ES2225502T3 - Arn modificado en nodavirus para la administracion de genes. - Google Patents
Arn modificado en nodavirus para la administracion de genes.Info
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Abstract
Una molécula modificada de ARN1 de un nodavirus que incluye una inserción heteróloga corriente abajo del ORF de la replicasa de dicho ARN1.
Description
ARN modificado de nodavirus para la
administración de genes.
Esta invención pertenece al campo de la
administración de genes y, más particularmente, a la administración
de genes para su expresión usando ARN modificado de nodavirus
empaquetado en partículas similares a virus (VLP).
Los Nodaviridae tienen genomas de ARN
bipartitos, es decir, sus genomas están formados por dos moléculas
separadas de ARN monocatenario, denominadas ARN1 y ARN2. Ambas están
empaquetadas en el interior del mismo virión. ARN1 codifica una ARN
replicasa, y ARN2 codifica la proteína de la cápside del virión. En
el virus de FHV (fiebres hemorrágicas virales), el ARN1 tiene 3,1 kb
de longitud y el ARN2 1,4 kb.
El producto replicasa del ARN1 del FHV es
específico para el genoma vírico y esto permite que el FHV se
replique de manera autónoma [Ball y col. (1992) J. Virol.
66:2326-34; Gallagher y col. (1983) J. Virol.
46:481-9]. En condiciones naturales, la replicasa es
muy específica de molde y replica sólo ARN1 y ARN2 víricos, pero
también se produce la autorreplicación en ausencia de ARN2. Además,
aun cuando el FHV es un virus que infecta a insectos, se puede
autorreplicar en muchos tipos celulares diferentes, incluyendo
plantas, vertebrados y levaduras.
Se ha descrito de manera extensa la manipulación
del ARN2 y de la proteína de la cápside del FHV. Se ha descrito la
inserción de epitopos del VIH en los bucles de la superficie [por
ejemplo, Scodeller y col. (1995) Vaccine
13:1233-39; Buratti y col. (1996) J. Immunol.
Methods 197:7-18; Schiappacassi y col. (1997)
J. Virol. Methods 63:121-27]. De manera más
general, se ha usado el virión como sistema para presentar epitopos
[Lorenzi & Burrone (1999) Immunotechnol.
4:267-72; véase también el documento
WO96/05293].
Por el contrario, no se ha realizado la
manipulación del ARN1 ni de la replicasa del FHV. De hecho, se ha
mostrado que la función de autorreplicación del ARN1 es muy
sensible a la manipulación del ARN1 y de su ORF [Ball (1995) J.
Virol. 69:720-727]. Se ha postulado que la
adición de secuencias heterólogas a los ARN del virus de FHV puede
mejorar su uso en la transformación (documento WO99/61597).
Durante la replicación del ARN1 también se
transcribe un pequeño ARN subgenómico, denominado ARN3, desde el
extremo 3' del ARN1. El ARN3 codifica dos pequeñas proteínas cuya
función se desconoce: B1 (en el mismo marco de lectura abierto y
con el mismo codón de terminación de la traslación que la
replicasa) y B2 (en el marco abierto de lectura + 1 respecto a la
replicasa) [Ball (1992) J. Virol.
66:2335-45; Johnson & Ball (1999) J.
Virol. 73:7933-7942]. La transcripción de ARN3
parece estar controlada por un promotor interno que se activa
cuando se forma un producto intermedio bicatenario ARN+/ARN-.
Un objeto de la invención es permitir la
modificación y la manipulación de la molécula de ARN1 para
aprovechar su capacidad de autorreplicarse, y suministrar esas
moléculas de ARN1 modificadas.
La invención proporciona una molécula de ARN1
modificado de un nodavirus que incluye una inserción heteróloga
corriente abajo del ORF de la replicasa de dicho ARN1. La inserción
se realiza preferentemente corriente abajo de la replicasa y de los
ORF de B2 de dicho ARN.
La invención se basa en la molécula de ARN1 de un
nodavirus. El ARN1 codifica una ARN replicasa que replica
específicamente el genoma del nodavirus, y se dispone de secuencias
de varios nodavirus, por ejemplo, el virus de FHV (acceso X77156),
el virus del escarabajo negro (accesos X02396 y K02560), el virus
de la necrosis nerviosa del lucio listado (AB025018), el virus
Pariacoto (AF171942), el virus Nodamura (AF174533), el virus del
escarabajo negro (NC_001411) y el virus de la necrosis nerviosa del
fletán (AJ401165).
