ES2234287T3 - Vacunas que comprenden proteinas de choque termico (hsp) inducidas por citoquinas. - Google Patents
Vacunas que comprenden proteinas de choque termico (hsp) inducidas por citoquinas.Info
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Abstract
Un procedimiento in vitro para la producción de una vacuna, caracterizado porque comprende las etapas de: a) tratamiento de células infectadas por virus, células recombinantes que expresan un antígeno heterólogo frente al que se desea una respuesta, o células cancerosas con una citoquina en cantidad suficiente para inducir la producción de proteínas de estrés relacionado con el choque térmico; b) extracción de las proteínas de choque térmico inducidas por citoquinas de las células tratadas; y c) uso de las proteínas de choque térmico extraídas en la preparación de una vacuna.
Description
Vacunas que comprenden proteínas de choque
térmico (HSP) inducidas por citoquinas.
La presente invención se refiere a una vacuna y a
un procedimiento para la producción de una vacuna.
Un componente importante de cualquier respuesta
inmune humana es la presentación de antígenos a las células T
mediante células presentadoras de antígenos (APCs) como los
macrófagos, las células B o las células dendríticas. Los fragmentos
de los antígenos extraños se presentan sobre la superficie de los
macrófagos en combinación con moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC), en asociación con moléculas
colaboradoras, como las moléculas CD4 y CD8. Tales "fragmentos
antigénicos", presentados de esta manera, son reconocidos por el
receptor celular T de las células T, y la interacción del antígeno
con el receptor celular T da como resultado la proliferación de
células T específicas de antígeno, y la secreción de linfoquinas
por las células T.
La naturaleza del fragmento antigénico presentado
por las APCs es crítica en el establecimiento de la inmunidad. Las
proteínas de choque térmico (HSPs) constituyen una familia de
proteínas altamente conservadas que están ampliamente distribuidas
en los reinos vegetal y animal. Según sus pesos moleculares, las
HSPs se agrupan en seis familias diferentes: pequeñas (hsp
20-30 kDa); hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; y hsp100.
Aunque las HSPs se identificaron originalmente en células sometidas
a estrés térmico, se ha encontrado que se asocian a muchas otras
formas de estrés como las infecciones, y por lo tanto se conocen
más comúnmente como "proteínas de estrés" (SPs).
Los miembros de la familia hsp90 de los mamíferos
incluyen la hsp90 citosólica (hsp83) y la hsp90 (hsp83) homóloga
del retículo endoplásmico, hsp87, Grp94 (Erp99) y gp97. Véase por
ejemplo, Gething y col. (1992) Nature 355:33-45.
Los miembros de la familia hsp70 incluyen las hsp70 (p73) y hsp70
(p72) citosólicas, la BIP (Grp78) homóloga del retículo
endoplásmico, y la hsp70 (Grp75) homóloga mitocondrial. Los miembros
de la familia hsp60 de los mamíferos sólo se han identificado en la
mitocondria.
Las SPs son ubicuas en las células, uno de los
papeles de las SPs es acompañar a los péptidos de un compartimento
celular a otro y presentar péptidos a las moléculas para la
presentación de superficie celular de moléculas del MHC al sistema
inmune. En el caso de células enfermas, las SPs también acompañan a
los péptidos asociados a virus o tumores a la superficie celular.
Li y Sirivastave (1994) Behring Inst. Mitt,
94:37-47 y Suzue y col. (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci, EEUU 94:13146-51. La función de las chaperonas
se lleva a cabo a través de la formación de complejos entre SPs y
proteínas y entre SPs y péptidos asociados a virus o tumores en una
reacción dependiente de ATP. Las SPs se unen a un amplio espectro
de péptidos de manera dependiente de ATP. Los péptidos unidos
parecen ser una mezcla aleatoria de péptidos. Las mezclas y las
naturalezas exactas de los péptidos no se han determinado. La
asociación de SPs con varios péptidos se ha observado en tejidos
normales también y no es un fenómeno específico de tumores. Ver
Srivastava (1994) Experimentia 50:1054-60.
Por ejemplo, se ha observado la expresión de
hsp26, hsp60, hsp70 y hsp90 en la superficie de las células de
pacientes con leucemia mieloide crónica (CML) humana, Chant y col..
(1995) Br. J. Haematol. 90:163-8. La expresión en
la superficie celular de hsp70 se ha detectado en la mucosa oral
humana normal, premaligna y maligna, Kaur y col.. (1998) Oral Oncol.
