CN102459616A - 复制型逆转录病毒载体的生产细胞 - Google Patents

Abstract

本公开提供产生用于基因治疗的载体和病毒粒子的细胞系和方法。

Description

复制型逆转录病毒载体的生产细胞

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119要求2009年6月17日提出的临时申请系列号61/218,063的优先权，其公开内容通过参考并入本文。

技术领域

本公开涉及产生重组的复制型逆转录病毒载体的方法、产生所述载体的细胞系以及产生和使用所述细胞系的方法。

背景技术

逆转录病毒的生命周期包含病毒的遗传物质插入宿主细胞基因组中的阶段。此步骤是必不可少的，因为插入的病毒核酸即原病毒是通过宿主细胞机构复制。

作为该过程的一部分，逆转录病毒的RNA基因组在插入至宿主细胞基因组之前通过双链DNA中间物复制。通过逆转录酶完成病毒RNA分子向双链DNA(dsDNA)分子的最初转变。然后dsDNA通过整合酶整合入宿主细胞基因组中，以通过宿主细胞机构进一步复制。RNA转变为dsDNA和整合入宿主基因组所必需的逆转录酶和整合酶在感染期间在病毒粒子内携带。原病毒DNA最终利用宿主机构转录为多个RNA拷贝。这些RNA分子然后翻译为病毒肽或蛋白质，或整合入病毒粒子中，所述病毒粒子从细胞释放到培养基或细胞外环境中。

逆转录病毒RNA基因组通常包含6个可表达多种蛋白质的典型区域。这些区域包括gag、pol和env基因序列，其与包装信号psi(ψ)信号有关且侧翼为5′和/或3′长末端重复(LTR)区域。gag基因可表达病毒核蛋白核心的蛋白质组分，而pol基因产物与多核苷酸合成和重组相关。env基因编码逆转录病毒粒子的包膜组分。5′和3′LTR区域包含启动子且帮助病毒基因组整合入宿主细胞的染色体DNA中。psi信号是指逆转录病毒包装信号，其控制RNA有效地包装入病毒粒子中。

由于逆转录病毒不能形成原病毒，因此逆转录病毒可用于修饰靶标或宿主细胞的基因组，且可对逆转录病毒进行各种修饰以用于基因治疗治疗。使用逆转录病毒载体的基因治疗治疗一般通过向编码或产生目的多肽或转录物的病毒基因组中加入异源多核苷酸，将重组基因组包装入病毒粒子和感染靶宿主细胞来实现。然后靶细胞整合作为原病毒一部分的外源基因。

已经将大多数逆转录病毒载体变成“有缺陷的”，以避免病毒粒子不受控制的传播和生产。然而，关于复制型逆转录病毒载体系统的开发少有报道。

发明内容

本公开提供可用于产生用于基因治疗的重组复制型逆转录病毒载体基因治疗的细胞系和病毒粒子生产细胞。

本公开提供用于产生复制型逆转录病毒粒子的逆转录病毒生产细胞系，所述细胞系包括纤维肉瘤、骨肉瘤或胸腺瘤细胞系，所述细胞系稳定表达重组逆转录病毒基因组，所述重组逆转录病毒基因组包含gag基因、pol基因、env基因、异源多核苷酸和用于组装所述重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒psi(Ψ)因子。在一个实施方案中，稳定表达复制型逆转录病毒粒子。在另一个实施方案中，半衰期在2-8℃下大于7天。在另一个实施方案中，从细胞系产生的病毒粒子在细胞系于65℃下储存12个月后显示感染力无损失。在另一个实施方案中，产生的载体在3个月或更长时间内大约100％稳定，且以相同复制型逆转录病毒瞬时转染的细胞系所产生的相同载体在相同储存条件下在2到8周时与起始滴度相比损失至少5倍活性。在另一个实施方案中，复制型逆转录病毒包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多核苷酸，其包含位于逆转录病毒多核苷酸序列3’端的长末端重复(LTR)序列、位于逆转录病毒多核苷酸5’端的启动子序列(所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达)、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域；序列盒，其包含有效连接于异源多核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)或调控核酸结构域，其中所述序列盒位于3’LTR的5’和编码逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3’；和在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。

其中与pACE载体相比，RCR在6次传代后保持较高的复制能力。在一个实施方案中，逆转录病毒多核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒内源性病毒(BEV)和猫病毒RD114。在另一个实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在另一个实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一个实施方案中，启动子序列与生长调节基因相关。在另一个实施方案中，核酸调节域包含pol II启动子。在另一个实施方案中，启动子序列包括组织特异性启动子序列，例如雄激素反应元件。在一个实施方案中，雄激素反应元件来源于probasin启动子。

生产者细胞系所产生的逆转录病毒载体包含多种结构域。例如，启动子包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所阐述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或一个以上核酸碱基的修饰，所述修饰能指导和引发转录；CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所阐述的序列，或与如SEQ ID NO：19、20或22所阐述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多核苷酸促进与其有效连接的核酸分子的转录；gag核酸结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列；pol结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列；env结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列；IRES包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95％、98％或99％同一性的序列；且异源核酸包括具有如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17所阐述的序列的多核苷酸。

本公开还提供一种无细胞制剂，其包含从本文所述的产生逆转录病毒的细胞系获得的病毒粒子。在一些实施方案中，从分离的病毒粒子制备药物制剂。

本公开还提供一种产生本文所述的产生载体细胞系的方法，其包括用编码逆转录病毒载体的质粒转化293细胞系，所述逆转录病毒载体从5’到3’包含：人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体；逆转录酶的引物结合位点PBS；5’剪接位点；ψ包装信号；MLV组特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列；3’剪接位点；MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列；来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)，或核酸调节结构域；经修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；多聚嘌呤区(polypurine tract)；和U3-R-U5 MLV长末端重复序列；培养293细胞以产生病毒粒子；分离病毒粒子；用病毒粒子感染HT1080细胞系，从而产生生产病毒粒子的细胞系。本公开还提供一种由上述方法产生的细胞系。

本公开还提供一种产生用于基因治疗的组合物的方法，其包括培养本文所述的细胞系以产生病毒粒子和基本上纯化病毒粒子。

本公开还提供包含本公开细胞系的细胞库。在一些实施方案中，本公开的细胞系悬浮生长。在一些实施方案中，本公开的细胞系在无血清培养基中生长。在一些实施方案中，细胞系在无血清培养基中悬浮生长。

序列表的电子拷贝和本文一起提交并且其全文整合入本文中。

本公开的一个或一个以上实施方案的细节阐述于附图和以下具体实施方式中。根据具体实施方式和附图并根据权利要求书，本公开的其它特征、目标和优势可显而易见。

附图说明

图1显示产生本公开的生产者细胞系和库的一般方法；

图2显示细胞杀死数据的曲线图，表明经修饰的载体与原始野生型CD相比更有效；曲线图还显示经修饰骨架(T5.0007)在细胞杀死方面比pACE-CD的骨架更有效；还显示将各种载体构建体和其名称按目录分类的表；

图3A-F显示(a)本公开的重组逆转录病毒载体的图解；(b和c)本公开的多核苷酸的质粒图谱(CMV启动子：1-582；R：583-650；U5：651-1202；引物结合位点(PBS)：728-776；5’剪接位点：788-789；gag：1203-2819；pol：2820-6358；3’剪接位点：3314-3315；4070A env：6359-8323；EMCV IRES：8327-8876；yCD2：8877-9353；多聚嘌呤区(PPT)：9386-9404；U3：9405-9854；R：9855-9921；U5：9922-9998)；(d和e)本公开的多核苷酸序列(SEQ ID NO：19)；(f)本公开的第一代和第二代RCR的图解；

图4显示在感染的U-87细胞中观察到的yCD2蛋白的水平高于野生型yCD蛋白；

图5显示如使用PCR扩增所评定，本公开的载体在12个病毒传代周期后保持遗传稳定；图还证明本公开的载体与载体pACE-CD(Kasahara等人)相比在更长传代后更为稳定；具体而言，pAC3-CD比pACE-CD更稳定，证明经改变的骨架使载体更稳定；此外，pACE-yCD1(T5.0001)和-yCD2(T5-0002)比pAC-yCD更稳定；

图6A-B显示细胞杀死活性；(A)细胞杀死分析；和(B)用不同载体感染的细胞的胞嘧啶脱氨酶特异活性；(A)显示当U87感染细胞暴露于渐增水平的5-FC时，本公开的胞嘧啶脱氨酶和载体至少杀死被感染细胞，并且也许优于原始pACE-CD；(B)显示本公开的特异性CD活性(T5.0007、T5.0001和T5.0002)与pACE-CD(T5.0000)相比均增加，次序为T5.0000＜T5.0007＜T5.0001＜T5.0002；

图7显示用本公开的CD载体(也称为“Toca 511”、“pAC3-yCD2(V)”和“T5.0002”，参见例如图2)体内处理并从以4个周期的5-FC处理的小鼠外植的U-87(人)肿瘤对药物仍然敏感；

图8显示脑癌的人异种移植物(U87)小鼠模型中的给药信息；

图9显示同基因小鼠模型中的给药信息和治疗效果；

图10显示批次T003-002-40L(未稀释和1/100稀释)于≤-65℃下12个月时的效力剂量曲线(参见实施例8)；

图11显示M100-09(高剂量)、M101-09(中剂量)和M102-09(低剂量)三个批次于≤-65℃下6个月时的效力剂量曲线；

图12显示HT1080+T5.0002克隆候选物的每日滴度，其反映汇合培养物的滴度产量；

图13显示感染后第1、3和6天，3种犬神经胶质瘤细胞系上的T5.0006(GFP)载体的病毒传播；

图14显示T003-002-40L批次和GMP批次于≤-65℃下12个月内测量的滴度趋势；

图15显示基于S91皮下肿瘤细胞的生长动力学的对Toca 511和Toca 621转导的分析；S91肿瘤在植入10天后用载体注射；

图16显示由稳定的生产者细胞系产生的经纯化的T5.0006(GFP载体)随着时间(0、5、9、12、26天)在裸鼠中的U87皮下肿瘤中的传播。

具体实施方式

除非上下文明确指出，否则如本文和随附权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数形式。因此，例如，提及“一细胞”时包括多个所述细胞，且提及“所述载体”时包括提及一种或一种以上载体，诸如此类。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文所述的方法和试剂类似或等效的任何方法和试剂都可以用于实施所公开的方法和组合物，但现在描述示例性方法和材料。

此外，除非另外说明，否则使用“或”意味着“和/或”。类似地，“包含”和“包括”可互换使用且不旨在是限制性的。

应进一步理解，当各个实施方案的描述使用术语“包含”时，所属领域技术人员将理解在一些特定情况下，可备选地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。

本文提到的所有出版物以其全文通过参考并入本文中，以用于描述和公开在可以与本文描述联合使用的出版物中所描述的方法。上文和贯穿本文讨论的出版物单独提供，因为它们的公开早于本申请的申请日之前。本文中的任何内容都不应解释为承认发明人无权依靠先前公开而将本公开的日期提前。

本文所用的术语“RCR”旨在指复制型逆转录病毒(RCR)。复制型病毒是能在宿主细胞中自我复制的病毒粒子。

本文所用的术语“RCR质粒载体”意思是指质粒，其包含逆转录病毒基因组的全部或部分，包括5’和3’逆转录病毒长末端重复(LTR)序列、包装信号(ψ)，所述质粒也可包含一个或一个以上编码一个或多个目的蛋白质或一个或多个多肽，例如治疗剂或选择标记的多核苷酸。术语“治疗”以通用含义使用且包括治疗剂、预防剂和替代剂。

本文所用的术语“转染”旨在指将至少一种外源核酸转移到细胞中。核酸可以是RNA、DNA或两者的组合。外源核酸是指在宿主细胞分裂或宿主细胞增殖过程中没有发现的核酸。

本文所用的术语“病毒”旨在指天然病毒或逆转录病毒粒子。

本文所用的术语“细胞系”是指可传代(分裂)一次以上的培养的细胞。本公开涉及可传代2次以上、直至200次或以上且包括其中任何整数的细胞系。

本文所用的表述“稳定表达”旨在指遗传物质稳定表达和/或永久且稳定地整合到宿主细胞基因组中，并且因此具有与宿主细胞的天然遗传物质相同的随时间表达的潜力。

本文所用的表述“瞬时表达”旨在指遗传物质暂时表达和/或没有永久且稳定地整合到宿主细胞基因组中，并且因此不具有与宿主细胞的天然遗传物质相同的随时间表达的潜力。

本文所用的术语“异源”核酸序列或转基因是指(i)在野生型逆转录病毒中正常情况下不存在的序列，(ii)来源于外源物种的序列，或(iii)如果来自相同物种，则可从其原始形式经过相当大的修饰。备选地，在细胞中通常不表达的未改变的核酸序列也是异源核酸序列。

本文所用的术语“治疗”是指预防、逆转或减缓疾病或其症状自然过程的作用。治疗作用可以是预防性、治愈性或仅仅缓解性，且不意味着患病人或动物患者不会死于疾病。

在一个实施方案中，本公开的生产者细胞系能悬浮生长或在无血清培养基中生长。生产者细胞系也可同时在无血清培养基中悬浮生长。虽然无血清培养基和悬浮生长的能力是代表性条件，但是本公开的细胞(例如293T细胞)也可以贴壁方式在常规含血清培养基中培养，以实现特定目的。此类目的可以是例如促进细胞转染或选择细胞克隆。

用于产生逆转录病毒的生产者细胞类型(下文更充分描述)可用于生产用于基因递送和基因治疗的复制型病毒粒子。

本公开提供一种产生生产者细胞系的方法，包括用本公开的RCR质粒载体转化或转染第一哺乳动物细胞类型，培养第一细胞类型以产生逆转录病毒粒子，从产生逆转录病毒粒子的第一细胞类型获得无细胞培养基，其中无细胞培养基包含逆转录病毒粒子，使第二哺乳动物细胞类型与培养基接触以感染第二细胞类型，和培养第二细胞类型以产生生产者细胞系，所述细胞系可产生复制型逆转录病毒载体以用于转化哺乳动物细胞。第一细胞类型可以是在转染后能产生病毒的几乎任何哺乳动物细胞类型，且可包括HeLa、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)和HT1080细胞，且转染可用磷酸钙或所属领域技术人员已知可用于转染的其它试剂，例如脂质制剂进行。

在一个实施方案中，第一细胞类型是人胚肾细胞。在另一个实施方案中，人胚肾细胞是293细胞(通常也称为HEK 293细胞、293细胞或更简单地称为HEK细胞)，它是最初来源于组织培养中生长的人胚肾细胞的细胞系。HEK 293细胞是通过用剪切的腺病毒5DNA转化正常人胚肾细胞的培养物产生。HEK293细胞非常容易生长和转染，且多年来已经广泛用于细胞生物学研究中。它们也在生物工程工业上使用以产生用于基因治疗的治疗性蛋白和病毒。

在另一个实施方案中，第一细胞类型是用SV40大T抗原转化的哺乳动物细胞。在一个特定实施方案中，使用293T HEK细胞。该细胞系的一种重要变体是这样的293T细胞系，其含有SV40大T抗原，从而允许含有SV40复制起点的转染的质粒的游离型复制。这使得转染的质粒扩增和延长期望基因产物的暂时表达。

本文所用的术语“人293细胞”包括HEK 293T细胞系、人293细胞系(ATCC编号CRL 1573)(Graham等人，J.Gen.Virol.，第36卷，第59-72页(1977))或通过用一种或一种以上包含编码多种的gag、pol和env蛋白的多核苷酸的表达载体(例如质粒载体)转染293细胞而形成的细胞系。包膜可以是双嗜性包膜、亲嗜性包膜、异嗜性包膜、GALV包膜、RD114包膜、FeLV包膜或其它逆转录病毒包膜。包膜也可以是来自异源来源的包膜，例如α病毒包膜。此类细胞也可包含其它多核苷酸，例如编码选择标记的多核苷酸。此类细胞系的实例包括，但不限于，293T/17(ATCC编号CCRL 11268)、Anjou 65(ATCC编号CCRL11269)、Bosc 23(CCRL 11270)和CAK8，也称为Bing细胞系(ATCC编号CCRL 11554)。

