JPWO2006035829A1 - レトロウイルスベクター産生用細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒトGnT−III発現プラスミドベクターの構築
ヒトGnT−IIIをコードするDNA(GenBank E13194、配列番号1)を含むDNA断片を調製し、遺伝子発現用プラスミドベクターpTriEx−3 Hygro(ノヴァジェン社製)のNcoIサイト−Sse8387Iサイト間に挿入した組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミドをphG3−Hygroと命名した。
1. 293T細胞導入クローンの単離
ヒト293T細胞[Mol. Cell Biol.、第7巻、第379〜387頁(1987)]の培養は、10%ウシ胎仔血清(JRH社製)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、シグマ社製)を増殖培地とし、37℃、5%CO2の条件下で行った。組織培養用6cm径プレート(岩城硝子社製)に、1プレートあたり3×106個のヒト293T細胞を播種して一晩培養した。翌日、ヒト293T細胞がセミコンフルエントであることを確認し、培地を吸引除去し、あらたに1プレートあたり3mlの増殖培地を添加した。
上記1にて得られた293T/hG3の各クローン1×107個よりTRIzol(インビトロジェン社製)を用いてtotal RNAを抽出した。これを鋳型として下記の操作によりcDNA合成反応を行った。5U/μl AMV Reverse Transcriptase XL(ライフサイエンス社製)1μl、10×RNA PCRバッファー(タカラバイオ社製)2μl、 40U/μl RNase Inhibitor 0.5μl、50pmol/μl Random 9mers 1μl、各10mM dNTP混合液 2μl、25mM MgCl2 4μl、1μg相当の鋳型 1μlを混合し、RNase free蒸留水で20μlにメスアップして調製した反応液を30℃で10分、42℃で30分、99℃で5分、4℃で5分反応させた。反応後、この反応液1μlを鋳型としてヒトGnT−III遺伝子特異的プライマー対(hG3−F1、hG3−R4;配列番号2、3にそれぞれhG3−F1、hG3−R4の塩基配列を示す)を使用したPCR反応により、ヒトGnT−III遺伝子の検出を行った。反応は、94℃で5分間反応後、94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で30秒間のサイクルを30サイクル行い、最後に72℃で7分間反応した。陽性コントロールとしてphG3−Hygroを用い、陰性コントロールには293T/Mクローンから上記と同様に調製したRT−PCR産物1μlを用いた。PCR反応後、反応液8μlを2%アガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を確認した。その結果、陰性コントロールでもヒトGnT−III遺伝子由来の断片の増幅が確認されたが、293T/hG3クローンから調製した鋳型を用いた場合、陰性コントロールよりも増幅産物量が増加しており、上記1で単離した293T/hG3クローンではphG3−Hygro由来のヒトGnT−IIIが発現されていることが示された。
上記1にて得られた293T/hG3の2クローン(293T/hG3−1株および293T/hG3−67株)、293T/Mの2クローン(293T/M2株および293T/M3株)、293T細胞をそれぞれ106〜107個回収し、PBSにて洗浄後、遠心分離にて得た沈殿に100μlのCelLyticTMM Cell Lysis Reagent(シグマ社製)を加え、室温で15分間攪拌した。20400×g、15分間の遠心分離後上清を回収してGnT−III粗酵素液とし、活性測定を行った。粗酵素液の一部は、BCA Protein Assay Reagent kit(ピアス社製)を用いてタンパク質定量を行った。
293T/hG3クローンからのウイルス調製
1. ウイルス液の調製
上記実施例2で単離した293T/hG3クローンのうち、GnT−III遺伝子の発現が確認された7クローンを選択し、アンフォトロピックレトロウイルス液を調製した。対照実験として293T細胞と293T/Mの2クローンについても同様の操作を行った。6ウェルの組織培養用プレート(岩城硝子社製)の1ウェルあたり上記の各細胞クローンのそれぞれを1.5×106個ずつ播種し、2mlの10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM中、37℃、5%CO2にて一晩培養した。翌日、各細胞クローンがセミコンフルエントであることを確認し、各ウェルの培地を吸引除去し、あらたに1ウェルあたり10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを1.5ml添加した。更にクロロキン(和光純薬社製)を終濃度25μMとなるように各ウェルに加えた。ポリスチレン製丸底チューブ内にてレトロウイルスの構成タンパク質gag−polを発現させるベクター、pGP プラスミドベクター(タカラバイオ社製)を27.5μgと、同じくアンフォトロピックenvを発現させるためのpE−amphoプラスミドベクター(タカラバイオ社製)を27.5μg、レトロウイルスベクタープラスミドpDON−AI(タカラバイオ社製)にプラスミドpQBI25(Quantum Biotechnologies Inc.社製)に挿入されているクラゲ由来の蛍光タンパク質(Red-shift Green Fluorescent Protein:rsGFP)遺伝子を挿入したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを55μg、2M CaCl2 341μlをあわせて滅菌蒸留水で2750μlに調製し、これを1300μlずつ 2本に分けた。1本のチューブにつきトランスフェクションバッファー1300μlを添加後ただちに電動ピペッターの排出を利用して20秒間バブリングし、各ウェルに500μlずつ均一に滴下した。このプレートを37℃、5%CO2にて9時間培養した後、培養上清1.5mlを除去し、あらたに1ウェルあたり2mlの10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを添加して培養を続けた。遺伝子導入操作より24時間後、各ウェルの培地を新鮮な10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM 2mlと交換し、更に24時間培養した後、培養上清を採取し、0.45μmのフィルター(ミリポア社製)でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−80℃で保存した。