34:93-8. Una correlación de la expresión de hsp70
con rasgos clínico- patológicos mostró una asociación positiva con
la gravedad de la displasia en el epitelio de la mucosa oral.
Ito y col.. (1998) J. Oral Pathol. Med.
27:18-22, publicaron que examinaron 24 muestras de
carcinoma de células escamosas de la lengua y encontraron que,
aunque la inmunohistoquímica de las SP reveló cambios en la
expresión durante la tumorogénesis, no se observó correlación con
otros rasgos clínicos estudiados (periodo de supervivencia, estadio,
metástasis en nódulos linfáticos, grado histológico, inmunotinción
de p53).
Actualmente se cree que la antigenicidad de las
SPs es resultado no de la SP per se, sino del complejo de péptidos
asociado a la SP. Esta conclusión se basa en algunas
características de los complejos. No hay diferencias en la
estructura de las SPs derivadas de células normales y tumorales.
Ciertos complejos pierden su inmunogenicidad en tratamiento con
ATP, Udono y col.. (1993) J. Exp. Med. 178:1391-96.
Tal pérdida de inmunogenicidad se debe a la disociación del
complejo en sus componentes de SP y péptidos.
En un contexto terapéutico, se ha propuesto usar
complejos antígeno-SP como vacunas. En particular,
la patente de EEUU n° 5750119 de Srivastava desvela un
procedimiento en múltiples etapas específico del cáncer del
paciente para inhibir la proliferación de un tumor en mamíferos,
mediante (a) resecando el tumor del mamífero; (b) aislando todos
los complejos de las células tumorales y (c) administrando de nuevo
los complejos aislados al mamífero para estimular una respuesta
inmune específica del tumor. Los complejos
hsp70-péptido, hsp90-péptido y
gp96-péptido se detallan como complejos que tienen
una utilidad particular como vacunas. Sin embargo, en la práctica
del procedimiento desvelado por Srivastava, no se considera
necesario o incluso práctico aislar un péptido específico o incluso
el complejo en la estimulación de la respuesta inmune.
Los documentos WO-97/10000 y
WO-97/10001 desvelan que una mezcla de proteínas de
choque térmico (HSPs) aisladas de células cancerosas o células
infectadas con virus es capaz de estimular inmunidad protectora o
linfocitos T citotóxicos frente al tumor cognado o el antígeno
viral. Sin embargo, por el contrario, las HSPs aisladas de células
normales son incapaces de estimular tal inmunidad. Se piensa ahora
que las HSPs no son inmunogénicas per se, sino que son capaces de
estimular la inmunidad debido a su asociación con péptidos
antigénicos específicos de tumores o virus que se generan durante
el procesamiento del antígeno. De forma específica, los péptidos
asociados con las HSPs son inmunogénicos, y son presentados a las
células T. Las HSPs en ausencia de péptidos asociados pierden su
inmunogenicidad (Udono, H. y Srivastava, P. K., Journal of
Experimental Medicine, 178, página 1391 y siguientes, 1993). Hasta
este momento, la naturaleza de estos péptidos no se ha
determinado.
La inmunogenicidad de las preparaciones de HSP
depende de la presencia de células fagocitarias, como los
macrófagos y otras APCs. Ahora se piensa que las HSPs son
incorporadas por los macrófagos, y estos péptidos asociados con las
HSPs son presentados entonces por las moléculas del MHC de clase I
de los macrófagos. De esta manera, se inicia una respuesta de
células T.
El uso de proteínas HSP como componentes de las
vacunas se ha desvelado en los documentos
WO-95/24923 y WO-98/34641. Las HSPs
aisladas de células tumorales o células infectadas por virus se han
propuesto como fuente de péptidos antigénicos, que podrían entonces
presentarse a las células T. Esto necesita la producción y
purificación de las HSPs de las células. Para ayudar a la
purificación, se necesita tratar las células con choque térmico u
otro estrés, para incrementar los niveles intracelulares de SPs.
Sin embargo, en este momento no se sabe si tales SPs inducidas
formarán complejos inmunogénicos con péptidos heterólogos como
hacen las HSPs expresadas de forma constitutiva.