第一细胞类型(例如HEK 293T细胞)可以以包括磷酸钙等在内的多种方式用本公开的RCR质粒载体转化。哺乳动物细胞、尤其是人293细胞的有代表性培养条件在本领域中是已知的。

一旦被转化，第一细胞类型便在用于生产病毒粒子的条件下培养。此类条件有代表性地包括在适当培养基、CO₂和湿气中再供给细胞。培养条件也可包括添加抗生素、抗真菌剂、生长因子等。有代表性地，在24、48、72或96小时后收获再供给的培养基，且此种过程被称为瞬时表达转染过程。

来自以上培养的细胞的培养基可直接用于进一步培养。备选地，可使用本领域中已知的多种技术，包括离心、尺寸排阻技术、阴离子交换层析等分离培养细胞的培养基中的病毒粒子。

当直接使用培养基时，培养基可添加到第二细胞类型培养过程中所用的培养基中。当病毒粒子首先基本上纯化时，粒子在添加到第二细胞类型中之前可在适当缓冲液或培养基中或在特定感染力浓度下洗涤或再悬浮，从而产生稳定表达生产者细胞系。

在一个实施方案中，第二细胞类型是人纤维肉瘤细胞系。在一个具体实施方案中，细胞系是HT1080细胞系或其衍生物。HT1080人纤维肉瘤细胞系(ATCC，目录号CCL-121)可直接从美国典型培养物保藏中心(邮箱1549，Manassas，VA)获得。方法包括用本公开的RCR感染HT1080细胞以提供稳定转染的宿主细胞。可培养稳定转染的宿主细胞以产生用于基因治疗或基因递送的病毒粒子，或可“保藏”用于以后使用，且可以是转染细胞混合物或克隆细胞系。保藏的细胞可使用本领域中已知的技术冷冻和储存。

有代表性地，细胞将在无血清培养基中培养。在一个实施方案中，细胞在用于制备用于向人递送的生物制剂的无动物成分培养基或确定成分培养基中培养。

出乎意料的是，上文所述的过程从稳定表达生产者细胞系得到用于基因治疗的病毒粒子，其与通过瞬时表达过程产生的病毒粒子相比，稳定性提高。

RCR病毒粒子(例如AC3-yCD2(V))可基本上从HT1080+T5.002细胞的培养基中纯化。纯化的载体可在适当的可药用的载体中洗涤、稀释和再悬浮。备选地，纯化的载体可通过冷冻或冻干储存。

在一个实施方案中，AC3-yCD2(V)将作为溶液形式的逆转录病毒粒子施用。最终填充的载体制剂被称为Toca 511，并且作为含有以下制剂赋形剂(mg/mL)的无菌水溶液形式提供：蔗糖10.0、甘露醇10.0、NaCl 5.3、人血清白蛋白(HSA，Baxter)1.0和抗坏血酸0.10。

如本文进一步描述，本公开的许多逆转录病毒载体可与本文所述的生产者细胞系和方法一起使用。

在本文提供的具体实施例中，TOCA 511用于证明本发明的方法和组合物。如本文所述，TOCA 511是指在命名为pAC3-yCD2(也称为T5.0002)的质粒中编码的复制型逆转录病毒载体。病毒载体包含来源于鼠白血病病毒(MLV)的复制型逆转录病毒，所述逆转录病毒编码病毒复制所必需的所有逆转录病毒组分(gag、pol和env)，其中原始亲嗜性包膜被4070A病毒的双嗜性包膜替代。

TOCA 511载体编码酵母胞嘧啶脱氨酶(CD)基因。该基因序列已经插入来源于脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)的下游，所述IRES又插入到病毒env基因的下游，如以下图5中所示。TOCA 511载体中的基因是修饰的酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因。使用修饰的CD基因的原理是使得口服前药氟胞嘧啶(5-FC)更有效地在体内转化为活性细胞毒性剂氟尿嘧啶(5-FU)。

本公开的方法和组合物适用于其它载体和重组逆转录病毒载体。本公开描述由本公开的细胞系和方法制造的多种修饰和重组载体。

本公开的方法和细胞系包括重组构建体，其包含一种或一种以上编码目的异源核酸(例如胞嘧啶脱氨酶，例如SEQ ID NO：1-13中提供的多核苷酸和多肽)、γ干扰素基因或例如公布的专利申请WO2010036986中公开的许多治疗基因中的任一种的核酸序列。在一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。

术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意思是指通过其可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞中，以便转化宿主并促进所引入序列表达(例如转录和翻译)的运载体。载体有代表性地包含可传播因子的DNA，通过限制酶技术向其中插入了编码蛋白质的外源DNA。常见类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含式分子，容易接受额外(外源)DNA且容易引入到合适宿主细胞中。已描述了可在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的许多载体，包括质粒和真菌载体。非限制性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，Calif.)或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和许多适当的宿主细胞，其中使用本文公开或引用的方法或者相关领域技术人员已知的方法。重组克隆载体通常包括一个或一个以上用于克隆或表达的复制系统、一个或一个以上用于宿主筛选的标记物(例如抗生素抗性)和一个或一个以上表达盒。

术语“表达”意思是指允许或导致基因或DNA序列的信息表现出来，例如通过激活相应基因或DNA序列转录和翻译所涉及的细胞功能而产生蛋白质。DNA序列在细胞中表达或由细胞表达，从而形成“表达产物”，例如蛋白质。表达产物自身，例如所得到的蛋白质，也可被称为被细胞“表达”的。例如，当多核苷酸或多肽是在外源或天然启动子控制下在外源宿主细胞中表达或产生时，或在外源启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，则所述多核苷酸或多肽是重组表达。

在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在另一个实施方案中，病毒载体是只能感染正在复制的哺乳动物细胞的复制型逆转录病毒载体。逆转录病毒的分类存在多种方式，但近十年来命名法已经标准化(参见国际互联网(www)的ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/上的ICTVdB-The Universal Virus Database，v 4，和教科书“Retroviruses”Coffin，Hughs和Varmus编，Cold Spring HarborPress 1997，其公开内容通过参考并入本文)。复制型逆转录病毒载体来源于逆转录病毒科，且可包括正逆转录病毒(Orthoretrovirinae)亚科的成员，或更有代表性地包括来自γ逆转录病毒属的逆转录病毒。在一个实施方案中，复制型逆转录病毒载体包含位于编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸5’的内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸位于逆转录病毒载体的env多核苷酸的3’。

本公开提供修饰的逆转录病毒载体。修饰的逆转录病毒载体可来源于逆转录病毒科的成员。该科的分类在最近10到15年期间已经发生数次改变。目前，逆转录病毒科包括两个亚科：泡沫逆转录病毒亚科(Spumaretrovirinae)，其具有一个属，即泡沫病毒属(或泡沫病毒)，例如人和猿泡沫病毒(HFV)；和正逆转录病毒亚科，其具有6个属，即β逆转录病毒(例如MMTV)、γ逆转录病毒(例如MLV)、α逆转录病毒(例如ALV)、δ逆转录病毒(例如BLV和HTLV-1)、慢病毒(例如HIV 1)和ε逆转录病毒(例如角膜白斑皮肤肉瘤病毒)。这些分类是基于共同分子特征，例如gag、pol和env的相关读码框、多聚蛋白的加工、用于引发逆转录的各个tRNA、和LTR结构性质作出的。基于在病毒成熟期间于电子显微镜下观察的粒子形态，逆转录病毒的原始分类法被分为A、B、C和D组。A型粒子代表在感染细胞的细胞质中看到的B型和D型病毒的不成熟粒子。这些粒子不具有感染性。通过胞质内A型粒子的包膜作用，B型粒子作为成熟病毒粒子从质膜发芽。所述粒子在膜上具有75nm的环形核，长的糖蛋白从其中突出。在发芽后，B型粒子含有偏心定位的电子致密核心。β逆转录病毒小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)具有B型形态，但β逆转录病毒也可具有D型结构。D型粒子与B型粒子的相似之处在于它们都在被感染的细胞质中显示从细胞表面开始生长的环状结构，但病毒体整合有短的表面糖蛋白突出物。电子致密核心在粒子内也是偏心定位。另一种β逆转录病毒梅森费舍猴病毒(MPMV)是原型D型病毒。在被C型病毒感染的细胞中没有观察到胞质内粒子。相反，成熟粒子经由月牙`C`形缩合直接从细胞表面生长出，然后自我闭合并由质膜封闭起来。可见到包膜糖蛋白突出物以及均匀的电子致密核心。生长可从表面质膜开始或直接进入胞内液泡。α逆转录病毒、γ逆转录病毒、δ逆转录病毒和ε逆转录病毒都具有C型结构外观。

逆转录病毒可根据其复制遗传物质的方式来定义。RNA在复制期间转化为DNA。在细胞感染之后，通过被称为逆转录的分子过程，从病毒粒子中携带的两个RNA分子产生双链DNA分子。DNA形式作为原病毒共价地整合到宿主细胞基因组中，在细胞和/或病毒因子的帮助下从所述DNA表达病毒RNA。所表达的病毒RNA包装到粒子中且作为感染性病毒体释放。

逆转录病毒粒子包括两个相同的RNA分子。每个野生型基因组具有正义单链RNA分子，其在5’端被加帽并在3’尾端被聚腺苷酸化。二倍体病毒粒子含有与gag蛋白复合的两条RNA链、病毒酶(pol基因产物)和gag蛋白“核心”结构内的宿主tRNA分子。从宿主细胞膜衍生且含有病毒包膜(env)蛋白的脂质双层包围和保护着此衣壳。env蛋白与病毒的细胞受体结合，且粒子有代表性地通过受体介导的内吞作用和/或膜融合而进入宿主细胞。

在外部包膜脱落后，病毒RNA通过逆转录拷贝到DNA中。逆转录是由pol区所编码的逆转录酶催化且使用包装到病毒体中的宿主细胞tRNA作为DNA合成的引物。以此方式，RNA基因组转化为更复杂的DNA基因组。

逆转录所产生的双链线性DNA可能必须或可能不是必须在核内成环形。原病毒现在在每一端具有两个相同的重复序列，称为长末端重复序列(LTR)。这两个LTR序列的末端产生被催化整合的pol产物(整合酶蛋白)识别的位点，使得原病毒总是与LTR末端距离两个碱基对(bp)与宿主DNA连接。在两个LTR的末端看到细胞序列的复制，暗示可转座基因元件的整合模式。认为整合基本上是在靶细胞基因组内随机发生。然而，通过修饰长末端重复序列，可以控制逆转录病毒基因组的整合。

所整合的病毒DNA的转录、RNA剪接和翻译是由宿主细胞蛋白介导。产生以多种剪接转录物。在人逆转录病毒HIV-1/2和HTLV-I/II的情况下，也使用病毒蛋白来调控基因表达。细胞因子和病毒因子之间的相互作用是控制病毒潜伏期和病毒基因表达时间序列的一个因素。

逆转录病毒可水平和垂直传播。逆转录病毒的有效感染传播需要在靶细胞上表达特异性识别病毒包膜蛋白的受体，但病毒也可低效地利用不依赖受体的非特异性进入途径。此外，靶细胞类型必须能够支持在病毒结合和穿透之后复制循环的所有阶段。当病毒基因组整合入宿主的生殖细胞系中时，发生垂直传播。然后原病毒从一代传到另一代，就好像它是细胞基因一样。因此，产生了内源原病毒，其通常潜伏在体内，但在宿主暴露于适当因子下时可被活化。

如上所述，整合的DNA中间物称为原病毒。先前基因治疗或基因递送系统所使用的方法和逆转录病毒要求在适当辅助病毒存在情况下，或在含有允许衣壳化而同时不会产生污染性辅助病毒的适当序列的细胞系中，转录原病毒并组装到感染性病毒中。如下所述，产生本公开的重组逆转录病毒不需要辅助病毒，这是因为在基因组中提供用于衣壳化的序列，从而提供复制型逆转录病毒载体用于基因递送或治疗。

本公开的逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有至少三种基因：gag、pol和env，这些基因可侧接一个或两个长末端(LTR)重复序列，或在原病毒中侧接两个长末端重复序列(LTR)和含有顺式作用序列，例如psi的序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和/或3’LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷化。LTR含有病毒复制所必需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有其它基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。

与5’LTR相邻的序列是基因组的逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化入粒子中(Psi位点)所必需的。如果衣壳化(或逆转录病毒RNA包装到感染性病毒体中)所必需的序列从病毒基因组丢失，则将导致阻止基因组病毒RNA衣壳化的顺式缺陷(cis defect)。这类修饰的载体是有代表性地在先前基因递送系统(即缺少病毒体衣壳化所必需元件的系统)中使用的载体。

在第一实施方案中，本公开提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或具有细胞增殖病症细胞的重组逆转录病毒。本公开的重组复制型逆转录病毒包含编码病毒GAG、病毒POL、病毒ENV的多核苷酸序列，和在病毒载体感染靶细胞之后表达且封装入病毒体内的异源多核苷酸。

在一个实施方案中，异源核酸序列之前为启动子且有效连接于启动子。

在另一个实施方案中，异源核酸序列之前为内部核糖体进入位点(IRES)且有效连接于IRES。

内部核糖体进入位点(“IRES”)是指在通常处于IRES的3’的编码序列翻译期间促进核糖体进入或滞留的核酸区段。在一些实施方案中，IRES可包含剪接受体/供体位点，但优选的IRES缺少剪接受体/供体位点。正常情况下核糖体经由位于所有真核信使RNA的5’端的帽进入mRNA。然而，这一普遍规律存在例外。在一些病毒mRNA中缺乏帽，表明在这些RNA的内部位点上存在可允许核糖体进入的替代结构。迄今为止，已经在未加帽病毒mRNA的5’非编码区中鉴定了许多此类结构，根据其功能命名为IRES，尤其例如在细小核糖核酸病毒中，例如脊髓灰质炎病毒(Pelletier等人，1988，Mol.Cell.Biol.，8，1103-1112)和EMCV病毒(脑心肌炎病毒)(Jang等人，J.Virol.，1988，62，2636-2643)。本公开提供IRES在复制型逆转录病毒载体的情况中的用途。

取决于本公开的逆转录病毒载体的预期用途，可向逆转录病毒载体中插入许多异源多核苷酸或核酸序列。一些实例在WO2010/036986中提供。例如，可以使用对于体外研究通常使用的标记基因或报告基因，包括抗生素抗性和荧光分子(例如GFP)。编码任何期望多肽序列的其它多核苷酸序列也可插入到本公开的载体中。当寻求异源核酸序列的体内递送时，可使用治疗性序列和非治疗性序列两者。例如，异源序列可编码导向与细胞增殖病症有关的特定基因的治疗性分子，包括反义分子或核酶。异源序列可以是自杀基因(例如HSV-tk或PNP或胞嘧啶脱氨酶)、小干扰RNA或微小RNA、生长因子或治疗性蛋白(例如因子IX)。适用于本公开的其它治疗性蛋白在本领域中也容易鉴定。

在一个实施方案中，载体内的异源多核苷酸包含已经针对在人细胞中表达而优化的胞嘧啶脱氨酶。在另一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含已经进行人密码子优化的序列，并且包含与野生型胞嘧啶脱氨酶相比增加胞嘧啶脱氨酶稳定性(例如降解减少或热稳定性提高)的突变。在另一个实施方案中，异源多核苷酸编码融合构建体，所述构建体包含与编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多核苷酸有效连接的胞嘧啶脱氨酶(经人密码子优化或未经优化，突变或未突变)。在另一个实施方案中，异源多核苷酸包括本公开的CD多核苷酸(例如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17)。

