PL202301B1

PL202301B1 - Atenuowany szczep Salmonella gallinarum oraz zawierająca go szczepionka

Info

Publication number: PL202301B1
Application number: PL352815A
Authority: PL
Inventors: Theodore T. Kramer
Original assignee: Fatro Spa
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2009-06-30
Also published as: HU0200984D0; TR200200659A3; HUP0200984A2; HU226257B1; PL352815A1; ITMI20010555A1; TR200200659A2

Abstract

1. Szczep Salmonella gallinarum-pullorum oznaczony SGP695AV zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem dost epu PTA2859. 2. Zywa, atenuowana i inaktywowana lub szczepionka, znamienna tym, ze jej aktywnym sk lad- nikiem jest szczep Salmonella gallinarum-pullorum oznaczony SGP695AV zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem dost epu PTA2859. 6. Szczepionka wed lug zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienna tym, ze s lu zy do szczepienia prze- ciwko bia lej biegunce piskl at. 7. Szczepionka wed lug zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienna tym, ze s lu zy do szczepienia prze- ciwko salmonellozie spowodowanej przez Salmonellae nale zace do serotypów 1,9,12 lub 9,12. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy atenuowanego szczepu Salmonella gallinarum-pullorum, sposobu przygotowania nowego szczepu atenuowanego oraz szczepionek zawierających wspomniany szczep służących do zwalczania ludzkiej oraz zwierzęcej salmonellozy. Salmonelloza ludzka i zwierzęca zazwyczaj występuje w dwóch postaciach:

1. Postaci jelitowej, często spowodowanej powszechnie występującymi Salmonellae (niespecyficzne gatunkowo), w tym: S. enteritidis, S. typhimurium, S. heidelberg, S. anatum, S. montevideo, i tym podobnymi. Te powszechnie wystę pują ce szczepy ulegają ł atwemu przeniesieniu z jednego gospodarza na drugiego, w tym na człowieka.

2. Specyficzne gatunkowo gatunki Salmonellae wywołują u gospodarza posocznicę. Bardzo rzadko ulegają przeniesieniu na innych gospodarzy, u których powodują zapalenie jelit z biegunką. Do tych Salmonellae zaliczamy: S. typhi (lub typhosa) powodującą u ludzi dur brzuszny; S. dublin, wywołującą zapalenie jelit, posocznicę, poronienia i zapalenie wymion u bydła (oraz czasami u owiec); S. choleraesuis, wywołująca posocznicę u świń; S. gallinarum-pullorum, będąca przyczyną białej biegunki piskląt i duru kur. Salmonella gallinarum-pullorum w szczególności należy do serotypu 1,9,12.

Obecnie znane komercyjnie dostępne żywe atenuowane szczepionki przeciwko Salmonella gallinarum-pullorum zawierają mikroorganizmy atenuowane na drodze różnych metod. EP-555,366 dotyczy sposobu przygotowania żywej atenuowanej szczepionki przeciwko Salmonella choleraesuis, podczas gdy EP 876,476 opisuje żywą atenuowaną szczepionkę przeciwko ptasiemu zakażeniu powodowanemu przez Salmonella enteritidis. Niekorzystną cechą tych sposobów jest to, że nie powodując one całkowitego usunięcia wirulencji, niosą tym samym ryzyko zakażenia osobników, choć jest to ryzyko niskiego stopnia.

W ż adnym z dostę pnych produktów, mikroorganizm nie ulegał atenuacji na drodze fagocytozy przez heterofilne granulocyty.

Nowy, całkowiecie pozbawiony wirulencji szczep Salmonella gallinarum-pullorum stanowi przedmiot niniejszego wynalazku.

Szczep według wynalazku został dnia 27 grudnia 2000 roku złożony w ATCC (American Type Culture Collection) pod numerem dostępu PTA 2589 i oznaczony jako SGP695AV.

Niniejszy wynalazek obejmuje również żywe atenuowane szczepionki otrzymane z nowego szczepu jak również sposób przygotowywania wspomnianego szczepu.