La estimulación de células mediante choque
térmico produce un incremento general en el nivel de proteínas de
choque térmico. De forma ideal, sería deseable estimular la
producción de sólo un subgrupo de HSPs, que son especialmente
inmunogénicas. Tal subgrupo de HSPs sería particularmente adecuado
para usar en la producción de una vacuna. Se sabe que algún otro
estrés como el estrés osmótico, el estrés oxidativo o el
tratamiento con metales pesados produce HSPs muy parecidas. Sin
embargo, en este momento, no hay manera de estimular
específicamente las células para producir un subgrupo de HSPs con
inmunogenicidad aumentada.
Por lo tanto, en primer lugar, la presente
invención proporciona un procedimiento para la producción de una
vacuna, que comprende las etapas de:
- a)
- tratamiento de las células infectadas por virus, recombinantes o cancerosas con una citoquina;
- b)
- extracción de las proteínas de choque térmico de las células tratadas; y
- c)
- uso de las proteínas de choque térmico extraídas en la preparación de una vacuna.
Sorprende que el tratamiento de células
infectadas por virus, transformadas o cancerosas con citoquinas,
particularmente interferón-\alpha, produce HSPs
que son más inmunogénicas que las HSPs derivadas de células que se
han sometido a choque térmico. El aspecto más notable de la
inmunidad estimulada por las HSPs inducidas por citoquinas es la
memoria a largo plazo comparada con la inducida por la inmunización
por otros subgrupos de HSP.
El término "vacuna" como se usa en la
presente memoria descriptiva, se refiere a cualquier composición
que estimula el sistema inmune de forma que pueda responder mejor a
posteriores infecciones. Se comprenderá que una vacuna normalmente
tiene un determinante inmunogénico y un adyuvante, que aumenta de
forma no específica la respuesta al determinante.
Preferentemente, el determinante inmunogénico
para la presente invención se transporta en combinación con un
adyuvante. Los adyuvantes adecuados están claros para los expertos
en la materia, como el adyuvante completo de Freund, el adyuvante
incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs o escualeno. Sin
embargo, se comprenderá que la vacuna de la presente invención
puede también ser efectiva sin adyuvante. Tal vacuna puede
administrarse mediante cualquier medio adecuado, como en forma oral
o mediante inyección.
El término "proteína de choque térmico",
como se usa en la presente memoria descriptiva, es estándar en la
materia, e incluye aquellas proteínas que son inducidas cuando una
célula se somete a estrés térmico, como HSP70 y GRP96. Estas
proteínas desempeñan un papel en la protección de otras proteínas
celulares de los efectos del estrés térmico. Las proteínas de
choque térmico (HSPs) también se expresan bajo condiciones
celulares normales, donde desempeñan un papel en el plegamiento
proteico. La familia de las HSPs incluye las proteínas de estrés
(SPs) y los miembros de esta familia de proteínas que se expresan
de forma constitutiva así como aquéllas inducidas por una variedad
de otros tipos de estrés que incluyen insultos medioambientales y
estrés oxidativo y osmótico. La familia de las HSPs se define
primariamente sobre homologías de secuencias de aminoácidos.
Las células eucariotas contienen varias familias
de HSPs, como la familia HSP90, la familia HSP70, la familia HSP60
y la familia GRP96 (endoplasmina). Estas familias se nombran según
el tamaño de los péptidos para los que codifican. Las familias
están altamente conservadas entre las especies. Además, muchas
bacterias también expresan homólogos de proteínas eucariotas.
Preferentemente la vacuna contiene al menos una HSP derivada del
citoplasma de células infectadas por virus, recombinantes o
cancerosas, y una que está unida a la membrana. Preferimos en
particular que las familias de proteínas HSP70, HSP90 y GRP96 se
usen como determinantes antigénicos en la presente invención,
siendo HSP70 y GRP96 las que más se prefieren. Preferentemente las
proteínas inmunogénicas tienen homologías superiores al 25% y/o son
en un 20% idénticas en el nivel de aminoácidos a las familias de
proteínas HSP inducidas térmicamente.
El término "citoquina", como se usa en la
presente memoria descriptiva, es estándar en la materia, y se
refiere a una señal química intracelular. La presente invención
requiere que la citoquina que se usa sea capaz de estimular la
presencia de HSPs en las células infectadas por virus o tumorales.
Se prefiere que la citoquina sea un interferón, especialmente
interferón-\alpha (IFN-\alpha).