En relación con la presente invención, una
secuencia de "ARN1 de nodavirus" incluye una secuencia que se
encuentra en la naturaleza, así como fragmentos, variantes y
mutantes de la misma que codifican replicasas que conservan la
capacidad de amplificar específicamente sus propios genes.
Se podrá apreciar que la molécula de ARN1 de la
invención se puede preparar mediante modificación de un ARN1 que se
obtiene a partir de un nodavirus usando técnicas estándar de
biología molecular, o se puede ensamblar sintéticamente por medios
enzimáticos y/o químicos.
Las secuencias disponibles del ARN1 de nodavirus
(véase más arriba) indican la localización de los ORF de la
replicasa (o "A") y de "B2". La inserción en las
moléculas de la presente invención se realiza corriente abajo del
ORF de la replicasa, y preferentemente también corriente abajo del
ORF de B2.
En el FHV el ARN1 tiene 3107 nucleótidos de
longitud. El ORF de la replicasa está codificado por los nucleótidos
40-3033, y el ORF de B2 está codificado por los
nucleótidos 2738-3055. Por lo tanto, según la
invención, la inserción heteróloga para el FHV está situada entre
los nucleótidos 3033 y 3107, y preferentemente entre los
nucleótidos 3055 y 3107.
Preferentemente la inserción heteróloga está más
de 5 nucleótidos corriente abajo del ORF de la replicasa (es decir,
corriente abajo del nucleótido 3038 del FHV), por ejemplo, más de
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nt corriente abajo. Más
preferentemente está más de 5 nucleótidos corriente abajo del ORF
de B2 (es decir, corriente abajo del nucleótido 3060 del FHV), por
ejemplo, más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nt corriente
abajo de los ORF. De manera similar, la inserción heteróloga está
preferentemente más de 5 nucleótidos corriente arriba del extremo
3' de ARN1 (es decir, corriente arriba del nucleótido 3102 de FHV),
por ejemplo, más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nt
corriente arriba. Conservar cierta longitud de la secuencia 3'
terminal natural de un ARN1 ayuda a asegurarse de que el ARN1
mantiene su capacidad de autorreplicarse [Ball (1995) J.
Virol. 69:720-72].
Si la inserción heteróloga está a menos de 3
nucleótidos del último codón del ORF de la replicasa o de B2 (es
decir, entre los nucleótidos 3034 y 3036 o
3056-3058) se prefiere que el extremo 5' de la
inserción mantenga un codón de terminación para el ORF (es decir,
un codón de terminación en los nucleótidos
3034-3036 para la replicasa o en
3056-3058 para B2).
El ARN1 modificado de la invención contiene una
inserción heteróloga. Esta inserción preferentemente comprende una o
más regiones codificadoras de proteínas, con sus propios codones de
inicio y de terminación.
Como la inserción está corriente abajo de uno o
más ORF nativos del ARN1, para ayudar a su traducción la porción 5'
de la inserción heteróloga también puede comprender una secuencia
que dirige la traducción independiente de la caperuza. Por lo
tanto, típicamente la inserción heteróloga comprenderá un punto de
entrada interno al ribosoma (IRES) que está asociado funcionalmente
a una región codificadora de proteínas. Se puede usar cualquier
IRES adecuado, como el IRES de los virus de la hepatitis C o de la
encefalomiocarditis, o el de picornavirus, del virus de la
glosopeda, del ecovirus 11', del virus de la peste porcina clásica,
del protooncogén c-myc, etc. [por ejemplo,
Martínez-Salas (1999) Curr. Opin.
Biotechnol. 10:458-464].
La inserción heteróloga no destruye la capacidad
del ARN1 de autorreplicarse mediante su replicasa codificada. De
esta manera el ARN1 modificado puede administrar un gen de interés
para su expresión, y es capaz de dirigir su propia replicación.
A fin de administrar el ARN1 modificado a una
célula se prefiere empaquetarlo, por ejemplo, en el interior de una
partícula similar a un virus (VLP) o de un pseudovirión.
Se puede usar una partícula de un nodavirus, que
comprende la proteína que se expresa a partir de ARN2 (modificado
de manera opcional). Si se aplica este enfoque, el ARN2 procede
preferentemente del mismo nodavirus que el ARN modificado que se
empaqueta.