Szczepionki mogą być przygotowywane i sprzedawane w postaci zliofilizowanej lub jako zawiesina lub roztwór do podawania doustnego lub pozajelitowego.

Postacie farmaceutyczne zawierają szczep według wynalazku Salmonella gallinarum-pullorum oraz odpowiednie zaróbki, adjuwanty i środki konserwujące.

Korzystną cechą szczepionki według wynalazku jest możliwość jej stosowania do profilaktyki zakażeń spowodowanych przez Salmonella gallinarum-pullorum. W szczególności, istotną korzyścią żywych szczepionek, a zwłaszcza tych stymulujących komórkową odpowiedź immunologiczną odgrywającą duże znaczenie w przypadku zakażeń Salmonellae, jest to, że tego rodzaju szczepionki mogą działać jako względne wewnątrzkomórkowe patogeny i temu działaniu towarzyszy znaczny poziom bezpieczeństwa, porównywalny do szczepionek inaktywowanych co jest możliwe dzięki wyjątkowej procedurze atenuacji zastosowanej w niniejszym wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem, bakterie ulegają inaktywacji poprzez fagocytozę za pośrednictwem granulocytów heterofilnych.

Fagocytoza Salmonellae dokonywana przez heterofile zmienia charakterystykę ich wirulencji, tym samym prowadząc do ich atenuacji. Klony sfagocytowanych bakterii są poddawane analizie wirulencji, ponieważ nie wszystkie sfagocytowane bakterie są wystarczająco awirulentne. Całkowicie, ostatecznie awirulentny szczep został otrzymany poprzez powtarzanie fagocytozy na zestawie najbardziej awirulentnych szczepów.

Szczepionki według wynalazku będą podawane zgodnie z procedurami (dawki, czas podawania i droga podawania) stosowanymi w przypadku znanych szczepionek. Szczepionki wynalazku są szczególnie korzystne do szczepienia ptaków, a zwłaszcza drobiu, przeciwko durowi kur i białej biegunce piskląt.

Co więcej, szczepionki według wynalazku są szczególnie korzystne do szczepienia przeciwko salmonellozie spowodowanej przez Salmonellae należące do serotypów 1,9,12 lub 9,12.

Niniejszy wynalazek jest opisany szczegółowo w następującym przykładzie.

PL 202 301 B1

P r z y k ł a d

1. Patogenny, wirulentny szczep Salmonella gallinarum-pullorum (SGP) był hodowany na pożywce do stężenia 1X10⁸ CFU (colony forming units, jednostka tworząca kolonie) na ml. 3 ml heterofilnych granulocytów w stężeniu 6.5x10⁶ml, otrzymanych ze świeżej kurzej krwi dodawano do 1 ml SGP w stężeniu 1X10⁸ CFU i inkubowano przez 20 minut celem zajścia fagocytozy.

2. Po zwirowaniu mieszaniny SGP-heterofilnych granulocytów przy 250 g, osad zawieszono w 4 ml HBSS (zbalansowane sole Hanka) zawierającym 100 μΐ/ml gentamycyny i inkubowano przez 10 minut.

3. Po zwirowaniu, supernatant hodowano w podłożu hodowlanym aby upewnić się co do nieobecności żywych, niesfagocytowanych zewnątrzkomórkowych SGP.

4. Osad z etapu 3 był zawieszany w HBSS zwierającym 100 μl kanamycyny i inkubowany przez 10 minut.

5. Po zwirowaniu, supernatant hodowano w podłożu hodowlanym aby upewnić się co do nieobecności żywych, niesfagocytowanych zewnątrzkomórkowych SGP.

6. Osad z etapu 4 był zawieszany w HBSS niezawierającym antybiotyków i inkubowany przez 10 minut.

7. Po zwirowaniu, supernatant hodowano w podłożu hodowlanym aby upewnić się co do nieobecności żywych, niesfagocytowanych zewnątrzkomórkowych SGP.

