JP2000502257A

JP2000502257A - ヘテロフィル適合化家禽用ワクチン

Info

Publication number: JP2000502257A
Application number: JP9523045A
Authority: JP
Inventors: クラマー，セオドア，ティー．
Original assignee: アイオワステートユニバーシティーリサーチファウンデーション，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-12-19
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 2000-02-29
Also published as: US6120774A; BR9612090A; EP0876476A4; WO1997022688A1; EP0876476A1; US6376228B1

Abstract

(57)【要約】ヒトにおけるサルモネラ症および微生物関連の他の健康障害を防止するために家禽にワクチンを接種する方法が記載されている。この方法には、ワクチン中で使用しうる微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株を単離する工程が含まれる。家禽ヘテロフィル適合化菌株の調製物を含んでなるワクチンを家禽に投与することにより、サルモネラ症や他の疾患を引き起こす微生物の伝播が低減される。

Description

【発明の詳細な説明】ヘテロフィル適合化家禽用ワクチン発明の分野本発明は、ヒトにおけるサルモネラ症および微生物関連の他の健康障害を防止するための家禽用ワクチンに関する。特に、本発明は、微生物のヘテロフィル適合化菌株を使用した家禽へのワクチン接種に関する。発明の背景サルモネラ症は、サルモネラ属の一群のグラム陰性菌によって引き起こされるが、米国においては、年間約200万人の食中毒患者を生む原因になっている。卵の中のSalmonella enteritidis（SE）によって起こるサルモネラ症は、食物を介して大衆に感染する最も重要なサルモネラ障害である。こうした障害の発生する原因のほとんどは、調理の不十分な卵を摂取することであった。多数のファージ型SEが存在するが、こうした障害のほとんどは1種または数種のファージ型SEによって引き起こされた。多くの他の国からもヒトSE食中毒の流行が報告されてきたが、そこで報告されたファージ型は、必ずしも米国で流行しているファージ型であるとは限らない。 SEのトリ菌株の中には、産卵鶏の卵に垂直伝播されるものがある。卵巣、輸卵管、および峡部が、垂直伝播の部位であることが明らかにされた。更に、卵の排泄腔感染を指摘した観測報告もある。SEの中のどの菌株またはファージ型が垂直伝播されるかについては分かっていない。また、垂直伝播に対する遺伝的または分子的な要件についても明らかにされていない。雌鶏にSEを感染させると、盲腸や生殖器官への定着を起こすが、通常、発病することはなかった。ほとんどの場合、感染した雌鶏は、正常な周期で産卵を続けた。感染しても顕在的な病状が現れないため、感染の検出を臨床的にまたは血清学的診断法により行うことは困難であった。鶏舎、個々の雌鶏、および／または卵、の中のSEを検出することは、不明な点の多い難しい課題である。感染が根絶されない状況下では、ワクチン接種が、依然として病害防除のための特に優れた方法である。SEは、通常、雌鶏を発病させることがないので、強力な免疫応答はなく、雌鶏は、長期にわたり、場合によっては生涯にわたり、保菌者のままで存在する。従って、免疫処置を繰返し行う必要があると推定される。サルモネラ症の場合、経口投与された弱毒化生菌ワクチンだけが有効であると考えられる。Curtiss，R．III，et al.,Vet ．Microbiol., 37: 397-405(1993)。ワクチン菌株が、雌鶏の消化管および場合により生殖路の中で卵伝播菌株と置き換わる可能性がある。 SEによって起こるサルモネラ症は、ほとんどの場合、家禽の病気ではないが、世界で最も深刻な大衆健康障害の1つである。摂取された卵からSEが伝播する危険を取り除くことができれば、数千人の命が救われるとともに、年間約10億ドルの経費削減がなされるであろう。従って、サルモネラの伝播を防止する家禽用ワクチンは、ヒトにおけるサルモネラ症の発生を抑え、世界中で公衆衛生に著しく貢献するであろう。発明の概要本発明は、家禽種において弱毒化生菌ワクチンとして使用するうえで好適な、微生物のヘテロフィル適合化菌株、を製造する方法を特徴とする。この方法には、家禽種の1メンバーから採取されたヘテロフィルの第1の集団とともに野生型微生物をインキュベートし、ヘテロフィル内在化微生物および細胞外微生物を含んだサンプルを調製する工程が含まれる。ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを、次の工程のために使用する。ヘテロフィル内在化クローンから得られた微生物を、ヘテロフィルの第2の集団とともにインキュベートし、次の継代のヘテロフィル内在化微生物および次の継代の細胞外微生物を生成する。