在另一个实施方案中，复制型逆转录病毒载体可包含编码包含胞嘧啶脱氨酶(如本文所述)的多肽的异源多核苷酸，并且还包含与细胞类型或组织特异性启动子连接的多核苷酸，包括miRNA或siRNA分子。

如本文所用，术语“RNA干扰”(RNAi)是指由短干扰核酸(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默过程。术语“能介导RNA干扰的试剂”是指siRNA以及当在细胞内转录时编码siRNA的DNA和RNA载体。如本文所用的术语“siRNA”是指短干扰核酸。该术语意思是包括能介导序列特异性RNA干扰的任何核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡聚核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡聚核苷酸、化学修饰siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。

用于设计发夹双链体的主干长度的合适范围包括20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸和600-700个核苷酸的主干长度。用于设计发夹双链体的环长度的合适范围包括4-25个核苷酸、25-50个核苷酸或更长(如果发夹双链体的主干长度很长的话)的环长度。在某些情况下，具有长度超过21个核苷酸的双链体区域的发夹结构可促进有效的siRNA指导的沉默，而不管环序列和长度如何。

本公开的复制性逆转录病毒也可通过表达经工程改造的siRNA或miRNA(Dennis，Nature，418：122 2002)而用于改善疾病，所述siRNA或miRNA关闭或降低控制患病细胞(包括肿瘤细胞)增殖或存活的关键基因的表达。此类靶标包括例如Rad 51等基因，Rad 51是DNA修复中的关键酶，且在没有它的情况下细胞生长会受到显著限制。其它靶标包括控制细胞生长的许多信号传导途径分子(Marquez & McCaffrey Hum Gene Ther.19：27 2008)。载体将在整个肿瘤中复制，且在生长抑制发生之前，病毒首先整合入宿主基因组中并在该细胞的生长被抑制之后继续产生病毒。用于筛选功能性miRNA或siRNA序列的方法在本领域中是已知的。一般来说，设计有效siRNA或miRNA序列中的关键特征通常是避免“脱靶”作用。然而，对于使用对肿瘤细胞具有高特异性的复制型载体，例如本公开中的那些来说，这些副作用不是非常重要，因为期望细胞最终都会死亡。本公开的载体将使用来自对应蛋白质没有被显著靶向的其它物种的细胞产生。此类细胞包括狗细胞系或鸡细胞系。备选地，病毒可以通过瞬时转染人293衍生细胞或允许有效瞬时转染的其它细胞系产生。对于该用途，病毒不需要表达IRES，且siRNA或miRNA序列只需插入在病毒基因组的适宜位点。该位点包括包膜下游和复制性逆转录病毒的3’LTR上游的区域。备选地，polIII转录单元可插入具有适当siRNA或miRNA的病毒基因组中，优选插入3’包膜基因下游。可插入数个不同的siRNA或miRNA序列以确保靶基因的有效下调或一个以上基因的下调。合适的序列和靶标可以从本领域技术人员已知的来源获得。例如：

·MIT/ICBP siRNA Database http:(//)web.mit.edu/sirna/-″The MIT[Massachusetts Institute of Technology]/ICBP[Integrative Cancer Biology Program]siRNA数据库是大学范围的科研成果，其用于将这些实验验证的试剂分类且使该信息可供MIT团体内部和之外的其它研究者使用(Massachusetts Institute ofTechnology)。

·RNAi Central-http:(//)katahdin.cshl.org：9331/RNAi_web/scripts/main2.plRNAi resources，包括siRNA和shRNA设计工具(Hannon Lab，Cold SpringHarbor Laboratory)。

·The RNAi Web-http:(//)www.rnaiweb.com/General resource。

·siDIRECT-http:(//)genomics.jp/sidirect/用于哺乳动物RNA干扰的在线靶特异性siRNA设计(University of Tokyo，Japan)。

·siRNA Database-含有针对各种生物体中所有已知mRNA序列的siRNA靶标的综合性siRNA数据库(Protein Lounge系统生物学网站的部分)。

·siRNA Database and Resources for RNA Interference Studieshttp:(//)www.rnainterference.org/

·siRNA Selector-http:(//)bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm.使用一组规则基于热动力学参数(Khvorova等人，2003；Schwarz等人，2003)和由Dharmacon开发的序列相关决定因素(Reynolds等人，2004)来评估siRNA功能性。针对UniGene数据库使用BLAST来确定特异性(Wistar Institute)。

·siRNA Target Finderhttp:(//)www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html(Ambion)。

本公开的复制性逆转录病毒也可表达天然存在的siRNA的靶标，所述靶标在表达上局限于特定细胞类型，使得载体复制在那些细胞类型中被显著抑制。对于抗肿瘤目的，以一定水平天然复制的一些体内正常细胞是造血细胞、肠壁细胞和一些内皮细胞。这些正常细胞是在循环中可有效感染病毒的潜在位点。一般来说这是不合需要的。例如这些正常细胞等细胞的任何离群感染(strayinfection)可通过在这些细胞类型中包含天然存在的siRNA或siRNA组合的靶标来抑制。已经证明使用siRNA靶标抑制免疫反应的一些可行性(Brown等人，Nat Biotechnol.2007 25：1457-67)。这些靶标是与天然存在的siRNA序列具有同源匹配的小RNA序列。这些序列可以插入到本发明载体的任何适宜位点中，一般不会对载体活力造成显著有害的后果，除非在期望类型的细胞中。载体可如先前所述制备和使用。siRNA靶标可以插入到转基因的3’，但在3’LTR之前或IRES上游，和包膜3’端之后。一般来说，靶标不会插入到蛋白质编码序列中。

在其它实施方案中，异源多核苷酸可包含细胞因子，例如白细胞介素、γ干扰素等。

通常，本公开的重组病毒能够将核酸序列转移到靶细胞中。

术语“核酸调节结构域”总体是指启动子序列(例如pol II启动子序列)、多腺苷化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、增强子等，这些序列总体用于接受细胞中编码序列的复制、转录和翻译。并不是所有的这些控制序列都必须存在，只要所选的编码序列能在适当宿主细胞中复制、转录和翻译即可。本领域技术人员容易从公开数据库和材料鉴定调节核酸序列。此外，本领域技术人员可鉴定适用于预期用途，例如体内、间接体内或体外的调节序列。

术语“启动子区”在本文中以其普通意义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列来源于能结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的基因。调节序列可与预期基因序列同源或异源。例如，可利用多种启动子，包括上文所述的病毒或哺乳动物启动子。

异源核酸序列有代表性地处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制下，且逆转录病毒LTR内保留的信号仍可导致载体有效地整合到宿主细胞基因组中。因此，本公开的重组逆转录病毒载体、期望序列、基因和/或基因片段可插入至一些位点中并处于不同调节序列控制下。例如，插入位点可以是病毒增强子/启动子邻近位点(即5’LTR驱动的基因座)。备选地，期望序列可插入至调节序列远端位点(例如env基因3’的IRES序列)中或存在两个或两个以上异源序列的地方，一个异源序列可处于第一调节区的控制下且第二异源序列可处于第二调节区的控制下。其它远端位点包括病毒启动子序列，其中一个或一个以上期望序列的表达经过启动子邻近顺反子的剪接，且可使用内部异源启动子(例如SV40或CMV)或内部核糖体进入位点(IRES)。

在一个实施方案中，本公开的逆转录病毒基因组包含含有用于插入期望多核苷酸序列的克隆位点的IRES。在一个实施方案中，IRES位于逆转录病毒载体中env基因的3’，但位于期望异源核酸的5’。因此，编码期望多肽的异源多核苷酸序列有效连接于IRES。

在另一个实施方案中，包含靶向多核苷酸序列作为本公开的重组逆转录病毒载体的部分。靶向多核苷酸序列是靶向配体(例如肽激素例如调蛋白、单链抗体、受体或受体的配体)、组织特异性或细胞类型特异性调节元件(例如组织特异性或细胞类型特异性启动子或增强子)或靶向配体与组织特异性/细胞类型特异性调节元件的组合。优选地，靶向配体有效连接于逆转录病毒的env蛋白，从而产生嵌合逆转录病毒env蛋白。病毒GAG、病毒POL和病毒ENV蛋白可来源于任何合适的逆转录病毒(例如MLV或慢病毒衍生的逆转录病毒)。在另一个实施方案中，病毒ENV蛋白是非逆转录病毒衍生的(例如α病毒、CMV或VSV)。

因此本公开的重组逆转录病毒可以以使病毒靶向于特定细胞类型(例如平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、赘生性细胞、神经胶质瘤细胞、神经元细胞和本领域中已知的其它细胞)的方式遗传修饰，使得核酸基因组被递送到非分裂靶细胞、分裂靶细胞或具有细胞增殖病症的靶细胞。靶向可以以两种方法实现。第一种方法通过结合在细胞外表面上具有分子的细胞而将逆转录病毒导向靶细胞。这种靶向逆转录病毒的方法利用靶向配体在逆转录病毒包膜上的表达，以便帮助病毒靶向于具有与逆转录病毒表面上的靶向配体相互作用的受体或结合分子的细胞或组织。在病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞且逆转录病毒遗传物质可整合入宿主细胞基因组中。第二种靶向方法利用细胞或组织特异性调节元件，以促进病毒基因组在主动利用调节元件的所靶向细胞中的表达和转录，如下文更详细地描述。然后转移的逆转录病毒遗传物质在宿主细胞内被转录和翻译成蛋白质。靶向调节元件有代表性地连接于5’和/或3’LTR，从而产生嵌合LTR。

通过将目的异源核酸序列连同编码例如特异性靶细胞上受体的配体的另一个基因插入到本公开的病毒载体中，现在载体对靶标具有特异性。病毒载体可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向可使用以病毒载体为目标的抗体来完成。本领域技术人员将了解或容易确定，使得含有目的核酸序列的病毒载体进行靶特异性递送的可插入至病毒基因组中的特异性多核苷酸序列或者可与病毒包膜连接的蛋白质。

因此，在一个实施方案中，本公开包括嵌合env蛋白，其包含有效连接于靶向多肽的逆转录病毒env蛋白。靶向多肽可以是细胞特异性受体分子、细胞特异性受体的配体、针对细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段，或本领域中容易鉴定的可结合靶细胞或与靶细胞相互作用的任何其它配体。靶向多肽或分子的实例包括使用生物素-链亲和素作为连接体的二价抗体(Etienne-Julan等人，J.Of General Virol.，73，3251-3255(1992)；Roux等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA86，9079-9083(1989))；在包膜中含有编码针对半抗原的单链抗体可变区的序列的重组病毒(Russell等人，Nucleic Acids Research，21，1081-1085(1993))；将肽激素配体克隆到逆转录病毒包膜中(Kasahara等人，Science，266，1373-1376(1994))；嵌合EPO/env构建体(Kasahara等人，1994)；针对亲嗜性MLV包膜中的低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体，导致表达LDL受体的HeLa细胞的特异性感染(Somia等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，92，7570-7574(1995))；类似地，ALV的宿主范围可通过整合整联蛋白配体而改变，使得病毒现在能跨种特异性地感染大鼠成胶质细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann等人，J.Virol.68，4609-4619(1994))；且Dornberg和其合作者(Chu和Dornburg，J.Virol 69，2659-2663(1995))已经报导了脾坏死病毒(SNV)(一种禽逆转录病毒)的组织特异性靶向，其使用含有针对肿瘤标记导向的单链抗体的包膜。

本公开提供一种产生能感染靶细胞的重组逆转录病毒的方法，其包括用以下载体转染合适的宿主细胞：包含编码病毒gag、病毒pol和病毒env的多核苷酸序列的载体，其中所述载体含有用于引入与调节核酸序列有效连接的异源基因的克隆位点；和回收重组病毒。

本公开的逆转录病毒和方法提供复制型逆转录病毒，其不需要辅助病毒或其它核酸序列或蛋白质即可传播和产生病毒体。例如，本公开的逆转录病毒的核酸序列编码例如本文分别讨论的组特异性抗原和逆转录酶(以及对于成熟和逆转录所必需的整合酶和蛋白酶)。病毒gag和pol可来源于慢病毒如HIV或者γ逆转录病毒如MoMLV。此外，本公开的逆转录病毒的核酸基因组包括编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可来源于任何逆转录病毒。env可以是允许转导人和其它物种细胞的双嗜性包膜蛋白；只能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白；异嗜性包膜；GALV包膜；RD114包膜；FeLV包膜；或其它逆转录病毒包膜。包膜也可以是异源来源，例如α病毒、CMV或VSV的包膜。此外，可能需要通过将包膜蛋白与用于靶向于特定细胞类型的受体抗体或特定配体连接来靶向重组病毒。如上所述，逆转录病毒载体可通过插入例如糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向通常通过使用抗体将逆转录病毒载体靶向于特定细胞类型上的抗原(例如在某些组织中发现的细胞类型，或癌细胞类型)来实现。本领域技术人员将认识到或无需过度实验即可容易地确定，用于将逆转录病毒载体递送于特异性靶标的特定方法。在一个实施方案中，env基因来源于非逆转录病毒(例如α病毒、CMV或VSV)。逆转录病毒来源的env基因实例包括，但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。也可使用其他env基因，例如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白质G)、巨细胞病毒包膜(CMV)或流感病毒血细胞凝集素(HA)。

在一个实施方案中，逆转录病毒基因组来源于γ逆转录病毒，且更具体地来源于哺乳动物γ逆转录病毒。“来源”意思是指亲本多核苷酸序列是已经通过插入或去除天然存在的序列(例如插入IRES、插入编码目的多肽或抑制核酸的异源多核苷酸、用来自不同逆转录病毒或病毒的更有效的启动子替换野生型启动子等)而修饰的野生型γ逆转录病毒。

与本领域标准方法所产生的重组逆转录病毒存在缺陷且需要帮助才可产生感染性载体粒子不同，本公开提供具有复制能力的逆转录病毒。

在另一个实施方案中，本公开提供使用调节序列而靶向的逆转录病毒载体。可利用细胞或组织特异性调节序列(例如启动子)来靶向基因序列在特异性细胞群体中的表达。本文其它地方描述用于本公开的合适哺乳动物和病毒启动子。因此，在一个实施方案中，本公开提供在逆转录病毒基因组的5’端具有组织特异性启动子元件的逆转录病毒。优选地，组织特异性调节元件/序列位于逆转录病毒基因组LTR的U3区中，包括例如用于赘生性细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(例如肿瘤细胞特异性增强子和启动子)，和诱导型启动子(例如四环素)。

本公开的转录控制序列也可包括与编码超抗原、细胞因子或趋化因子的基因天然相关的天然存在的转录控制序列。

在一些情况下，可能需要调节表达。例如，取决于期望表达水平，可利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，经常使用CMV立即早期启动子来提供强转录活化。当期望转基因的表达水平降低时，还使用了效力较低的CMV启动子的修饰形式。当期望转基因在造血细胞中表达时，可使用逆转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTR。可使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2 LTR、腺病毒启动子(例如来自E1A、E2A或MLP区)、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽类肉瘤病毒。

可使用类似的组织特异性或选择性启动子来实现在特异性组织或细胞中的转录，以便降低对非靶向组织的潜在毒性或不当影响。例如，可使用例如PSA、probasin、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hK2)等启动子来靶向前列腺中的基因表达。表1列举可使用的其它启动子/调节结构域。

