CN101072875A - 新型癌抗原肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种作为癌症治疗剂及/或预防剂有用的新型肽及其药物用途。上述肽具有在表达于脑肿瘤细胞表面的YKL－40抗原的特定区域、即aa10－19、aa49－61、aa74－83、aa96－117、aa152－161、aa177－185、aa202－211、aa246－261或aa326－354的区域内的连续氨基酸序列，并且具有免疫诱导活性。通过将上述肽给与生物体可用于治疗及/或预防癌症，另外，还可用于在生物体外刺激T细胞从而诱导对癌细胞发挥细胞毒活性的T细胞。

Description

新型癌抗原肽及其用途
技术领域
本发明涉及一种对人类癌症具有特异性的蛋白质、其部分肽及其用途。并且，本发明涉及编码该肽的多核苷酸、被上述肽刺激并诱导的活化T细胞、含有该肽与HLA分子的复合体的抗原呈递细胞、针对该肽的抗体、及含有该肽或抗体的药物。
背景技术
癌症是在全部死亡原因中占第一位的疾病，目前进行的治疗以手术治疗方法为主，组合使用放射线疗法和化学疗法。其现状为，尽管近年开发了新的手术方法或发现了新的抗癌剂，但除了部分癌症外，癌症的治疗效果仍未见提高。
近年，由于分子生物学和癌免疫学的进步，已经能够鉴定被作用于癌的细胞毒性T细胞识别的癌抗原或编码癌抗原的基因，对抗原特异性免疫疗法的期待日渐提高(参见非专利文献1)。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等人通过使用自身癌细胞株和癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法，分离了CD8阳性T细胞识别的人黑色素瘤抗原MAGE1(参见非专利文献2)。在Boon的报告后，作为CD8阳性T细胞识别的抗原，分离了酪氨酸酶(tyrosinase)(参见非专利文献3)、MART1/MelanA(参见非专利文献4)、gp100(参见非专利文献5)等。
在免疫疗法中，为了减轻副作用，人们期望作为其抗原被识别的蛋白质在正常细胞中少，在癌细胞中过量存在。还期望在抗原蛋白质中，除了能够诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的肽部分之外，所述细胞毒性T细胞直接破坏表达抗原的肿瘤，还含有能够诱导抗原特异性辅助T细胞的肽部分，所述辅助T细胞可以辅助细胞毒性T细胞的活性。
最近，提出可以将YKL-40有效地用作与人恶性脑肿瘤相关的血清中的肿瘤标记。已有报道指出该蛋白质在大部分的人恶性脑肿瘤中过量地表达，而另一方面该蛋白质几乎不在正常脑组织中表达(参见非专利文献6)。
非专利文献1：秋吉毅，《癌和化学疗法》、1997年、第24卷、p551-519
非专利文献2：Bruggen P.et al.，Science，254：1643-1647(1991)
非专利文献3：Robbins P.F.et al.，Cancer Res.，54：3124-3126(1994)
非专利文献4：Kawakami Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(9)：3515-3519(1994)
非专利文献5：Kawakami Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：6458-6462(1994)
非专利文献6：Meena K.et al.，Cancer Res.，62：4364-4368(2002)
发明内容
本发明的目的在于提供一种作为癌症的治疗及/或预防剂有用的新型肽。本发明的目的还在于提供该肽作为癌症的治疗及/或预防剂的应用和作为处理抗原呈递细胞的处理剂的应用。并且，本发明的目的还在于提供一种含有该肽和HLA分子的复合体的离体抗原呈递细胞、及选择性地结合肽和HLA分子的复合体的离体T细胞、及上述细胞在癌症治疗及/或预防剂中的应用。
本申请发明人等经潜心研究，结果发现存在于具有序列号2表示的氨基酸序列的上述YKL-40中的特定区域内的部分肽被抗原呈递细胞呈递，具有使对该肽特异性的细胞毒性T细胞活化及增殖的能力(免疫诱导活性)，因此，该肽可用于癌症的治疗及/或预防，另外，与该肽接触的抗原呈递细胞或与该抗原呈递细胞接触的T细胞也可用于癌症的治疗及/或预防，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种由序列表的序列号2所示的氨基酸序列中的7个以上连续氨基酸构成的肽，所述肽是具有序列号2的aa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261或aa326-354的区域内的连续氨基酸序列且具有免疫诱导活性的肽，或与上述任一种肽有80％以上的同一性且具有免疫诱导活性的7～30个氨基酸残基的肽，或含有上述任一种肽作为部分序列且氨基酸残基数为8～31的具有免疫诱导活性的肽。另外，本发明提供一种编码上述本发明的肽的多核苷酸。并且，本发明提供一种含有上述本发明的肽作为有效成分的药物。并且，本发明提供一种含有上述本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂。并且，本发明提供一种上述本发明的肽在制备癌症的治疗及/或预防剂中的应用。并且，本发明提供一种癌症治疗及/或预防方法，该方法给予个体有效量的上述本发明的肽。并且，本发明提供一种含有上述本发明肽的抗原呈递细胞的处理剂。并且，本发明提供一种上述本发明的肽在制备抗原呈递细胞处理剂中的应用。并且，本发明提供一种包含使上述本发明的肽和抗原呈递细胞接触的步骤的抗原呈递细胞处理方法。并且，本发明提供一种含有上述本发明的肽和HLA分子的复合体的离体抗原呈递细胞。并且，本发明提供一种包含使上述本发明的离体抗原呈递细胞与T细胞接触的步骤的T细胞活化方法。并且，本发明提供一种选择性结合上述本发明的肽与HLA分子的复合体的离体T细胞。并且，本发明提供一种含有上述本发明的离体抗原呈递细胞或上述本发明的离体T细胞作为有效成分的药物。并且，本发明提供一种含有上述本发明的离体抗原呈递细胞或上述本发明的离体T细胞作为有效成分的癌症治疗及/或预防剂。并且，本发明提供一种包含给予有效量的上述本发明的离体抗原呈递细胞或上述本发明的离体T细胞的步骤的癌症治疗及/或预防方法。并且，本发明提供一种与上述本发明的肽发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段。并且，本发明提供一种含有上述本发明的抗体或其抗原结合性片段的癌症诊断剂。并且，本发明提供一种含有上述本发明的抗体或其抗原结合性片段的癌症治疗及/或预防剂。并且，本发明提供一种癌特异性免疫诱导剂，所述免疫诱导剂为具有序列号2所示氨基酸序列的蛋白质或具有与该氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列的蛋白质，含有具有免疫诱导活性的蛋白质作为有效成分。
根据本发明，提供了对癌症的治疗及/或预防、或对用于其中的抗原呈递细胞或T细胞的诱导有用的新型肽及该肽在医学领域中的各种应用。如下述实施例中的具体内容所述，被本发明的肽活化的CD8阳性T细胞对表达YKL-40的癌细胞显示优异的细胞毒活性。所以，通过将本发明的肽给予人类，或将使用该肽在体外活化的T细胞给予人类，对癌症的治疗及/或预防有效。
附图说明
[图1]是表示肽特异性CD8阳性T细胞识别该肽与HLA-A0201的复合体生成IFN-γ的图。
[图2]是表示肽特异性CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。
[图3]是表示肽特异性CD4阳性T细胞识别该肽与HLA-DRB1*04的复合体生成IFN-γ的图。
[图4]是表示肽特异性CD4阳性T细胞作用于吞噬癌细胞裂解液的树状细胞并增殖的图。
[图5]是表示肽特异性CD8阳性T细胞识别该肽与HLA-A0201的复合体生成IFN-γ的图。
[图6]是表示肽特异性CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。
[图7]是表示肽特异性CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。
具体实施方式
如上所述，作为本发明的肽，首先可以举出一种肽(以下，有时简便地称为“免疫诱导性部分肽”)，该肽由序列表的序列号2所示氨基酸序列(YKL-40的氨基酸序列)中的7个以上连续氨基酸构成，具有序列号2的aa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261或aa326-354区域内的连续氨基酸序列，并具有免疫诱导活性。
此处，“aa”表示从氨基酸序列的N末端开始计数的第几个氨基酸残基。例如“aa10”表示从N末端开始计数的第10个氨基酸残基，“aa10-19的区域”表示由从N末端开始计数的第10个氨基酸残基到第19个氨基酸残基为止的10个氨基酸残基构成的区域。另外，“免疫诱导活性”是指使作用于表达YKL-40的癌细胞的T细胞活化及增殖的能力，具体是指按照下述实施例中详述的方法测定的、用肽刺激的T细胞的IFN-γ生成能力及/或对YKL-40表达癌细胞的细胞毒活性，与未用肽刺激的对照T细胞相比较高，并且，用肽刺激的T细胞与未用肽刺激的对照T细胞相比增殖更强。增殖可以通过目视观察、显微镜下的细胞数计测、流式细胞计量法、培养基中的3H-TdR(tritiumthymidine，氚-胸腺嘧啶核苷)在细胞内的摄入量等进行确认。此外，下述实施例中采用的IFN-γ生成能力的测定记载于例如J.Immunol.，154，p2257，1995中，另外，细胞毒活性的测定以记载于Int.J.Cancer，58：p317，1994中的称为51Cr释放法的公知方法为基准。