好ましくは、ヘテロフィルの第2の集団は、第1の継代に使用した家禽種のメンバーと同じメンバーから採取する。少なくとも3回の継代、好ましくは少なくとも5回の継代が完了するまで、これらの操作を繰り返す。最後の継代から得られたヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを単離して、ヘテロフィル適合化菌株を得る。ヘテロフィル適合化菌株は、アルギニンヒドロラーゼ陰性であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。本発明の適用可能な家禽種としては、七面鳥、ホロホロ鳥、鳩、鶉鶴、パートリッジ、ブロイラー、および産卵鶏が挙げられるが、これらに限定されるものではない。微生物の種としては、サルモネラ属のメンバー、例えば、Salmonella e nteritidis 、が挙げられる。好ましい実施態様において、ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを単離する工程には、抗生物質とともにヘテロフィルをインキュベートする工程と、水洗する工程と、それに続いて、ヘテロフィルを破砕し、ヘテロフィル内在化微生物を放出させる工程と、が含まれる。2つ以上の抗生物質とともにヘテロフィルをインキュベートしてもよい。本発明の方法に有用な抗生物質としては、アミノグリコシドまたはアミノシクリトールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。カナマイシンおよびゲンタマイシンを使用するのが最も好ましい。抗生物質は、個別的に、逐次的に、または任意の組合せで、使用できるが、関連する細胞外微生物を死滅させるかまたは不活性化できるものとする。もう1つの態様において、本発明は、微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株の調製物を家禽に投与すること、好ましくは、経口投与すること、によって、家禽にワクチン接種を行う方法を特徴とする。もう1つの実施態様において、微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株および粘膜アジュバントのコレラトキシンの両方を、家禽に提供する。更にもう1つの態様において、本発明には、微生物の実質的に純粋な家禽ヘテロフィル適合化菌株が含まれる。好ましい実施態様において、微生物は、サルモネラ属の1メンバーである。最も好ましくは、サルモネラ属のメンバーは、Salmo nella enteritidis である。ヘテロフィル適合化菌株は、アルギニンヒドロラーゼ陰性であってもよい。更にもう1つの態様において、本発明は、微生物の実質的に純粋な家禽ヘテロフィル適合化菌株の調製物を含む家禽用弱毒化生菌ワクチンを特徴とする。好ましい実施態様において、微生物はサルモネラ属の1メンバーである。より好ましくは、サルモネラ属のメンバーはSalmonella enteritidisであり、例えば、ATCC 受託番号を有するSalmonella enteritidis SETK499菌株、またはATCC受託番号55 770を有するSETK598菌株が挙げられる。もう1つの実施態様において、ワクチンには、微生物の実質的に純粋な家禽ヘテロフィル適合化菌株ならびにコレラトキシンが含まれる。好ましくは、ワクチンは、経口投与に適合される。もう1つの関連する態様において、本発明には、微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株を有する家禽メンバーが含まれる。好ましい実施態様において、微生物は、サルモネラ属のメンバー、例えば、Salmonella enteritidis、である。更にもう1つの関連する態様において、本発明には、免疫された家禽メンバーから誘導された卵および体の一部分（ウィング、胸部、ドラムスティック、または、例えば、食用として市販されている体の他の部分）が含まれる。このような卵および体の一部分は、免疫されていない点を除けば同等な家禽メンバーから得られた卵および体の一部分よりも、微生物混入の危険性は低い。図面の簡単な説明図1は、SE野生型チャレンジ菌株SETK474およびSETK584の糞への排出を示している（実験SE1）。図2は、ワクチン菌株HASES SETK499の糞への排出を示している（実験SE1）。図3は、実験SE1において、ワクチン菌株HASES SETK499を接種する前と後におけるSE野生型チャレンジ菌株SETK474およびSETK584の糞への排出を示している。図4は、ワクチン菌株HASES SETK598の糞への排出を示している（実験SE2）。図5は、ワクチンの接種された雌鶏において、ワクチン接種後に野生型菌株SET K584を投与した場合の糞への菌の排出を示している（実験SE2）。好ましい実施態様の説明本発明は、家禽用弱毒化生菌ワクチンとして使用するための好適なヘテロフィル適合化菌株の調製方法に関する。