在某些适应症中，可能需要在施用基因治疗载体之后的特定时间激活转录。这可以使用例如激素或细胞因子调节的启动子进行。例如，在适应症是产生或分送特异性类固醇的性腺组织的治疗应用中，使用雄激素或雌激素调节的启动子可能是有利的。此类激素调节的启动子包括MMTV、MT-1、蜕皮激素和RuBisco。可使用其它激素调节的启动子，例如响应于甲状腺、垂体和肾上腺激素的启动子。可使用的细胞因子和炎症蛋白响应启动子包括K和T激肽原(Kageyama等人，1987)、c-fos、TNF-α、C反应蛋白(Arcone等人，1988)、触珠蛋白(Oliviero等人，1987)、血清淀粉样蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，1989)、补体C3(Wilson等人，1990)、IL-8、α-1酸性糖蛋白(Prowse和Baumann，1988)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂酶(Zechner等人，1988)、血管紧张素原(Ron等人，1990)、纤维蛋白原、c-jun(可由佛波醇酯、TNF-α、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(由佛波醇酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(可由重金属和糖皮质激素诱导)、溶基质蛋白酶(可由佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶。也可使用肿瘤特异性启动子，例如骨钙蛋白、缺氧反应元件(HRE)、MAGE-4、CEA、α-甲胎蛋白、GRP78/BiP和酪氨酸酶来调节肿瘤细胞中的基因表达。

此外，所述启动子清单不应解释为详尽的或限制性的，本领域技术人员将知晓可与本文所公开的启动子和方法结合使用的其它启动子。

表1组织特异性启动子

“组织特异性调节元件”是能驱动基因在一种组织中转录同时在其它组织类型中大体上保持“沉默”的调节元件(例如启动子)。然而，应当理解组织特异性启动子在其沉默的那些组织中可具有可检测量的“背景”或“基础”活性。启动子在靶组织中被选择性地活化的程度可用选择性比(靶组织中的活性/对照组织中的活性)表示。就此而言，可用于本公开的实践中的组织特异性启动子有代表性地具有大于约5的选择性比。选择性比优选地大于约15。

应进一步理解，某些启动子虽然在活性上不局限于单一组织类型，但仍然可能显示选择性，因为其在一组组织中可能有活性，而在另一组组织中活性较低或沉默。所述启动子也称为“组织特异性的”，且考虑用于本公开中。例如，在各种中枢神经系统(CNS)神经元中有活性的启动子可在治疗上用于防止因可影响许多不同的大脑区域的中风所致的伤害。因此，本公开中所用的组织特异性调节元件适用于调节异源蛋白以及可用作本发明逆转录病毒载体中的靶向多核苷酸序列。

本公开的逆转录病毒载体和CD多核苷酸和多肽可用于治疗多种疾病和病症，包括许多细胞增殖疾病和病症(参见例如美国专利号4,405,712和4,650,764；Friedmann，1989，Science，244：1275-1281；Mulligan，1993，Science，260：926-932；R.Crystal，1995，Science 270：404-410，每篇文献全文通过参考并入本文；还可参见The Development of Human Gene Therapy，Theodore Friedmann编，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999.ISBN 0-87969-528-5，其全文通过参考并入本文中)。

短语“非分裂”细胞是指未经历有丝分裂的细胞。非分裂细胞可以在细胞周期的任何点(例如G₀/G₁、G_1/S、G_2/M)被阻断，只要细胞没有活跃地分裂。对于间接体内感染，可通过本领域技术人员所用的标准技术，包括照射、阿非迪霉素(aphidocolin)处理、血清饥饿和接触抑制处理分裂细胞以阻断细胞分裂。然而，应当理解间接体内感染通常不会阻断细胞，这是因为许多细胞已被阻遏(例如干细胞)。例如，不论使用何种机制阻断细胞分裂或细胞在细胞周期中哪一点被阻断，重组慢病毒载体能感染任何非分裂细胞。体内预先存在的非分裂细胞的实例包括神经元、肌肉、肝、皮肤、心脏、肺和骨髓细胞和其衍生物。对于分裂细胞可使用γ逆转录病毒载体，因为其只能感染分裂中的细胞。

“分裂”细胞意思是指经历活跃的有丝分裂或减数分裂的细胞。所述分裂细胞包括干细胞、皮肤细胞(例如成纤维细胞和角化细胞)、生殖细胞和本领域中已知的其它分裂细胞。术语分裂细胞尤其关注且涵盖具有细胞增殖病症的细胞，例如赘生性细胞。术语“细胞增殖病症”是指特征为细胞数目异常的病症。病症可包括肥大(细胞连续繁殖，导致细胞群体在组织内过度生长)和不足(组织内的细胞缺乏或不足)细胞生长，或细胞过量流入或迁移入身体区域。细胞群体不一定是转化的、致瘤性的或恶性的细胞，也可包括正常细胞。细胞增殖病症包括与结缔组织过度生长有关的病症，例如各种纤维化病症，包括硬皮病、关节炎和肝硬化。细胞增殖病症包括肿瘤病症，例如头颈癌。头颈癌包括例如口癌、食道癌、咽喉癌、喉癌、甲状腺癌、舌癌、唇癌、唾液腺癌、鼻癌、副鼻窦癌、鼻咽癌、上鼻道癌和鼻窦癌、嗅神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、鼻腔鼻窦未分化癌(SNUC)、脑肿瘤(包括成胶质细胞瘤)或血液肿瘤。还包括区域淋巴结癌，所述区域淋巴结包括颈淋巴结、喉前淋巴结、肺食管旁淋巴结和下颌下淋巴结(Harrison′s Principles of Internal Medicine(Isselbacher等人编，McGraw-Hill，Inc.，第13版，第1850-1853页，1994)。其它癌症类型包括，但不限于肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、淋巴瘤、口腔癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、胃癌、皮肤癌和卵巢癌。

本公开还提供用于治疗细胞增殖病症的基因治疗。此种治疗通过将适当的治疗性多核苷酸序列(例如反义分子、核酶、自杀基因、siRNA)引入到患有增殖病症的受试者的细胞中来实现其治疗效果。多核苷酸构建体可使用本公开的重组逆转录病毒载体递送，尤其在所述载体基于MLV时，其只能感染分裂细胞并在被感染细胞中被持续产生，即使在细胞停止分裂之后。

此外，如本文所述的治疗方法(例如基因治疗或基因递送方法)可在体内或间接体内进行。优选在基因治疗之前去除大部分肿瘤，例如通过外科手术或通过放射。外科手术或放射也可在基因治疗之后使用。在一些方面，逆转录病毒治疗可在化学治疗之后或之前进行。

因此，本公开提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或赘生性细胞的重组逆转录病毒，其中重组逆转录病毒包含病毒GAG；病毒POL；病毒ENV；有效连接于IRES或内部启动子的异源核酸；和对于包装、逆转录和整合所必需的顺式作用核酸序列。重组逆转录病毒可以是慢病毒如HIV，或可以是γ逆转录病毒。如上文对于产生重组逆转录病毒的方法所述，本公开的重组逆转录病毒可进一步包括VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV和VPU蛋白中的至少一种。不希望受特定理论束缚，相信这些基因/蛋白产物中的一种或一种以上对于增加所产生的重组逆转录病毒(例如NEF)的病毒滴度至关重要，或可能有利于在具有高含量的病毒限制元件(例如，对于具有活性APOBEC3G或等效物的细胞来说，采用VIF)的细胞中进行感染和包装病毒粒子。

本公开还提供一种将核酸转移到靶细胞以提供特定核酸(例如异源序列)表达的方法。因此，在另一个实施方案中，本公开提供一种在靶细胞中引入和表达异源核酸的方法，其包括用本公开的重组病毒感染靶细胞，和在靶细胞中表达异源核酸。如上文所述，靶细胞可以是任何细胞类型，包括分裂、非分裂、赘生性、永生化、经修饰细胞和本领域技术人员知晓的其它细胞类型，只要它们能被逆转录病毒感染即可。

可能需要通过用本公开的方法引入核酸序列(例如异源核酸序列)来调节细胞中的基因表达，其中核酸序列例如产生反义或核酶分子。术语“调整”表示当基因过度表达时抑制基因表达，或者当基因表达不足时增强基因表达。当细胞增殖病症与基因表达相关时，可使用在翻译水平上干扰基因表达的核酸序列。这种方法利用例如反义核酸、核酶或三股螺旋试剂，通过用反义核酸或三股螺旋试剂屏蔽特异性mRNA，或通过用核酶裂解特异性mRNA来阻断所述mRNA的转录和翻译。

反义核酸是与特异性mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub，Scientific American，262：40，1990)。在细胞中，反义核酸与相应mRNA杂交，形成双链分子。因为细胞无法翻译双链mRNA，所以反义核酸干扰mRNA的翻译。优选约15个核苷酸的反义寡聚物，这是因为其容易合成且在引入靶细胞中时相比大分子引起问题的可能性较小。使用反义方法抑制基因体外翻译在本领域中是众所周知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，1988)。

反义核酸可用于阻断突变蛋白或优势活性基因产物(例如在阿尔茨海默病中积累的淀粉状前体蛋白的表达。此类方法也可用于治疗亨廷顿舞蹈病、遗传性帕金森综合症和其它疾病。特别关注对与细胞增殖病症有关的基因进行阻断。反义核酸也可用于抑制与毒性有关的蛋白的表达。

使用寡聚核苷酸阻断转录被称为三链体策略，这是因为寡聚物在双螺旋DNA周围缠绕，形成三股螺旋。因此，这些三链体化合物可设计用于识别选定基因上的独特位点(Maher等人，Antisense Res.and Dev.，1(3)：227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。

核酶是能够以与DNA限制性内切酶类似的方式特异性地裂解其它单链RNA的RNA分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，有可能对识别RNA分子中的特异性核苷酸序列并将其裂解的分子进行工程改造(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1988)。该方法的主要优点在于，因为这些分子是序列特异性的，所以只有具有特定序列的mRNA才被失活。

可能需要转移编码生物反应调节剂(例如细胞因子)的核酸。该类别包括免疫强化剂，包括编码被分类为“白细胞介素”的许多细胞因子的核酸。这些细胞因子包括例如白细胞介素1至15。虽然不一定根据相同机制工作，但该类别也包括干扰素且尤其是γ干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其它多肽包括例如血管生成因子和抗血管生成因子。可能需要将该类核酸递送到骨髓细胞或巨噬细胞以治疗酶缺乏或免疫缺陷。也可将编码生长因子、毒性肽、配体、受体或其它生理学上重要的蛋白质的核酸引入到特定靶细胞中。

例如，EGF受体家族成员HER2(参见例如SEQ ID NO：23和24)是药物曲妥珠单抗(赫赛汀^TM，Genentech)的结合靶标。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的介导物。活性利用免疫组织化学优先被靶向于2+和3+级过度表达的HER2表达细胞，而不是1+级和非表达细胞(赫赛汀处方信息，Crommelin 2002)。通过在低HER2肿瘤中引入表达HER2或截短HER2(只表达胞外结构域和跨膜结构域)的载体来增强HER2的表达可促进ADCC的最佳触发并克服在临床应用上观察到的快速出现HER2抗性。

用yCD2取代HER2的胞内结构域可实现HER2的细胞表面表达和yCD2的胞质定位。HER2胞外结构域(ECD)和跨膜结构域(TM)(约从175位到2200位的约2026bp)可通过PCR扩增(Yamamoto等人，Nature 319：230-234，1986；Chen等人，Canc.Res.，58：1965-1971，1998)或化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Ontario，加拿大)，并插入载体pAC3-yCD2 SEQ ID NO：19中的IRES与yCD2基因之间。备选地，yCD基因可被切除并用编码HER2多肽或其片段的多核苷酸取代。仅具有ECD和TM结构域的赫赛汀结合结构域IV(从1910位到2200位的约290bp)的另一种截短HER2可如上文所述扩增或化学合成并使用(Landgraf 2007；Garrett等人，J.of Immunol.，178：7120-7131，2007)。具有融合于IV和TM结构域的天然信号肽(175-237位的约69bp)的该截短形式的另一种修饰体可如上文所述化学合成和使用。所得到的病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。

或者，如上所述的HER2和修饰体可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码包膜和目的基因的复制型性(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum等人，Mol.Therapy，13(6)：1050-1063，2006)。例如，多核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的GAG和POL和yCD2基因缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV结构域，且IRES或启动子例如RSV有效地直接连接于HER2、HER2 ECDTM、HER2 ECDIVTM或HER2SECDIVTM。

用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒体[Emi 1991]。这一点同样适用于伪装逆转录病毒粒子的其它包膜。例如，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和HER2(或变体)的子代病毒体。所得到的病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。

形成曲妥珠单抗抗性的另一方面涉及干扰曲妥珠单抗活性所必需的胞内信号传导。抗性细胞显示PTEN缺失和p27kip1表达较低(Fujita，Brit J.Cancer，94：247，2006；Lu等人，Journal of the National Cancer Institute，93(24)：1852-1857，2001；Kute等人，Cytometry Part A 57A：86-93，2004)。

例如，编码PTEN的多核苷酸(SEQ ID NO：25)可化学合成(BioBasic Inc.，Markham，加拿大)，并有效地直接插入载体pAC3-yCD2 SEQ ID NO：19或22中的yCD2基因之后，或连同先前所述的连接体序列一起插入，或代替yCD2插入。在另一个实施例中，编码PTEN的多核苷酸可如上合成，并插入在IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接体一起插入。

备选地，PTEN可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码包膜和目的基因的复制型(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：12021991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu，Rev Med Virol.2000，Baum，Mol.Ther.13(6)：1050-1063，2006)。例如，多核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的gag和pol和yCD2基因缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV结构域，且IRES或启动子例如RSV有效地直接连接于PTEN。

用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒体[Emi 1991]。这一点同样适用于伪装逆转录病毒粒子的其它包膜。例如，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和PTEN(或变体)或只编码PTEN的子代病毒体。所得到的病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。

类似地，编码p27kip1的多核苷酸(SEQ ID NO：27和28)可化学合成(BioBasic Inc.，Markham，加拿大)，并有效地直接插入载体pAC3-yCD2 SEQID NO：19中的yCD2基因后，或连同连接体序列一起插入。在另一个实施例中，编码p27kip1的多核苷酸可如上合成并插入到IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接体一起插入，或代替yCD2基因插入。

备选地，p27kip1可在含有不同env基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码包膜和目的基因的复制型或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006，上文)。例如，多核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的gag和pol和yCD2基因缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV结构域，且IRES或启动子例如RSV有效地直接连接至p27kip1。

用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒体[Emi 1991]。这一点同样适用于伪装逆转录病毒粒子的其它包膜。例如，如上所述来源于SEQ ID NO：19和TT的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和p27kip1(或变体)的子代病毒体。所得到的病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。

在另一个实施例中，CD20是药物利妥昔单抗(Rituxan^TM，Genentech)的结合靶标。利妥昔单抗是补体依赖性细胞毒性(CDC)和ADCC的介导物。根据流式细胞术测量，具有较高平均荧光强度的细胞显示对利妥昔单抗敏感性提高(van Meerten等人，Clin Cancer Res 2006；12(13)：4027-4035，2006)。通过在低CD20 B细胞中引入表达CD20的载体来增强CD20表达可促进ADCC的最佳触发。

例如，编码CD20的多核苷酸(SEQ ID NO：29和30)可化学合成(BioBasicInc.，Markham，加拿大)，并连同先前所述的连接体序列一起有效地直接插入载体pAC3-yCD2(-2)SEQ ID NO：19或22中的yCD2基因之后，或代替yCD2基因插入。在另一个实施例中，编码CD20的多核苷酸可如上合成，并插入到IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接体一起插入。作为另一个替代方案，CD20序列可在通过Psi1和Not1消化切除CD基因后插入到pAC3-yCD2载体中。

在另一个实施例中，编码CD20的多核苷酸(SEQ ID NO：29和30)可化学合成(BioBasic Inc.，Markham，加拿大)，并插入含有非双嗜性env基因或其它适当表面蛋白的载体中(Tedder等人，PNAS，85：208-212，1988)。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu2000，Baum 2006)。例如，多核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的gag和pol和yCD2基因缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV结构域，且IRES或启动子例如RSV有效地直接连接至CD20。

用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒体[Emi 1991]。这一点同样适用于伪装逆转录病毒粒子的其它包膜。例如，如上所述来源于SEQ ID NO：19或22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和CD20的子代病毒体。所得到的病毒可与美罗华(Rituxan)和/或5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。类似地，用仅编码CD20标记的载体感染肿瘤可导致肿瘤可使用美罗华来治疗。

