KR100591660B1 - 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신 - Google Patents

동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국내 유행 살모넬라균 혈청그룹인 그룹 B, C 및 D에 속하는 각각의 살모넬라균주의 세포외막단백질(OMP)을 면역항원으로 함유하는 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신을 제공한다. 본 발명은 바람직하게는 상기 그룹 B에 속하는 살모넬라균으로는 살모넬라 티피뮤리움을, 그룹 C에 속하는 살모넬라균으로는 살모넬라 브렌더럽을, 및 그룹 D에 속하는 살모넬라균으로는 살모넬라 엔테라이티디스 균주가 선택되어지는 혼합백신을 제공한다.

Description

동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신{Mixed Vaccine for Prevention of Infection by Animal Salmonella}
도 1은 살모넬라균 농도와 흡광도의 직선관계식을 나타낸다.
도 2는 기니아피그를 대상으로 하여 실시된 항체형성능의 측정결과를 나타낸다.
도 3은 마우스를 대상으로 하여 실시된 항체형성능의 측정결과를 나타낸다.
본 발명은 동물살모넬라 예방용 혼합백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내 유행하는 살모넬라의 다양한 혈청형에 의한 살모넬라감염증을 동시에 방어할 수 있으며, 높은 항체가가 장기간 유지될 수 있는 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신에 관한 것이다.
살모넬라감염증은 이유자돈, 송아지 등 어린가축과 조류에서 설사와 패혈증에 의한 폐사발생으로 양축농가에 큰 피해를 주고 있는 질병이며 오염된 식육을 통 하여 사람에서도 가장 빈번한 식중독의 원인이 되는 인수공통전염병으로서도 중요하다. 살모넬라 감염증은 다양한 혈청형의 균종에 의해 감염되나 지금까지 일부 축종에서 단일균종의 예방백신, 즉 가금티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나럼의 약독생균백신이나 균체사균 백신이 사용되고 있고 그 효과는 매우 제한적이어서 돼지 등 다른 가축에 대한 예방효과는 기대하기 어려운 실정이다. 또한, 항생제 등 치료약제로도 완치가 않되고 재발하는 경우가 일반적이어서 살모넬라 방제에 어려움이 많은 실정이다.
본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 국내 유행하는 살모넬라의 다양한 혈청형에 의한 살모넬라감염증을 동시에 방어할 수 있으며, 높은 항체가가 장기간 유지될 수 있는 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 국내 유행 살모넬라균 혈청그룹인 그룹 B, C 및 D에 속하는 각각의 살모넬라균주의 세포외막단백질(OMP)을 면역항원으로 함유하는 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 상기 그룹 B에 속하는 살모넬라균으로는 살모넬라 티피뮤리움을, 그룹 C에 속하는 살모넬라균주로는 살모넬라 브렌더럽을, 및 그룹 D 에 속하는 살모넬라균주로는 살모넬라 엔테라이티디스 균주가 선택되어지는 혼합백신을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 상기 살모넬라 티피뮤리움의 파지형은 피티104엘인 혼합백신을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 상기 살모넬라 엔테라이티디스의 파지형은 피티1인 혼합백신을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 상기 혼합백신 적용 대상인 동물은 돼지, 닭인 혼합백신을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
국내가축에 분포하는 살모넬라의 혈청형의 분포를 보면 대략 B그룹 46.3％, C그룹 26.6％ 및 D그룹 19.7％로서 이 3그룹이 전체의 92.6％를 차지하고 있다. 따라서, 이들 3그룹에 각각 속하는 균주를 임의로 선발하고 이들 균주로부터 세포외막단백질(Outer Membrane Protein: OMP)을 분리하여 얻은 OMP 혼합조성은 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신으로 매우 유용하다.
