procedimiento preferido, las bacterias de Salmonella del grupo D atenuadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo B atenuadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo B inactivadas son Salmonella Typhimurium, las bacterias de Salmonella del grupo D inactivadas son Salmonella Enteritidis, las bacterias de Salmonella del grupo C2 inactivadas son Salmonella Hadar y las bacterias de Salmonella del grupo C1 inactivadas son Salmonella Virchow y/o Salmonella Infantis.

[0069] Puede añadirse adyuvante o adyuvantes a la suspensión bacteriana, obtenida en particular después de cultivo e inactivación. Un adyuvante puede escogerse entre hidróxido de aluminio, saponina, cualquier emulsión de agua en aceite o emulsión de aceite en agua que sea compatible con tejidos aviares (véase, por ejemplo, Herbert W.J., The Lancet, 1965, octubre 16: 771; Brugh M. y col., Am. J. Vet. Res., 1983, 44 (1): 72 – 5; Boersma W.J.A. y col., 44th Forum in Immunology, "Characteristics and use of new-generation adjuvants", 503 – 511; Gast y col., Avian Diseases, 1993, 37 (4): 1085 – 91; Stone, Avian Diseases, 1993, 37: 399 – 405; Stone y col., Avian Diseases, 1990,

34: 979 – 983; Stone y col., Avian Diseases, 1983, 27 (3): 688 – 697; documento US-A-3.919.411; documento WOA-05/00.946)

[0070] Entre los ejemplos de adyuvantes se incluyen, pero no se limitan a, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite en agua basadas en aceite mineral y/o aceite vegetal y tensioactivos no iónicos como copolímeros de bloque, Tween®, Span®. Dichas emulsiones son en particular las descritas en la página 147 de "Vaccine Design – The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995, volumen 6, editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, Plenum Press, Nueva York y Londres, o emulsiones TS, en particular la emulsión TS6, y emulsiones LF, en particular la emulsión LF2 (sobre emulsiones TS y LF, véase el documento WO-A-04/024.027). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, vitamina E, saponinas y polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, es decir Carbopol® (Noveon; véanse los documentos WO-A-99/51.269; WO-A-99/44.633), Havlogen®, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995, Plenum Press Nueva York), adyuvantes biológicos (por ejemplo, C4b, en particular C4b murino (Ogata R T y col., J. Biol. Chem. 1989, 264 (28): 16565 – 16572) o C4b equino, GM-CSF, en particular GM-CSF equino (documento US-A-6.645.740)), toxinas (por ejemplo, toxinas del cólera CTA o CTB, toxinas termolábiles Escherichia coli LTA o LTB (Olsen C W y col., Vaccine, 1997, 15 (10): 1149 – 1156; Fingerut E y col., Vaccine, 2005, 23 (38): 4685 – 4696; Zurbniggen R y col., Expert Rev Vaccines, 2003, 2 (2): 295 – 304; Peppoloni S y col., Expert Rev Vaccines, 2003, 2 (2): 285 – 293)) y CpG (por ejemplo, CpG #2395 (véase Jurk M y col., Immunobiology 2004,209 (1 – 2): 141 – 154), CpG #2142 (véase SEQ. ID. NO: 890 en el documento EP-B1-1.221.955), CpG #2135, CpG #2007, CpG #2336). Los polímeros de ácido acrílico

o metacrílico reticulado, especialmente los reticulados por éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes son conocidos por el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, nº 2, junio de 1996). Un experto en la materia también puede referirse a la patente de EE.UU. nº 2.909.462, que proporciona dichos polímeros acrílicos reticulados por un compuesto de polihidroxilo que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferentemente no más de ocho de dichos grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener también otros sustituyentes, como metilo. Son especialmente adecuados los productos comercializados con el nombre de Carbopol® (Noveon). Están reticulados por alil-sacarosa o por alil-pentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P, 934, 940 y 971P.

[0071] Las composiciones inmunógenas y vacunas según la descripción pueden ser liofilizadas ventajosamente con un estabilizador. La liofilización puede realizarse según procedimientos de liofilización estándar bien conocidos. Los estabilizadores aceptables desde un punto de vista farmacéutico o veterinario pueden ser hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, mannitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T y col., Cryobiology 1983, 20 (3): 318 – 23; Israeli E y col., Cryobiology 1993, 30 (5): 519 – 23), proteínas como peptona, albúmina, lactoalbúmina o caseína, agentes que contienen proteínas como leche desnatada (Mills C K y col., Cryobiology 1988, 25 (2): 148 – 52; Wolff E y col., Cryobiology 1990, 27 (5): 569 – 75) y tampones (por ejemplo, tampón de fosfato, tampón de fosfato de metal alcalino). Pueden usarse adyuvantes para solubilizar las preparaciones liofilizadas.

[0072] Entre los ejemplos de aceites útiles se incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, como aceite de parafina, Drakeol® 6VR, Marcol® 80; Marcol® 52; aceites de terpeno como escualeno y escualano; aceites vegetales como aceite de soja, aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de yoyoba, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de hueso de albaricoque, aceite de aguacate, aceite de germen de trigo, aceite de colza, aceite de linaza y aceite de almendra; aceites de pescado como aceite de tiburón, aceite de reloj anaranjado, aceite de lacha tirana y aceite de hígado de bacalao; aceites animales como aceite de visón, aceite de manteca de cerdo y aceite de grasa de pollo.