作为上述本发明的肽的优选例，可以举出具有序列号3至序列号19所示的氨基酸序列的肽。这些肽的序列号、氨基酸序列、序列号2中的位置如下述表1所示。需要说明的是，在本发明中，所谓“具有氨基酸序列”是指氨基酸残基按照这样的顺序排列。所以，例如“具有序列号3所示的氨基酸序列的肽”是指17个氨基酸残基大小的肽，具有Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser ArgArg的氨基酸序列。另外，例如“具有序列号3所示的氨基酸序列的肽”有时简称为“序列号3的肽”。
[表1]
  序列号  序列  位置(aa)
    3  Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg Arg  101-117
    4  Ser Ile Met Thr TyrAsp Phe His Gly Ala  202-211
    5  Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala  345-353
    6  Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile  177-185
    7  Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val  326-334
    8  Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser  49-57
    9  Ser Val Lys Ser Lys Val Gln Tyr Leu  333-341
    10  His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile  53-61
    11  Lys Leu Val Met Gly Tle Pro Thr Phe  253-261
    12  Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu  345-354
    13  Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val  246-255
    14  Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe  152-161
    15  Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe  49-58
    16  Phe Val Val Leu Val Leu Leu Gln Cys Cys  10-19
    17  Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu Asn Thr Leu  74-83
    18  Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg Arg  96-117
在上述本发明的肽中，取代、缺失及/或插入1个至数个氨基酸残基，与原来的肽具有80％以上同一性，优选具有90％以上同一性且具有免疫诱导活性的7～30个氨基酸残基的肽(以下，有时简称为“免疫诱导性修饰肽”)，也可以与上述本发明的肽相同地用于癌症的治疗及/或预防等，包括在本发明的范围之内。此处，所谓氨基酸序列的“同一性”是将下述所得的结果用百分率表示而得到的，即，将两氨基酸序列整列，使两者的氨基酸序列残基尽可能多地一致(必要时插入间隔)，用不一致的氨基酸残基数除以氨基酸残基总数(两者序列中氨基酸序列残基总数不同时以较短一方序列的氨基酸残基总数计)所得的结果，可以根据BLAST之类公知的软件容易地进行计算。此外，已知构成天然蛋白质的20种氨基酸可分成具有类似性质的如下几组，即具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly，Ile，Val，Leu，ala，Met，Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn，Gln，Thr，Ser，Tyr，Cys)、酸性氨基酸(Asp，Glu)、碱性氨基酸(Arg，Lys，His)、芳香族氨基酸(Phe，Tyr，Trp)，如果是在上述组间的取代，则肽的性质大多不发生变化。所以，取代上述本发明的免疫诱导性部分肽中的氨基酸残基时，通过在上述各组间取代，能够维持免疫诱导活性的可能性升高。
含有上述本发明的肽(免疫诱导性部分肽及免疫诱导性修饰肽)作为部分序列(即，在本发明的肽的一端或两端附加其他的肽)、氨基酸残基数为8～31的具有免疫诱导活性的肽(以下，有时简称为“免疫诱导性附加肽”)，也可以与本发明的肽相同地用于癌症的治疗及/或预防等，包括在本发明的范围之内。
上述本发明的肽可以使用市售的肽合成机，按照常法容易地进行制备。
本发明提供一种编码上述本发明的肽的多核苷酸。多核苷酸可以为DNA也可以为RNA。编码YKL-40的基因的碱基序列已公知，如序列号1所示。所以，编码本发明的免疫诱导性部分肽的多核苷酸可以具有序列号1所示的碱基序列中的编码该免疫诱导性部分肽的区域的碱基序列。或者可以使用其保存性取代碱基序列(编码的氨基酸序列相同、碱基序列不同)。需要说明的是，由于编码各氨基酸的密码子公知，所以编码特定的氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列易于鉴定。因此，编码本发明的免疫诱导性修饰肽及免疫诱导性附加肽的多核苷酸的碱基序列也易于鉴定。上述多核苷酸可以使用市售的核酸合成机，按照常法合成。
本发明也提供一种重组载体，该重组载体含有上述本发明的多核苷酸、能够在细胞内表达该多核苷酸。细胞可以为哺乳动物细胞，也可以为大肠杆菌或酵母菌之类原核或真核微生物。作为用于将基因导入哺乳动物细胞的载体，可以为质粒载体，也可以为病毒载体，上述载体本身已公知，多种载体在市场上有售，因此可以利用市售的载体。通过在市售载体的多克隆位点插入上述本发明的多核苷酸，可以得到本发明的重组载体。
将本发明的多核苷酸整合到用于将基因导入哺乳动物细胞内的载体上得到的重组载体，可以用作用于癌症的治疗及/或预防的基因疫苗。基因疫苗的给药途径优选肌肉内给药、皮下给药、静脉内给药、动脉内给药等非口服给药途径，给药量可以根据抗原的种类等适当地选择，但通常每1Kg体重给与基因疫苗的重量为0.1μg～100mg左右，优选1μg～10mg左右。
作为采用病毒载体的方法，例如可以举出将本发明的DNA整合并导入逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺伴随病毒(adeno-associated virus)、疱疹病毒(herpesvirus)、痘苗病毒(vacciniavirus)、痘病毒(Poxvirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)等RNA病毒或DNA病毒的方法。其中特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒等的方法。
作为其他方法，可以举出直接肌肉内给与表达质粒的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质转染法(Lipofectin)、微量注射法、磷酸钙法、电蚀孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。
为了使编码本发明的肽的基因实际作为药物发挥作用，有将基因直接导入体内的体内(in vivo)方法、及从人体中采取某种细胞在体外将基因导入该细胞再将此细胞放回体内的体外方法(日经科学，1994年4月，p20-45，月刊药事、1994年、第36卷、第1号，p.23-48，实验医学增刊，1994年，第12卷，第15号，及上述的引用文献等)。
较优选体内方法。
通过体内方法给药时，可以通过与治疗目的疾病、症状等相应的适当给药途径给药。例如，可以在静脉、动脉、皮下、肌肉内等给药。通过体内方法给药时，例如可以采用液体制剂等制剂形态，一般采用含有本发明DNA为有效成分的注射剂等，根据需要，也可以加入常用的载体。另外，在含有本发明的DNA的脂质体或膜融合脂质体(日本血凝病毒(HVJ)-脂质体等)中，可以为悬浊剂、冻结剂、离心分离浓缩冻结剂等脂质体制剂形态。
另一方面，大肠杆菌或酵母菌等微生物用的载体也众所周知，多种载体在市场上有售。将本发明的多核苷酸整合到微生物用载体中得到的重组载体，可用于以基因工程学的方式大量生产本发明的肽。可以通过众所周知的方法将重组载体整合到微生物中。
具体如下述实施例所述，本发明的肽显示免疫诱导活性。即，用本发明的肽刺激的T细胞对表达YKL-40的癌细胞显示细胞毒活性，并增殖。所以，通过将本发明的肽给与生物体，能够进行癌症的治疗及/或预防。即，本发明提供了含有上述本发明的肽作为有效成分的药物及含有上述本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂。
作为本发明的癌症治疗及/或预防剂的治疗对象的癌症，可以举出表达YKL-40的癌症，可以举出脑肿瘤、头、颈、肺、子宫或食道的扁平上皮癌、黑色素瘤、肺或子宫的腺癌、肾癌等。另外，给药对象为哺乳动物，特别优选人。
含有本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂的给药途径，可以口服给药也可以非口服给药，优选肌肉内给药、皮下给药、静脉内给药、动脉内给药等非口服给药。另外，给药量只要为对癌症的治疗及/或预防有效的剂量即可，可以根据症状、使用目的等适当地选择，通常为0.0001mg～1000mg、优选为0.001mg～1000mg，优选数日至数月内给药1次。