このような菌株は、ヒトの健康障害を引き起こす微生物、例えば、Salmonella enteritidis、の食物を介した発生を低減させるのに有用である。より詳細には、免疫処理および卵へのSE伝播の防止を行うために、ヘテロフィル適合化菌株を単離し、産卵鶏へ経口投与した。本明細書中で使用する場合、ヘテロフィル(heterophil)という用語は、家禽血液中の多形核細胞または顆粒細胞を意味する。本明細書中で使用する場合、家禽という用語は、七面鳥、ホロホロ鳥、鳩、鶉、パートリッジ、ブロイラー、および産卵鶏などのトリを意味するが、これらに限定されるものではない。本明細書中で使用する場合、家禽メンバーとは、家禽種の個々のメンバーを意味する。一般的には、本発明は、微生物のヘテロフィル適合化菌株を含むワクチンを得るためのヘテロフィル適合化の方法を利用する。本発明の1態様において、家禽種のメンバーから得られたヘテロフィルとともに微生物の野生型菌株をインキュベートすることにより、ヘテロフィル適合化菌株を産生することができる。本明細書中で使用する場合、「野生型」という用語は、家禽ヘテロフィル適合化されていない任意の微生物を意味する。好ましい実施態様において、家禽種は産卵鶏である。微生物は、サルモネラ属の任意のメンバーであってよく、例えば、Salm onella enteritidis (SE)、Salmonella gallinarum(SG)、Salmonella pullorum(S P)、Salmonella dublin(SD)、およびSalmonella typhimurium(ST)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様において、ヘテロフィル適合化に使用される微生物はSEである。ヘテロフィル適合化のために使用される野生型微生物としては、種々のSE菌株が利用できる。例えば、SETK474およびS ETK584が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヘテロフィル適合化は種々の方法で行うことができる。例えば、家禽種の1メンバーから得られたヘテロフィルの第1の集団とともに、微生物の一部がヘテロフィルにより内在化されるまで、微生物の野生型菌株をインキュベートしてもよい。好ましくは、約41℃において約30分間、ヘテロフィルとともに微生物をインキュベートするが、インキュベーション温度、家禽および微生物の種、ならびに他の条件に依存して、他のインキュベーション時間を用いた方が適当な場合もある。いずれの場合においても、少なくとも一部の微生物がヘテロフィルにより内在化されるように、インキュベーション時間を選択する。このような内在化は、破砕されたヘテロフィルをGN肉汁およびMacConkey寒天中で細菌学的に培養することにより、容易にモニターすることができる。ヘテロフィルとともにインキュベーションを行うは、全血、好ましくはヘパリン化された管中に採取された血液、を使用してもよい。この他、精製されたヘテロフィルまたは部分的に精製されたヘテロフィルを使用してもよい。好ましい実施態様において、産卵鶏から得られた血液を、ヘパリン化された管中に採取し、微生物の野生型菌株を一晩培養したものとともにインキュベートする。インキュベーションを一晩行ってから、McFarland比濁計を用いて595nmにおける光学濃度 (O.D.)が約0.2となるように、培養菌株を調節する。野生型微生物とともに家禽ヘテロフィルのインキュベーションを行うと、細菌：ヘテロフィルの比が約10:1 であるために内在化されない微生物（すなわち、「細胞外」微生物）とともに、ヘテロフィル内在化微生物を含んだサンプルが得られる。従って、本明細書中で使用する場合、細胞外微生物とは、ヘテロフィルの外面上にあるかまたはインキュベーション培地中に分散されて、ヘテロフィルに結合していない微生物を意味する。本明細書中で使用する場合、ヘテロフィル内在化微生物とは、インキュベーション中にヘテロフィルにより内在化された微生物を意味する。ヘテロフィル適合化における次の工程には、ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを単離する工程が含まれる。この単離工程には、まず最初に、ヘテロフィルと野生型微生物とのインキュベーション混合物から細胞外微生物を除去する工程が含まれる。細胞外微生物の除去に利用できる方法であれば、いずれを使用してもよい。好ましい実施態様において、細胞外微生物の除去工程には、細胞外微生物を死滅させるかまたは不活性化するのに有効な抗生物質とともにインキュベートする工程と、それに続いて、培地を用いて洗浄し、サンプルから抗生物質を除去する工程と、が含まれる。抗生物質の存在下で行われるインキュベーションの時間は、実質的に細胞外微生物のすべてを死滅させるかまたは不活性化するのに十分な長さでなければならない。好ましくは、抗生物質とともにインキュベーションを行うのは、約41℃において約60分間である。微生物の野生型菌株は、一般的には、実質的に細胞外微生物のすべてを死滅させるかまたは不活性化するために使用される抗生物質に感受性のあるものでなければならない。