[0073] Entre los ejemplos de tensioactivos usados en vacunas en emulsión se incluyen Arlacel® 80 (monooleato de sorbitano), Tween® 80 (Polisorbato 80), Span® 80, Span® 85, Arlacel® 83 (sesquioleato de sorbitano), Arlacel® 85 (sesquioleato de sorbitano) y Tween® 61 (polioxietilensorbitano), por ejemplo. Entre los tensioactivos adecuados para vacunas de agua en aceite animales y vegetales se incluyen cera de abeja purificada y refinada, por ejemplo. Además, entre los tensioactivos adecuados para vacunas que contienen escualeno y escualano se incluyen Arlacel® y Tween® 80.

[0074] Preferentemente, el adyuvante es un aceite para formar una emulsión de agua en aceite que comprende un aceite de parafina y tensioactivos, en particular un aceite de parafina, un éster de ácido graso y poliol, y un éster de ácido graso y poliol etoxilado.

[0075] Entre los animales aviares que pueden ser vacunados por un procedimiento de la presente descripción se incluyen pollos, gallinas, pavos, patos, ánades, gansos, ansarinos, gallinas pintadas, faisanes, gallinillas de Bantam, codornices, palomas.

[0076] Los procedimientos de la presente descripción se refieren a al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada y al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada. Un animal aviar de un día de vida puede ser vacunado por un procedimiento según la presente descripción, es decir, la única o primera primo-administración puede administrarse en un animal aviar de un día de vida. Preferentemente, la única o primera primo-administración se administra a animales aviares de un día a aproximadamente 28 días de vida, y más preferentemente de un día a aproximadamente 15 días de vida. Cuando se administran al menos dos primoadministraciones, estas primo-administraciones se administran preferentemente con intervalos de 2 a 4 semanas. La administración de refuerzo se administra de 2 a 18 semanas después de la única o primera primoadministración, preferentemente de 3 a 10 semanas después de la única o primera primo-administración, y más preferentemente de 3 a 6 semanas después de la única o primera primo-administración. Cuando se administran al menos dos administraciones de refuerzo, estas administraciones de refuerzo se administran preferentemente en intervalos de 2 a 12 semanas.

[0077] En una forma de realización preferida, los procedimientos de la presente descripción comprenden dos primo-administraciones y dos administraciones de refuerzo. Las primo-administraciones se administran preferentemente con intervalos de 2 a 4 semanas. La primera administración de refuerzo se administra de 6 a 10 semanas después de la primera primo-administración, y preferentemente de 8 a 10 semanas después de la primera primo-administración. La segunda administración de refuerzo se administra de 14 a 18 semanas después de la primera primo-administración, y preferentemente de 15 a 16 semanas después de la primera primo-administración.

[0078] En otra forma de realización preferida, los procedimientos de la presente descripción comprenden dos primo-administraciones y una administración de refuerzo. Las primo-administraciones se administran preferentemente con intervalos de 2 a 4 semanas. La administración de refuerzo se administra de 6 a 18 semanas después de la primera primo-administración, y preferentemente de 6 a 16 semanas después de la primera primoadministración, y más preferentemente de 11 a 16 semanas después de la primera primo-administración.

[0079] En otra forma de realización preferida, los procedimientos de la presente descripción comprenden una primo-administración y dos administraciones de refuerzo. La primera administración de refuerzo se administra de 2 a 10 semanas después de la primo-administración, y preferentemente de 3 a 6 semanas después de la primoadministración. La segunda administración de refuerzo se administra de 12 a 18 semanas después de la primoadministración, y preferentemente de 14 a 16 semanas después de la primo-administración.

[0080] En otra forma de realización preferida, los procedimientos de la presente descripción comprenden una primo-administración y una administración de refuerzo. La administración de refuerzo se administra de 2 a 18 semanas después de la primo-administración, y preferentemente de 3 a 10 semanas después de la primoadministración, y más preferentemente de 3 a 6 semanas después de la primo-administración.

[0081] Las vías de administración adecuadas de las composiciones inmunógenas o vacunas según los procedimientos de la presente descripción para primo-administración incluyen vías orales, por ejemplo, por ingestión de agua, o vías oculares, por ejemplo, por nebulización.

[0082] Las dosis de composiciones inmunógenas o vacunas atenuadas para primo-administración según los procedimientos de la presente descripción incluyen de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2,0 ml, preferentemente de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 1,0 ml, y más preferentemente de aproximadamente 0,4 ml a aproximadamente 0,6 ml. Estas dosis tienen de aproximadamente 106 unidades formadoras de colonias por dosis (UFC/dosis) a aproximadamente 1010 UFC/dosis de cada cepa de Salmonella, y preferentemente aproximadamente 108 UFC/dosis de cada cepa de Salmonella. Cuando se administra una composición inmunógena o vacuna atenuada con agua potable a un animal aviar, estas dosis se diluyen de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml de agua potable por animal aviar.

[0083] Las vías de administración adecuadas de las composiciones inmunógenas o vacunas según los procedimientos de la presente descripción para administración de refuerzo incluyen vías subcutáneas (SC) y vías intramusculares (IM). Una composición inmunógena o vacuna según los procedimientos de la presente descripción puede administrarse mediante una jeringa con una aguja o mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, Pigjet, Avijet, Dermojet, Vitajet o Biojector (Bioject, Oregón, EE.UU.), véase el documento US-A-2006/0.034.867).

[0084] Las dosis de composiciones inmunógenas o vacunas inactivadas para la administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción pueden ser de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 2,0 ml, preferentemente de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 1,0 ml, y más preferentemente de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 0,4 ml. Estas dosis tienen de aproximadamente 106 UFC/dosis antes de la inactivación a aproximadamente 1010 UFC/dosis antes de la inactivación de cada cepa de Salmonella, y preferentemente de aproximadamente 108 UFC/dosis antes de la inactivación de cada cepa de Salmonella.