嘧啶合成代谢中所涉及的酶和辅因子的水平可构成限制。与敏感细胞系相比，OPRT、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、尿苷一磷酸激酶和嘧啶核苷磷酸化酶在5-FU抗性癌细胞中的表达水平低(Wang等人，Cancer Res.，64：8167-8176，2004)。大群体分析显示酶含量与疾病结果的相关(Fukui等人，Int’l.J.OF Mol.Med.，22：709-716，2008)。可利用CD和其它嘧啶合成代谢酶(PAE)的共表达来增加活性且因此增加氟嘧啶药物的治疗指数。

为了进一步增加含yCD2/PAE载体的遗传稳定性(参见例如图5)，可化学合成在序列中具有随机突变的酶编码基因。这些突变可以是基本上随机的，或可以仅由每个氨基酸的摆动位置上的突变组成。突变序列的文库如先前对于SEQ ID NO：11和13所述插入到yCD2基因下游，以产生质粒文库，其可接着通过瞬时转染293T细胞或同等物而用于产生感染粒子文库。可用编码融合多肽的逆转录病毒感染敏感细胞并用适当化学物进行筛选。例如，可化学合成随机突变的疱疹胸腺嘧啶核苷激酶(TK)(Bio Basic Inc，Markham，加拿大)。合成的序列可插入SEQ ID NO：19中的yCD2序列的3’，或在切除CD2基因后独自插入pAC3-yCD2载体骨架中。如先前所述包装逆转录病毒载体混合物。用载体感染小鼠成纤维细胞LMTK细胞并在HAT培养基中筛选TK活性(Hiller等人，Mol.Cell Biol.8(8)：3298-3302，1988)。在HAT培养基中再次筛选的新鲜LMTK细胞的抗性细胞上清液的连续传代可筛选出稳定表达TK的载体。可分离TK⁺抗性细胞并用基于PCR的标准技术拯救TK序列以用于突变分析(Cowell等人，CDNA Library Protocols，由Humana Press发行，1996)。以此方式，根据功能蛋白表达和逆转录病毒载体构建体的基因组稳定性筛选序列。类似策略可用于UPRT(SEQ ID NO：11，13)、OPRT(SEQ ID NO：15，17)(Olah等人，CancerRes.40：2869-2875，1980；和Suttle，Somatic Cell & Mol.Genet.，15(5)：435-443，1989)和其它目的基因。

备选地，OPRT、UPRT、TK或其它PAE可在含有不同ENV基因或其它适当表面糖蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码包膜和目的基因的复制型(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006，上文)。例如，多核苷酸可包括如下序列，其中GAG和POL基因缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV结构域，且IRES或启动子例如RSV有效地直接连接于OPRT、UPRT、TK或其它PAE基因。

用VSV-g假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒体[Emi等人，J.Virol.65：1202，1991]。这一点同样适用于伪装逆转录病毒粒子的其它包膜。例如，如上所述来源于SEQ ID NO：19和20的逆转录病毒所造成的感染会在被感染细胞中产生能编码yCD2和OPRT的子代病毒体。所得病毒可与5-FC结合用于治疗受试者的细胞增殖病症。

本公开的重组逆转录病毒可用于治疗神经元病症，所述逆转录病毒例如可任选地含有外源基因，例如编码受体的基因或编码配体的基因。如上所述，此类受体包括响应于多巴胺、GABA、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸盐、乙酰胆碱和其它神经肽的受体。可在神经元病症中提供治疗作用的配体的实例包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸和5-羟色胺。被感染的供体细胞分泌必需配体之后，所述配体发生扩散和摄取在受试者的神经细胞在产生这种基因产物方面存在缺陷的病症中是有益的。经遗传修饰以分泌神经营养因子，例如神经生长因子(NGF)的细胞可用于防止胆碱能神经元退化，所述神经元如果不经治疗可能会死亡。

备选地，移植入患有基底神经节病症，例如帕金森病’的受试者中的细胞可被修饰以含有编码多巴胺前体L-DOPA的外源基因。帕金森症的特征在于中脑黑质中缺少以基底神经节作为主要靶器官的多巴胺神经元。

可用本公开的方法类似地治疗的其它神经元病症包括阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、因中风引起的神经元损伤和脊髓损伤。阿尔茨海默病的特征在于基底前脑的胆碱能神经元发生退化。这些神经元的神经递质是乙酰胆碱，其是所述神经元的生存所必需的。可如上所述用本公开的方法植入被本公开的重组逆转录病毒感染的胆碱能细胞，所述逆转录病毒含有可促进这些神经元生存的因子的外源基因。在中风后，海马以及皮层细胞的CA1中的细胞发生选择性损失，这可能是这些患者的认知功能和记忆丧失的基础原因。一旦被鉴定出来，负责CA1细胞死亡的分子可通过本公开的方法抑制。例如，反义序列或编码拮抗剂的基因可转移到神经元细胞中并植入大脑海马区。

对于因蛋白产物缺乏而引起的疾病，基因转移可将正常基因引入受累组织以用于取代治疗，以及利用反义突变来产生疾病的动物模型。例如，可能需要将因子IX编码核酸插入用于感染肌肉或肝细胞的逆转录病毒中。

本公开还提供用于治疗细胞增殖病症或免疫病症的基因治疗。此种疗法通过将反义、siRNA或显性失活编码多核苷酸引入具有增殖病症的细胞中来实现治疗作用，其中多核苷酸结合与细胞增殖病症相关的基因并阻止其翻译或表达。可使用本公开的重组逆转录病毒载体递送适用于治疗或调节细胞增殖病症的异源核酸(例如反义或siRNA多核苷酸)。在另一个实施方案中，通过引入本公开的CD多核苷酸、表达多核苷酸以产生包含胞嘧啶脱氨酶活性的多肽和使细胞与5-氟胞嘧啶在可产生细胞毒性量的5-FU的量和时间下接触来治疗细胞增殖病症。

此外，本公开提供编码本公开的重组逆转录病毒载体的多核苷酸序列。多核苷酸序列可整合到多种病毒粒子中。例如，可用于基因治疗的多种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘或优选RNA病毒，例如逆转录病毒，且更加特别地是哺乳动物γ逆转录病毒。逆转录病毒载体可以是鼠、猿或人逆转录病毒衍生物。可插入外源基因(例如异源多核苷酸序列)的逆转录病毒载体的实例包括，但不限于：鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒内源性病毒(BEV)和猫病毒RD114的衍生物。所有这些载体都可以转移或整合选择标记的基因，以便可鉴别和产生转导的细胞。例如，通过将目的异源序列连同编码特异性靶细胞上受体的配体的另一个基因插入病毒载体中，载体现在对靶标具有特异性。逆转录病毒载体可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。可使用以逆转录病毒载体为靶标的抗体或配体来实现靶向。本领域技术人员了解或无需过度实验即可容易确定，可插入逆转录病毒基因组中或连接于病毒包膜以允许含异源多核苷酸的逆转录病毒载体的靶标特异性递送的特异性多核苷酸序列。此外，逆转录病毒载体可通过利用包含于逆转录病毒基因组LTR中的细胞或组织特异性调节元件而靶向细胞。优选地，细胞或组织特异性调节元件位于LTR的U3区。因此，在整合入细胞之后，逆转录病毒基因组只在细胞或组织特异性启动子活跃的细胞中表达。

在另一个实施方案中，本公开提供包含重组逆转录病毒来源的构建体的质粒。质粒可以直接引入靶细胞或细胞培养物中，例如NIH 3T3或其它组织培养细胞。所得到的细胞将逆转录病毒载体释放到培养基中。

本公开提供一种多核苷酸构建体，其从5’到3’包含：可用于起始转录的启动子或调节区；psi包装信号；gag编码核酸序列；pol编码核酸序列；env编码核酸序列；内部核糖体进入位点核酸序列；编码标记、治疗或诊断多肽的异源多核苷酸；和LTR核酸序列。如本文其它地方所述和如下所示，本公开的多核苷酸构建体的多种区段(例如重组复制型逆转录病毒多核苷酸)部分取决于期望宿主细胞、表达时间或表达量和异源多核苷酸而经工程改造。本公开的复制型逆转录病毒构建体可分为多个结构域，它们可由本领域技术人员个别地修饰。

例如，启动子可包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所阐述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或一个以上(例如2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100个或以上核酸碱基)核酸碱基所作的修饰，只要经修饰的启动子能够引导和起始转录即可。在一个实施方案中，启动子或调节区包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。CMV-R-U5结构域包含针对MLV R-U5区的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。在一个实施方案中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所阐述的序列，或与如SEQ ID NO：19、20或22所阐述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多核苷酸促进与其有效连接的核酸分子的转录。多核苷酸的gag结构域可来源于多种逆转录病毒，但有代表性地来源于γ逆转录病毒且更加特别地来源于哺乳动物γ逆转录病毒。在一个实施方案中，gag结构域包含约核苷酸1203到约核苷酸2819的序列，或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多核苷酸的pol结构域可来源于多种逆转录病毒，但有代表性地来源于γ逆转录病毒且更加特别地来源于哺乳动物γ逆转录病毒。在一个实施方案中，pol结构域包含约核苷酸2820到约核苷酸6358的序列或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.9％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多核苷酸的env结构域可来源于多种逆转录病毒，但有代表性地来源于γ逆转录病毒且更加特别地来源于哺乳动物γ逆转录病毒。在一些实施方案中，env编码结构域包括双嗜性env结构域。在一个实施方案中，env结构域包含约核苷酸6359到约核苷酸8323的序列，或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多核苷酸的IRES结构域可从许多内部核糖体进入位点获得。在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在一个实施方案中，IRES结构域包含约核苷酸8327到约核苷酸8876的序列，或与所述序列具有至少95％、98％或99％(四舍五入到十分位)同一性的序列，只要所述结构域允许核糖体进入即可。异源结构域可包含本公开的胞嘧啶脱氨酶。在一个实施方案中，CD多核苷酸包含经人密码子优化的序列。在另一个实施方案中，CD多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶的突变多肽，其中所述突变赋予增加的热稳定性，这使得解链温度(Tm)升高10℃，从而允许在更为宽广的温度范围下的持续动力学活性和提高的蛋白质累积水平。在一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸8877到约9353所阐述的序列。异源结构域之后为多聚嘌呤富集结构域。3’LTR可来源于许多种逆转录病毒，有代表性地是γ逆转录病毒且优选地哺乳动物γ逆转录病毒。在一个实施方案中，3’LTR包含U3-R-U5结构域。在另一个实施方案中，LTR包含如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸9405到约9998所阐述的序列，或与所述序列具有至少95％、98％或99.5％(四舍五入到十分位)同一性的序列。

本公开还提供一种重组逆转录病毒载体，其从5’到3’依次包含：CMV-R-U5，即人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的融合体；逆转录酶的引物结合位点PBS；5’剪接位点；ψ包装信号；gag，即MLV组特异性抗原的ORF；pol，即MLV聚合酶多聚蛋白的ORF；3’剪接位点；4070A env，即MLV品系4070A的包膜蛋白的ORF；IRES，即脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点；经修饰的胞嘧啶脱氨酶(经热稳定化和密码子优化)；PPT，即多聚嘌呤区；和U3-R-U5，即MLV长末端重复序列。该结构在图3中进一步描绘。

本公开还提供一种包含如SEQ ID NO：19、20或22所阐述的序列的逆转录病毒载体。

目前已有许多化学治疗剂在市面销售，其治疗效果从完全缓解到暂时缓解不等且可延长寿命，同时疾病复发率达到预期。市面销售的一些癌症治疗剂是以肿瘤的血管生成特性为目标。组合物以肿瘤的血管生成为目标，设法减少供应给肿瘤或癌细胞的血液和营养物，从而减小肿瘤并延长受试者的寿命。VEGF是已知可在肿瘤生长中起作用的血管生成因子。因此，已经开发了作为抗癌剂的VEGF拮抗剂。

人VEGF介导正常和恶性脉管系统中的新生血管生成；其在大多数恶性肿瘤中过度表达，且已经发现高水平的VEGF与许多患者的较高转移风险和不良预后有关。当VEGF在血管生成体外模型中与其受体相互作用时，发生内皮细胞增殖和新血管形成。在动物模型中，已经证明了VEGF可诱导血管内皮细胞增殖/迁移，维持新形成血管的存活，并提高血管通透性。

VEGF拮抗剂以VEGF信号传导路径为目标或负向调节VEGF信号传导路径。实例包括VEGF抑制剂(例如直接抑制VEGF(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D)的试剂，例如通过结合VEGF(例如抗VEGF抗体，例如贝伐单抗(AVASTIN

)或兰尼单抗(LUCENTIS)，或其它抑制剂，例如派加他尼、NEOVASTAT

AE-941、VEGF Trap和PI-88))、VEGF表达调节剂(例如INGN-241、口服四硫钼酸盐、2-甲氧基雌二醇、2-甲氧基雌二醇纳米晶体分散剂、贝伐西尼钠、PTC-299、Veglin)、VEGF受体抑制剂(例如KDR或VEGF受体III(Flt4)，例如抗KDR抗体、VEGFR2抗体例如CDP-791、IMC-1121B、VEGFR2阻断剂例如CT-322)、VEGFR表达调节剂(例如VEGFR1表达调节剂Sirna-027)或VEGF受体下游信号传导抑制剂。在本文所述的一些方面中，VEGF拮抗剂是贝伐单抗、派加他尼、兰尼单抗、索拉非尼、舒尼替尼、AE-941、VEGF Trap、帕唑帕尼、凡德他尼、瓦他拉尼、西地尼布、维甲酰酚胺、角鲨胺、INGN-241、口服四硫钼酸盐、四硫钼酸盐、Panzem NCD、2-甲氧基雌二醇、AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠、AMG-706、阿西替尼、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184或ZK-304709。

贝伐单抗(AVASTATIN

)(rhuMAb-VEGF)(抗VEGF单克隆抗体)是针对血管内皮生长因子(VEGF)的重组人/鼠嵌合单克隆抗体。贝伐单抗是通过将鼠抗VEGF单克隆抗体的VEGF结合残基工程改造到人免疫球蛋白-1(IgG1)的框架区中来制备(Prod Info Avastin，2004)。只有7％的氨基酸序列来源于鼠抗体，其余93％来自IgG1。贝伐单抗通过识别两种人VEGF受体类型(flt-1和flk-1)的结合位点来结合和中和所有人VEGF形式。在动物模型中，已经显示抗体可通过抑制VEGF所诱导的血管生成来稳定已形成的肿瘤或抑制肿瘤生长。

贝伐单抗的药代动力学在0.3mg/kg或以上的剂量之后是线性的(Anon，2002)。在晚期癌症患者(n＝25)中静脉内输注0.3、1、3和10mg/kg达90分钟后，贝伐单抗的峰值血清浓度分别在5到9mcg/mL、21到39mcg/mL、52到92mcg/mL和186到294mcg/mL范围内；在重复剂量(每周一次)下观察到轻微累积，但这并不显著且药代动力学仍然保持线性。在每周一次、每2周一次或每3周一次施用1到20mg/kg后100天内获得贝伐单抗的稳态水平。

贝伐单抗的推荐剂量是每2周一次历经30分钟静脉内输注5毫克/千克，直到疾病发展减轻为止。贝伐单抗应该在化学治疗之后进行。单一药剂贝伐单抗的功效尚未确定。贝伐单抗(其可与吉西他滨和多西他赛共同施用，或在化学治疗之前或之后一周内施用)是以约1mg/kg到约15mg/kg、优选约5mg/kg静脉内施用。

本公开的方法和组合物可用于组合治疗，包括使用贝伐单抗的治疗。如本文所述，本公开的包含治疗剂(例如细胞毒性基因)的复制型逆转录病毒(RCR)可用于治疗细胞增殖病症。本公开的RCR的优点包括能够感染复制细胞癌细胞。若载体的转基因包含细胞毒性基因(例如编码将非细胞毒性剂转化为细胞毒性剂的多肽的基因)，则可提供杀死癌细胞的能力。