好ましい実施態様において、カナマイシンまたはゲンタマイシンとともにサンプルをインキュベートすることにより、細胞外微生物を破壊する。もう1つの実施態様において、2つ以上の抗生物質とともに逐次的にインキュベーションを行うことにより、細胞外微生物を死滅させるかまたは不活性化する。例えば、最初に、カナマイシンとともにサンプルをインキュベートし、続いて、ゲンタマイシンとともにインキュベートする。抗生物質に晒した後、例えば、低速で遠心分離を行ってヘテロフィルをペレット化することにより、抗生物質を除去する。抗生物質を含有する上清を除去し、新しい培地をペレットに添加する。攪拌する(vortexing )ことにより、ペレットを再び懸濁させてもよい。サンプル中の細胞外微生物の死滅または不活性化ならびに抗生物質の除去を行った後、洗浄されたヘテロフィルを破砕することにより、ヘテロフィル内在化微生物を放出させてもよい。好ましい実施態様において、ヘテロフィルの破砕は、サポニンなどの界面活性剤を用いて行う。次に、破砕されたヘテロフィルのサンプルのアリコートを寒天プレート上または液状培地中で増殖させ、続いて、寒天プレート上にプレーティングする。好ましい実施態様において、破砕されたヘテロフィルのサンプル約6滴のアリコートを寒天プレート上に滴下してプレーティングする。好ましくは、寒天プレートはMacConkey寒天プレートである。適切な期間の増殖を行ってから、寒天プレートからうまく単離された単一コロニーを同定し、ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンが得られたら、ヘテロフィル適合化の一回目の継代を終了する。二回目の継代において、一回目の継代から得られたクローン化ヘテロフィル内在化微生物の培養菌株を、好ましくは一回目の継代で使用したものと同じ供給源（すなわち、同じトリ）から得られたヘテロフィルの第2の集団を用いてインキュベートし、次に、上述したものと同じ手順により処理する。同様に、後続の各継代を開始する際も、同じトリから得られたヘテロフィルを、直前の継代から得られたクローン化ヘテロフィル内在化微生物の培養菌株とともにインキュベートする。微生物のヘテロフィル適合化は、野生型微生物から始めて、上述のヘテロフィル適合化処理を繰返し行うことにより行うことができる。好ましくは、少なくとも3回のヘテロフィル適合化処理、より好ましくは少なくとも4回〜5回のヘテロフィル適合化処理、更に好ましくは少なくとも6回のヘテロフィル適合化処理を介してヘテロフィル適合化微生物を得る。MacConkey寒天上にプレーティングした場合、界面活性剤によるヘテロフィルの破砕を行った後、回収されたコロニーの数が、一回目の継代のコロニー数十個から約2〜5個のコロニーに減少したときにヘテロフィル適合化に成功したとみなすことができる。各継代の後、ヘテロフィル中で生存する細菌の数が減少した場合、食細胞中における生存能力が低下すると解釈できる。ヘテロフィル適合化菌株は、多くの遺伝的または生化学的変化を呈することがある。例えば、アルギニンヒドロラーゼの消失は、ヘテロフィル適合化菌株が、重要な酸化的毒性産物である酸化窒素(NO)を産生する能力を失ったことを示す可能性がある。最近、食細胞によるサルモネラの死滅において、NOは重要な殺菌性物質である可能性のあることが分かった。従って、好ましい実施態様において、ヘテロフィル適合化菌株は、アルギニンヒドロラーゼ陰性である。ビルレンスプラスミドの消失は、ある種のヘテロフィル適合化菌株が呈する変化のもう1つの例である。ヘテロフィル適合化菌株は、家禽へのワクチン接種に使用することができる。家禽へのワクチン接種を行うために、ヘテロフィル適合化菌株の調製物を含むワクチンを投与する。好ましい実施態様において、微生物のヘテロフィル適合化菌株の調製物を経口投与することにより家禽へのワクチン接種をおこなう。好ましくは、ヘテロフィル適合化菌株の調製物を飲料水に添加することにより、経口投与を行う。好ましい実施態様において、ヘテロフィル適合化菌株の調製物を、約 50mLの脱イオン化された飲料水に添加する。飲料水の入ったコップを、実質的に空になるまで小屋の中に置き、調製物が実質的にすべて投与されたことを確認する。調製物は、培養物、冷凍サンプル、凍結乾燥サンプル、高層寒天、または細菌を保持するのに適した任意の他の形態であってもよい。もう1つの実施態様において、ヘテロフィル適合化微生物のほかに、家禽にコレラトキシン（粘膜アジュバント）が提供される。好ましい実施態様において、調製物には、家禽に投与されるヘテロフィル適合化菌株が各トリあたり約10⁶〜約10⁸コロニー形成単位（ CFU）のオーダーで含まれる。ヘテロフィル適合化菌株が生菌ワクチンとして適しているかは、野生型チャレンジ菌株およびヘテロフィル適合化菌株に家禽を晒す実験を行うことにより決めることができる。ワクチン菌株に晒した後の菌排出の頻度および持続期間、ならびに卵へのチャレンジ菌株の伝播は、ワクチンの効力の尺度として使用できる。例えば、ワクチン接種の前後におけるワクチン菌株およびチャレンジ菌株の糞への排出および卵への伝播を評価し、対照のチャレンジ菌株を感染させた雌鶏における同じパラメーターと比較する。 