Sin embargo, se comprenderá que cualquier citoquina adecuada que
sea capaz de inducir específicamente la regulación de un subgrupo
de HSPs inmunogénicas se incluye en la presente invención. Estas
citoquinas incluyen, pero no limitan, el
interferón-\beta (IFN-\beta),
factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha),
interleucinas 1 y 6 (IL1 e IL6).
El tratamiento de las células infectadas por
virus, recombinantes o cancerosas con IFN-\alpha
estimula las HSPs que son más inmunogénicas, por peso, que aquellas
HSPs derivadas de células que se han sometido a choque térmico,
produciendo títulos más altos de anticuerpos y/o frecuencias de
células T citotóxicas. Se comprenderá que estas HSPs transportan
los péptidos antigénicos derivados de las células cancerosas o los
fragmentos de los péptidos virales. Sin estar obligados por la
teoría, se piensa que el tratamiento con citoquinas funciona tanto
para inducir específicamente aquellas HSPs más capaces de
interaccionar con péptidos como para inducir aquellas HSPs que son
fagocitadas más fácilmente por las APCs, o ambas. Las citoquinas
pueden actuar también para incrementar los niveles de péptidos
virales o tumorales, que son entonces capaces de interaccionar con
las HSPs y, por lo tanto, son adecuadas para la estimulación
efectiva del sistema inmune.
En el caso del tratamiento con otras citoquinas,
la presente invención incluye cualquier procedimiento adecuado de
tratamiento con citoquinas que produce un subgrupo de HSPs que son
más inmunogénicas, por peso, que aquéllas producidas sólo por
choque térmico. La inmunogenicidad comparativa se puede determinar
mediante pruebas in vivo sobre modelos animales. Otros
procedimientos adecuados estarán claros para los expertos en la
materia, "Current Protocols in Immunology", Wiley
Interscience, 1997.
Las células derivadas de tumores, transformadas o
infectadas por virus se tratan preferentemente con la citoquina
in vitro. Las citoquinas se usan de 0,5-1000
unidades internacionales (i.u)/mL de media, preferentemente de
1-500 i.u/mL. De forma específica, para el
IFN-\alpha se prefiere que las células se traten
con 10-500 i.u/mL y se cultiven después durante
10-16 horas. De forma alternativa, las células
pueden crecer sobre monocapas de alimentación productoras de
citoquinas o inducirse para que produzcan citoquinas endógenas. Sin
embargo, se comprenderá que algunas células son más sensibles que
otras, y de este modo se puede necesitar mayor o menor cantidad de
citoquinas. Por ejemplo, el IFN-\alpha es
efectivo de 0,1-2 pg por mL de media con una línea
celular 2D9 de fibroblastos infectados por ECV pero de
1-100 pg con la línea celular Daudi de B6. Además,
el tiempo de incubación de las células con las citoquinas también
es variable. Se prefiere usar un tiempo de exposición de
6-18 horas, pero este tiempo se puede reducir a
0,5-4 horas en algunos casos y ser todavía
efectivo.
Los medios de prueba para niveles de citoquinas y
periodo de incubación óptimos están disponibles para los expertos
en la materia. Sin embargo, se comprenderá que el nivel exacto de
citoquinas no es crucial para la invención, mientras el tratamiento
estimule la producción de las HSPs inmunogénicas deseadas en las
células tratadas. De forma similar, otras condiciones del
tratamiento, como la duración de la exposición a citoquinas, la
incubación celular media y la temperatura de incubación no son
rasgos esenciales de la presente invención y pueden variarse
dependiendo de la naturaleza exacta de la población celular y de la
citoquina que se usa. Los medios para variar y optimizar estos
parámetros estarán claros para los expertos en la materia.
Preferentemente la citoquina se aísla del mismo
organismo que la célula que se va a tratar. El tratamiento de
células con citoquinas del mismo organismo proporciona una
estimulación óptima de las HSPs. Sin embargo, el uso de citoquinas
de otras especies o individuos también puede ser útil en la
regulación de los niveles de HSP en las células, para proporcionar
HSPs adecuadas para el uso en la presente invención.
Los términos células "infectadas por virus",
"recombinantes" y "tumorales" son estándar en la materia.
Las células adecuadas para el uso en la presente invención incluyen
cualquier forma de célula tumoral, células infectadas con cualquier
virus y células transformadas para expresar proteínas o péptidos
heterólogos. Tales células contienen antígenos que no están
normalmente presentes en células o líneas celulares no infectadas o
normales, o que no son presentadas normalmente al sistema inmune.
