JP2013028639A - 免疫誘導剤及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カルモジュリン2がヒトの腫瘍組織において、正常組織と比較して有意に高発現していることが見出された。カルモジュリン2タンパク中の部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性T細胞を活性化及び増殖させる能力(免疫誘導活性)を有し、このため、該ペプチドが癌の治療及び/又は予防に有用であり、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したT細胞が癌の治療及び/又は予防に有用である。
【選択図】図1
Description
(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン2タンパク(以下CALM2タンパクと略記することがある)。
(b) (a)の断片であって、連続する7個以上のアミノ酸配列からなり、免疫誘導活性を有する断片(以下、便宜的に「免疫誘導性断片」と言うことがある)。
(c) (a)のカルモジュリン2タンパク又は(b)の断片と、80%以上の相同性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド(以下、便宜的に「免疫誘導性修飾ペプチド」と言うことがある)。
(d) (a)のカルモジュリン2タンパク、(b)の断片または(c)のペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチド(以下、便宜的に「免疫誘導性付加ペプチド」と言うことがある)。
(1)実験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た119名の食道ガン患者から、食道ガン摘出手術時又は食道生検実施時に食道の摘出組織を得た。摘出された組織片について肉眼的及び/又は病理組織学的に食道ガン組織を判断し、食道ガン病変部と正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
試料として食道ガン患者の食道組織における食道ガン病変部の組織、及び同一食道組織における非ガン組織(正常組織)を用いた。おのおのの組織から、Trizol reagent(Invitrogen社)を用いて、同社推奨のプロトコールにより全RNAを調製した。
オリゴDNAマイクロアレイとしてはAffymetrix社GeneChip(登録商標)(Human Genome U133 A)及び本明細書中で述べる方法に従って作製したDNAチップを使用した。
標識したcDNA 1μgをアンチセンスオリゴカクテル(QIAGEN)に溶解し、Gapカバーグラス(松浪硝子工業)を載せたDNAチップにアプライし、42℃で16時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ終了後、DNAチップを2xSSC/0.1%SDS、1xSSC、0.2xSSCで順次洗浄した。
上述の方法によりハイブリダイゼーションを行ったDNAチップをAgilentマイクロアレイスキャナー(Agilent社)を用いてスキャンし、画像を取得して蛍光強度を数値化した。統計学的処理はSpeed T.著「Statistical analysis of gene expression microarray data」Chapman & Hall/CRC,及びCauston H.C.ら著「A beginner's guide Microarray gene expression data analysis」Blackwell publishingを参考にして行った。すなわちハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータについて、それぞれの対数値をとり、global normalizationとLOWESS(locally weighted scatterplot smoother)による平滑化を行い、MADによるスケーリング処理によってノーマライゼーション補正を行った。その結果、食道ガン病変部における発現量が、非ガン組織部よりも多い遺伝子として、CALM2を見出すことができた。
(1)ヒトCALM2タンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201結合モチーフ予測のため、公知のBIMASソフト(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能)を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトCALM2タンパク質のアミノ酸配列を解析し、HLAクラスI分子に結合可能と予想されるペプチド24種類を選択した。
(1)上記で誘導した各穴のT細胞の内、配列番号3、5、6又は7に示すアミノ酸配列を有するペプチドで刺激されたT細胞が増殖していることが顕微鏡下における細胞数計測により確認された。増殖が見られたT細胞それぞれについて、パルスに用いた各ペプチドに対する特異性を調べるために、ペプチドでパルスされた、HLA-A0201分子を発現するT2細胞(Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ATCCより購入)(10μg/mlの濃度でAIM−V培地中各ペプチドを添加し、37℃、5%CO2の条件下で4時間培養)5×104個に対して、5×103個のT細胞を添加し、10%ヒトAB血清を含むAIM−V培地中で96穴プレートにて24時間培養した。培養後の上清を取って、IFN−γの産生量をELISA法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないT2細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号3、5、6又は7のペプチドをパルスしたT2細胞を用いた穴の培養上清において、IFN−γ産生が確認された(図1)。中でも、配列番号3のペプチドでパルスした場合におけるIFN−γ産生量が顕著に高かった。従って、配列番号3、5、6及び7のペプチドは特異的にHLA-A0201陽性CD8陽性T細胞を増殖刺激させ、IFN−γ産生を誘導する能力を有するT細胞エピトープペプチドであることが判明した。
Claims (12)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン2タンパク若しくは免疫誘導活性を有し、連続する7個以上のアミノ酸から成るその断片、又は前記カルモジュリン2タンパク若しくはその前記断片と80%以上の同一性を有し、免疫誘導活性を有するペプチド、又は前記カルモジュリン2タンパク、その前記断片若しくは前記ペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤。
- 前記カルモジュリン2タンパク又は免疫誘導活性を有する連続する7個以上のアミノ酸から成るその断片を有効成分として含有する請求項1記載の免疫誘導剤。
- 前記断片は、配列番号2中の(1)aa9〜17の9アミノ酸の領域、(2)aa63〜72の10アミノ酸の領域、(3)aa65〜73の9アミノ酸の領域又は(4)aa121〜129の9アミノ酸の領域を含む、9アミノ酸以上のペプチドである請求項1又は2記載の免疫誘導剤。
- 癌の治療及び/又は予防剤である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の免疫誘導剤。
- ワクチン又は抗原提示細胞の処理剤である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の免疫誘導剤。
- 有効成分であるペプチドのアミノ酸数が7〜30であり、抗原提示細胞の処理剤である請求項5記載の免疫誘導剤。
- 請求項6記載のペプチドとHLA分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
- 請求項6記載のペプチドとHLA分子の複合体を選択的に結合する、単離T細胞。
- 請求項7記載の単離抗原提示細胞又は請求項8記載の単離T細胞を有効成分として含有する医薬。
- 請求項7記載の単離抗原提示細胞又は請求項8記載の単離T細胞を有効成分として含有する癌の治療及び/又は予防剤。
- 癌であるか否かを検出すべき患者から得た試料における、配列番号1に示す塩基配列を有するコード領域を有するカルモジュリン2遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するカルモジュリン2タンパクと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌の診断剤。
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