[0085] Otro aspecto de la descripción es un kit para vacunación de animales aviares según la presente descripción. En una forma de realización, el kit comprende al menos dos viales y un prospecto incluido en el envase con instrucciones de administración, el primer vial comprende una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada para primo-administración según los procedimientos de la presente descripción y el segundo vial comprende una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada para administración de refuerzo según los procedimientos de la presente descripción. Opcionalmente, el kit puede comprender viales que comprenden una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella atenuada para primo-administración múltiple y/o viales que comprenden una composición inmunógena o vacuna a base de Salmonella inactivada para administración de refuerzo múltiple.

[0086] En otra forma de realización, el kit para vacunación de animales aviares comprende al menos dos viales y un prospecto incluido en el envase con instrucciones de administración, comprendiendo el primer vial una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D y comprendiendo el segundo vial una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D. Opcionalmente, el kit puede comprender viales que comprenden una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D para primo-administración múltiple y/o viales que comprenden una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D para administración de refuerzo múltiple.

[0087] A continuación se describirá adicionalmente la invención por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1:

[0088] Para la producción de la vacuna atenuada, se usó un mutante de doble marcador auxótrofo de adenina / histidina de cepa de Salmonella Enteritidis fago tipo 4 (PT4), obtenida a través de mutagenia de N-metil-N’nitro-N-nitrosoguanidina. Esta cepa de Salmonella se denominó cepa E 3/49 (Martin G. y col., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., 1996, 109 (10): 325 – 9). Se cultivó la cepa de Salmonella E 3/49 en medio nutriente que contenía extracto de levadura, triptona, Na2HPO4 x 2 H2O, MgSO4 x 7 H2O y agua para inyección, pH 7,6 ± 0,2, durante 18 a 24 horas a 37 °C ± 1 °C como un cultivo no ventilado. Los cultivos se estabilizaron con glicerina al 10 % en volumen, se rellenaron con ello recipientes en partes alícuotas de 1,8 ml y se almacenó a -80 °C ± 5 °C.

[0089] Se usó el mismo medio nutriente con adición de glucosa para fermentación de la cepa bacteriana. Los cultivos fueron cultivos no ventilados durante 8 a 24 horas o cultivos en matraces con agitación durante 8 a 16 horas a 37 °C ± 1 °C. El inóculo fue del 0,2 al 10 % en volumen.

[0090] Los cultivos se almacenaron a entre + 2 °C y + 8 °C durante hasta 4 días.

[0091] Se recogieron y diluyeron las bacterias obtenidas con solución salina fisiológica tamponada dependiendo del recuento de organismos y solución de sacarosa al 20 % en volumen (concentración máxima del 60 %). El pH de la vacuna se ajustó a 7,0 ± 0,5 con NaOH o CH3COOH.

[0092] A continuación se liofilizó la suspensión bacteriana para su almacenamiento.

[0093] Se enfriaron las bandejas a 0 °C paso a paso desde el fondo hacia arriba. Se congeló la vacuna en el liofilizador a una temperatura mínima de -40 °C durante aproximadamente 3 a 4 horas. Una vez que se obtuvo el vacío necesario se inició el proceso de secado principal (temperatura de la bandeja controlada a un máximo de + 10 °C), hasta que se alcanzó una temperatura del producto de + 5 °C. A continuación se realizó un secado secundario a una temperatura de bandeja de + 35 °C como máximo durante un máximo de 12 horas.

[0094] Después del secado, se llenaron los frascos con nitrógeno seco estéril, se sellaron automáticamente, se bruñeron y se almacenaron en una sala fresca.

[0095] En la vacuna atenuada obtenida después de la reconstitución en 0,5 ml de agua potable para animal aviar, la valoración de Salmonella Enteritidis atenuada fue de 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis.

EJEMPLO 2:

[0096] Para la producción de la vacuna inactivada, se usaron dos cepas diferentes de Salmonella, cepa de Salmonella Enteritidis PT 4 y cepa de Salmonella Typhimurium DT 104.

[0097] Se puso en cultivo cada una de las cepas de Salmonella en caldo de soja tripticasa en agar blando al 0,25 % (TSA).

[0098] Se recogieron las bacterias obtenidas, se diluyeron en agua para inyección y se congelaron a una temperatura objeto de -70 °C en bolsas en presencia de un crioprotector (20 % de glicerol y 5 % de sacarosa) durante el almacenamiento.

[0099] Para la inactivación de la cepa de Salmonella Enteritidis PT 4, se descongelaron bolsas que contenían cepa de Salmonella Enteritidis PT 4, y se transfirió la suspensión bacteriana a un vaso estéril. Se añadió el agente de inactivación, solución de formaldehído al 35 %, en una concentración del 3,88 % (volumen de solución de formaldehído / volumen de cultivo) a la suspensión bacteriana. Después de mezcla por agitación, se transfirió la suspensión a otro vaso estéril. Se llevó a cabo la inactivación bajo agitación durante 24 horas a 24 °C.

[0100] Para la inactivación de la cepa de Salmonella Typhimurium DT 104, se llevó a cabo el mismo procedimiento descrito para la cepa de Salmonella Enteritidis PT 4.

[0101] Se almacenaron las bacterias inactivadas a una temperatura de + 5 °C +/- 3 °C hasta su uso para la formulación.

[0102] Se mezclaron las bacterias de Salmonella Enteritidis PT 4 inactivadas y las bacterias de Salmonella Typhimurium DT 104 inactivadas y se formularon con un adyuvante de emulsión de agua en aceite que comprende un aceite de parafina, un éster de ácido graso y poliol, y un éster de ácido graso y poliol etoxilado.

[0103] Se añadió un conservante en el producto final (es decir, timerosal) a una concentración final de 100 !g por ml.