含有本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂，可以使用与各给药方案相适应的药理学上允许的载体及/或稀释剂制成制剂。制剂方法及其所用的各载体在药物制剂领域中众所周知。药理学上允许的载体及/或稀释剂，例如可以为生理缓冲液之类缓冲液、或赋形剂(砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等)，也可以适当地混合使用粘合剂(糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶等)、润滑剂(硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石粉、二氧化硅等)等。作为给药方案，可以举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服制剂，吸入剂、注射剂、栓剂、液剂等非口服制剂等。上述制剂可以根据一般公知的制备方法制备。
含有上述本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂，可以为疫苗的形态，此时优选除有效成分外还含有佐剂。佐剂提供抗原的贮存处(细胞外或巨噬细胞内)，通过活化巨噬细胞且刺激特定组的淋巴细胞，能够强化免疫学应答。多种佐剂在该领域内已众所周知。作为具体例，可以举出MPL(SmithKline Beecham)、沙门氏菌属的Salmonella minnesota Re 595脂多糖类(lipopolysaccharide)的精制及酸水解后所得的同类物；从QS21(SmithKline Beecham)、Quilljasaponaria萃取物中精制得到的纯QA-21皂苷；PCT申请WO96/33739(SmithKline Beecham)中记载的DQS21；QS-7、QS-17、QS-18及QS-L1(So、其他10人、“分子和细胞(Molecules and cells)”、1997年、第7卷、p.178-186)；弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′sadjuvant)；弗氏完全佐剂；维生素E；MONTANIDE；明矾；CpG寡核苷酸(例如参见Kreig，其他7人，“自然(Nature)”，第374卷，p.546-549)；及由鲨烯(Squalene)及/或生育酚(tocopherol)之类生物分解性油配制的各种油包水乳剂。优选将肽与DQS21/MPL组合物混合给药。DQS21与MPL之比代表性约为1∶10～10∶1，优选约为1∶5～5∶1，更优选约为1∶1。典型的情况是，在对人给药时，DQS21及MPL在疫苗处方物中的存在量在约1μg～约100μg的范围内。其他佐剂在该领域内已知，可以用于本发明(例如参见Goding著，“MonoclonalAntibodies：Principles and Practice”，第2版、1986年)。肽及佐剂的混合物或乳剂的配制方法，对于预防接种的本领域技术人员来说已众所周知。
也可以对对象给予刺激对象发生免疫应答的其他因子。例如其他细胞因子作为淋巴细胞刺激特性的结果在预防接种方案中也有用。用于上述目的的多种有用的细胞因子已经被本领域技术人员所熟知，作为其例子，可以举出具有强化疫苗的预防作用的白细胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、IL-18及Flt3配体。给药时，本发明的治疗用组合物可以制成制药上允许的配制物进行给药。上述的配制物可以常规地含有制药上允许浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相溶性载体、辅助免疫增强剂，例如佐剂及细胞因子及任意的其他疗法的作用物质。
具体如下述实施例所述，通过在体外使抗原呈递细胞与本发明的肽接触，能够使抗原呈递细胞呈递本发明的肽。即，本发明也提供一种含有上述本发明的肽的抗原呈递细胞处理剂。此处，作为抗原呈递细胞，可以优选使用含有HLA I类或HLA II类分子的树状细胞或B细胞。多种HLA I类分子或HLA II类分子已经被鉴定并周知。作为HLAI类分子，可以举出HLA-A、HLA-B、HLA-C。更具体而言可以举出HLA-Al，HLA-A0201，HLA-A0204，HLA-A0205，HLA-A0206，HLA-A0207，HLA-A11，HLA-A24，HLA-A31，HLA-A6801，HLA-B7，HLA-B8，HLA-B2705，HLA-B37，HLA-Cw0401，HLA-Cw0602等。作为HLA II类分子，可以举出HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。
含有HLA I类或HLA II类分子的树状细胞或B细胞可以通过公知方法由末梢血调制。例如，用颗粒细胞巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)由骨髓、脐带血或患者末梢血诱导树状细胞，通过在此培养系中加入肿瘤相关肽，可以诱导肿瘤特异性树状细胞。通过给与有效量的此树状细胞，能够诱导癌症治疗所期望的应答。所用细胞可以使用由健康人提供的骨髓或脐带血、患者本人的骨髓或末梢血等，使用患者本来的自身细胞时，安全性高，可以避免严重的副作用。末梢血或骨髓可以为新鲜试样、低温保存试样及冻结保存试样中的任意一种。末梢血可以培养全血，也可以只分离白细胞成分进行培养，后者效率高而优选。并且白细胞成分中也可以分离单核细胞。另外，来自骨髓或脐带血时，可以培养构成骨髓的全体细胞，也可以从其中分离单核细胞进行培养。在末梢血或其白细胞成分、骨髓细胞中，含有作为树状细胞来源的单核细胞、造血干细胞或未成熟树状细胞或CD4阳性细胞等。所用细胞因子只要是确认了安全性和生理活性的特性的因子即可，可以为天然型或者基因重组型等，对其生产方法没有限制，优选以必要最低量使用确保用于医疗的质量的标准品。添加的细胞因子的浓度只要是能够诱导树状细胞的浓度即可，没有特殊的限制，通常以细胞因子的总浓度计优选为10～1000ng/mL左右，更优选为20～500ng/mL左右。可以使用常用于白细胞培养的公知培养基进行培养。培养温度只要白细胞能够增殖即可，没有特殊的限制，但最优选为人的体温，即37℃左右。另外，培养中的气体环境只要白细胞能够增殖即可，没有特殊的限制，但优选通气5％CO2。并且培养时间只要是能够诱导必要数量的细胞的时间即可，没有特殊的限制，通常为3天～8周。用于细胞的分离或培养的机械可以使用适当的机械，优选已确认医疗用安全性且操作稳定简便的机械。特别指出的是，对于细胞培养装置，并不局限于皿、烧瓶、瓶等一般的容器，也可以使用层叠型容器或多级式容器、滚瓶(roller bottle)、旋转式瓶、袋式培养器、中空类柱等。
在体外使本发明的肽和抗原呈递细胞接触的方法自身可以通过公知的方法进行，也具体记载于下述实施例中。即，可以通过在含有本发明的肽的培养液中培养抗原呈递细胞使二者接触。培养基中的肽浓度没有特殊的限制，通常为1μg/ml至100μg/ml左右，优选为5μg/ml至20μg/ml左右。培养时的细胞密度没有特殊的限定，通常为103细胞/ml至107细胞/ml左右，优选5×104细胞/ml至5×106细胞/ml左右。培养优选按照通常方法在37℃、5％CO2氛围中进行。
通过在与上述肽共存的条件下培养抗原呈递细胞，肽被抗原呈递细胞的HLA分子摄取，呈递在抗原呈递细胞的表面。本发明也提供上述含有本发明的肽和HLA分子的复合体的离体抗原呈递细胞。上述抗原呈递细胞在生物体内或体外，对T细胞呈递该肽，可以诱导对该肽特异性的细胞毒性T细胞，并使其增殖。
通过使如上所述配制的含有本发明的肽和HLA分子的复合体的抗原呈递细胞在体外与T细胞接触，能够诱导对该肽特异性的细胞毒性T细胞并使其增殖。此工序可以通过在液体培养基中共存培养上述抗原呈递细胞和T细胞而进行。例如可以如下进行：将抗原呈递细胞悬浊在液体培养基中，装入微孔板的孔等容器中，向其中添加T细胞进行培养。共存培养时的抗原呈递细胞和T细胞的混合比率没有特殊的限制，通常以细胞数比率计为1∶1～1∶100左右，优选1∶5～1∶20左右。另外，悬浊于液体培养基中的抗原呈递细胞的密度没有特殊的限定，通常为100～1000万细胞/ml左右，优选10000～100万细胞/ml左右。共存培养优选根据常法在37℃、5％CO2氛围中进行。培养时间没有特殊的限定，通常为2天～3周，优选4天～2周。另外，共存培养优选在存在1种或多种IL-2、IL-6、IL-7及IL-12之类白细胞介素的条件下进行。此时，IL-2及IL-7的浓度通常为5U/ml至20U/ml左右，IL-6的浓度通常为500U/ml至2000U/ml左右，IL-12的浓度通常为5ng/ml至20ng/ml左右，但并不限定于此。上述共存培养也可以追加新鲜的抗原呈递细胞反复操作1至数次。例如，可以将弃去共存培养后的培养上清液、加入新鲜的抗原呈递细胞的悬浊液再进行共存培养的操作进行1次或反复数次。各共存培养的条件可以与上述相同。需要说明的是，在本说明书中，如上所述，有时将为了在抗原呈递细胞表面呈递本发明的肽而将肽加入到抗原呈递细胞的培养液中称为“用肽脉冲细胞”。另外，有时将使呈递本发明的肽的抗原呈递细胞与T细胞接触称为“用肽刺激T细胞”。
通过上述共存培养，对该肽特异性的细胞毒性T细胞被诱导、增殖。本发明还提供上述选择性地结合本发明的肽和HLA分子的复合体的离体T细胞。
呈递上述本发明的肽的上述抗原呈递细胞在生物体内也能够诱导对该肽特异性的细胞毒性T细胞，并使其增殖，因此可以通过将其给与生物体来进行癌症的治疗及/或预防。另外，选择性结合本发明的肽和HLA分子的复合体的T细胞由于对表达YKL-40的癌细胞显示细胞毒活性，所以通过将该T细胞给与生物体也能够进行癌症的治疗及/或预防。所以，本发明还提供含有上述本发明的抗原呈递细胞作为有效成分的药物、及癌症的治疗及/或预防剂、及含有上述本发明的T细胞作为有效成分的药物、及癌症的治疗及/或预防剂。作为治疗对象的癌症的例子，当然可以举出作为含有本发明的肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂的治疗对象的上述癌症。