本公开提供治疗例如癌症和肿瘤等细胞增殖病症的方法，其包括施用本公开的RCR载体，随后用化学治疗剂或抗癌剂进行治疗，所述RCR载体是由HT1080+T5.0002细胞或可产生编码其它异源基因的类似HT1080衍生的细胞产生。在一个实施方案中，RCR载体在施用化学治疗剂或抗癌剂之前施用于受试者一段时间，使得RCR感染和复制。然后在可减少增殖或杀死癌细胞的时段和剂量下用化学治疗剂或抗癌剂治疗受试者。在一方面，如果化学治疗剂或抗癌剂治疗减少但不杀死癌/肿瘤(例如部分缓解或暂时缓解)，则受试者随后可用非毒性治疗剂(例如5-FC)治疗，所述非毒性治疗剂可在表达来自RCR的细胞毒性基因(例如胞嘧啶脱氨酶)的细胞中转化为毒性治疗剂。使用此种方法，本公开的RXCR载体在肿瘤细胞复制过程中传播，然后此类细胞可通过用抗癌剂或化学治疗剂处理而被杀死，且可使用本文所述的RCR处理方法而被进一步杀死。

在本公开的另一个实施方案中，异源基因可包含靶抗原(例如癌抗原)的编码序列。在该实施方案中，用包含编码靶抗原的异源多核苷酸的RCR感染包含细胞增殖病症的细胞，以提供靶抗原的表达(例如癌抗原的过度表达)。然后对受试者施用包含特异性地与靶抗原相互作用的靶向同源部分的抗癌剂。靶向同源部分有效连接于细胞毒性剂或自身可以是抗癌剂。因此，被包含靶向抗原编码序列的RCR感染的癌细胞可增加靶标在癌细胞上的表达，从而提高细胞毒性靶向作用的效率/功效。

已经显示阻断免疫系统细胞之间的相互作用可具有显著的活化性的或抑制性的免疫作用(Waldmann Annu Rev Med.57：65 2006)。例如，已经显示阻断CTLA-4(CD 152)与B7.1(CD80)的相互作用(其调节T细胞活化)可引起免疫刺激，推测这是因为阻断了该抑制性相互作用(Peggs等人Curr.Opin.Immunol.18：206，2006)。这种阻断可以用针对CTLA-4的抗体或用可溶性B7.1实现。全身施用这些类型的分子会具有不合需要的全身作用，其至少会导致有害副作用，在一种C28激动剂的情况中甚至会导致死亡(Suntharalingam等人NEJM 355 1018 2006)。Pfizer一直在开发一种此类抗CTLA-4阻断抗体(CP-675,206)作为抗癌剂，但是因为副作用明显，最近已经停止开发。局部递送阻断分子可提供局部免疫调节并避免这些严重副作用，所述阻断分子在用编码释放到胞外空间中的此类分子的复制型载体感染肿瘤之后，从肿瘤释放到局部环境中。阻断分子是抗体、单链抗体、天然配体的可溶形式或结合此类受体的其它肽。

在另一个实施方案中，本公开的RCR可包含含有与同源抗原或配体特异性地相互作用的结合结构域(例如抗体、抗体片段、抗体结构域或受体配体)的编码序列。然后包含结合结构域的编码序列的RCR可用于感染患有细胞增殖病症的受试者的细胞，例如癌细胞或赘生性细胞。被感染细胞然后表达结合结构域或抗体。然后可将有效连接于细胞毒性剂或自身具有细胞毒性的抗原或同源物施用于受试者。然后细胞毒性同源物选择性地杀死表达结合结构域的感染细胞。备选地，结合结构域自身可以是抗癌剂。

如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。例如，抗体可包含重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实施例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂、Fd片段、Fv片段和dAb片段)以及完整抗体。

VH和VL区可进一步细分为称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其间散布有称为“框架区”(FR)的更保守区域。框架区和CDR的范围已被精确确定(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国健康和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH公布号91-3242，和Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL有代表性地包含三个CDR和四个FR，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

“免疫球蛋白结构域”是指来自免疫球蛋白分子的可变结构域或恒定结构域的结构域。免疫球蛋白结构域有代表性地含有两个由约7个β股形成的β折叠，和保守二硫键(参见例如A.F.Williams和A.N.Barclay 1988 Ann.Rev Immunol.6：381-405)。如Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14(18)：4628-38中所述，可自免疫球蛋白可变结构域的序列推断其高变环的标准结构。

如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可形成免疫球蛋白可变结构域结构的氨基酸序列。例如，序列可包含天然存在可变结构域的所有或部分氨基酸序列。例如，序列可省略1个、2个或更多个N或C端氨基酸、内部氨基酸，可包含一个或一个以上插入或额外末端氨基酸，或可包含其它改变。在一个实施方案中，包含免疫球蛋白可变结构域序列的多肽可与另一个免疫球蛋白可变结构域序列结合以形成靶标结合结构(或“抗原结合位点”)，例如与Tie1相互作用(例如结合或抑制Tie1)的结构。

抗体的VH或VL链可进一步包含全部或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链通过例如二硫键互相连接。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含CL结构域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区有代表性地介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)，和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。在一个实施方案中，抗体被糖基化。抗体可对抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性发挥功能。

术语“单特异性抗体”是指对于特定靶标例如表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”，其是指作为单一分子种类而产生的抗体，例如从同系分离细胞群体产生。“单克隆抗体组合物”是指抗体或其片段在包含单一分子种类的抗体的组合物中的制剂。在一个实施方案中，单克隆抗体由哺乳动物细胞产生。可组合一种或一种以上单克隆抗体种类。

抗体的一个或一个以上区域可以是人的或实际上是人的。例如，一个或一个以上可变区可以是人源的或实际上是人的。例如，一个或一个以上CDR可以是人的，例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。每个轻链CDR都可以是人的。HC CDR3可以是人的。一个或一个以上框架区可以是人的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。在一个实施方案中，所有框架区都是人的，例如来源于人体细胞，例如产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中，人序列是例如由生殖系核酸编码的生殖系序列。一个或一个以上恒定区可以是人的或实际上是人的。在另一个实施方案中，至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或98％的框架区(例如，全部的FR1、FR2和FR3，或全部的FR1、FR2、FR3和FR4)或整个抗体可以是人的或实际上是人的。例如，FR1、FR2和FR3全部可与编码重链或轻链序列的基因座的人生殖系V区段所编码的人序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％同一性。

全部或部分抗体可由免疫球蛋白基因或其区段编码。示例性人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25Kd或214个氨基酸)在NH2端由可变区基因编码(约110个氨基酸)且在COOH端由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和一种其它上述恒定区基因例如γ(编码约330个氨基酸)编码。轻链是指包含轻链可变结构域的任何多肽。重链是指包含重链可变结构域的任何多肽。

本公开提供一种治疗患有细胞增殖病症的受试者的方法。受试者可以是任何哺乳动物，优选是人。受试者可与本公开的重组复制型逆转录病毒载体接触。接触可在体内或间接体内进行。施用本公开的逆转录病毒载体的方法在本领域中是已知的，且包括例如全身施用、局部施用、腹膜内施用、肌肉内施用、颅内施用、脑脊髓施用以及在肿瘤或细胞增殖病症部位直接施用。其它施用途径在本领域中也是已知的。

因此，本公开包括可用于治疗细胞增殖病症的多种药物组合物。根据本公开的药物组合物可通过使用载剂、赋形剂和添加剂或助剂，将含有可用于治疗或调节根据本公开的细胞增殖病症的异源多核苷酸序列的逆转录病毒载体制成适合于施用于受试者的形式来制备。经常使用的载剂或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物油和植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇类、甘油和多元醇。静脉内运载体包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它可药用的载剂包括水溶液、无毒赋形剂(包括盐)、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The NationalFormulary XIV.，第14版，Washington：American Pharmaceutical Association(1975)中所述，其内容通过参考并入本文。药物组合物的各种组分的pH和确切浓度可根据本领域的常规技术来调节。参见Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis for Therapeutics(第7版)。

例如且不构成限制，可用于治疗细胞增殖病症的逆转录病毒载体包括双嗜性ENV蛋白、GAG和POL蛋白，U3区逆转录病毒基因组中的启动子序列，和逆转录病毒基因组在靶细胞中复制、包装和整合所必需的所有顺式作用序列。

如上所述，本公开提供一种用本文提供的载体转导(转化或转染)的宿主细胞(例如293细胞或HT1080细胞)。载体可以是例如质粒(例如在293T细胞中所用的)、病毒粒子(在HT1080细胞中所用的)、噬菌体等。宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基在适当情况下可经改良以用于活化启动子、筛选转化株或扩增编码多核苷酸。例如温度、pH等培养条件是如筛选用于表达的宿主细胞先前所用，且对于本领域技术人员和根据本文引用的参考文献是显而易见的，参考文献包括例如Sambrook、Ausubel和Berger，以及例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第3版(Wiley-Liss，New York)和其中引用的参考文献。

在本公开的一个实施方案中，生产者细胞所产生的复制型逆转录病毒载体相对于通过常规瞬时转染技术产生的逆转录病毒载体具有提高的稳定性。在产生、感染和复制期间此种提高的稳定性对于治疗细胞增殖病症很重要。复制型逆转录病毒提供转导效率、转基因稳定性和靶标选择性的组合。组合物和方法提供插入物稳定性且维持转基因的转录活性和所编码多肽的翻译活力。

以下实施例旨在进一步说明本发明且不知在限制上文的更广公开内容。

实施例

从来源于HT1080人纤维肉瘤细胞系(ATCC，目录号CCL-121)的HT1080+T5.0002生产者细胞系产生AC3-yCD2(“V”病毒粒子)，所述HT1080人纤维肉瘤细胞系直接从美国典型培养物保藏中心(邮箱1549，Manassas，VA)获得。

使细胞系HT1080+T5.0002扩增以产生前库和随后的母细胞库(MCB)。使用MCB生产临床批次。图1显示用于产生前库和母细胞库的流程图。

由11,893个核苷酸碱基对组成的质粒(pAC3-yCD2；也称为T5.0002)可编码Toca511病毒载体。以下图表1提供pAC3-yCD2质粒的总构建体的限制酶图谱，以及某些基因元件的序列位置。

用于制造可产生复制型载体AC3-yCD2(V)的稳定表达生产者细胞系的一般流程.用在293T细胞中通过转染瞬时产生的AC3-yCD2病毒转导天然HT1080细胞，产生载体生产者细胞系“HT1080+T5.0002”(参见图1)。用于产生AC3-yCD2(病毒粒子)的瞬时转染是用经GLP测序的“合格质粒储液”来进行。更具体地说，瞬时产生的AC3-yCD2载体在转染48小时后收获，并经0.45μm滤器过滤，得到0.8mL过滤的上清液，用于转导含有15mL培养基的HT1080细胞的75％汇合培养物。此感染体积转换为约0.1转导单位(TU)/细胞的近似转导剂量。利用每隔2-4天再供应或传代的细胞使转导在培养物中扩散9天，接着冷冻由12个小瓶组成的初始前库储液，每个小瓶含有大约5×10⁶个细胞。冷冻培养基包含10％DMSO、USP(Cryoserv，Bioniche Pharma USA，LLC，LakeForest，IL)和90％经γ照射的胎牛血清(Hyclone Laboratories.Inc，Logan Utah)。细胞在-80℃冷冻器中冷冻，然后在第二天转移到汽相条件下的液氮冷冻器中。用于培养HT1080+T5.0002细胞以产生载体的培养基包含限定DMEM培养基、GlutaMax(L-谷氨酰胺替代品)、非必需氨基酸(NEAA)和限定胎牛血清(FBS)。

293T细胞系从HEK(人胚肾)293细胞发展而来且最初描述于1987年(Dubridge 1987)。通过将温度敏感SV40 T抗原突变体tsA1609(Dubridge 1987)转染入HEK 293细胞中形成所述细胞系(Graham 1977)。与原始HEK 293细胞系相比，293T细胞更容易转染。因为293T细胞的可转染性较高，所以其通常用于通过瞬时转染来产生高滴度载体(Yang等人，Hum.Gene Ther.10：123-1321999)。

实施例2：利用胎牛血清从作为贴壁细胞系的HT1080+T5.0002稳定表达生产者细胞系制备载体.HT1080+T5.0002细胞在一次性多层细胞培养容器(CellStack，Corning)中生长。使用人工分批进料方法，使用各自含有约1.2L条件培养基的多个细胞堆叠，经2-4个收获周期每隔10-24小时收获HT1080+T5.0002细胞的汇合培养物，并从所述培养物收获条件培养基以产生粗制Toca 511逆转录病毒载体。粗制TOCA 511逆转录病毒载体直接收获到10-20L处理袋中，并在2-8℃下储存，直到收集了约40L材料为止。合并的粗制收获物的样品可用于PTC支原体、体外病毒测试、生物负载、信息PCR滴定和保留。

粗制载体材料通过流经0.45微米滤筒而变得澄清，并用Benzonase处理以消化宿主细胞基因组DNA。然后，经澄清且DNA消化的TOCA 511载体使用阴离子交换(AEX)色谱法捕获和浓缩。洗脱的浓缩的大量产物然后进行缓冲液更换和使用尺寸排阻(SEC)色谱法的纯化步骤。配制缓冲液包括基于Tris的配制缓冲液，其含有氯化钠、蔗糖、甘露醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸和人血清白蛋白。所配制的大量的配制缓冲液经0.2μm过滤以确保无菌，对其取样用于测试，然后作为大量材料分配到多个容器中并在低于(＜)-65℃下冷冻储存。

从HT1080+T5.0002细胞产生的载体在天然PC3(人前列腺癌)或U-87细胞(人成胶质细胞瘤-星状细胞瘤)上测试，这取决于测试类型。这些测试包括：(1)通过Western分析测试CD(胞嘧啶脱氨酶)蛋白质表达的转移；(2)通过HPLC分析测试CD蛋白将5-FC转化为5-FU的功能性CD活性；和(3)测量5-FC杀死用AC3-yCD2(V)转导的U-87细胞(MTS分析)的能力。

实施例3：构建编码胞嘧啶脱氨酶、绿色荧光蛋白(GFP)、小鼠γ干扰素(IFN)和其它蛋白质或核酸的载体.这些复制型逆转录病毒载体如先前在WO2010/036986中所述建构。下文显示表1，其描述这些载体中一些载体的性质。

表1：载体构建体和名称

可使用本申请所述细胞系和方法产生的其它载体还描述于WO2010/036986中。这包括编码在pol III启动子控制下的单链抗体、IL-2、miRNA和siRNA的载体，和siRNA靶序列。