[0104] En la vacuna inactivada, la valoración de la cepa de Salmonella Enteritidis PT 4 fue de 108,3 UFC/dosis antes de la inactivación, y la de la cepa de Salmonella Typhimurium DT 104 fue de 108 UFC/dosis antes de la inactivación.

EJEMPLO 3:

[0105] En el D0 del estudio se tomaron aleatoriamente 30 pollos LPE (libres de patógeno específico) de un día de vida, y a continuación se asignaron a tres grupos de 10 pollos cada uno.

[0106] Los grupos se definen del modo siguiente:

-

G.00 = grupo de control

-

G.01 = vacuna atenuada del ejemplo 1 (1 día de vida) + vacuna inactivada del ejemplo 2 (2) días de vida)

-

G.02 = vacuna inactivada del ejemplo 2 (21 días de vida)

[0107] Después de la identificación, se asignó cada grupo a unidades de aislamiento hasta D53.

[0108] En D0, se vacunó a animales del grupo G.01 con una dosis (al menos 108 UFC) de vacuna atenuada del ejemplo 1 de 0,5 ml por vía oral, suministrada directamente en la cavidad oral.

[0109] En D21, se vacunó a los animales de los grupos G.01 y G.02 con una dosis de vacuna inactivada del ejemplo 2 por vía intramuscular en la región profunda muscular pectoral izquierda, 0,3 ml/dosis, valoración de Salmonella Enteritidis de 108,3 UFC por dosis antes de la inactivación, valoración de Salmonella Typhimurium 108 UFC por dosis antes de la inactivación.

[0110] El grupo G.01 fue vacunado en último lugar, para evitar la contaminación cruzada con la cepa de vacuna atenuada.

[0111] Se tomó sangre de todos los grupos el D49 justo antes de la prueba de provocación, y a continuación se sometió a prueba el suero recogido en busca de anticuerpos específicos. Los grupos G.00, G.01 y G.02 se sometieron a prueba mediante ensayo ELISA IDEXX y por Prueba de Aglutinación Lenta (PAL).

[0112] El día anterior a la prueba de provocación (D48), se descongeló una parte alícuota de Salmonella Heidelberg (Salmonella del grupo B), a temperatura ambiente, y a continuación se suspendió en 100 ml de medio de caldo de soja triptona (TSB) Bio Mérieux y se incubó a 37 °C durante 14 horas.

[0113] Se centrifugó la suspensión bacteriana obtenida y se sembraron sedimentos de la cepa en un TSB precalentado nuevo y se incubó a 37 °C durante un periodo de crecimiento óptimo (5 horas).

[0114] En cuanto la valoración del cultivo bacteriano en desarrollo evaluada por densidad óptica (medida a 620 nm) fue suficientemente elevada para alcanzar una valoración de la suspensión de 109 UFC/0,2 ml, se usó para infección de los pollos.

[0115] Se sembraron diluciones 10 veces en serie en TSB del inóculo en agar de tripticasa-soja (TSA) y se incubó 24 horas a 37 °C para recuento con 3 repeticiones.

[0116] En D49, se sometió a todos los grupos a prueba de provocación con caldo de cultivo de Salmonella Heidelberg, valorándose 108,9 UFC en 0,2 ml. Se infectó a cada pollo por vía oral.

[0117] Se sacrificaron todos los pollos cuatro días después de la infección (D53). Se muestrearon el bazo y el ciego asépticamente en cada pollo y se colocó en tubos individuales previamente identificados. Al final de la recogida, se procesaron los tubos para reaislamiento de la Salmonella.

-

se trituró cada bazo en jeringa de 10 ml y se diluyó en 10 ml de agua de peptona tamponada (APT),

-

se sembraron en placa 200 !l de la dilución en medio de XLT4 + Ampicilina (adición a la velocidad de 50 pg/ml) para numeración (la siembra se extendió en el agar). Se incubaron las placas a 37 °C durante 48 horas.

Fase de pre-enriquecimiento (PE) [0118]

-

a continuación se incubaron todos los bazos diluidos a 37 °C durante 16-20 horas,

-

sólo en los bazos negativos para el procedimiento directo se prosiguió completamente a través de las fases siguientes.

Fase de enriquecimiento (E) [0119]

-

inoculación de la suspensión de bazo "PE" en caldo de Soja Rappaport Vassiliadis (SRV) en una proporción de 1: 100 (5 !l en 500 !l) e incubación a 42 °C durante 24 horas.

Aislamiento selectivo [0120]

-

siembra en placa de la suspensión de bazo "E" en medio XLT4 + Ampicilina, a continuación incubación a 37 °C durante 48 horas – volumen sembrado en placa de 10 !l. La colonia de Salmonella típica era negra o con centro negro, y cuando estaba presente este tipo de colonia, la muestra se valoró como positiva.

[0121] Los resultados se expresaron en ucc/órgano.

[0122] Se recogió asépticamente el contenido cecal recogido (aproximadamente 1 g) en un tubo estéril, se pesó y se diluyó en 1: 10 peso/volumen en APT hasta 10e-7. [0123] Se incubaron las diluciones 10-2, 10-3, 10-5 y 10-7 a 37 °C durante 16-20 horas (PE) y se trataron

adicionalmente para la fase de enriquecimiento (E) y aislamiento selectivo al igual que en las muestras de bazo. [0124] Se identificaron las colonias de Salmonella y se anotaron las placas positivas. [0125] Los datos de reaislamiento se analizaron del modo siguiente: para el bazo:

-

las muestras negativas después de pre-enriquecimiento y enriquecimiento se contaron como 0 ucc/órgano,

-

las muestras negativas en siembra en placa directa que fueron positivas después de pre-enriquecimiento y enriquecimiento se contaron como 10 ucc/muestra,

para el contenido cecal:

-

el resultado semicuantitativo se expresó en ucc/g de contenido en órgano, basándose en el procedimiento de dilución y en la positividad (es decir, 50 !l + 450 !l hasta diluciones 10-2, 10-3, 10-5 y 10-7 corresponden, cuando son positivas, a 102,3, 103,3, 105,3 y 107,3 ucc/g de contenido cecal de Salmonella respectivamente).