对于给与生物体的抗原呈递细胞或T细胞，为了避免将上述细胞作为异物进行攻击的生物体内的免疫应答，优选如上所述地使用本发明的肽调制从接受治疗的患者处采集的抗原呈递细胞或T细胞。
含有抗原呈递细胞或T细胞作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂的给药途径，优选静脉内给药或动脉内给药之类非口服给药。另外，给药量可以根据症状或给药目的等适当地选择，通常为1个～10兆个，优选100万个～10亿个，优选数日～数月给药1次。制剂可以为例如将细胞悬浊于生理缓冲食盐水中制成的制剂等，也可以与其他抗癌剂或细胞因子等并用。另外，也可以添加在制剂领域公知的1种或2种以上添加剂。
本发明还提供以上述本发明的肽为对应抗原的抗体及其抗原结合性片段。此处，所谓抗原结合性片段是指抗体分子中含有的Fab段或F(ab’)2段之类具有与抗原结合的能力的抗体段。抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，但为了进行免疫测定等，优选再现性高的单克隆抗体。以肽为免疫原的多克隆抗体及单克隆抗体的调制方法已公知，可以根据常法容易地进行。例如，使匙孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)或酪蛋白等载体蛋白质结合肽，将所得结合体作为免疫原，通过与佐剂共用对动物进行免疫，能够诱生抗该肽的抗体。使从免疫动物中采集的脾细胞或淋巴细胞之类抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合，调制杂交瘤，选择可产生与本发明的肽结合的抗体的杂交瘤，使其增殖，可以从培养上清液中获得以本发明的肽为对应抗原的单克隆抗体。需要说明的是，上述方法为公知的常法。
本发明的抗体或其抗原结合性片段可以用作对表达YKL-40的细胞或呈递本发明的肽的抗原呈递细胞进行检测或定量的免疫测定用试剂。免疫测定本身在本领域内是公知的，按照反应样式进行分类，有夹层法、竞争法、凝集法、蛋白质印迹法(Western Blot)等，流式细胞计量法也被认为是免疫测定的一种。另外，按照标记进行分类，有放射免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定、生物素免疫测定等，本发明的抗体或其抗原结合性片段可用于上述任意一种测定中。用于检测或定量表达YKL-40的细胞时，本发明的抗体或其抗原结合性片段作为癌症诊断剂发挥功能。作为癌症诊断剂使用时，优选操作简便不需大规模装置等的夹层ELISA或凝集法。此外，上述本发明的肽也可以用作通过竞争法检测或测定表达该肽的细胞时的免疫测定用试剂。
此外，在下述实施例中，明确了被本发明的肽刺激的T细胞对表达YKL-40的癌细胞显示细胞毒活性，因此可以将YKL-40作为癌特异性免疫诱导剂给与生物体。即，本发明也提供一种癌特异性免疫诱导剂，所述诱导剂含有具有免疫诱导活性的蛋白质作为有效成分，所述蛋白质为具有序列号2所示氨基酸序列的蛋白质或具有与该氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列的蛋白质。此时，对生物体的给药途径、给药量、制剂等可以与含有上述肽作为有效成分的癌症的治疗及/或预防剂的给药途径、给药量、制剂等相同。
以下，根据实施例更加具体地说明本发明。
实施例
实施例1：诱导来自YKL-40的肽表位反应性CD8阳性T细胞
(1)从基因数据库(GenBank)中获得人YKL-40蛋白质的氨基酸序列的信息。为了预测HLA-A0201结合基元，通过使用公知的BIMAS软件(可利用http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)的计算机预测程序，解析人YKL-40蛋白质的氨基酸序列，选择推测能够与HLA I类分子结合的肽。
(2)分离来自HLA-A0201阳性的健康人的末梢血，叠层在淋巴细胞分离液(Organonp Teknika，Durham，NC)上，以1,500rpm在室温下离心20分钟。回收含有PBMC的部分，在冷磷酸盐缓冲液中清洗3次(或3次以上)，得到末梢血单核细胞(PBMC)。将所得PBMC悬浊在20ml的AIM-V培养基中(Life Technololgies，Inc.，Grand Island，NY)，使其于培养瓶(Falcon)中在37℃、5％CO2的条件下粘着2小时。非粘着细胞用于调制T细胞，粘着细胞用于调制树状细胞。
另一方面，在AIM-V培养基中于IL-4(1000U/ml)及GM-CSF(1000U/ml)存在下，培养粘着细胞。6天后，换成加有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)、IL-1β(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)及TNF-α(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基，再培养2天后，将所得的非粘着细胞集团用作树状细胞。
(3)在AIM-V培养基中以1×106细胞/ml的细胞密度悬浊调制所得的树状细胞，以10μg/ml的浓度添加选择的肽，使用96孔板，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，照射X射线(3000rad)，用AIM-V培养基清洗，悬浊在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)、IL-6(1000U/ml)及IL-12(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中，在24孔板的每孔中分别加入1×105细胞。再按1×106细胞于每孔中分别加入调制的T细胞集团，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。7天后，分别弃去培养上清液，与上述相同地用所得各肽处理后进行X射线照射，将得到的树状细胞悬浊在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)、IL-7(10U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)及IL-2(10U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中(细胞密度：1×105细胞/ml)，向24孔板的每孔中分别加入1×105细胞，再进行培养。每隔7天将相同的操作重复4～6次后，回收被刺激的T细胞，通过流式细胞计量法确认CD8阳性T细胞的诱导。
实施例2
确定刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞的来自YKL-40的细胞毒性T细胞抗原表位
(1)通过显微镜下的细胞数计测确认上述诱导的各孔的T细胞之中，被作为本发明的肽的具有序列号3所示氨基酸序列的肽刺激的T细胞增殖。为了调查本T细胞对序列号3的肽的特异性，在5×104个用肽脉冲的、表达HLA-A0201分子的T2细胞(文献及购入地：Salter RDet al.，Immunogenetics，21：235-246(1985)、从ATCC购入)(以10μg/ml的浓度在AIM-V培养基中加入各肽，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时)中，加入5×103个T细胞，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中用96孔板培养24小时。取出培养后的上清液，通过ELISA法测定IFN-γ的生成量。结果确认与使用未用肽脉冲的T2细胞的孔的培养上清液相比，使用用序列号3的肽脉冲的T2细胞的孔的培养上清液中，IFN-γ的生成显著(图1)。所以，可判定序列号3的肽是特异性地增殖刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞且具有诱导IFN-γ生成的能力的T细胞表位肽。同样地，鉴定序列号4至序列号17中记载的14种肽，判定其特异性地增殖刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞，具有诱导IFN-γ生成的能力(图5)。
需要说明的是，图1中纵轴的参照序号1表示具有序列号3所示的氨基酸序列的肽的结果。参照序号2表示肽LQCCSAYKL(序列号19)的结果(比较例1)，所述肽是来自YKL-40的肽的一种，但不在本发明的范围内。参照序号3表示未添加肽而进行上述处理时的结果(比较例2)。另外，图5中，横轴的参照序号12至25分别表示具有序列号4至序列号17所示氨基酸序列的肽的结果。进而，横轴的参照序号26表示序列号19的肽的结果(比较例3)，所述序列号19的肽是来自YKL-40的肽的一种，但不在本发明的范围内，横轴的参照序号27表示未添加肽而进行上述处理时的结果(比较例4)。