ウイルス上清液の力価の測定はNIH/3T3細胞(ATCC CRL−1658)を使用して標準的な方法[J. Virol.、第62巻、第1120〜1124頁(1988年)]に従って測定した。すなわち、6ウェルの組織培養用プレートに1ウェルあたり5×104個のNIH/3T3細胞を含む10%ウシ血清(ギブコ社製)を含有するDMEM 2mlを添加し、37℃、5%CO2にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに系列希釈したウイルス上清液1mlを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド(ポリブレン:アルドリッチ社製)を終濃度8μg/mlとなるように加えた。これを37℃、5%CO2で4〜6時間培養し、更に10%ウシ血清を含有するDMEMを1ml添加して72時間培養した。このプレートより回収した細胞をフローサイトメーターFACS Vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)による解析に供し、rsGFP発現NIH/3T3細胞の割合を測定した。ウェルあたりの仕込み細胞数にrsGFP発現細胞の割合とウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清1mlあたりの感染性粒子数(I.V.P./ml)を算出し、ウイルス力価とした。ウイルス調製を数回行い、ウイルス力価を測定したところ、293T/hG3クローン由来のウイルス液の力価は1.9×105I.V.P./mlから2.8×106I.V.P./mlの範囲であり、対照実験として用いた293T細胞由来のウイルス液の力価は9.4×105I.V.P./mlから1.6×106I.V.P./ml、293T/Mクローン由来のウイルス液力価は1.8×106I.V.P./mlから2.6×106I.V.P./mlの範囲であった。
1. CH−296コートプレートの作製
表面未処理24ウェルプレート(ファルコン社製)に1ウェルあたり500μlの32μg/mlのフィブロネクチンフラグメントであるCH−296(レトロネクチン;タカラバイオ社製)を添加して4℃で一晩放置した後、2%BSA/PBSで室温にて30分間ブロッキングし、さらにPBSで洗浄した。このプレートをCH−296コートプレートとし、必要に応じて作製した。
NIH/3T3細胞への遺伝子導入に使用したウイルスは、実施例3で調製したウイルス液のうち、ヒトGnT−III修飾ウイルスとして293T/hG3−1株および293T/hG3−67株より調製したウイルスを選択した。対照として293T細胞より調製したウイルス、及びMockウイルスとして293T/M2株より調製したウイルス1種を選択した。これらウイルスを用いて、上記のCH−296コートプレートを用いてNIH/3T3細胞へ感染させ、ヒトGnT−III遺伝子が導入された細胞から調製されたレトロウイルスの感染性の変化を以下に示す操作によって調べた。
ヒトK562細胞(ATCC CCL−243)は10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI−1640(シグマ社製)を増殖培地とし、37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。また、ヒトTF−1細胞(ATCC CRL−2003)は10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI−1640を増殖培地とし、終濃度2ng/mlの顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF:シェリング・プラウ社製)存在下のもと、37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。実施例3で調製したウイルス液を上記2に記載の方法でCH−296コートプレートを用いてM.O.I.(multiplicity of infection)=0.2の条件で感染させた。細胞の調製、ウイルスの希釈には各細胞の増殖培地を用いた。感染から3日後の各細胞をフローサイトメーターFACS Vantageに供し、rsGFP発現各細胞の割合を測定した。この結果を図2、3に示す。図2はK562細胞、図3はTF−1細胞についての結果を示しており、図中、横軸にはウイルス液が調製されたクローン名が記載されている。縦軸は遺伝子導入効率(%)を示す。
HT1080細胞(ATCC CCL−121)、293細胞(ATCC CRL−1573)、A375M細胞[Cancer Lett.、第38巻、第137〜147頁(1987)]、KB細胞(ATCC CCL−17)、MDA−MB−435S細胞(ATCC HTB−129)は10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを増殖培地とし、MKN1細胞(BRC RCB1003)は10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI−1640を増殖培地として37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。実施例3で調製したウイルス液のうち、ヒトGnT−III修飾ウイルスとして293T/hG3−1より調製したウイルス、対照として293T及び293T/M2より調製したウイルスを用い、上記2と同様にM.O.I.=0.2の条件で、ポリブレンあるいはCH−296コートプレートを用いて各種細胞へ感染させた。感染から3日後の各細胞をフローサイトメーターFACS Vantageに供し、rsGFP発現各細胞の割合を測定した。この結果を図4〜9に示す。図4〜9にはそれぞれHT1080細胞、293細胞、A375M細胞、KB細胞、MDA−MB−435S細胞、MKN1細胞での結果が示されている。図中、横軸にはウイルス液が調製されたクローン名が記載されており、(Pb)はポリブレン存在下に感染が実施された群を、(RN)はCH−296コートプレートで感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率(%)を示す。