[0126] En la Tabla 1 se resumen los resultados de valoraciones de anticuerpos específicos para todos los pollos inmunizados y no inmunizados, 4 semanas después de la vacunación.

[0127] Los valores se expresan mediante valoraciones medias geométricas (VMG) para PAL y mediante valoraciones medias aritméticas (VMA) para resultados de ELISA de Salmonella Enteritidis de S/R e IP.

Tabla 1:

Grupos

PAL – VMG SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA-AM

SALMONELLA TYPHIMURIUM

Relación S/R Unidades IP

G.00

< 10 0,72 28

G.01

197 0,37 63

G.02

171 0,41 59

[0128] Los resultados serológicos de PAL y ELISA obtenidos en el grupo no vacunado fueron constantemente negativos.

5 [0129] En lo que respecta a los resultados PAL de Salmonella Typhimurium, la vacuna inactivada en solitario mostró seroconversión consistente (171 unidades PAL) con un efecto sinérgico sorprendente (15,2 %) de vacuna basada en Salmonella Enteritidis atenuada en componente de Salmonella Typhimurium (197 unidades PAL).

10 [0130] En relación con los resultados de ELISA de Salmonella Enteritidis de G.01 y G.02, la VMA mostró valores superiores de unidades IP (6,8 %) en vacuna atenuada más inactivada que en inactivada en solitario, 63 y 59 respectivamente, con 10/10 sujetos positivos por grupo.

[0131] La Tabla 2 resume los resultados de reaislamiento de Salmonella Heidelberg en bazos y contenidos 15 cecales 4 días postinfección (expresado como positivo/total y como log10 ucc/bazo o g).

Tabla 2:

Grupos

Bazo Contenido cecal

-/Tot.

+/Tot. s. d. +/Tot d. e. log10 ucc bazo -/Tot. +/Tot. dilución d. e. log10 ucc gramo

-2

-3 -5 -7

G.00

3/10 3/10 4/10 1,2 0/10 10/10 10/10 7/10 0/10 4,7

G.01

10/10 0/10 0/10 0,0 2/10 8/10 1/10 0/10 0/10 1,9

G.02

8/10 1/10 1/10 0,3 0/10 10/10 8/10 1/10 0/10 3,5

-: Negativos +: Positivos s. d.: siembra directa d. e.: después de enriquecimiento

[0132] Tal como se observa en la Tabla 3, 4 días después de la infección la cepa de la prueba de

20 provocación de Salmonella Heidelberg mostró su capacidad para alcanzar y colonizar los órganos internos del grupo de control con 0/10 muestras negativas y una numeración significativa de Salmonella de 10e1,2 ucc/órgano y 10e4,7 ucc/g, en bazo y contenido cecal respectivamente.

[0133] En relación con los resultados de bazo, la mejor protección contra la prueba de provocación de

25 Salmonella Heidelberg fue proporcionada por vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) con L = 101,2 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. También se obtuvieron resultados significativos en el grupo G.02 por vacuna inactivada usada en solitario (L = 100,9 ucc/bazo en comparación con el grupo de control).

[0134] En relación con los resultados de contenido cecal, la vacuna inactivada asociada con vacuna

30 atenuada (G.01) mostró un muy buen nivel de protección con un L de 102,8 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. La vacuna inactivada mostró un nivel significativo de protección frente a contenido cecal con L = 101,2 en comparación con el grupo de control.

[0135] Los resultados serológicos del grupo G.01 mostraron el efecto sinérgico de inyección de vacuna

35 atenuada a 1 día de vida en seroconversión de la vacuna inactivada. El efecto de cebado cuantificable fue del 6,8 % para el componente de Salmonella Enteritidis (63 unidades IP ELISA) y un sorprendente 15,2 % para el componente de Salmonella Typhimurium (197 unidades PAL) en comparación con la vacuna inactivada en solitario.

[0136] La vacuna inactivada en asociación con la vacuna atenuada mostró un efecto protector pleno para

40 bazo y también contra invasión de contenido fecal con Salmonella Heidelberg que la vacuna inactivada en solitario, con L = 101,2 ucc/bazo y L = 102,8 ucc/gramo de contenido cecal, en comparación con los resultados de control. Existe un claro aumento de protección entre grupos inducido por cebado de vacuna de Salmonella Enteritidis atenuada en vacuna de Salmonella Enteritidis + Salmonella Typhimurium inactivada.

45 EJEMPLO 4:

[0137] Se realizó el mismo experimento tal como se describe en el ejemplo 3 con la salvedad de que la cepa Salmonella de la prueba de provocación no fue Salmonella Heidelberg sino Salmonella Infantis.

[0138] En la Tabla 3 se resumen los resultados de valoraciones de anticuerpos específicos para todos los pollos inmunizados y no inmunizados, 4 semanas después de la vacunación.

[0139] Los valores se expresan mediante valoraciones medias geométricas (VMG) para PAL y mediante valoraciones medias aritméticas (VMA) para resultados ELISA de Salmonella Enteritidis de S/R e IP.

Tabla 3:

Grupos

PAL – VMG SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - VMA

SALMONELLA TYPHIMURIUM

Relación S/R Unidades IP

G.00

< 10 1,27 00

G.01

184 0,40 60

G.02

139 0,44 56

10 [0140] Los resultados serológicos de PAL y ELISA obtenidos del grupo no vacunado fueron constantemente negativos.