1組の実験において、野生型チャレンジ菌株を飲料水に添加することにより、産卵鶏を野生型チャレンジ菌株に曝露した。チャレンジ菌株への曝露を２ラウンド行った後、SE の5回の継代を経た(5×)ヘテロフィル適合化菌株を含有するワクチン菌株に産卵鶏を曝露した。次に、産卵鶏をチャレンジ菌株に曝露し、再びワクチン菌株に曝露した。この1組の実験により次のことが判明した。すなわち、野生型チャレンジ菌株を感染させた場合、糞への排出および卵への伝播が長期化すること、更に、糞への排出に対する回復期免疫性はなく、しかも卵への伝播に対する回復期免疫性は僅かであること、が明らかになった。ワクチン菌株は、短期間に少ない頻度で排出された。また、卵へのワクチン菌株の伝播は起こらなかった。続いて、ワクチン接種された産卵鶏を野生型チャレンジ菌株またはワクチン菌株に曝露したところ、糞への排出の頻度および持続期間は減少し、しかも卵への伝播が起こらなくなった。第2の組の実験において、6回の継代（6×）を経たヘテロフィル適合化菌株をワクチン菌株として使用した。産卵鶏を、このワクチン菌株にトリ1匹あたり10⁶ 〜10⁸CFUの量で曝露し、続いて、野生型チャレンジ菌株に曝露した。第2のグループに対しては、粘膜アジュバントとして知られるコレラトキシンと共にワクチン菌株に曝露し、続いて、チャレンジ菌株に曝露した。これらの実験により次のことが示された。すなわち、曝露量が少なければ、糞への排出は起こらず、一方、ワクチン菌株を大量投与すると、限られた期間（約10日間〜14日間）に、糞へのいくらかの排出が起こることが分かった。コレラトキシンを使用すると、糞への排出が減少した。ワクチン接種されたグループでは、チャレンジ菌株に曝露した対照グループ（ワクチン接種なし）と比較した場合、糞へのチャレンジ菌株の排出は顕著に少なかった。重要な点は、ワクチン菌株およびチャレンジ菌株がいずれも、ワクチン接種されたグループの卵からは単離できなかったことである。ワクチン菌株を用いて繰り返しワクチン接種を行ったところ、免疫された雌鶏において糞へのチャレンジ菌株の排出レベルが低下した。これらの実験から、ヘテロフィル適合化菌株は、安全性があり、家禽用ワクチンとして有効であることが判明した。例示のための次の実施態様を参照すれば、本発明を更によく理解できるであろうが、これらの実施態様は、単に例示するためのものであり、これにより、請求の範囲に記載された本発明の真の範囲が限定されるものと解釈すべきではない。実施例１野生型Salmonella enteritidisのヘテロフイル適合化試薬：使用した試薬としては、pH約7.2の無菌のHanks培地またはRPMI 640培地(RPMI) を含有するDifco製のGN Hajna肉汁（GN）、血液吸引用のヘパリン化管、HanksまたはRPMI中に1mg/mLの量で含まれるカナマイシン、HanksまたはRPMI中に10μg/m Lの量で含まれるゲンタマイシン、MacConkey寒天（Difco）、および脱イオン水中の1%サポニン無菌溶液が挙げられる。方法：第1日目に、野生型菌株の単離コロニーをGN中で一晩増殖した。第2日目に、次の工程を行った。約5mLの血液を、ニワトリからヘパリン化管中へ吸引採取した。この管へ、無菌Hanks 4mLおよび一晩培養した接種材料1mL（McFarland比濁計を用いて595λにおける増殖培地中の濃度を0.2O.D.としたもの）を添加した。穏やかに攪拌しながら、または低速で回転させながら、41℃において30分間、管をインキュベートした。カナマイシンのHanks溶液1mLを、管中の溶液10mLに添加した。次に、41℃において60分間、管をインキュベートし、低速（200g）で約10分間、遠心分離した。上清1mLをGN（洗液#1）中に加え、更に、MacConkey寒天（プレート#1）上にプレーティングした。残りの上清を管から除去し、ゲンタマイシンのHanks溶液10mLを使用して再びペレットを懸濁させた。次に、管を30分間インキュベートし、低速（200g）で約10分間、遠心分離した。上清1mLをGN（洗液# 2）中に加え、更に、MacConkey寒天プレート（プレート#2）上にプレーティングした。残りの上清を除去し、Hanks20mL中で再びペレットを懸濁させた。次に、管を30分間インキュベートし、低速（200g）で約10分間、遠心分離した。上清1mLをGN（洗液#3）中に加え、更に、MacConkey寒天プレート（プレート#3）上にプレーティングした。残りの上清を除去し、1％サポニン2〜3滴を細胞ペレットに添加し、管を回転させた。次に、Hanks 2mLを添加し、続いて、得られた懸濁液6滴をMacConkey寒天プレート（プレート#4）上にドロッププレーティングした。GN 25mLを管に添加し、41℃において管を一晩インキュベートした。第3日目に、第1、第2、および第3の洗液が無菌であるかをしらべた。すべての洗液が無菌の場合、プレート#4から得られた単一コロニーを、GNおよび血液寒天中で継代培養し、単離コロニーを得た。第4日目に、単離コロニーを選んで、GN 中に加えた。