实施例4：定量PCR滴定分析.使用基于定量PCR(qPCR)的方法测定功能载体浓度或滴度。在这种方法中，通过用标准体积的载体感染可转导宿主细胞系(例如PC-3人前列腺癌细胞，ATCC目录号CRL-1435)并测量在转导后于宿主细胞内获得的原病毒含量来滴定载体。细胞和载体在标准培养条件(37℃，5％CO₂)下培养24小时以使得完全感染，随后添加抗逆转录病毒AZT以终止载体复制。接下来从培养皿收获细胞，使用Invitrogen Purelink gDNA纯化试剂盒来纯化基因组DNA(gDNA)，并用无RNA酶/DNA酶的无菌水将其从纯化柱洗脱。在分光光度计上测量A₂₆₀/A₂₈₀吸光率比以确定样品的浓度和相对纯度。用额外的无RNA酶/DNA酶水将gDNA浓度标准化为任何指定组的gDNA制剂的最低浓度，使得qPCR的输入DNA对于分析的所有样品是恒定的。通过在经溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶上将每个样品的等分试样电泳来进一步评估基因组DNA纯度。如果样品通过1.8-2.0的A₂₆₀/A₂₈₀吸光率范围且显示单一gDNA带，则样品可用于载体的原病毒拷贝数的qPCR分析。使用结合原病毒LTR区的引物(逆转录的载体DNA和整合到宿主gDNA中的载体DNA)，进行qPCR以估算当使用已知体积的载体转导已知数目的细胞时所发生的转导事件的总数。从标准曲线计算每个反应的转导事件数目，所述标准曲线利用已知拷贝数的携带靶标的质粒，其从10⁷个拷贝连续稀释成10个拷贝并在相同qPCR条件下作为样品来测量。通过知道每个qPCR反应使用多少基因组等效物(根据先前测定的浓度)以及每个反应中发生多少转导事件，我们可基于在转导时存在的细胞总数来确定所发生的转导事件总数。这个值是载体在初始转导期间稀释到含有细胞的培养基中之后的载体滴度。为了计算经校正的滴度值，通过乘以培养物体积并除以滴定体积来校正稀释度。这些实验在复制培养物中进行，并通过qPCR，对于每个条件使用三次测量来进行分析，以测定平均滴度和与其有关的标准偏差和变异系数。

实施例5：编码胞嘧啶脱氨酶的载体的效力分析.本分析评估细胞样品在转导4天后的胞嘧啶脱氨酶活性，并测量载体的复制能力和相应的胞嘧啶脱氨酶活性。U-87细胞在96孔板中生长并用一系列病毒稀释液(直至12次稀释，半对数间隔)转导。将5-氟胞嘧啶添加到细胞中维持1小时，通过添加10％三氯乙酸终止反应，并通过用HPLC测量所产生的5-氟尿嘧啶来分析获得的经过滤混合物的胞嘧啶脱氨酶活性。HPLC分析是在与光阵列检测器和自动加样器串联连接的Shimadzu LC20AT单元上进行的。HPLC方法使用Hypersil BDS C18柱，其中以95％缓冲液A(含0.1％四正丁基高氯酸铵的50mM磷酸铵，用磷酸将缓冲液的pH调整到2.1)和5％溶剂B(100％甲醇)以1mL/min等度运行。运行时间为6分钟。光电二极管检测器从190nm扫描到350nm，其中选择色谱图用于显示5-氟尿嘧啶在264nm下的吸光度。使用浏览器功能转移大批报告中的数据，其中报告了264nm下的5-氟尿嘧啶保留时间和面积和285nm下的5-氟胞嘧啶保留时间和面积。然后针对输入的稀释度标绘峰面积以产生4参数曲线拟合，并将测试样品的EC50值与内部参考值比较(参见例如这些图表中的图10和图11)。

实施例6：载体纯化和浓缩.本公开的载体可通过在293T细胞上瞬时转染来制造，或从生产者细胞库制造，或从克隆的生产者细胞系制造。培养基可含血清或不含血清，且细胞可以贴壁细胞的形式生长或悬浮生长，通常采用灌注模式。收获培养基，且当培养基是从稳定生产者细胞系获得时，在2-8℃下储存长达2周。来自稳定细胞系的载体在2-8℃下的半衰期大于7天，而这对于从瞬时转染获得的材料并不适用。然后，该大量收获物经0.45微米滤筒过滤，并用Benzonase(L.Shastry等人，Hum Gene Ther 15：221 2004)和其它色谱柱步骤(参见例如US5792643；T.Rodriguez等人，J Gene Med 9：233 2007；P.Sheridan等人，Mol.Ther.2：262-275 2000)处理。载体制剂加样到阴离子交换柱上，且载体在NaCl梯度下洗脱。先后用PCR分析(实施例4)和A260鉴别含载体的部分，并收集和混合阳性部分。制剂然后加样到尺寸排阻柱(SEC)上以去除盐和其它残余污染物。用配制缓冲液洗脱SEC，并从空隙容积收集SEC柱上的载体部分并以大量材料形式测试其滴度。然后载体部分经0.2微米滤器过滤，并按照0.8到3ml等分到小瓶中。已基于标准测试(例如无菌性、支原体和内毒素)，以及产物特定效力(实施例5，图10和图11)、强度(实施例4)和同一性测试来公开临床材料。通过靶细胞中的整合病毒载体DNA的PCR定量来测定滴度，以转导单位(TU)表示(实施例4)。选定滴度高达10⁹TU/ml的最终产物，其在等渗Tris缓冲蔗糖溶液中配制成无菌注射液。

一般来说，为了准确且精确地测定载体批次的强度，已经开发了基于定量PCR的滴度分析(如实施例4中一般所述)。所述分析程序的细节包括以下步骤：

转导.使用来源于人前列腺癌的稳定PC-3细胞系，以12孔板型式进行转导。对于每个测试样品，使用三个未滴定的载体制剂的稀释液在一式三份的孔中转导PC-3细胞。在转导24小时后用叠氮基胸腺嘧啶核苷(AZT)终止病毒复制。另外维持细胞24-64小时，随后收获细胞并纯化基因组DNA。

实施例8：感染HT1080细胞的非考虑库的克隆.稀释接种.对预温培养基和多个96孔细胞培养板做标记，以便可基于培养板和孔位置来鉴别克隆，并用含有HT1080单细胞悬浮液的预温培养基填充各孔。通过用胰蛋白酶处理和产生由每600微升1个细胞组成的单细胞悬浮液来收获100％感染的HT1080细胞的早期世代。将200微升转移到96孔板的每个孔中，以便每孔接种约0.3个细胞。在此过程的实施中，大多数孔都是每孔接受0、1或2个细胞。使细胞粘附约4小时，并检查每个孔以排除每孔接受一个以上细胞的孔或空白孔。

克隆增殖.通过每隔3-4天对每个孔用新鲜100微升培养基更换1/2的培养基(大约100μL)来培养最初每孔含1个细胞的各孔。在培养基更换期间同样更换用于对每个孔加样的尖管，这样可以防止细胞从一个孔意外地转移到另一个孔。当孔中的细胞开始接近汇合时，需要全部更换培养基。一旦细胞达到汇合，就将每个克隆候选物转移到48孔板的孔中以继续扩大培养。每个克隆都增殖且转移到6孔板的孔中，随后转移到T-25烧瓶中，随后转移到T-75烧瓶中，每次细胞都达到汇合。一旦T-75烧瓶中的克隆细胞达到汇合，就制备至少2-3个小瓶的冷藏细胞，每瓶含有1-2×10⁶个细胞。

基于表现的克隆筛选.一旦克隆候选物被冷冻，就进行细胞培养实验，以基于滴度产生表现和理想细胞培养特征来鉴定最佳克隆并备份细胞。基于以下能力选择最佳克隆：(1)在每日更换培养基的情况下，所述克隆在随后2-4天内提供最高的持续滴度的能力[参见图12和以下表2]；(2)所产生的病毒将期望的目的基因的表达转移到天然细胞的能力(参见图10和图11)；(3)所述克隆以18-30小时之间的倍增时间适度分裂的能力，以及达到100％汇合而形成均匀的细胞层同时在达到汇合时细胞脱离最少的能力。

实施例9：感染D-17和Cf2-Th细胞系以产生非克隆库和随后的克隆载体生产者细胞系候选物.为了制造表达MLV复制型逆转录病毒载体的D-17(犬骨肉瘤；ATCC # CCL-183)和Cf2-Th(犬胸腺；ATCC # CRL-1430)细胞系载体生产者库和稀释克隆，使用与上文对于HT-1080细胞所述的方法完全相同的方法产生D-17和Cf2-Th细胞系。以下表2显示结果。

表2：用于支持产生HT-1080、D-17和Cf2-Th复制型逆转录病毒载体的生产者细胞系库和随后的稀释克隆的数据

^*TU/mL表示每毫升的转导单位，通过用于测定在转导到滴定天然U-87细胞系中之后整合原病毒MLV基因组的拷贝数的定量qPCR方法来测定。

实施例10：测试从用T5.0006(表达GFP的复制型载体)感染的Cf2-Th细胞产生的复制型逆转录病毒载体的感染力和表达转移.用编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因的复制型逆转录病毒载体T5.0006(V)进行评估，以评估所述载体在来源于犬的肿瘤细胞系中感染和繁殖的能力。在此项研究中，从PeterDickinson博士的实验室(University of California，Davis；Vet Med Surgery andRadiological Sciences)获得三种犬成胶质细胞瘤细胞系，它们分别是J3 T-bg、SDT-3G和G06-A。所有这些细胞系最初都来源于自发神经胶质瘤外植体且处于原始分离株的8-14代以内。为了测试病毒感染力，将0.1mL经0.45微米过滤的T5.0006(V)病毒上清液放在6孔培养板中的三份2mL培养物中，其含有4.4×10⁵个每种肿瘤类型的细胞，例外是SDT-3G细胞的数量为1.9×10⁴个。制备三个重复的板，每个时间点制备一个板。为了追踪感染力，在第1、3和6天收获具有三个重复感染和非感染对照孔的一个板，进行FACs分析GFP荧光的存在，从而测定感染后每一天被感染细胞的百分比。接种的T5.0006病毒上清液是来源于如上所述而制备且已经表征所制造的病毒的滴度的Cf2-Th稳定生产者细胞的内部感染培养物。

Cf2-Th+T5.0006生产者细胞系和T5.0006(V)病毒：先前用瞬时产生的T5.0006(V)病毒感染Cf2-Th细胞培养物，所述T5.0006(V)病毒是通过使用标准磷酸钙转染方法将质粒pAC3-emd(也称为pT5.0006)转染到293T细胞中而产生。在几次传代之后且在感染三种犬神经胶质瘤细胞系当天，从汇合的感染Cf2-Th培养物收集新鲜病毒上清液并通过0.45微米针头式过滤器以去除任何存活的感染的Cf2-Th细胞。

感染三种犬成胶质细胞瘤细胞系和阳性对照HT-1080细胞系：在2008年11月20日从Peter Dickinson博士的实验室(University of California，Davis；VetMed Surgery and Radiological Sciences)以冷藏细胞形式获得三种犬成胶质细胞瘤细胞系，它们分别是J3T-bg、SDT-3G和G06-A。所有这些细胞系最初都来源于自发神经胶质瘤且处于原始分离株的8-14代以内，这一点由随冷冻小瓶的收据一起提供的文件所指示。HT1080阳性对照细胞系来源于最初源自ATCC(CCL-121；批次6805248)的内部冷冻储备物。

对于每种细胞系解冻一个小瓶，并在补充有10％胎牛血清和200mMGlutamax的DMEM培养基中培养数代，并在37℃下在5％CO₂条件下培育。在感染细胞前一天，对于每种肿瘤细胞系，在2mL新鲜的完全DMEM培养基中以5E4个细胞/平方厘米(4.4E5个细胞/孔)接种一个6孔板，例外是SDT-3G板以1.9E4个细胞/孔制备。在肿瘤细胞系病毒感染同一天，在添加病毒之前3.5小时接种阳性对照HT1080培养物。通过向每个6孔板中的3个孔添加0.1mL经过滤的T5.0006(V)来进行病毒感染，3个非感染的孔用作FACS分析的阴性对照。感染后，将6孔板放回37℃恒温箱。对于每种细胞系一式三份制备平板。

在感染后第1、3和6天，使用trypzean试剂(Sigma-Aldrich)从一式三份的孔收获每种感染和非感染细胞系，在完全培养基中洗涤，然后用含有2％FBS和0.09％叠氮化钠的PBS中的1％多聚甲醛固定，并在暗处或在冰上冷藏直到进行FACS分析。应注意在第3天收获点之后的剩余培养物在第3天传代。

FACS分析：在位于悉尼金梅尔癌症中心(Sidney Kimmel Cancer Center)的BD LSRII FACS仪器上(SN H47200068)，通过用BD FACS Diva软件5.0.1版进行分析来分析所有经多聚甲醛固定的细胞。使用从先前感染获得的经HT108和HT1080 100％GFP感染的细胞设定阈值。每种样品读取一次。

表3证明在感染后第1、3和6天，被感染细胞的百分比的一式三份读数的平均结果。图13显示数据的图解表示。所述数据表明，用T5.0006(V)感染的每种犬肿瘤细胞系都显示了高于背景阴性对照的一定程度的GFP表达，但在不同的肿瘤细胞系之间观察到病毒传播动力学的差异。G06-A肿瘤细胞系在感染6天后显示了94.5％GFP阳性，而J3T-bg和SDT-3G则在相同收获点分别显示了81.2％和30.9％GFP阳性。所有对照组都是有效的，其中非感染对照组显示了可忽略的背景GFP表达水平，且HT1080许可阳性对照细胞系在感染3天后显示了73.4％GFP阳性(第6天的样品丢失)。在使用相同条件的类似先前实验中，人U87神经胶质瘤细胞系变成80-90％GFP阳性。

表3.用T5.0006(GFP)载体感染后，三种犬神经胶质瘤细胞系上GFP表达呈阳性的细胞百分比的概述

丢失＝测试样品丢失

实施例11：使HT-1080复制型MLV病毒载体生产者细胞系从血清和贴壁依赖性向无血清悬浮培养的适应.在筛选和鉴定HT-1080复制型载体生产者细胞系的合适稀释克隆之后，开展无血清适应过程。无血清适应过程也可用非克隆载体生产者HT1080细胞系开展。通过将约2×10⁷个细胞接种到125mL摇瓶中开始适应过程，所述摇瓶含有10mL含5％血清的条件培养基和10mL选定的无血清培养基，导致血清浓度降为2.5％。在该情况下，无血清培养基为由Invitrogen Corp，Carlsbad，CA经销的FreeStyle 293表达培养基。将培养物放置在位于具有温度和CO₂气体控制的组织培养恒温箱中的震荡平台上。震荡平台优选设定为80RPM，且恒温箱优选设定为37℃和5％CO₂条件。每隔3-7天，通过收集悬浮的细胞来重新供应培养物，并再接种于新的摇瓶中，所述摇瓶含有10mL相同的初始条件培养基和10mL新鲜无血清培养基，血清含量维持在约2.5％。必要时，在每次重新供应时通过活细胞计数来检验培养物，以检查细胞繁殖。当基于细胞倍增或葡萄糖消耗显示细胞生长时，则通过调整条件培养基和新鲜无血清培养基的体积量达到1.67％的血清浓度。再次检验培养物且每隔3-7天重新供应。当细胞显示生长时，再次通过调整条件培养基和新鲜无血清培养基的体积达到1.25％的血清浓度。继续该过程以获得随后血清条件：1.0％、0.9％、0.83％血清条件，直到细胞处于100％无血清条件为止。在所述适应过程期间，细胞培养物在1000mL摇瓶中扩大培养至约200mL体积，获得约0.5-1.0×10⁶个细胞/毫升的最小活力培养物。一旦细胞到达100％无血清条件，就在无血清条件下将细胞连续传代，通过在不搅动的情况下使较重的聚集细胞短时间沉淀来分离悬浮的单细胞。一旦培养物中约95的群体为始终悬浮的单细胞，则使用标准哺乳动物细胞冷冻条件，在包含10％DMSO和90％无血清培养基的低温保存培养基中冷冻培养物。

实施例12：从稳定生产者细胞系制备的载体比通过瞬时转染制备的载体在长期储存中更稳定.通过瞬时转染产生载体.通过两种瞬时转染方法产生粗制上清液，所述上清液含有编码胞嘧啶脱氨酶的基因或绿色荧光蛋白的基因的复制型MLV病毒。第一种方法使用由Graham和van der Eb描述的标准磷酸钙转染方法，其中使用最初如Yang 1999所述的通常用于产生高滴度载体的293T细胞。第二种转染方法使用由Promega(Madison，WI)在市场上经销的专利转染试剂(Fugene)。转染48小时后，使用0.2或0.45微米滤器过滤病毒上清液，将等分的试样在≤-65℃的温度下冷冻并储存。通过定量qPCR方法滴定冷冻的澄清上清液，以确立感染滴度的初始浓度。随后在不同日期测试滴度，显示病毒制剂不稳定，且根据相同的定量qPCR方法所测试，所述病毒制剂仅在14天内就迅速损失了至少一个对数单位的滴度(参见表4)。