[0141] En relación con los resultados PAL de Salmonella Typhimurium, la vacuna inactivada en solitario mostró seroconversión consistente (139 unidades PAL) con un efecto sinérgico sorprendente de vacuna de 15 Salmonella Enteritidis atenuada en componente de Salmonella Typhimurium (184 unidades PAL).

[0142] En relación con los resultados ELISA de G.01 y G.02 Salmonella Enteritidis, la VMA mostró valores más elevados en unidades IP en vacuna atenuada más inactivada que en inactivada en solitario, 60 y 56 respectivamente, con 10/10 sujetos positivos por grupo.

20 [0143] La Tabla 4 resume los resultados de reaislamiento de Salmonella Infantis en bazos y contenidos cecales 7 días después de la infección (expresado como positivo/total y como log10 ucc/bazo o g).

Tabla 4:

Grupos

Bazo Contenido cecal

-/Tot.

+/Tot. s. d. +/Tot d. e. log10 ucc bazo -/Tot. +/Tot. dilución d. e. log10 ucc gramo

-5

-7

G.00

0/10 9/10 1/10 2,3 0/10 10/10 4/10 6,1

G.01

5/10 3/10 2/10 0,9 1/10 1/10 0/10 2,9

G.02

5/10 2/10 3/10 0,7 0/10 3/10 0/10 3,9

-: Negativos +: Positivos s. d.: siembra directa d. e.: después de enriquecimiento

25 [0144] Tal como se observa en la Tabla 4, 7 días después de la infección la cepa de la prueba de provocación de Salmonella Infantis mostró su capacidad para alcanzar y colonizar los órganos internos del grupo de control con 0/10 muestras negativas y una numeración significativa de Salmonella de 102,3 ucc/órgano y 106,1 ucc/g, en bazo y contenido cecal respectivamente.

30 [0145] En relación con los resultados de bazo, se proporcionó una buena protección contra la prueba de

101,4

provocación de Salmonella Infantis por vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) con L =

ucc/bazo en comparación con el grupo de control.

35 [0146] En relación con los resultados de contenido cecal, la vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) mostró un nivel muy bueno de protección con un L de 103,2 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. La vacuna inactivada mostró un nivel significativo de protección contra el contenido cecal con L = 102,2 en comparación con el grupo de control.

40 [0147] Los resultados serológicos del grupo G.01 mostraron el efecto sinérgico de inyección de vacuna atenuada a 1 día de vida en seroconversión de vacuna inactivada. El efecto de cebado cuantificable fue del 7 % para componente de Salmonella Enteritidis (60 unidades IP ELISA) y 32 % para componente de Salmonella Typhimurium (184 unidades PAL) en comparación con vacuna inactivada en solitario.

45 [0148] La vacuna inactivada en asociación con vacuna atenuada mostró un mejor efecto protector principalmente para protección cecal (L = 103,2 ucc/gramo) y una protección similar a vacuna inactivada en solitario en bazos con L = 101,4 ucc/órgano, en comparación con resultados de control.

EJEMPLO 5:

[0149] Se realizó el mismo experimento tal como se describe en el ejemplo 3 con la salvedad de que la cepa Salmonella de la prueba de provocación no fue Salmonella Heidelberg sino Salmonella Virchow.

5 [0150] En la Tabla 5 se resumen los resultados de valoraciones de anticuerpos específicos para todos los pollos inmunizados y no inmunizados, 4 semanas después de la vacunación.

[0151] Los valores se expresan mediante valoraciones medias geométricas (VMG) para PAL y mediante 10 valoraciones medias aritméticas (VMA) para resultados de ELISA S/R e IP para Salmonella Enteritidis.

Tabla 5:

Grupos

PAL – VMG SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - VMA

SALMONELLA TYPHIMURIUM

Relación S/R Unidades IP

G.00

< 10 1,07 00

G.01

160 0,44 56

G.02

149 0,50 50

[0152] Los resultados serológicos de PAL y ELISA obtenidos del grupo no vacunado fueron constantemente 15 negativos.

[0153] En relación con los resultados para PAL de Salmonella Typhimurium, la vacuna inactivada en solitario mostró una seroconversión consistente (149 unidades PAL) con un sorprendente efecto sinérgico de la vacuna a base de Salmonella Enteritidis atenuada en el componente de Salmonella Typhimurium (160 unidades PAL).

20 [0154] En relación con los resultados ELISA de Salmonella Enteritidis de G.01 y G.02, la VMA mostró un valor superior de unidades IP en vacuna atenuada más inactivada que en inactivada en solitario, 56 y 50 respectivamente, con 10/10 sujetos positivos por grupo.

25 [0155] La Tabla 6 resume los resultados de reaislamiento de Salmonella Virchow en bazos y contenidos cecales 4 días después de la infección (expresado como positivos/totales y como log10 ucc/bazo o g).

Tabla 6:

Grupos

Bazo Contenido cecal

-/Tot.

+/Tot. s. d. +/Tot d. e. log10 ucc bazo -/Tot. +/Tot. dilución d. e. log10 ucc gramo

-5

-7

G.00

0/10 8/10 2/10 2,4 0/10 10/10 6/10 6,5

G.01

9/10 0/10 1/10 0,1 0/10 5/10 1/10 4,5

G.02

6/10 2/10 2/10 0,6 0/10 8/10 3/10 5,5

-: Negativos +: Positivos s. d.: siembra directa d. e.: después de enriquecimiento

30 [0156] Tal como se observa en la Tabla 6, 4 días después de la infección la cepa de la prueba de provocación de Salmonella Virchow mostró su capacidad para alcanzar y colonizar los órganos internos del grupo de control con 0/10 muestras negativas y numeración significativa de Salmonella de 102,4 ucc/órgano y 106,5 ucc/g, en bazo y contenido cecal respectivamente.