少なくとも5回のヘテロフィル継代を行って無菌の洗液が得られるまで、逐次採血により得られた同じトリに由来するヘパリン化血液を用いて、第2日目から第4日目までのヘテロフィル適合化プロトコルを繰り返した。従って、適合化は、、SEの単一クローンと個々のトリの食細胞との相互作用を表す。いずれのヘテロフィル継代においても、食菌されないSEが偶然に単離されないように、特別の注意を払った。ヘテロフィルのサポニン溶菌を行った後で回収されたSEコロニーの数が、MacConkey寒天上にプレーティングされた溶菌血6滴を基準に、第１回目の継代を行った後のコロニー数十個から約2〜5のコロニーまで減少した場合、ヘテロフィル適合化に成功したと考えられる。実施例２糞および卵の細菌学的培養 Bichler et al.，Am．J．Vet．Res．57:489-495 (1996)；Gast R.K.，Poultry Science 8:1611-1614(1993)に記載の技法に従って、ニワトリの糞の培養を行った。手短に述べれば、トリプチカーゼ大豆肉汁中で糞を一晩培養し、ヨウ素およびスルファジアジンを含むテトラチオネート肉汁中で2日間継代培養し、Rappapo rt-Vassiliadis培地中で継代培養し、ブリリアントグリーン寒天上にプレーティングした。KSU法(Difco)により、およびサルモネラD1グルーピング血清(Difco) 中の細菌懸濁液のスライド凝集性により、サルモネラの存在が疑われるコロニーを同定した。Bichler et al.，Am ．J．Vet．Res．57: 489-495 (1996)の方法に改良を加えて、卵の培養を行った。手短に述べれば、卵の殼を洗浄し、更に、卵の殻をアルコール滅菌し、次に、卵の殻の内膜、黄身、および白身を別々に培養した。実施例３産卵鶏実験の手順以下に記載の産卵鶏実験はすべて、成熟した（年齢1〜2歳）レグホン産卵鶏を用いて行った。個別に小屋に入れられた産卵鶏の中から、産卵性の良いものを選び、糞および卵のサルモネラ感染がないことを5回のサンプリングを行って確認してから実験用プールに用いる産卵鶏を選んだ。実験用SE菌株（野生型菌株およびヘテロフィル適合化SE菌株（HASES）のワクチン菌株）を飲料水に入れた。飲料水を各小屋に1カップずつ配置した。回収トレイから毎日1回、糞をサンプリングし、更に、卵を回収し、冷蔵し、回収から24時間以内にSEの培養を行った（実施例2に記載のもの）。チャレンジSE菌株およびHASESワクチン菌株は、別々に同定はしなかった。すべての産卵鶏の糞および卵が少なくとも10日間、SE陰性になるまでは、次の処理（ワクチン菌株またはチャレンジ菌株の投与）は行わなかった。実施例４ HASES SETK499 の安全性および効力 HASES SETK499ワクチン菌株は、野生型フィールド菌株SETK474から誘導した。 HASES SETK499は、実施例1に記載したように、5×ヘテロフィル適合化を行ったものである。実験SE1は、5サイクルで行った。サイクル1：12匹の雌鶏のそれぞれを、3日間連続して、約1×10⁸コロニー形成単位(CFU)の野生型菌株SETK474およびSETK584を50mLの飲料水に入れて曝露し、糞への排出の頻度および持続期間、ならびに卵への野生型菌株の伝播を調べた。 1×10⁸CFU/mL 1mLを50mLの飲料用脱イオン水に加えて希釈した。雌鶏がすべての水を飲み終わるまで（通常、3〜4時間）、飲料用コップの水を空けたり、取り替えたりすることはなかった。糞および卵に対して、39日間、SE回収のために培養を行った。サイクル2：サイクル1の開始日の60日後に、サイクル2を開始した。12匹の雌鶏のそれぞれを、2日間連続して、約1×10⁸CFU／飲料用脱イオン水50mLの野生型菌株SETK474およびSETK584に再び曝露し（図1）、同じ菌株を継続して感染させたときの糞への排出および卵への伝播に対する回復期免疫性を調べた。サイクル3：サイクル2の開始日の60日後に、サイクル3を開始した。これらの雌鶏のそれぞれを、3日間連続して、1×10⁸CFU／飲料用脱イオン水50mLのHASES ワクチン菌株SETK499に曝露した（図2）。曝露後25日間、糞および卵をサンプリングし、ワクチン菌株に関する糞への排出の頻度および持続期間ならびに卵への伝播を調べた。サイクル4：サイクル3の開始日の62日後に、サイクル4を開始した。2日間連続して、1×10⁸CFU／飲料水50mLの野生型菌株SETK474およびSETK584に再び雌鶏を曝露した（図3）。曝露後39日間、糞および卵をサンプリングし、雌鶏へのワクチン接種（サイクル3）を行った後におけるチャレンジ菌株に関する糞への排出の頻度および持続期間ならびに卵への伝播を調べた。サイクル5：サイクル4の開始日の70日後に、サイクル5を開始した。1×10⁸CFU ／飲料水50mLのHASES SETK499に再び曝露し（図2）、糞への排出の頻度および持続期間ならびに卵への伝播に対する既往免疫性を調べた。結果および考察サイクル1、2、および4を含む実験の部分から、野生型菌株SETK474およびSETK 584が後続の研究を行うための有効なチャレンジ菌株であることが判明した。