OMP 항원은 혈청형별로 공통되는 항원을 가지면서 살모넬라 면역에 중요하게 인식되는 세포성 면역과 체액성 면역을 동시에 활성화시키는 면역물질로 인식되고 있다. 따라서, 상기 각 그룹에 속하는 균주로부터 획득되는 OMP는 각 그룹간 공통되는 항원으로 작용하므로 이들을 혼합하여 백신으로 제작하는 경우 살모넬라 균주에 대하여 실질적으로 100％에 가까운 면역효과를 발휘할 수 있다.
상기 그룹 B에 속하는 균주로는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 더비, 살모 넬라 스크와젠그론드 등이 있으며, 바람직하게는 축종에 관계없이 감염되고 병원성이 강한 균종인 살모넬라 티피뮤리움을 사용하며, 보다 바람직하게는 파지형이 피티104엘(PT104L)을 사용하는 것이 좋다.
그룹 C에 속하는 균주로는 살모넬라 브렌더럽, 살모넬라 엠반다카, 살모넬라 뉴우포터 등이 있으며, 바람직하게는 축종에 관계없이 감염되고 병원성이 강한 균종인 살모넬라 브렌더럽을 사용하며, 보다 바람직하게는 SB2균주를 사용하는 것이 좋다.
그룹 D에 속하는 균주로는 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 풀로룸 등이 있으며, 바람직하게는 축종에 관계없이 감염되고 병원성이 강한 균종인 살모넬라 엔테라이티디스를 사용하며, 보다 바람직하게는 파지형이 피티1(PT1)을 사용하는 것이 좋다.
상기 본 발명에 사용가능한 균주들은 국립수의과학검역원에서 자유로이 분양받을 수 있다.
상기 균주들로부터 OMP를 획득하는 방법은 공지된 방법 즉, Arockiasamy 등(Analytic Biochemistry 283, 2000) 또는 Yuichi 등(Infection and Immunity 61, 1993)에 기재된 방법에 따라 수행되어질 수 있다. 각 그룹에 속하는 균주로부터 상기 방법에 따라 얻어지는 OMP는 적절한 비율로서 혼합될 수 있다. 이러한 혼합비는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 바람직하게는 각 그룹의 존재비율에 따라, 예를 들면, B그룹 OMP 20∼50％, C그룹 OMP 20∼40％ 및 D그룹 OMP 10∼40％로서 혼입될 수 있을 것이다.
이러한 OMP 혼합물질은 바람직하게는 각 OMP 물질의 불활화를 위해 포르말린 등으로 불활화시켜 제공된다. 혼합백신은 상기 불활화한 각 그룹에 속하는 균주에서 유래하는 OMP 혼합물과 약제학적으로 허용되는 각종 보조제를 함유하여 제조될 수 있다. 이러한 보조제의 예를 들면, 수산화알루미늄겔[Al(OH)3] 및 오일(ISA25, ISA70) 등이 있다.
각 그룹에 속하는 어떤 종들은 돼지, 소, 및 닭 등 축종에 관계없이 감염되는 성질을 가진 것들이 있다. 예를 들면, 그룹 B의 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라몬테비데오, 살모넬라 아고나 등과, 그룹 C에 속하는 균주로는 살모넬라 브렌더럽, 살모넬라 비쵸우, 살모넬라 뉴우포트 등과, 그룹 D에 속하는 균주로는 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 브레그담 등의 균주가 이에 해당한다.
따라서, 본 발명의 혼합백신은 특정한 가축에 한정됨이 없이 살모넬라 감염이 가능한 모든 축종에 대하여 사용이 가능하다. 축종에 접종시 접종량은 개별적인 축종 및 가축의 연령 등에 따라 상이하여 일률적으로 정하기는 어렵지만, 균종별 OMP 함량이 100∼500㎍/ml이 되도록 하여 수당 1∼2㎖ 정도 접종하는 것으로 충분하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 발명의 내용을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니며 유사한 경우에도 포괄적으로 응용되어질 수 있음을 당업자라면 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
<실시예 1> 균주들의 특성
1) 살모넬라 백신주 선발 (증식성, OMP생산성)
국내 가축에서 유행되고 있는 주요 혈청형 (B, C, D)별 분리주에 대한 파지형, 증식성, OMP 생산성을 근거로 살모넬라 티피뮤리움 (NVRQS-ST10-PT104L), 살모넬라 엔테라이티디스 (NVRQS-SE9-PT1) 및 살모넬라 브렌더럽 (NVRSQ-SB2)를 하기 표 1에서와 같이 각각 백신균주로 선발하였다.