从稳定细胞系产生载体.为了比较从稳定感染的HT-1080细胞产生的复制型MLV病毒的此种稳定性特征，如先前实施例中所述产生T5.0002病毒制剂，随后纯化并在含有10mg/mL蔗糖和1mg/mL人血清白蛋白的Tris氯化钠等渗缓冲液中配制。该稳定性研究中所用的具体T5.0002批次是T003-002-40L、M100-09、M101-09和M102-09批次，后三个批次是在良好制造规范(GMP)下产生的。为了评估病毒的稳定性，使用方法测定(1)感染滴度和(2)在天然细胞中的表达转移。

储存.从≤-65℃长期储存条件下取出T003-002-40L批次的未稀释和1/100稀释的T5.0002剂量，小瓶随后在装瓶后3、6和12个月时解冻并在以下分析中测试：强度、效力和TCID50。

表4.通过瞬时转染产生的多种复制型MLV病毒

由GMP产生的M100-09、M101-09和M102-09批次是从已纯化的HT1080+T5.0002稳定生产者细胞系制备，且从制备时就储存在≤-65℃下。取出小瓶，在装瓶后3和6个月时解冻，并在以下分析中测试：强度、效力、TCID50、pH、摩尔渗透压浓度和外观。

由定量qPCR获得的感染滴度.当测试的所有批次在≤-65℃下储存长达12个月时，没有观察到从稳定感染的HT-1080细胞系产生的纯化病毒载体滴度下降。表5和表6显示T003-002-40L批次(表5)和GMP批次(表6)的实测滴度。图14显示测试的所有批次历经12个月所产生的滴度趋势。

表5.研究批次T003-002-40L(未稀释和1/100稀释)在释放时和在≤-65℃下储存3、6和12个月时的实测滴度

图6.临床批次M100-09(高剂量)、M101-09(中剂量)和M102-09(低剂量)在释放时和在≤-65℃下储存3和6个月时的实测滴度

使用细胞培养物和HPLC分析的生物表达转移分析，用于评估在≤-65℃下储存的病毒载体的稳定性.通过测量载体在各种稀释度下感染天然细胞类型的能力和测试载体通过将胞嘧啶脱氨酶基因从病毒载体转移到天然感染细胞而将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)的能力来评估载体稳定性。通过HPLC定量5-FC到5-FU的转化，原始数据利用变换稀释值的非线性回归来处理。从T003-002-40L批次获得的两个剂量(未稀释和1/100稀释的样品)当在≤-65℃下储存长达12个月时没有显示表达转移能力的下降。T003-002-40L(未稀释)和M100-09产生了和当前参考载体相当的剂量曲线。M101-09产生的预期曲线为未稀释载体(M100-09)的1/10。T003-002-40L(1/100)和M102-09产生的预期曲线分别为其未稀释载体的1/100。图10和图11显示测试的最后一个时间点时T003-002-40L批次(图10)和GMP批次(图11)的5-FC转化剂量反应。

载体批次的TCID50分析.通过计算组织培养条件下50％细胞被感染时的感染剂量(TCID50)来测量载体感染天然细胞类型的能力，从而评估载体稳定性。用于测定细胞是否被感染的方法可通过PCR检测来确定。在此项评估中，对于所述分析的当前变异性内测试的所有批次来说，当在≤-65℃下储存长达12个月时，基于TCID50没有观察到感染力的下降(8个分析的参考载体的CV％为45％)。表13和表14显示T003-002-40L批次(表7)和GMP批次(表8)的实测TCID50/mL值。

表7.T003-002-40L批次(未稀释和1/100)在释放时和在≤-65℃下储存3和12个月时的TCID₅₀

图8.GMP批次M100-09(高剂量)、M101-09(中剂量)和M102-09(低剂量)在释放时和在≤-65℃下储存3和6个月时的TCID₅₀

基于以上稳定性数据，从稳定感染的HT-1080细胞产生的纯化的复制型MLV病毒载体比通过瞬时转染产生的相同载体在≤-65℃的温度下储存时更稳定。

实施例13：在小鼠肿瘤模型中，从HT1080克隆产生和从无血清悬浮培养物产生的T5.0002载体和在含胎牛血清的培养基中从贴壁HT1080+T5.0002细胞系产生的载体同样有效.从一种无血清悬浮克隆和从HT1080+T5.0002细胞系制备载体，并如实施例6所述对载体进行纯化和处理。

在单独实验中，用这些载体制剂处理小鼠神经胶质瘤模型，也就是B6C3F1小鼠中的Tu2449(H M.Smilowitz J Neurosurg 106：652-659，2007)。将所述肿瘤植入小鼠颅内，并在4天后，对于两种载体制剂，将递增剂量的载体(10⁴，10⁵Tu/g脑)施用于一组10只动物中。在第13天，开始每天两次腹膜内注射5-FC(500mg/kg，BID)，持续4天，然后按10天停药4天给药的方案进行5-FC处理。Kaplan-Meyer曲线显示从克隆细胞系获得的物质的存活率至少和从HT1080+T5.0002细胞系获得的物质同样好。两种物质在100天后在10⁵Tu组中都显示80-90存活，而对照组则具有约30天的中值存活时间。

实施例14：在同基因系小鼠癌症模型中使用纯化的编码小鼠γ干扰素的载体作为治疗剂的用途.此项研究的目的在于评估Toca 511(编码yCD2)和Toca621(编码小鼠γ干扰素)在S91/BALB/c模型中的效用，这是通过评估基于MLV的新的逆转录病毒载体在免疫活性BALB/c小鼠的S91皮下(subQ)肿瘤中的传播来进行的。载体从以下细胞系制备：1)HT108+T5.0002(Toca 511)，获得携带优化胞嘧啶脱氨酶基因的复制型逆转录病毒载体制剂；2)HT1080+mIFN(Toca 621的稳定生产者细胞系)，获得携带γ干扰素基因的复制型逆转录病毒载体；和3)HT1080+T5.0006(GFP载体)，所述载体各自通过肿瘤内注射(IT)来递送。

小鼠.雌性BALB/c小鼠(～8周龄)从Jackson Laboratories购得。小鼠在抵达后驯化7天。

肿瘤细胞.使来源于克隆M-3(一种产黑色素细胞系)的S91 Cloudman细胞(ATCC，Manassas VA)适应于由Y.Yasumura，A.H.Tashjian和G.Sato从(C XDBA)F1雄性小鼠的Cloudman S91黑素瘤获得的细胞培养物。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax的Dulbecco改良Eagles培养基(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。S91以200μL静脉内注射1E5，且以100μL皮下注射1E5。

在4组雌性BALB/c小鼠(65只小鼠，～8周龄)的右腹侧皮下植入S91肿瘤细胞。在肿瘤生长到约50-125mm³之后，在15-19天内对3只小鼠肿瘤内给药PBS(第1组)，对10只小鼠肿瘤内注射Toca 511 4.7E8/ml(第2组)，对5只小鼠肿瘤内注射Toca 621 2.8E8/ml(第3组)，并对6只小鼠肿瘤内注射GFP(第4组)。

组分配

载体.使用胰岛素注射器在肿瘤内缓慢注射Toca 511和Toca 621(50μL)。

对第2组的所有动物使用Toca 511(编码yCD2胞嘧啶脱氨酶基因)批号T511019-FNL，并对第3组的所有动物使用Toca 621(编码小鼠γ干扰素)批号T621006 SEC。所述物质是使用与临床试验物质所用方法相同的方法产生，但不是根据cGMP制备。

Toca 511批号T511019-FNL的滴度为4.7E8 TU/mL。

Toca 621批号T621006 SEC的滴度为2.8E8 TU/mL。

MLV-GFP(T5.0006)是批号TGFP004-FNL，滴度为9.0E7 TU/mL。

与注射Toca 511的肿瘤相比，注射Toca 621的肿瘤显示肿瘤生长降低(p＝0.0016)(图15)。一只接受Toca 621注射的动物清除了肿瘤。其它分析显示在注射后长达24天时，可在一些Toca 511和Toca 621肿瘤中检测到基因组。来自注射Toca 621的肿瘤的两个外植体中的一个通过ELISA可检测到IFNγ分泌(18.8pg/mL)。

实施例15：使用从稳定生产者细胞系获得的GFP载体的裸鼠U-87皮下异种移植物模型中的GFP病毒传播速率.为了基于对既定的U-87异种移植物单次施用3e5/100μL的载体来测定病毒传播速率，在裸鼠皮下肿瘤模型中测定各个时间点的GFP表达细胞的百分比。

研究描述：在第0天，在总共5只小鼠(ID#71到#75)的左背侧和右背侧皮下植入2e6 U-87细胞。在第13天，对每只小鼠的右背侧肿瘤注射3×10⁵TU/100μL的纯化T50006(GFP载体)，T50006从如上所述构建的HT1080生产者库制备且如实施例YYY中所述纯化。在同一天处死动物ID#71；在载体接种后第5、9、12和26天分别处死动物ID#72、ID#73、ID#74和ID#75。摘除肿瘤且进行处理以便通过FACS分析GFP。结果显示于图16中并且显示GFP阳性细胞％随时间稳定增长，表明载体在该模型中传播。

Claims (57)

1.一种用于产生复制型逆转录病毒粒子的逆转录病毒生产细胞系，所述细胞系包括纤维肉瘤、骨肉瘤或胸腺瘤细胞系，所述细胞系稳定表达重组逆转录病毒基因组，所述重组逆转录病毒基因组包含gag基因、pol基因、env基因、异源多核苷酸和用于组装所述重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒psi(Ψ)因子。

2.根据权利要求1所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述复制型逆转录病毒粒子稳定表达。

3.根据权利要求2所述的逆转录病毒生产细胞系，其中半衰期在2-8℃下大于7天。

4.根据权利要求2所述的逆转录病毒生产细胞系，其中产生的载体在3个月或更长时间内大约100％稳定，且用相同复制型逆转录病毒瞬时转染的细胞系所产生的相同载体在相同储存条件下在2到8周时与起始滴度相比活性损失至少5倍。

5.根据权利要求1所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述复制型逆转录病毒包含：

逆转录病毒GAG蛋白；

逆转录病毒POL蛋白；

逆转录病毒包膜；

逆转录病毒多核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列；在所述逆转录病毒多核苷酸的5’端的启动子序列，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；gag核酸结构域；pol核酸结构域；和env核酸结构域；

序列盒，其包含有效连接于异源多核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)或调节核酸结构域，其中所述序列盒位于所述3’LTR的5’和编码所述逆转录病毒包膜的所述env核酸结构域的3’；和

在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，

其中与pACE载体相比，所述RCR在6次传代后保持更高的复制能力。

6.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述逆转录病毒多核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、狒狒内源性病毒(BEV)和猫病毒RD114。

7.根据权利要求5或6所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述MLV是双嗜性MLV。

8.根据权利要求1所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述逆转录病毒是γ逆转录病毒。

9.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述启动子序列与生长调节基因有关。

10.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述启动子序列包括组织特异性启动子序列。

11.根据权利要求10所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素反应元件(ARE)。

12.根据权利要求11所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述雄激素反应元件是来源于probasin启动子。

13.根据权利要求10所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述组织特异性启动子序列包括probasin启动子。

14.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述启动子包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所阐述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或一个以上核酸碱基的修饰，所述修饰能指导和引发转录。

15.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述启动子包含如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所阐述的序列。

16.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。

17.根据权利要求16所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述CMV-R-U5结构域包含与MLV R-U5区域连接的来自人巨细胞病毒的立即早期启动子。

18.根据权利要求17所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述CMV-R-U5结构域多核苷酸包含如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所阐述的序列，或与如SEQ ID NO：19、20或22所阐述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多核苷酸促进与其有效连接的核酸分子的转录。

19.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述多核苷酸的gag来源于γ逆转录病毒。

20.根据权利要求19所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述gag核酸结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。

21.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述多核苷酸的pol结构域来源于γ逆转录病毒。

22.根据权利要求21所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述pol结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。

23.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述env结构域包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。

24.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述IRES来源于脑心肌炎病毒。

25.根据权利要求24所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述IRES包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95％、98％或99％同一性的序列。

26.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸包括具有如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17所阐述的序列的多核苷酸。

27.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸编码包含如SEQ ID NO：4所阐述的序列的多肽。

28.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸是经人密码子优化的且编码如SEQ ID NO：4所阐述的多肽。

29.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸包含如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸8877到约9353所阐述的序列。

30.根据权利要求29所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述3’LTR来源于γ逆转录病毒。

31.根据权利要求30所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述3’LTR包含U3-R-U5结构域。

32.根据权利要求31所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述3’LTR包含如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸9405到约9998所阐述的序列，或与其具有至少95％、98％或99.5％同一性的序列。

33.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述逆转录病毒多核苷酸包含如SEQ ID NO：19、20或22所阐述的序列。

34.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸序列编码生物反应调节剂。

35.根据权利要求34所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述生物反应调节剂包括免疫强化细胞因子。

36.根据权利要求35所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述免疫强化细胞因子选自白细胞介素1至15、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

37.根据权利要求35所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述免疫强化细胞因子是干扰素。

38.根据权利要求37所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述干扰素是γ干扰素。

39.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸编码将非毒性前药转化为毒性药物的多肽。

40.根据权利要求39所述的逆转录病毒生产细胞系，其中将非毒性前药转化为毒性药物的所述多肽是胸腺嘧啶激酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。

41.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸序列编码靶向部分。

42.根据权利要求41所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述靶向部分包括癌抗原。

43.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸序列编码结合结构域。

44.根据权利要求43所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述结合结构域包括受体结构域、抗体或抗体片段。

45.根据权利要求5所述的逆转录病毒生产细胞系，其中所述异源核酸序列包括抑制性多核苷酸。

46.根据权利要求45所述的逆转录病毒生产细咆系，其中所述抑制性多核苷酸包括RNAi或siRNA序列，且其中所述调节核酸结构域是启动子。

47.一种由根据权利要求1到45中任一项所述的逆转录病毒生产细胞系产生的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒生产细胞系来源于HT1080、D17、Cf2或293细胞系。

48.一种由根据权利要求1到47中任一项所述的逆转录病毒生产细胞系产生的逆转录病毒。

49.一种无细胞制剂，其包含从根据权利要求1到47中任一项所述的逆转录病毒生产细胞系获得的病毒粒子。

50.根据权利要求46所述的无细胞制剂，其包含抗坏血酸盐。

51.一种制产生据权利要求1所述的载体生产细胞系的方法，其包括：

用编码逆转录病毒载体的质粒转化293细胞系，所述逆转录病毒载体从5’到3’包含：

人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体；

逆转录酶的引物结合位点PBS；

5’剪接位点；

Ψ包装信号；

MLV组特异性抗原的gag编码序列；

MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列；

3’剪接位点；

MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列；

来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)，或核酸调节结构域；

修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；

多聚嘌呤区；和

U3-R-U5 MLV长末端重复序列；

培养所述293细胞以产生病毒粒子；

分离所述病毒粒子；

用所述病毒粒子感染HT1080细胞系，从而产生病毒粒子生产细胞系。

52.一种由根据权利要求51所述的方法产生的细胞系。

53.一种产生用于基因治疗的组合物的方法，其包括培养根据权利要求51所述的细胞系以产生病毒粒子和基本上纯化所述病毒粒子。

54.一种细胞库，其包含根据权利要求51所述的细胞系。

55.根据权利要求1所述的逆转录病毒生产细胞系，其是悬浮生长的。

56.根据权利要求1或55所述的逆转录病毒生产细胞系，其是在无血清培养基中生长。

57.一种药物组合物，其包含从根据权利要求51所述的生产细胞系的培养物分离的逆转录病毒粒子。

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