293T/hG3クローンからのウイルス調製と標的細胞への遺伝子導入
1.ウイルス液の調製
実施例2で単離した293T/hG3クローンのうち、発現の確認されたものから293T/hG3−1株を選択し、アンフォトロピックレトロウイルス液、およびエコトロピックレトロウイルス液を調製した。対照実験として293T細胞についても同様の操作を行った。組織培養用6センチ径プレート(岩城硝子社製)に3×106個の293Tあるいは293T/hG3クローンを播種し、4mlの10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM中で、37℃、5%CO2にて一晩培養した。翌日、293Tおよび293T/hG3クローンがセミコンフルエントであることを確認し、各プレートの10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを吸引除去し、あらたに1プレートあたり10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを3ml添加した。更にクロロキン(和光純薬社製)を終濃度25μMとなるように各プレートに加えた。アンフォトロピックレトロウイルス調製用にポリスチレン製丸底チューブを2本用意し、各チューブ内にてpGPプラスミドベクター(タカラバイオ社製)を5μgと、アンフォトロピックenvを発現させるためのpE−amphoプラスミドベクター(タカラバイオ社製)を5μg、レトロウイルスベクタープラスミドpDON−AI(タカラバイオ社製)にrsgfp遺伝子を搭載したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを10μg、2M CaCl2 62μlをあわせて滅菌蒸留水で500μlに調製した。同様に、エコトロピックレトロウイルス調製用にポリスチレン製丸底チューブを2本用意し、各チューブ内にてpGPプラスミドベクターを5μgと、エコトロピックenvを発現させるためのpE−ecoプラスミドベクター(タカラバイオ社製)を5μg、レトロウイルスベクタープラスミpDON−AIにrsgfp遺伝子を搭載したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを10μg、2M CaCl2 62μlをあわせて滅菌蒸留水で500μlに調製した。1本のチューブにつきトランスフェクションバッファー500μlを添加後ただちに電動ピペッターの排出を利用して20秒間バブリングし、各プレートに1mlずつ均一に滴下した。これを37℃、5%CO2にて9時間培養し、9時間後、培養上清3mlを除去し、あらたに1プレートあたり4mlの10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを添加し、37℃、5%CO2にて培養した。遺伝子導入操作より24時間後、各プレートの培地を新鮮な10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM 4mlと交換し、37℃、5%CO2にて更に24時間培養した後、培養上清を0.45μmのフィルター(ミリポア社製)でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−80℃で保存した。
ウイルス上清液の力価の測定はNIH/3T3細胞を使用し、実施例3の2.ウイルス上清液の力価の測定に準じて行った。アンフォトロピックレトロウイルスの力価は、293T/hG3クローン由来のウイルス液が1.9×106I.V.P./ml、対照実験として用いた293T細胞由来のウイルス液が1.1×106I.V.P./ml、エコトロピックレトロウイルスの力価は、293T/hG3クローン由来のウイルス液が3.7×106I.V.P./ml、対照実験として用いた293T細胞由来のウイルス液が6.0×106I.V.P./mlであった。
上記実施例5の1で調製したウイルス液のうち、293T/hG3−1株で調製されたヒトGnT−III修飾アンフォトロピックレトロウイルスと、対照として293T細胞より調製されたアンフォトロピックレトロウイルスを用い、NIH/3T3細胞への遺伝子導入をポリブレン(Pb)法及びCH−296コートプレートを用いたSupernatant(SN)法を用いてM.O.I.=0.2の条件で行った。また、HT1080細胞、K562細胞へは、同じくPb法及びSN法と、CH−296コートプレートを用いたBound virus(BV)法の3種で行った。HT1080細胞については各種方法でM.O.I.=0.2の条件で感染させ、K562細胞へはM.O.I.=2.0の条件で感染させた。Pb法、SN法は、それぞれ実施例4の2記載の方法に従って行った。BV法はウイルス液を10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI−1640を用いてHT1080細胞への感染用に8×103I.V.P./ml、K562細胞への感染用に8×104I.V.P./mlに調製し、CH−296コートプレートの1ウェルに500μlずつ添加した後、そのプレートを37℃、5%CO2インキュベーターにて4時間静置してCH−296へのウイルスの吸着を促し、4時間後、ウイルス上清を除去して1ウェル0.5mlずつの1×PBSで洗浄後、4×104/mlに調製した各細胞を1ウェルに500μlずつ添加して感染させた。これを37℃、5%CO2で3日間培養し、3日後の各細胞をフローサイトメーターFACS Vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)に供し、GFP発現各細胞の割合を測定した。この結果を図10〜12に示す。図10〜12はそれぞれNIH/3T3細胞、HT1080細胞、K562細胞での結果が示されている。図中、横軸には感染方法が示されており、Pbはポリブレン存在下に感染が実施された群を、SNはCH−296コートプレートでSupernatant法を用いて感染が実施された群を示し、BVはCH−296コートプレートでBound virus法で感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率(%)を示す。