Los fragmentos de estos péptidos que interaccionan con las HSPs son
capaces de estimular la respuesta inmune del cuerpo frente a estas
células anómalas. En el caso de las líneas celulares recombinantes,
los antígenos heterólogos expresados incluyen cualquier molécula
para la que se desea una respuesta inmune, incluyendo antígenos de
protozoos, parásitos, hongos y bacterias.
Cualquier célula infectada por virus,
recombinante o tumoral adecuada se puede usar en la presente
invención, para proporcionar una fuente de HSP. En el caso de las
células tumorales, se prefiere que las células usadas para la
extracción de las HSPs sean células derivadas directamente de las
células tumorales, aunque las células transformadas son también
apropiadas. Los procedimientos para la transformación de células
extraídas de los tumores, por ejemplo, son conocidas y estándar en
la materia. Además, los medios para el aislamiento de células
tumorogénicas o infectadas por virus son conocidos, y pueden
incluir técnicas como la biopsia, cirugía, uso de células
sanguíneas o raspados celulares de la garganta o la boca. Las
células recombinantes se pueden producir mediante transfección,
infección retroviral y otros procedimientos conocidos en la
materia. Otros procedimientos para el aislamiento de células
tumorogénicas o infectadas por virus están claros para los expertos
en la materia.
Además, se prefiere que las células infectadas
por virus se obtengan mediante la infección de una línea celular
apropiada con el virus deseado in vitro. Las células
infectadas de esta forma pueden estimularse entonces para producir
HSPs antigénicas, adecuadas para la vacunación frente a ese virus.
Esto incluye virus recombinantes que transportan epítopos
antigénicos de una fuente heteróloga como las usadas para producir
vacunas recombinantes. Éstas también incluyen todos los tipos de
células recombinantes transfectadas usadas para producir vacunas
recombinantes, como las líneas celulares de mamíferos transfectadas
con vectores recombinantes mediante procedimientos estándar en la
materia como la electroporación, la fusión de liposomas y el
fosfato de calcio. Además, la invención también incluye el uso de
las HSPs de células eucariotas que responden al tratamiento de
citoquinas, incluyendo aquéllas que expresan homólogos, y líneas
celulares recombinantes que expresan antígenos heterólogos. Aunque
los antígenos son predominantemente proteínas y péptidos, pueden
incluir también fracciones de carbohidratos, ácidos nucleicos y
lípidos que unen HSPs.
Se comprenderá que las HSPs derivadas de células
tumorales, por ejemplo, sólo serán capaces en general de
proporcionar protección inmune frente al tumor específico del cual
derivan las células. Para proporcionar la mejor protección de
vacuna, sería deseable por lo tanto combinar preparaciones de HSP
derivadas de varios tumores diferentes. Esto podría proporcionar
protección inmune frente a un abanico completo de tumores, mediante
la exposición del sistema inmune a antígenos de cada tipo
diferente de célula tumoral. De forma alternativa múltiples
antígenos tumorales, como los antígenos asociados a melanoma
(MAGEs) y el antígeno prostático específico (PSA), pueden expresarse
en células recombinantes que se usan entonces para producir las HSPs
inducidas por citoquinas. Argumentos similares se aplican
igualmente a los antígenos derivados de células infectadas por
virus. En el caso de que HSPs de diferentes tumores se combinen
para formar una vacuna, se prefiere que las preparaciones de HSP
deriven de las mismas especies que el organismo que se va a
vacunar. En el caso de vacunas de HSP heterólogas de antígenos
recombinantes y antígenos virales se prefieren por igual.
Además, se comprenderá que también se abarca en
la invención una vacuna para el cáncer específica del paciente. La
vacuna se puede preparar mediante el aislamiento de células
tumorales de pacientes específicas, por ejemplo, y el tratamiento
de las células con una citoquina para estimular la producción de
HSPs. Las HSPs producidas de esta manera pueden entonces
purificarse y usarse en una vacuna, para estimular la respuesta
inmune específica del paciente frente a su propio tumor.
Se comprenderá además que diferentes tumores
pueden compartir los mismos péptidos antigénicos, en cuyo caso una
preparación de HSP derivada de una línea tumoral específica
proporcionaría protección inmune frente a otros tumores, que
también comparten el mismo fragmento peptídico antigénico. Las
células recombinantes que expresan antígenos tumorales también
pueden usarse para producir preparaciones de vacunas de HSP
efectivas.