(2)接下来，探讨了作为本发明的肽之一的序列号3的肽是否是HLA-A0201阳性且被呈递在表达YKL-40的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上的肽，还探讨了被该肽刺激的CD8阳性T细胞是否为HLA-A0201阳性且破坏表达YKL-40的肿瘤细胞。用50ml容量的离心管收集105个确认YKL-40表达的恶性脑肿瘤细胞株、T98G(文献及购入地：Stein GH et al.，J.Cell Physiol.，99：43-54(1979)，从ATCC购入)，加入100mCi的铬51，在37℃下孵育2小时。之后，用含有10％人AB血清的AIM-V培养基清洗3次，在96孔V底板的每孔中添加103个细胞，进而再分别加入悬浊在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中的105、5×104、2.5×104及1.25×104个被序列号3的肽刺激的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，通过测定从被破坏的肿瘤细胞中释放到培养上清液中的铬51的量，计算被序列号3的肽刺激的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。结果表明被该肽刺激的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞对T98G具有细胞毒活性(图2)。所以，可明确作为本发明的肽之一的序列号3的肽是HLA-A0201阳性且被呈递到表达YKL-40的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上的肽，并且，该肽具有诱导能够破坏上述肿瘤细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞的能力。与其相同，分别用序列号4至序列号17所示的14种肽刺激的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞，对T98G显示细胞毒活性(图6)。并且，分别用序列号3至序列号17所示的15种肽刺激的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞，对确认YKL-40表达的其他恶性脑肿瘤细胞株、U87 MG(Beckman Get al.，Hum.Hered.，21：238-241(1971)，从ATCC购入)显示细胞毒活性(图7)。
此外，细胞毒活性的结果如下：如上所述，将105个被本发明的各肽刺激诱导的CD8阳性T细胞和摄取铬51的103个恶性脑肿瘤细胞株T98G或U87 MG混合，培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，根据以下计算式*算出CD8阳性T细胞对T98G或U87 MG的细胞毒活性。*式：细胞毒活性(％)＝加入CD8阳性T细胞时从T98G或U87 MG中的铬51游离量÷从加入1N盐酸的目标细胞中的铬51游离量×100
需要说明的是，图6中，横轴的参照序号28～41分别表示序列号4至序列号17的肽的结果。并且，横轴的参照序号42表示序列号19的肽的结果(比较例5)，所述肽是来自YKL-40的肽的一种，但不在本发明的范围内，横轴的参照序号43表示未添加肽而进行上述处理时的结果(比较例6)。另外，图7中，横轴的参照序号44～58分别表示序列号3至序列号17的肽的结果。并且，横轴的参照序号59表示序列号19的肽的结果(比较例7)，所述序列号19的肽是来自YKL-40的肽的一种，但不在本发明的范围内，横轴的参照序号60表示未添加肽而进行上述处理时的结果(比较例8)。
实施例3
诱导来自YKL-40的肽表位反应性CD4阳性T细胞
(1)为了预测CD4阳性T细胞抗原表位，使用3个计算机预测程序解析人YKL-40蛋白质的氨基酸序列，选择预测为HLA II类结合肽的肽。上述3个计算机预测程序为SYFPEITHI运算法则(Rammensee著，其他4人，“免疫遗传学(Immunogenetics)”、1999年、第50卷、p.213-219)、ProPred运算法则(Singh，其他1人、“生物信息学(Bioinformatics)”、2001年、第17卷、p.1236-1237)、及RANKPEP运算法则(Reche，其他2人，“人体·免疫学(Human immunology)”)。
(2)分离来自HLA-DRB1*04阳性的健康人的末梢血，叠层在淋巴细胞分离液(Organonp Teknika，Durham，NC)上，以1,500rpm在室温下离心20分钟。回收含有PBMC的部分，在冷磷酸盐缓冲液中清洗3次(或3次以上)，得到末梢血单核细胞(PBMC)。将所得PBMC悬浊在20ml的AIM-V培养基(Life Technololgies，Inc.，Grand Island，NY)中，于培养瓶(Falcon)中在37℃、5％CO2的条件下使其粘着2小时。非粘着细胞用于调制T细胞，粘着细胞用于调制树状细胞。
另一方面，在AIM-V培养基中于IL-4(1000U/ml)及GM-CSF(1000U/ml)存在下，培养粘着细胞。6天后，换成加有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)、IL-1β(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)及TNF-α(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基，再培养2天后，将所得非粘着细胞集团用作树状细胞。
(3)将调制所得的树状细胞以1×106细胞/ml的细胞密度悬浊在AIM-V培养基中，以10mg/ml的浓度添加选择的肽，使用96孔板，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，照射X射线(3000rad)，用AIM-V培养基清洗，悬浊在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)、IL-6(1000U/ml)及IL-12(10ng/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中，在24孔板的每孔中分别加入1×105细胞。再按1×106细胞于每孔中分别加入调制的T细胞集团，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。7天后，分别弃去培养上清液，将树状细胞用与上述相同地得到的各肽处理后进行X射线照射，将照射后的树状细胞悬浊在含有10％人AB血清(Nabi，Miami，FL)及IL-2(10U/ml、Genzyme，Cambridge，MA)的AIM-V培养基中，向24孔板的每孔中分别加入1×105细胞，再进行培养。每隔7天将相同的操作重复4～6次后，回收刺激的T细胞，通过流式细胞计量法确认CD4阳性T细胞的诱导。
实施例4
确定刺激HLA-DRB1*04阳性CD4阳性T细胞的来自YKL-40的辅助T细胞抗原表位
(1)确认上述诱导的各孔的T细胞之中，被作为本发明的肽的序列号18的肽刺激的T细胞增殖。为了调查本CD4阳性T细胞对序列号18的肽的特异性，在5×104个用各肽脉冲的且表达HLA-DRB1*04分子的T2DR4细胞(以10μg/ml的浓度在AIM-V培养基中加入各肽，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时)中，加入5×103个CD4阳性T细胞，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中用96孔板培养24小时。取出培养后的上清液，通过ELISA法测定IFN-γ的生成量。结果确认使用用序列号18的肽脉冲的T2DR4细胞的孔的培养上清液中，生成1000pg/ml以上的IFN-γ(图3)。另一方面，使用其他肽及未用肽脉冲的T2DR4细胞的孔的培养上清液中，几乎未确认IFN-γ生成(图3)。所以，可判定序列号18的肽可特异性地增殖刺激HLA-DRB1*04阳性CD4阳性T细胞，是具有诱导IFN-γ生成的能力的T细胞表位肽。
需要说明的是，图3中纵轴的参照序号4表示序列号18的本发明的肽的结果。并且，纵轴的参照序号5表示序列号19的肽的结果(比较例7)，所述序列号19的肽是来自YKL-40的肽的一种，但不在本发明的范围内。纵轴的参照序号6表示未添加肽而进行上述处理时的结果(比较例8)。
(2)接下来，探讨具有增殖刺激HLA-DRB1*04阳性T细胞的能力的该肽是否是YKL-40蛋白质在抗原呈递细胞中正常运作而呈递在HLA-DR上的表位。在未成熟树状细胞中添加已确认YKL-40表达的恶性脑肿瘤细胞株、T98G的裂解液，使其消化，使树状细胞成熟后，调查被该肽刺激的T细胞是否能够被本树状细胞刺激。使用液氮及热水浴将1.5×106个T98G细胞颗粒反复冻结融解7次，制作细胞裂解液。另一方面，分离来自HLA-DRB1*04阳性的健康人的末梢血，叠层在淋巴细胞分离液上，以1500rpm在室温下离心20分钟。回收含有PBMC的界面，在冷磷酸盐缓冲液中清洗3次(或3次以上)得到PBMC。将所得PBMC悬浊在20ml的AIM-V培养基中，使其在培养瓶(Falcon)中于37℃、5％CO2的条件下粘着2小时，在AIM-V培养基中于IL-4(1000U/ml)及GM-CSF(1000U/ml)存在下，将粘着细胞培养6天，制作未成熟树状细胞。在5×105个未成熟树状细胞中加入制作的各细胞裂解液，在加有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml)、IL-1β(10ng/ml)及TNF-α(10ng/ml)的AIM-V培养基中培养2天。同时，分别制作下述试样，即在未成熟树状细胞中加入序列号18的肽得到的试样，及在未成熟树状细胞中加入PBMC的细胞裂解液(由1.5×106个细胞颗粒制成)得到的试样，在加有IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6(1000U/ml)、IL-1β(10ng/ml)及TNF-α(10ng/ml)的AIM-V培养基中，于37℃、5％CO2的条件下培养2天。用X射线照射(3000rad)培养后的各树状细胞，用AIM-V培养基清洗后，悬浊在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中，在96孔板的每孔中分别加入3.3×104个细胞。再于每孔中加入5×104个被YKL肽刺激的T细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养72小时。需要说明的是，从开始培养到48小时后在各培养液中加入1mCi的3H-TdR。培养后用细胞收集器回收细胞到玻璃滤纸上，用液体闪烁计数器(Liquid Scintillation Counter)测定3H-TdR摄取量。结果如图4所示，确认被序列号18的肽刺激的T细胞通过添加T98G细胞裂解液的树状细胞的刺激而增殖。进而确认由于上述反应因添加抗HLA-DR中和抗体而被抑制，所以序列号18的本发明的肽是YKL-40蛋白质在抗原呈递细胞内正常运作而呈递在HLA-DR上的表位。