35 [0157] En relación con los resultados de bazo, la mejor protección contra la prueba de provocación de Salmonella Virchow fue suministrada por vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) con L = 102,3 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. También se obtuvieron buenos resultados en el grupo G.02 por vacuna inactivada usada en solitario (L = 101,8 ucc/bazo en comparación con el grupo de control).

40 [0158] En relación con los resultados de contenido cecal, la vacuna inactivada en asociación con vacuna atenuada (G.01) mostró un nivel de protección muy bueno con L de 102,0 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. La vacuna inactivada mostró un nivel significativo de protección frente a contenido cecal con L = 101,0 en comparación con el grupo de control.

45 [0159] Los resultados serológicos del grupo G.01 mostraron el efecto sinérgico de inyección de la vacuna atenuada a 1 día de vida en la seroconversión de la vacuna inactivada. El efecto de cebado cuantificable fue del 12 % para componente de Salmonella Enteritidis (56 unidades IP de ELISA) y un sorprendente 7,4 % para componente de Salmonella Typhimurium (160 unidades PAL) en comparación con la vacuna inactivada en solitario.

[0160] La vacuna inactivada en asociación con la vacuna atenuada mostró un mejor efecto protector principalmente para protección de bazo pero también contra invasión de contenido cecal con Salmonella Virchow que la vacuna inactivada en solitario, con L = 102,3 ucc/bazo y L = 102,0 ucc/gramo de contenido cecal, en

5 comparación con los resultados de control.

EJEMPLO 6:

[0161] Se realizó el mismo experimento tal como se describe en el ejemplo 3 con la salvedad de que la cepa 10 de Salmonella de la prueba de provocación no fue Salmonella Heidelberg sino Salmonella Hadar. La valoración del inóculo de la prueba de provocación final fue de 109 UFC/0,2 ml.

[0162] En la Tabla 7 se resumen los resultados de valoraciones específicas de anticuerpos para todos los pollos inmunizados y no inmunizados, 4 semanas después de la vacunación.

15 [0163] Los valores se expresan mediante valoraciones medias geométricas (VMG) para PAL y mediante valoraciones medias aritméticas (VMA) para resultados de ELISA S/R e IP para Salmonella Enteritidis.

Tabla 7:

Grupos

PAL – VMG SALMONELLA ENTERITIDIS ELISA - VMA

SALMONELLA TYPHIMURIUM

Relación S/R unidades

G.00

< 10 0,88 12

G.01

211 0,42 58

G.02

171 0,49 51

20 [0164] Los resultados serológicos de PAL y ELISA obtenidos del grupo no vacunado fueron constantemente negativos.

[0165] En relación con los resultados PAL de Salmonella Typhimurium, la vacuna inactivada en solitario 25 mostró una seroconversión consistente (171 unidades PAL) con un sorprendente efecto sinérgico de vacuna basada en Salmonella Enteritidis atenuada en el componente de Salmonella Typhimurium (211 unidades PAL).

[0166] En relación con los resultados de ELISA para Salmonella Enteritidis de G.01 y G.02, la VMA mostró un valor superior de unidades IP (6,8 %) en vacuna atenuada más inactivada que la inactivada en solitario, 58 y 51 30 respectivamente, con 10/10 sujetos positivos por grupo.

[0167] La Tabla 8 resume los resultados de reaislamiento de Salmonella Hadar en bazos y contenidos cecales 4 días después de la infección (expresado como positivo/total y como log10 ucc/bazo o g).

35 Tabla 8:

Grupos

Bazo Contenido cecal

-/Tot.

+/Tot. s. d. +/Tot d. e. log10 ucc bazo -/Tot. +/Tot. dilución d. e. log10 ucc gramo

-5

G.00

2/10 4/10 4/10 1,3 0/10 9/10 5,1

G.01

6/10 0/10 4/10 0,4 0/10 5/10 4,3

G.02

3/10 4/10 3/10 1,1 0/10 5/10 4,3

-: Negativos +: Positivos s. d.: siembra directa d. e.: después de enriquecimiento

[0168] Tal como se observa en la Tabla 8, 4 días después de la infección la cepa de prueba de provocación de Salmonella Hadar mostró capacidad para alcanzar y colonizar los órganos internos del grupo de control con 2/10 y 0/10 muestras negativas y una numeración significativa de Salmonella de 101,3 ucc/órgano y 105,1 ucc/g, en bazo y

40 contenido cecal respectivamente.

[0169] En relación con los resultados de bazo, la mejor protección contra la prueba de provocación de Salmonella Hadar fue suministrada por vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) con L = 100,9 ucc/bazo en comparación con el grupo de control. Se consiguieron también resultados limitados en el grupo G.02

45 por vacuna inactivada usadas en solitario (L = 100,2 ucc/bazo en comparación con el grupo de control).

[0170] En relación con los resultados de contenido cecal, la vacuna inactivada asociada con vacuna atenuada (G.01) o la vacuna inactivada (G.02) mostraron el mismo nivel de protección con una L de 100,8 ucc/bazo en comparación con el grupo de control.

5 [0171] Los resultados del grupo serológico G.01 mostraron el efecto sinérgico de la inyección de vacuna atenuada a 1 día de vida en la seroconversión de la vacuna inactivada. El efecto de cebado cuantificable fue del 14 % para el componente de Salmonella Enteritidis (58 unidades IP de ELISA) y un sorprendente 23 % para el componente de Salmonella Typhimurium (211 unidades PAL) en comparación con la vacuna inactivada en solitario.