La extracción y purificación de las proteínas HSP
de células infectadas por virus o células tumorales es estándar en
la materia. Los procedimientos adecuados incluyen la alteración de
las células tratadas mediante homogenización o sonicación, seguida
de centrifugación para obtener una preparación de HSP bruta en el
sobrenadante. Además, el fraccionamiento ConA o las columnas que
unen ADP también se pueden usar para purificar las HSPs. Otros
procedimientos adecuados para la extracción de las HSPs están
disponibles para los expertos en la materia, ver por ejemplo los
descritos en los documentos WO-97/10000 y
WO-97/10001.
Se comprenderá que la presente invención también
incluye procedimientos de producción y aislamiento de HSPs
inmunogénicas específicas de las células tumorales, las células
recombinantes o las células infectadas por virus, esencialmente
como se describe anteriormente. Las HSPs derivadas de esta manera
se pueden usar también para aislar muestras de péptidos
antigénicos, por ejemplo.
Un ejemplo específico del procedimiento de
preparación de HSP es el que sigue. Las células cancerosas o
infectadas por virus se incuban en un medio libre de suero, como
RPMI (Sigma), con una citoquina adecuada durante la noche. Las
células se lavan después en un medio libre de suero, seguido de un
lavado en salino tamponado con fosfato (PBS). Después las células
se vuelven a suspender en un tampón de homogenización. El tampón de
homogenización puede ser un tampón hipotónico, como fosfato 10 mM a
pH 7,4 con MgCl_{2} 2mM, después del cual las células se alteran
usando un homogenizador celular (por ejemplo un homogenizador
Dounce o Potter, mezcladora Ultraturrax o Waring). De forma
alternativa, el tampón de homogenización puede contener detergente,
como PBS con Tween 0,5%, estando la concentración del detergente
entre 0,1-1% y siendo adecuada para disolver la
membrana celular. La célula lisada se trata después mediante
centrifugación, normalmente 3-5000 g durante 5
minutos, para retirar el núcleo y los restos celulares, seguido de
una etapa de centrifugación a alta velocidad, normalmente 100.000 g
durante 15-30 minutos.
El sobrenadante obtenido de este modo se procesa
para proporcionar un complejo proteico adecuado para usar en una
vacuna. Esto puede hacerse simplemente mediante precipitación con
sulfato de amonio que usa una fracción del 50-70%
de sulfato de amonio. Específicamente, se añade el 50% (ponderal) de
sulfato de amonio a 4°C, el precipitado se desecha, seguido de la
adición de más sulfato de amonio para llevar la concentración al
70%. El precipitado proteico se recoge mediante centrifugación, y
después se dializa en un tampón inyectable fisiológico apropiado,
como el salino, para retirar el sulfato de amonio antes del uso. Se
comprenderá que las HSPs aisladas de esta manera no están
purificadas hasta la homogeneidad, pero sin embargo son adecuadas
para usarse como componentes de una vacuna.
Si se requiere una preparación de HSP más
purificada, las HSPs se pueden purificar del sobrenadante mediante
cromatografía de afinidad sobre matrices que llevan difosfato de
adenosina, como la agarosa-ADP o la
sefarosa-ADP. Estos procedimientos son estándar en
la materia, y se resumen en los documentos
W0-97/10000, W0- 97/10001 y
W0-97/10002.
Las HSPs se pueden usar en cualquier
concentración adecuada. Se prefiere que la cantidad del complejo
HSP70 y HSP90 que se administra esté en el intervalo de
10-600 \mug, preferentemente
10-100 \mug, con más preferencia 25 \mug. Para
los complejos HSP90 se prefiere que los niveles usados sean
50-5000 \mug, preferentemente 100 \mug.
Para determinar la inmunogenicidad de los
complejos péptido-proteicos de estrés, se pueden
usar ensayos de proliferación de células T. Los ensayos adecuados
incluyen la reacción linfocitaria mixta (MRL), ensayada mediante la
incorporación de timidina tritiada, y ensayos de citotoxicidad para
determinar la liberación de ^{51}Cr de las células diana. Ambos
ensayos son estándar en la materia (ver "Current Protocols in
Immunology", Wiley Interscience, 1997). De forma alternativa, se
puede examinar la producción de anticuerpos, usando inmunoensayos
o ensayos de lisis en placa estándar, o se pueden calcular mediante
la protección intrauterina del feto (ver "Current Protocols in
Immunology", anteriormente citado).