需要说明的是，图4中，纵轴的参照序号7表示下述结果：将用序列号18的本发明的肽脉冲的HLA-DRB1*04阳性的树状细胞经X射线照射后的细胞与被该肽刺激诱导的HLA-DRB1*04阳性的CD4阳性T细胞混合，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中培养48小时后，加入3H-TdR，再培养24小时后CD4阳性T细胞中3H-TdR的摄取量。参照序号8表示下述结果：使HLA-DRB1*04阳性的树状细胞摄取恶性脑肿瘤细胞株T98G的裂解液，经X射线照射后，与被序列号18的本发明的肽刺激诱导的HLA-DRB1*04阳性的CD4阳性T细胞混合，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中培养48小时后，加入3H-TdR，再培养24小时后CD4阳性T细胞中3H-TdR的摄取量。参照序号9表示下述结果：使HLA-DRB1*04阳性的树状细胞摄取恶性脑肿瘤细胞株T98G的裂解液，经X射线照射后，与被序列号18的本发明的肽刺激诱导的HLA-DRB1*04阳性的CD4阳性T细胞混合，在含有10％人AB血清和抗HLA-DR抗体的AIM-V培养基中培养48小时后，加入3H-TdR，再培养24小时后CD4阳性T细胞中3H-TdR的摄取量。参照序号10表示下述结果：使HLA-DRB1*04阳性的树状细胞摄取从HLA-DRB1*04阳性的健康人中分离的末梢血单核细胞的裂解液，经X射线照射后，与被序列号18的本发明的肽刺激诱导的HLA-DRB1*04阳性的CD4阳性T细胞混合，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中培养48小时后，加入3H-TdR，再培养24小时后CD4阳性T细胞中3H-TdR的摄取量。参照序号11表示下述结果：将用X射线照射后的HLA-DRB1*04阳性的树状细胞和被序列号18的本发明的肽刺激诱导的HLA-DRB1*04阳性的CD4阳性T细胞混合，在含有10％人AB血清的AIM-V培养基中培养48小时后，加入3H-TdR，再培养24小时后CD4阳性T细胞中3H-TdR的摄取量。
产业上的可利用性
本发明的肽作为癌症的治疗及/或预防剂的有效成分有用，另外，可用于诱导能够用作癌症的治疗及/或预防剂的抗原呈递细胞或T细胞。
序列表
<110>东丽株式会社.
<120>新型癌抗原肽及其用途
<130>05PF0311-PCT
<160>19
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1149
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1149)
<223>
<400>1
atg ggt gtg aag gcg tct caa aca ggc ttt gtg gtc ctg gtg ctg ctc       48
Met Gly Val Lys Ala Ser Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu
1               5                   10                  15
cag tgc tgc tct gca tac aaa ctg gtc tgc tac tac acc agc tgg tcc       96
Gln Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser
            20                  25                  30
cag tac cgg gaa ggc gat ggg agc tgc ttc cca gat gcc ctt gac cgc      144
Gln Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg
        35                  40                  45
ttc ctg tgt acc cac atc atc tac agc ttt gcc aat ata agc aac gat      192
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp
    50                  55                  60
cac atc gac acc tgg gag tgg aat gat gtg acg ctc tac ggc atg ctc      240
His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu
65                  70                  75                  80
aac aca ctc aac aac acg aac ccc aac ctg aag act ctc ttg tct gtc      288
Asn Thr Leu Asn Asn Thr Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val
                85                  90                  95
gga gga tgg aac ttt ggg tct caa aga ttt tcc aag ata gcc tcc aac         336
Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn
            100                 105                 110
acc cag agt cgc cgg act ttc atc aag tca gta ccg cca ttt ctg cgc         384
Thr Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg
        115                 120                 125
acc cat ggc ttt gat ggg cgt gac ctt gcc tgg ctc tac cct gga cgg         432
Thr His Gly Phe Asp Gly Arg Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg
    130                 135                 140
aga gac aaa cac cat ttt acc acc cta atc aag gaa atg aag gcc gaa         480
Arg Asp Lys His His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu
145                 150                 155                 160
ttt ata aag gaa gcc cag cca ggg aaa aag cag ctc ctg ctc agc gca         528
Phe Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala
                165                 170                 175
gca ctg tct gcg ggg aag gtc acc att gac agc agc tat gac att gcc         576
Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala
            180                 185                 190
aag ata tcc caa cac ctg gat ttc att agc atc atg acc tac gat ttt         624
Lys Ile Ser Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe
        195                 200                 205
cat ggc gcc tgg cgt ggg acc aca ggc cat cac agt ccc ctc agg cga         672
His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Arg Arg
    210                 215                 220
ggt cag gag gat gca agt cct gac aga ttc agc aac act gac tat gct         720
Gly Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala
225                 230                 235                 240
gtg ggg tac atg ttg agg ctg ggg gct cct gcc agt aag ctg gtg atg         768
Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met
                245                 250                 255
ggc atc ccc acc ttc ggg agg agc ttc act ctg gct tct tct gag act         816
Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr
            260                 265                 270
ggt gtt cca gcg cca atc tca gga ccg gga att cca ggc cgg ttc acc           864
Gly Val Pro Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr
        275                 280                 285
aag gag gca ggg acc ctt gcc tac tat gag atc tgt gac ttc ctc cgc           912
Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg
    290                 295                 300
gga gcc aca gtc cat aga acc ctc ggc cag cag gtc ccc tat gcc acc           960
Gly Ala Thr Val His Arg Thr Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr
305                 310                 315                 320
aag ggc aac cag tgg gta gga tac gac gac cag gaa agc gtc aaa agc          1008
Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser
                325                 330                 335
aag gtg cag tac ctg aag gat agg cag ctg gca ggc gcc atg gta tgg          1056
Lys Val Gln Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp
            340                 345                 350
gcc ctg gac ctg gat gac ttc cag ggc tcc ttc tgc ggc cag gat ctg          1104
Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp Leu
        355                 360                 365
cgc ttc cct ctc acc aat gcc atc aag gat gca ctc gct gca acg               1149
Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala Thr
    370                 375                 380
<210>2
<211>383
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Gly Val Lys Ala Ser Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser
            20                  25                  30
Gln Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg
        35                  40                  45
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp
    50                  55                  60
His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu
65                  70                  75                  80
Asn Thr Leu Asn Asn Thr Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val
                85                  90                  95
Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn
            100                 105                 110
Thr Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg
        115                 120                 125
Thr His Gly Phe Asp Gly Arg Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg
    130                 135                 140
Arg Asp Lys His His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu
145                 150                 155                 160
Phe Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala
                165                 170                 175
Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala
            180                 185                 190
Lys Ile Ser Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe
        195                 200                 205
His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Arg Arg
    210                 215                 220
Gly Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met
                245                 250                 255
Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr
            260                 265                 270
Gly Val Pro Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr
        275                 280                 285
Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg
    290                 295                 300
Gly Ala Thr Val His Arg Thr Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr
305                 310                 315                 320
Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser
                325                 330                 335
Lys Val Gln Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp
            340                 345                 350
Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp Leu
        355                 360                 365
Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala Thr
    370                 375                 380