<표 1>
균주명 파지형 증식성 (OD410nm, x2) OMP생산성 (28ml, ㎍/ml) 비고
S. typhimurium (B) ST1 PT203 1.2 83
ST2 PT195 1.2 83
ST3 PT102 1.2 320
ST4 PT193 1.3 192
ST5 PT104(?) 1.2 185
ST6 PT12L(?) 1.0 115
ST7 PT104BL 1.4 738
ST10 PT104L 1.4 412 백신주로 선발
S. enteritidis (D) SE1 PT3 1.3 223
SE2 PT33 1.1 47
SE3 PT11b 1.2 133
SE4 PT35 1.3 223
SE5 PT21 1.5 1,041
SE9 PT1 1.5 633 백신주로 선발
S. braenderup (C) SB1 1.3 299
SB2 1.3 353 백신주로 선발
SB3 1.2 198
SB4 1.2 247
SB5 1.4 265
※ 증식성: 하루배양(TSB), OD측정(410nm), OMP 생산성: 200ml BHI broth 배양, OMP 추출 및 BCA 단백질 측정 킷트에 의한 함량측정
2) 백신주의 실험동물 (마우스)에 대한 병원성 시험
선발된 백신주를 트립틱 소이 브루스(Tryptic soy broth: TSB, Difco) 또는 브레인하트인퓨전 브루스(Brain Heart Infusion: BHI, Difco)에 37℃, 24시간 배양하여 단계별로 희석한 후 마우스에 접종한 결과에서, 마우스 50％가 폐사하는 균농도, 즉 반수치사량(Lethal dose: LD50)은 살모넬라 엔테라이티디스가 4.6 x 107 cfu으로 가장 강하였고, 살모넬라 티피뮤리움이 1.6 x 108cfu를, 살모넬라 브렌더럽이 2.7 x 1010cfu의 순으로 나타났다 (표 2참조).
<표 2>
균주명 원액 (OD,410nm) 희석 배수 균수 (cfu/ml) 접종 수수 접종경과일별 폐사수 폐사율 (％)
1 2 3 4 5 6 7
ST-10 1.63(TSB) X10 1.3x1010 5 4 - 1 - - - 100
X50 2.6x109 5 - - 1 3 1 - 100
X100 1.3x109 5 - - - 4 - - 80
X200 0.7x109 5 - - 1 1 - - 40
LD50= 1.6 x 108cfu
SE-9 1.57(TSB) X5 4 x 109 5 1 - 3 1 - - 100
X10 2 x109 5 1 - 2 2 - - 100
X50 4 x 108 5 1 - 1 1 1 - 80
X100 2 x 108 5 - - - 2 1 - 60
LD50= 4.6 x 107cfu
Sb-2 2.01(BHI) 원액 5.4x1011 5 3 1 1 - - 100
X2 2.7x1011 5 2 2 - - - - 80
X5 1.9x1011 5 1 - 1 - - - 40
X10 1.1x1011 5 - - - - - - 0
LD50= 2.7 x 1010cfu
3) 백신균주별 균농도 산출식
선발된 백신균주 브레인하트인퓨전 브루스에 37℃, 24시간 배양 후 단계별로 희석하고 UV-스펙트로포토미터 (UV-spectrophotometer)에 의해 흡광도(Optical dencity: OD)를 측정하여 각각에 대한 균수 시험을 수행하였다. 그런 다음 흡광도와 균수와의 직선방정식을 산출하여 균수 측정에 이용하였다. 이에 의하면, 방정식은 각각 ST의 경우 Y=0.08X-0.184(r=0.999), SE는 Y=0.16X-0.391(r=0.98), 및 SB는 Y=0.43X-0.058(r=0.99)로 나타났다. (도 1참조)
<실시예 2> 사용된 균주들로부터 세포외막단백질의 제조