本実験から、これらの菌株によるチャレンジを行うと、糞への排出が長期化し（感染後>25日間）（図１および３）するとともに卵への伝播も長期化する（6.6%〜9 .2%の卵が汚染された；表1）ことが判明した。比較してみると、自然にSE感染した集団における汚染率は、0.05%〜0.5%であった。また、実験SE1から、これらの菌株に事前に曝露しても、糞への排出に対する回復期免疫性は得られないことが明らかとなった（図1および表１）。野生型菌株に事前に曝露しても、糞への排出に対する免疫性は得られなかったが、卵への伝播に対しては多少免疫性を呈する可能性がある。実際には、卵への伝播は、後続の感染サイクルで低減した（データは示されていない）。サイクル3および5の実施手順は、5×ヘテロフィル適合化菌株HASES SETK499の糞への排出が、低頻度で、かつ僅かな期間だけで起こることを明確にするようにデザインした（図2）。各雌鶏を連続して3日間、2×10⁸CFUの量でHASES SETK499 に曝露した場合、糞への排出は、発生頻度が僅かに3件、すなわち、感染後の第1 日目（1匹）、第4日目（2匹）、および第7日目（1匹）であった。排出が終わってから34日後に続けてHASES SETK499に曝露した場合（第5サイクル）、感染後の第4日目に一回、1匹が糞への排出を示した。サイクル3の後、野生型菌株で雌鶏をチャレンジした場合、チャレンジ菌株の排出は、感染後の第10日目でなくなった。サイクル3および5の手順はまた、ヘテロフィル適合化菌株が卵に伝播しないことを明確にするようにデザインした。HASES SETK499および後続投与されたチャレンジ菌株SETK584はいずれも、これらの雌鶏の卵に伝播しなかった（表1）。まとめると、実験SE1により、HASES SETK499は安全性があり、しかも有効なワクチン菌株であることが判明した。この菌株は、少ない頻度で、かつ経口投与後僅かな期間（7日間；サイクル3）だけで糞により排出された。この菌株の二度目の感染を行うと、排出の頻度および持続期間は更に減少したことから（サイクル 5）、既往効果が示唆された。初期ワクチン接種（サイクル3）を行った結果、感染後第10日目でチャレンジ菌株の感染がなくなった（サイクル4）。HASES SETK4 99は、卵に伝播せず、後続のチャレンジ菌株SETK584の卵への伝播を抑制した。実施例５ HASES SETK598 の特徴決定および効力 HASES SETK598ワクチン菌株は、野生型フィールド菌株SETK499から誘導し、実施例1に記載したように6×ヘテロフィル適合化処理にかけた。実験SE2は2サイクルで行った。サイクル1（ワクチンの安全性）：初期の免疫性および既往免疫性を調べるために、雌鶏（ワクチングループ1）をHASES SETK598に繰返し曝露した。3.40×10⁶ CFUのSETK598を飲料水に入れて投与した後、24日間にわたり糞および卵をサンプリングした。最初の曝露を行ってから45日後に再び雌鶏を4.0×10⁶CFUに曝露し、30日間にわたりサンプルを回収した。二回目の曝露を行ってから30日後に5. 0×10⁷CFUの三回目の曝露を開始し、糞への排出の頻度および持続期間ならびに卵への伝播を調べた。6匹の雌鶏（ワクチングループ2）を同等な方法で処理したが、ワクチン接種日に50μg/mlのコレラトキシン（CT）も一緒に飲料水に入れた。コレラトキシンを使用した理由は、免疫性をもつ既知の粘膜アジュバントであることである（図4）。サイクル1の目的は、繰返しワクチン接種を行った場合の HASES SETK598の糞への排出および卵への伝播を調べること、および野生型フィールド菌株でチャレンジしたときの後続の免疫性に及ぼすCTの効果を調べること、である。サイクル2（ワクチンの効力）：サイクル1の終了日の65日後にサイクル2を行った。16匹の免疫化雌鶏（上述のワクチングループ1および2）を、チャレンジ菌株に曝露した。約1×10⁸CFUの野生型チャレンジ菌株SETK584をこれらの雌鶏に与えた。11匹の対照の雌鶏を同時に同等なチャレンジに曝露し（図5）、チャレンジSEの糞への排出および卵への伝播を調べた。結果および考察実験SE2により、実験SE1で既に示されたHASESの少なくかつ過渡的な腸への定着が再確認された（実施例4を参照されたい）。ワクチン接種の間隔を30日以上にして、HASES SETK598のワクチン接種を3回繰り返した。一回目および二回目の低用量のワクチン接種サイクルの後、サルモネラは単離されなかった（一回の用量は約3〜4×10⁶CFU；データは示されていない）。三回目のサイクルでより高用量でHASESを与えた場合（5×10⁷CFU）、グループ1のワクチン接種された雌鶏において、感染後第5日目に2匹の雌鶏から、感染後第6日目および第7日目に1匹の雌鶏からワクチンが回収された。グループ2の雌鶏に対して、ワクチンと共に50 μgのCTアジュバントを与えたところ、感染後第5日目に1件だけ、また感染後第9 日目に1件HASESが回収された（図4）。ワクチン接種されたグループ1および2の方が、チャレンジを与えた対照のグループよりも、チャレンジ菌株の糞への排出は著しく少なかった（p<0.01；図5）。