10 [0172] La vacuna inactivada en asociación con vacuna atenuada mostró un mejor efecto protector principalmente contra la invasión de contenido cecal con Salmonella Hadar que la vacuna inactivada en solitario, en comparación con los resultados de control.

[0173] La Tabla 9 resume los resultados de los ejemplos 3 a 6 en relación con aislamiento de Salmonella en 15 bazos de pollos infectados después de la prueba de provocación con Salmonella de serovariedad heteróloga.

Tabla 9:

Número de muestras de bazo para aislamiento positivo/negativo después de prueba de provocación, para diversos tratamientos

Grupos de tratamiento

Positivo bazos Negativo bazos Total

Atenuada + inactivada

10 30 40

Sólo inactivada

18 22 40

Total

28 52 80

[0174] Estos resultados muestran una diferencia significativa en el riesgo del 6,5 % con la prueba K2 y una

20 diferencia significativa en el riesgo unilateral del 5 % con la prueba de Fischer exacta entre el grupo vacunado dos veces según un procedimiento de la presente descripción (por ejemplo, primero con la vacuna a base de Salmonella atenuada y segundo con la vacuna a base de Salmonella inactivada) y el grupo vacunado sólo con la vacuna a base de Salmonella inactivada.

25 [0175] El procedimiento que usa una primo-administración con una vacuna a base de Salmonella Enteritidis atenuada (grupo D) mejoró la eficacia de la Salmonella Enteritidis / Salmonella Typhimurium de la vacuna inactivada oleosa bivalente contra una prueba de provocación de serovariedad heteróloga del grupo B, y también de los grupos C1 y C2 que no estaban presentes en las fórmulas de vacuna que se emplearon. Esta mejora se muestra significativamente mediante la reducción de la invasión del bazo después de la prueba de provocación con

30 Salmonella de una serovariedad heteróloga, en comparación con el grupo vacunado dos veces según un procedimiento de la presente descripción y el grupo vacunado sólo con la vacuna a base de Salmonella inactivada.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición de vacuna para su uso en la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedad causada por al menos una Salmonella heteróloga y/o en la prevención del transporte de al menos una Salmonella heteróloga en animales aviares, en la que la vacuna está formulada para la administración en la forma de un régimen de sensibilización-refuerzo que comprende al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, en la que la primo-administración y la administración de refuerzo se administran con un intervalo de entre 2 y 18 semanas.

2. 2.

   La vacuna según la reivindicación 1, en la que el grupo B de Salmonella comprende Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg.

3. 3.

   La vacuna según la reivindicación 2, en la que la al menos una Salmonella inactivada del grupo B de Salmonella es Salmonella Typhimurium.

4. 4.

   La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el grupo D de Salmonella comprende Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum.

5. 5.

   La vacuna según la reivindicación 4, en la que la al menos una Salmonella atenuada o la al menos una Salmonella inactivada del grupo D de Salmonella es Salmonella Enteritidis.

6. 6.

   La vacuna según la reivindicación 1:

   que comprende además al menos una administración de Salmonella del grupo D entre aproximadamente 2 y aproximadamente 18 semanas después de la administración de la al menos una Salmonella inactivada del grupo B.

7. 7.

   Un kit o conjunto de vacunación para vacunación de animales aviares, que comprende al menos dos viales y un prospecto incluido en el envase con instrucciones de administración, en el que los al menos dos viales comprenden una Salmonella atenuada y una Salmonella inactivada, en el que el kit o conjunto de vacunación está ensamblado de forma operativa para realizar la administración de la vacuna a un animal de la familia aviar y para desencadenar una respuesta inmunitaria segura y protectora contra Salmonella, en el que el primer vial comprende una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D y el segundo vial comprende una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D.

8. 8.

   El kit o conjunto de vacunación según la reivindicación 7, en el que los al menos dos viales comprenden una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella atenuada del grupo D para primo-administración múltiple y una composición inmunógena o una vacuna a base de Salmonella inactivada del grupo B y de Salmonella inactivada del grupo D para administración de refuerzo múltiple.

9. 9.

   Uso de una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la protección cruzada de animales aviares contra una enfermedad causada por al menos una Salmonella heteróloga y/o la prevención del transporte de al menos una Salmonella heteróloga en animales aviares, en el que la vacuna está formulada para una administración en forma de un régimen de sensibilización-refuerzo que comprende al menos una primo-administración de una composición inmunógena o vacuna atenuada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y al menos una Salmonella atenuada del grupo D, administrada a un animal aviar antes de al menos una administración de refuerzo de una composición inmunógena o vacuna inactivada, que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, y al menos una Salmonella inactivada del grupo B y al menos una Salmonella inactivada del grupo D, en el que la primo-administración y la administración de refuerzo se administran con un intervalo de entre 2 y 18 semanas.

10. 10.

    El uso según la reivindicación 9, en el que el grupo B de Salmonella comprende Salmonella Typhimurium, Salmonella Braenderup, Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saint-Paul, Salmonella Brandenburg.

11. 11.

    El uso según la reivindicación 10, en el que la al menos una Salmonella inactivada del grupo B de Salmonella es Salmonella Typhimurium.

12. 12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el grupo D de Salmonella comprende 5 Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum.
13. 13. El uso según la reivindicación 12, en el que la al menos una Salmonella atenuada o la al menos una Salmonella inactivada del grupo D de Salmonella es Salmonella Enteritidis.

    10 14. El uso según la reivindicación 9:

    que comprende además al menos una administración de Salmonella del grupo D entre aproximadamente 2 y aproximadamente 18 semanas después de la administración de la al menos una Salmonella inactivada del grupo B.