ヒトGnT−III修飾ウイルスを感染させた各細胞では、CH−296存在下でrsGFP発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染各細胞に対して上昇した。
上記実施例5の1で調製したウイルス液のうち、293T/hG3−1株で調製されたヒトGnT−III修飾エコトロピックレトロウイルスと、対照として293T細胞より調製されたエコトロピックレトロウイルスを用い、NIH/3T3細胞への遺伝子導入をPb法及びCH−296コートプレートを用いたSN法を用いてM.O.I.=0.2の条件で行った。また、マウスL1210細胞(ATCC CCL−219)は10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI−1640を増殖培地とし、37℃、5%CO2の条件下で培養を行い、Pb法及びSN法と、CH−296コートプレートを用いたBV法の3種で、M.O.I.=2.0の条件で感染を行った。Pb法、SN法は、それぞれ実施例4の2記載の方法に従って行い、BV法は上記3記載の方法に従って行った。これを37℃、5%CO2で3日間培養し、3日後の各細胞をフローサイトメーターFACS Vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)に供し、GFP発現各細胞の割合を測定した。この結果を図13、14に示す。図13、14はそれぞれNIH/3T3細胞、L1210細胞での結果が示されている。図中、横軸には感染方法が示されており、Pbはポリブレン存在下に感染が実施された群を、SNはCH−296コートプレートでSupernatant法を用いて感染が実施された群を示し、BVはCH−296コートプレートでBound virus法で感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率(%)を示す。
ヒトGnT−III修飾ウイルスを感染させた各細胞では、CH−296存在下でrsGFP発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染各細胞に対して上昇した。
SEQ ID NO:3; Synthetic primer hG3-R4 to amplify a gene encoding GnT-III.
Claims (13)
- レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を有し、かつN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強された細胞。
- レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子が染色体上に組み込まれていることを特徴とする請求項1記載の細胞。
- レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されていることを特徴とする請求項1記載の細胞。
- N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子の人為的導入によることを特徴とする請求項1記載の細胞。
- N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子の染色体上への組み込みによることを特徴とする請求項4記載の細胞。
- N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子を含有するプラスミドでの形質転換によることを特徴とする請求項4記載の細胞。
- N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子が異種のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項1記載の細胞。
- 293細胞および293T細胞より選択される細胞に由来する請求項1記載の細胞。
- レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を有し、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換されたレトロウイルス産生細胞。
- レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を有し、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換されたレトロウイルス産生細胞を培養する工程、および
培養液上清を回収する工程
を包含する、レトロウイルスベクターの製造方法。 - 下記工程を包含するレトロウイルスベクターの製造方法により製造されたレトロウイルスベクター:
レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を有し、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換されたレトロウイルス産生細胞を培養する工程、および
培養液上清を回収する工程。 - レトロウイルス由来のgag−pol遺伝子、env遺伝子を有し、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換されたレトロウイルス産生細胞を培養する工程、
培養液上清を回収してレトロウイルスベクターを得る工程、および
該レトロウイルスベクターをレトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞に感染させる工程
を包含する、標的細胞への遺伝子導入方法。 - レトロウイルス結合活性を有する機能性物質がフィブロネクチンもしくはそのフラグメントである、請求項12記載の標的細胞への遺伝子導入方法。
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