보관된 백신균주를 BHI 브루스 또는 BHI 한천배지에 37℃, 48시간 배양한 후 잡균혼입여부를 조사하고, 균배양액을 원심분리기를 이용하여 10,000rpm, 40분간 원심하여 집균하고 멸균된 인산버퍼 식염수(phosphate buffered saline: PBS)로 풀어 2회 원심세척하였다. 10mM HEPES를 가하여 균을 풀어 적당한 농도로 조절하고 초음파처리하여 균을 파쇄한 후 원심분리(7,000rpm, 40분)하여 침전물을 제거하고 상층액을 조 OMP용액으로 하였다. 상기 조 OMP 용액에 O.5％ 포르말린을 처리하여 37℃에서 72시간 방치하여 불활화하고, BCA 단백질 분석킷트(BCA Protein Assay Reagent kit, Pierce Co)를 이용하여 스탠다드 알부민(standard albumin)의 단백질 함량을 기준으로 조 OMP의 단백질 농도(㎎/㎖)를 측정하고 사용 전까지 5℃ 냉장실에 보관하면서 사용하였다.
<실시예 3> 살모넬라 OMP 혼합백신의 실험동물에서의 면역효과
살모넬라 OMP혼합백신의 면역효과를 알아보기 위하여 ST-OMP 및 ST 균체백신을 대조군으로 하여 시험하였다. 각각의 불활화 항원에 부형제(adjuvant)로서 수산화알루미늄겔 15％ 및 ISA25 3％가 되게 혼합하여 OMP 혼합백신은 OMP 함량이 ST185㎍+SE250㎍+SB164㎍/ml이 되게 하였으며, ST 단일 OMP 백신은 330㎍/ml이 되게 하였고, ST균체백신은 균함량을 2.3x1011cfu/ml이 되게 제조하여 2주간격으로 0.2ml씩 마우스는 복강에, 기니아피그(Guinea pig)는 근육에 각각 2회 접종하고 3∼5수씩 채혈하여 항체를 측정하였다. 방어효과를 알아보기 위하여 2차백신접종 10일 후 균배양액 ST 2.3x1010cfu, SE 7.5x109cfu 및 SB 1.3x1011cfu/0.2ml 농도로 복강에 접종하여 7일간 생존여부를 관찰하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
도 2 및 도 3에서와 같이 살모넬라 시험백신의 실험동물에 대한 면역효과시험에서 OMP혼합(ST+SE+SB)백신은 ST균체 및 ST-OMP백신그룹보다 높은 항체가를 나타내었으며, 2차접종 후 6주까지 계속 상승된 후 점차적으로 내려가는 양상이었으나, 8∼10주까지 비교적 높은 항체가를 유지하는 것으로 나타났다.
<표 3> 실험동물(마우스)에 대한 방어효과 시험
시험백신 A 항원농도 접종량 공격B 접종 접종수수 공격접종 경과일별 폐사수수 방어율 (％)
1 2 3 4 5 6 7
OMP혼합 (ST+SE+SB) ST185㎍+ SE250㎍+SB164㎍/ml 0.2ml ST 10 - - - - - - - 100
SE 10 - - - - - - - 100
SB 10 - - - - - - - 100
0.5ml ST 5 - - - - - - - 100
ST OMP 330㎍/ml 0.2ml ST 10 - - - - - - - 100
0.5ml 5 - - - - - - - 100
ST균체백신 2.3x1011cfu/ml 0.2ml ST 10 - - 1 - - - - 90
0.5ml 5 - - - - - - - 100
대조군 1 - - ST 10 4 4 1 - 1 - - 0
대조군 2 - - SE 10 - 1 3 1 3 2 - 0
대조군 3 - - SB 10 3 3 2 - - - - 20
A 부형제: Gel(15％)+ISA25(3％). 백신 2회접종, 1차후 2주후 2차접종, 0.2ml/수, 복강
B 공격접종: 2차백신접종 10일 후, ST 2.3x1010cfu, SE 7.5x109cfu, SB 1.3x1011cfu/수 0.2ml, 복강
표 3에서와 같이 살모넬라 OMP혼합백신은 실험동물에 대한 방어효과 시험에서 대조군의 0∼20％에 비해 이들 3종 살모넬라균에 대해 모두 100％의 방어효과를 나타내었다.