Células 3T3 de ratón infectadas con VSV o células
3T3 recombinantes que se expresan con la proteína VSV G se
trataron durante la noche con 5 pg/mL de
interferón-\alpha. Las HSPs se prepararon de
lisados de detergente (Triton 0,25%) mediante fraccionamiento de
los extractos celulares para producir una fracción de
50-70% de sulfato de amonio. Se vacunaron ratones y
conejos con 1-10 microgramos del extracto que
contiene proteínas de estrés en salino tamponado con fosfato y se
potenciaron con idéntica dosis de vacuna un mes después de la
primera inyección. La inducción de inmunidad frente a VSV se
ensayó usando un ELISA para detectar anticuerpos frente a la
proteína VSV G. Se obtuvieron de forma rutinaria títulos de
anticuerpos de 1:1-10000. La actividad de las
células T citotóxicas dirigida contra la proteína VSV G también
podría detectarse en los ratones inmunizados con HSP. La prueba de
estimulación de los conejos con partículas VSV fijadas en periodos
de 6, 12 y 18 meses después de la inmunización inicial dio como
resultado la producción de buenas respuestas de anticuerpos con
títulos de 1:1-10000 que indican buenas respuestas
de memoria en los animales inmunizados.
Células 3T3 de ratón que expresan proteínas E1/2
y NS3 de pestivirus ovinos se trataron durante una noche con
interferón-\alpha y las HSPs se prepararon de los
lisados de detergentes como se describe en el ejemplo 1. Las
ovejas se vacunaron con 10-50 microgramos de HSPs en
salino tamponado con fosfato y se potenciaron con idéntica dosis
de vacuna un mes después de la primera inyección. La producción de
anticuerpos frente a las proteínas E1/2 se detectó mediante la
técnica de Western- blot. La prueba de estimulación de animales con
el virus vivo (3 x 10^{6}) mostró respuestas de anticuerpos
máximas en 1-2 semanas comparadas con las
4-5 semanas en los controles y los estudios
iniciales mostraron prevención en la transmisión del virus al feto
en las ovejas preñadas. Más interesante aún, los altos títulos de
anticuerpos de >1 en 100000 parecen inhibir completamente la
replicación viral en los animales inmunizados como se ensayó
mediante la detección de los antígenos E1/2 o los antígenos del
core viral procesados del suero de los animales inmunizados.
Claims (12)
1. Un procedimiento in vitro para la
producción de una vacuna, caracterizado porque comprende las
etapas de:
- a)
- tratamiento de células infectadas por virus, células recombinantes que expresan un antígeno heterólogo frente al que se desea una respuesta, o células cancerosas con una citoquina en cantidad suficiente para inducir la producción de proteínas de estrés relacionado con el choque térmico;
- b)
- extracción de las proteínas de choque térmico inducidas por citoquinas de las células tratadas; y
- c)
- uso de las proteínas de choque térmico extraídas en la preparación de una vacuna.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque la vacuna producida contiene un
adyuvante.
3. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la citoquina se
selecciona entre un interferón, un factor de necrosis tumoral y una
interleucina.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la citoquina es interferón \alpha o \beta.
5. Un procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la citoquina es interleucina 1 ó 6.
6. Un procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la citoquina es factor de necrosis tumoral \alpha.
7. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las células que
se van a tratar con la citoquina derivan de la misma especie que el
paciente al que se le va a administrar la vacuna producida.
8. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células que se van a tratar con la citoquina se obtienen del
paciente al que se va a administrar la vacuna.
9. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
citoquina se aísla del mismo organismo que la célula que se va a
tratar.
10. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células infectadas por virus se obtienen mediante la infección de
una línea celular apropiada con el virus deseado in
vitro.
11. Una composición de vacuna para la
administración a un paciente, caracterizada porque contiene
una vacuna obtenida de acuerdo con el procedimiento de una de las
reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso de una proteína de choque térmico
inducida por citoquinas de una célula infectada por virus, una
célula recombinante que expresa un antígeno heterólogo o una célula
cancerosa en la fabricación de una vacuna para estimular una
respuesta inmune.
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