8. Osad komórek z etapu 6 poddawano lizie przez inkubację przez 10 minut w 1% roztworze saponiny i wody destylowanej. Pozostały osad używano do inokulacji TSA (tryptonowy agar sojowy) i inkubowano przez 24 godziny cele zebrania sfagocytowanych kolonii SGP.

9. Celem określenia wirulencji, dziesięć różnych kolonii z etapu 8 w stężeniu 10⁷ CFU podawano doustnie jednodniowym kurczętom.

Klon (pojedynczą kolonię) uważano za awirulentną jeśli jednodniowe kurczęta przeżywały, wykazując się dobrym zdrowiem przez 10 dni po inokulacji sfagocytowanymi SGP.

10. Awirulentny klon otrzymany za pomocą procedury z etapu 1-9 był ponownie poddawany powyższym etapom celem potwierdzenia awirulencji.

W przypadku szczególnym:

Szczepem wyjściowym był wirulentny szczep Salmonella gallinarum-pullorum (SGP695V), poddawany 10-etapowej procedurze opisanej powyżej. Na końcu każdego cyklu fagocytozy, wybierano pojedynczy klon i poddawano dalszemu cyklowi fagocytozy. Otrzymany szczep SGP695AV testowano na 47 jednodniowych kurczętach. Jednoczesne testy przeprowadzone na 25 jednodniowych kurczętach za pomocą dzikiego szczepu wykazały, że szczep SGP695AV jest awirulentny i nie może ulec transmisji do wrażliwych osobników „sentinel obecnych w tym samym otoczeniu. Dziki szczep SGP695V 10 dni po zakażeniu spowodował padnięcie 64% osobników, zajęcie organów wewnętrznych w 89% przypadków oraz transmisję zakażenia do wrażliwych osobników.

Dane przedstawiono w Tabelach 1 i 2.

T a b e l a 1

Wyniki zakażenia jednodniowych kurczaków POF (pozbawionych organizmów patogennych) za pomocą szczepów wirulentnych i atenuowanych

Grupy	L. padniętych osobników	Procent śmiertel ności	L. dodatnich hodowli	Procent dodatnich hodowli
Organy wewnętrzne	Jelito ślepe	Organy wewnętrzne	Jelito ślepe
I. SGP695A V 1. 1x10⁷ CFU	0/26	0	1/26	0/26	3.8	0
II. SGP695AV 1. 1x10⁸ CFU	0/21	0	1/21	0/21	4.8	0
III. SGP695V (wirulentny) 1. 7x10⁷ CFU	16/25	64	8/9	8/9	89	89

PL 202 301 B1

T a b e l a 2

Porównanie horyzontalnej transmisji SGP695AV i SGP695V (wirulentny) szczepów ze zwierząt szczepionych do zwierząt nieszczepionych

Grupy	L. padniętych osobników	L. dodatnich komórek	L. osobników z lezjami
Całość organów	Jelito ślepe
Grupę I I grupę II szczepiono 10⁷ i 10⁸ CFU SGP695AV, odpowiednio	0/8	0/8	0/8	0/8
Grupa III była zakażana h 10⁷ CFU SGP695V (wirulentny)	3/5	3/3	3/3	1/3

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep Salmonella gallinarum-pullorum oznaczony SGP695AV zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA2859.
2. Żywa, atenuowana i inaktywowana lub szczepionka, znamienna tym, że jej aktywnym składnikiem jest szczep Salmonella gallinarum-pullorum oznaczony SGP695AV zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA2859.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że służy do szczepienia ptaków.
4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że służy do szczepienia drobiu.
5. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienna tym, że służy do szczepienia przeciwko durowi kur.
6. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienna tym, że służy do szczepienia przeciwko białej biegunce piskląt.
7. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienna tym, że służy do szczepienia przeciwko salmonellozie spowodowanej przez Salmonellae należące do serotypów 1,9,12 lub 9,12.
8. Sposób atenuacji wirulencji szczepów Salmonella gallinarum-pullorum, znamienny tym, że przeprowadza się seryjnie indukowaną fagocytozę szczepów Salmonella gallinarum-pullorum przez heterofilne granulocyty.