<실시예 4>
살모넬라 OMP 혼합백신의 농도에 따른 방어효과를 알아 보기 위하여 항원농도를 단계별로 희석하여 2주 간격으로 2회 접종하고 2주후, 균배양액 ST 2.3x1010cfu, SE 7.5x109cfu 및 SB 1.3x1011cfu/0.2ml 농도로 복강에 접종하여 7일간 생존여부를 관찰하여 하기 표 4에 나타내었다.
<표 4> 살모넬라 OMP 항원농도별 마우스에서의 방어효과
OMP농도 (ST+SE+SB) 접종수수 접종균주 접종수수 접종경과일별 폐사수수 방어율 (％)
1 2 3 4 5 6 7
50㎍/수 27수 ST10 10 - - - - - - - 100
SE9 9 - - - - - - - 100
SB2 8 - - - - - - - 100
25㎍/수 28수 ST10 10 - - - - - - - 100
SE9 10 - - - - - - - 100
SB2 8 1 - - - - - - 87.5
12.5㎍/수 32수 ST10 11 - - - - - - - 100
SE9 11 - - - - - - - 100
SB2 10 1 - - - - - - 90
6.25㎍/수 16수 ST10 6 - - - - - - - 100
SE9 5 - - - - - - - 100
SB2 5 2 - - - - - - 60
Control 37수 ST10 12 5 3 3 1 - - - 0
SE9 13 4 2 2 2 1 1 1 0
SB2 12 8 2 - - - - - 16.7
A 항원 2회접종: 1차, 2주후 2차접종
B 공격접종: 2차항원접종후 2주, ST 2.3x1010cfu, SE 7.5x109cfu, SB 1.3x10 11cfu/수 0.2ml, 복강접종
상기 표 4에서와 같이 실험동물(마우스)에 대한 살모넬라 항원농도별 방어효과시험에서 OMP 6.25㎍∼50㎍/수 접종시 ST 및 SE의 경우 100％의 방어효과를, SB의 경우는 60∼90％의 방어효과를 나타내었다.
본 발명에 따른 혼합백신은 국내 유행하는 살모넬라의 각 그룹별 세포외막단백질을 함유하므로 가축에서 문제시되는 다양한 혈청형에 의한 살모넬라감염증을 동시에 방어할 수 있게 한다. 특히 본 발명에서 면역력이 우수한 것으로 확인된 특정 균종의 세포외막단백질들로부터 얻어진 혼합백신은 높은 항체가가 장기간 유지되고, 실제 실험동물에 대한 방어효과에서도 거의 100％의 방어효과를 가진다.

Claims (5)

  1. 국내 유행 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 브렌더럽(Salmonella braenderup) 및 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 균주의 세포외막단백질(OMP)을 면역항원으로 함유하는 동물살모넬라 감염 예방용 혼합백신
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 파지형은 피티104엘임을 특징으로 하는 혼합백신
  4. 제 1항에 있어서, 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis)의 파지형은 피티1임을 특징으로 하는 혼합백신
  5. 제 1항에 있어서, 동물은 돼지, 닭임을 특징으로 하는 혼합백신
KR1020040025870A 2004-04-14 2004-04-14 동물 살모넬라 감염 예방용 혼합백신 KR100591660B1 (ko)

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