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>3
Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg
1               5                   10                  15
Arg
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>4
Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe His Gly Ala
1               5                   10
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>5
Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>6
Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>7
Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val
1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>8
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser
1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>9
Ser Val Lys Ser Lys Val Gln Tyr Leu
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>10
His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile
1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>11
Lys Leu Val Met Gly Ile Pro Thr Phe
1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>12
cag ctg gca ggc gcc atg gtatgg gcc ctg                            30
Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu
1               5                   10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>13
Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val
1               5                   10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>14
Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe
1               5                   10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>15
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe
1               5                   10
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>16
Phe Val Val Leu Val Leu Leu Gln Cys Cys
1               5                   10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>17
Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu Asn Thr Leu
1               5                   10
<210>18
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>18
Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser
1               5                   10                  15
Asn Thr Gln Ser Arg Arg
            20
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>19
Leu Gln Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu
1               5

Claims (27)

1、一种肽，所述肽由序列表的序列号2表示的氨基酸序列中的7个以上连续氨基酸构成，是具有在序列号2的aa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261或aa326-354的区域内的连续氨基酸序列且具有免疫诱导活性的肽，或与所述肽中的任一种肽具有80％以上同一性且具有免疫诱导活性的7～30氨基酸残基的肽，或含有前述肽中的任一种肽作为部分序列、氨基酸残基数为8～31、且具有免疫诱导活性的肽。
2、如权利要求1所述的肽，所述肽由序列表的序列号2表示的氨基酸序列中的7个以上连续氨基酸构成，是具有在序列号2的aa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261或aa326-354区域内的连续氨基酸序列且具有免疫诱导活性的肽，或含有所述任一种肽作为部分序列、氨基酸残基数为8～30、且具有免疫诱导活性的肽。
3、如权利要求2所述的肽，所述肽由序列表的序列号2表示的氨基酸序列中的7个以上连续氨基酸构成，具有在序列号2的aa10-19、aa49-61、aa74-83、aa96-117、aa152-161、aa177-185、aa202-211、aa246-261或aa326-354区域内的连续氨基酸序列，并且具有免疫诱导活性。
4、如权利要求1～3中任一项所述的肽，其中，所述具有在序列号2的aa49-61区域内的连续氨基酸序列的肽具有序列号8、序列号10或序列号15所示的氨基酸序列。
5、如权利要求1～4中任一项所述的肽，其中，所述具有在序列号2的aa96-117区域内的连续氨基酸序列的肽具有序列号3或序列号18所示的氨基酸序列。
6、如权利要求1～5中任一项所述的肽，其中，所述具有在序列号2的aa246-261区域内的连续氨基酸序列的肽具有序列号11或序列号13所示的氨基酸序列。
7、如权利要求1～6中任一项所述的肽，其中，所述具有在序列号2的aa326-354的区域内的连续氨基酸序列的肽具有序列号5、序列号7、序列号9或序列号12所示的氨基酸序列。
8、如权利要求3所述的肽，所述肽具有序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15、序列号16、序列号17或序列号18所示的氨基酸序列。
9、如权利要求8所述的肽，所述肽具有序列号3或序列号18所示的氨基酸序列。
10、一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1～9中任一项所述的肽。
11、一种重组载体，所述重组载体含有权利要求11所述的多核苷酸，能够在细胞中表达该多核苷酸。
12、一种药物，含有权利要求1～9中任一项所述的肽作为有效成分。
13、一种癌症的治疗剂及/或预防剂，含有权利要求1～9中任一项所述的肽作为有效成分。
14、权利要求1～9中任一项所述的肽在制备癌症的治疗及/或预防剂中的应用。
15、一种治疗及/或预防癌症的方法，所述方法给与个体有效量的权利要求1～9中任一项所述的肽。
16、一种抗原呈递细胞处理剂，含有权利要求1～9中任一项所述的肽。
17、权利要求1～9中任一项所述的肽在制备抗原呈递细胞处理剂中的应用。
18、一种抗原呈递细胞处理方法，所述处理方法使权利要求1～9中任一项所述的肽与抗原呈递细胞接触。
19、一种离体抗原呈递细胞，含有权利要求1～9中任一项所述的肽与HLA分子的复合体。
20、一种T细胞的活化方法，所述方法使权利要求19所述的离体抗原呈递细胞与T细胞接触。
21、一种离体T细胞，所述离体T细胞选择性地结合在权利要求1～9中任一项所述的肽和HLA分子的复合体上。
22、一种药物，含有权利要求19所述的离体抗原呈递细胞或权利要求21所述的离体T细胞作为有效成分。
23、一种癌症的治疗剂及/或预防剂，含有权利要求19所述的离体抗原呈递细胞或权利要求21所述的离体T细胞作为有效成分。
24、一种治疗及/或预防癌症的方法，所述方法给与有效量的权利要求19所述的离体抗原呈递细胞或权利要求21所述的离体T细胞。
25、一种抗体或其抗原结合性片段，所述抗体或其抗原结合性片段以权利要求1～9中任一项所述的肽作为对应抗原。
26、一种癌症诊断剂，含有权利要求25所述的抗体或其抗原结合性片段。
27、一种癌特异性免疫诱导剂，所述诱导剂为含有序列号2所示氨基酸序列的蛋白质或具有与该氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列的蛋白质，含有具有免疫诱导活性的蛋白质作为有效成分。
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