ワクチン接種されたグループ1および2の4 77個の卵のいずれからも、HASESおよびチャレンジ菌株SETK584は単離されなかったが、チャレンジを与えた対照のグループでは、71個の卵のうちの4個（5.6%）からこれらが単離された（表1）。実験SE2により、HASES SETK598は、約10⁶CFUの量で繰返し投与を行っても雌鶏の糞への排出は起こらないという証拠が得られた。5×10⁷CFUの用量で投与した場合、感染後第9日目まで、数匹の雌鶏の糞からの排出が見られた。HASES SETK5 98の繰返しワクチン接種を行ったところ、免疫化雌鶏においてチャレンジ菌株の糞への排出レベルが低下した。ワクチン接種された雌鶏の卵の中には、ワクチン菌株およびチャレンジ菌株はいずれも検出されなかった。表1 野生型菌株SETK474およびSETK584ならびにワクチン菌株HASES SETK499およびHASES SETK598の卵への感染

Claims

【特許請求の範囲】１．家禽種において弱毒化生菌ワクチンとして使用するための微生物のヘテロフィル適合化菌株を製造する方法であって、しかも、 a）該家禽種のメンバーから得られたヘテロフィルの第1の集団と共に野生型微生物をインキュベートし、ヘテロフィル内在化微生物および細胞外微生物を含有するサンプルを調製する工程と、 b）該ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを単離する工程と、 c）該家禽種の該メンバーから得られたヘテロフィルの第2の集団と共に該クローンからの微生物をインキュベートし、次の継代のヘテロフィル内在化微生物および次の継代の細胞外微生物を形成する工程と、 d）工程（b）および（c）を少なくとも3回目の継代まで繰り返し行う工程と、 e）該少なくとも3回目の継代から得れた該ヘテロフィル内在化微生物の実質的に純粋なクローンを単離し、ヘテロフィル適合化菌株を得る工程と、を含む前記方法。２．前記工程（b）および（c）を少なくとも5回目の継代まで繰り返し行う請求項１記載の方法。３．前記ヘテロフィル適合化菌株がアルギニンヒドロラーゼ陰性である請求項１記載の方法。４．前記微生物がサルモネラ属のメンバーである請求項１記載の方法。５．前記サルモネラ属の前記メンバーがSalmonella enteritidisである請求項４記載の方法。６．前記家禽種の前記メンバーが産卵鶏である請求項１記載の方法。７．前記工程（b）および（e）の各単離工程が、抗生物質と共に前記ヘテロフィルをインキュベートする工程と、該ヘテロフィルを洗浄して該抗生物質を除去する工程と、該ヘテロフィルを破砕する工程と、を含む請求項１記載の方法。８．前記抗生物質と共にインキュベートする前記工程が、2種以上の抗生物質と共に順次インキュベーションを行う工程を含む請求項７記載の方法。９．前記抗生物質が、カナマイシンおよびゲンタマイシンから成る群より選ばれる請求項７または８記載の方法。１０．微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株の調製物を前記家禽に投与する工程を含む、家禽へのワクチン接種方法。１１．前記微生物がサルモネラ属のメンバーである請求項１０記載の方法。１２．前記メンバーがSalmonella enteritidisである請求項１１記載の方法。１３．前記投与が経口投与である請求項１０記載の方法。１４．コレラトキシンを前記家禽に与える工程を更に含む請求項１０記載の方法。１５．微生物の実質的に純粋な家禽ヘテロフィル適合化菌株。１６．微生物の前記菌株がサルモネラ属のメンバーである請求項１５記載の菌株。１７．前記メンバーがSalmonella enteritidisである請求項１６記載の菌株。１８．前記ヘテロフィル適合化菌株がアルギニンヒドロラーゼ陰性である請求項１５記載の菌株。１９．微生物の実質的に純粋な家禽ヘテロフィル適合化菌株の調製物を含んでなる家禽用弱毒化生菌ワクチン。２０．微生物の前記菌株がサルモネラ属のメンバーである請求項１９記載のワクチン。２１．前記メンバーがSalmonella enteritidisである請求項２０記載のワクチン。２２．コレラトキシンを更に含んでなる請求項１９記載のワクチン。２３．前記ヘテロフィル適合化菌株がアルギニンヒドロラーゼ陰性である請求項１９記載のワクチン。２４．前記菌株がATCC受託番号を有するSETK499である請求項１９記載のワクチン。２５．前記菌株がATCC受託番号55770を有するSETK598である請求項１９記載のワクチン。２６．前記ワクチンが経口投与に適している請求項１９記載のワクチン。２７．微生物の家禽ヘテロフィル適合化菌株を含んでなる家禽メンバー。２８．前記微生物がサルモネラ属のメンバーである請求項２７記載の家禽メンバー。２９．前記メンバーがSalmonella enteritidisである請求項２８記載の家禽メンバー。３０．請求項２７記載の家禽メンバーから卵を得る工程を含む、家禽から卵を得る方法。３１．請求項２７記載の家禽メンバーから家禽の身体部分を得る工程を含む、家禽の身体部分を得る方法。