Sin embargo, como los nodavirus infectan de
manera natural a las células de los insectos, cuando se desea la
administración a una célula de un mamífero se prefiere utilizar un
empaquetamiento diferente. Un empaquetamiento preferido es una VLP
de un papilomavirus [por ejemplo, Touze y Coursaget (1998) Nucl.
Acid Res. 26:1317-1323; Kawana y col. (1998)
J. Virol. 72:10298-10300; Müller y col.
(1997) Virol. 234:93-111; Zhao y col. (1998)
Virol. 243:482-491; Unckell y col. (1997)
J. Virol. 71:2934-2939; documento
WO97/46693; documento WO98/02548; etc.], que se puede unir a
receptores de células de mamíferos.
Usar VLP del HPV ofrece varias ventajas. En
primer lugar, las VLP del HPV se unen a una amplia gama de tipos
celulares, de modo que el mayor nivel de unión se observa con
células epiteliales y mesenquimatosas, y en seres humanos sólo se
han observado concentraciones bajas de anticuerpos
anti-VLP [Le Cann y col. (1995) J. Clin.
Microbiol. 33:1380-1382]. En segundo lugar, las
proteínas L1 de diferentes tipos de HP se pueden expresar de modo
que, como la inmunidad que se induce con el uso de las VLP es
predominantemente tipoespecifica, se puede evitar la presencia de
anticuerpos anti-HVP preexistentes y se pueden
realizar múltiples inmunizaciones. En tercer lugar, como el ARN1
del nodavirus es pequeño, puede superar una limitación conocida de
las VLP del HPV, es decir, el límite superior de 7-8
kpb del ácido núcleo encapsidado. De esta manera, el ARN del
nodavirus ofrece ventajas significativas sobre otros ácidos
nucleicos.
El papilomavirus es preferentemente un
papilomavirus humano, como HPV-6. La cápside de la
VLP puede comprender las proteínas L1 y L2, o puede estar formada
solamente por L1.
A fin de facilitar el empaquetamiento del ARN1
modificado, las proteínas que forman el paquete (es decir, las
proteínas de la cápside de la VLP) se pueden modificar para que
incluyan una secuencia o estructura que puede interactuar
específicamente con el ARN1 modificado. La especificidad in
vivo de las interacciones ARN/proteína es otra ventaja de
utilizar ARN de nodavirus, en comparación con los problemas que se
encuentran cuando se usan plásmidos de ADN.
Un sistema de empaquetamiento particularmente
útil de este tipo depende de la interacción tat/TAR de los virus de
inmunodeficiencia (por ejemplo, VIH, VIB, etc).
Helga-Maria y col. (1999, J. Virol.
73(5):4127-4235) describen la importancia de
TAR en el empaquetamiento de secuencias retroviricas en viriones.
En este sistema el paquete incluye un motivo de la proteína tat (por
ejemplo, una secuencia tat mínima, como los aminoácidos 48 y el 59
de tat del VIH; véase también Derse y col. (1991) J. Virol.
65:7012-15; Chen y Frankel (1994)
Biochemistry 33:2708-2715; Puglisi y col.
(1995) Science 270:1200-1202) que interactúa
específicamente con un motivo TAR (por ejemplo, una secuencia
mínima TAR, como el 59mer mínimo, o los motivos descritos en el
documento WO92/02228) del ARN1 modificado. De esta manera el ARN1
modificado de la invención además comprenderá un motivo TAR. Esto
se puede hacer corriente arriba o corriente abajo de un gen en el
interior de inserción heteróloga, pero es preferentemente corriente
abajo. Como alternativa, el motivo TAR se puede situar corriente
arriba del ORF de la replicasa (es decir, antes de nucleótido 40 del
FHV). En un sistema de empaquetamiento basado en un papilomavirus,
se puede insertar una secuencia tat en la proteína L1,
preferiblemente en el extremo C-terminal o cerca
del mismo. Aunque esta región no es esencial para la formación de
la cápside [Paintsil y col. (1996) Virology
223:238-244], la secuencia no debe alterar la
capacidad de las VLP de ensamblarse [Müller y col. (1997)
Virology 234:93-111]. La interacción entre
tat y TAR da lugar a empaquetamiento del ARN1 modificado en el
interior del paquete. Se prefiere el uso de la interacción tat/TAR
del VIB, porque es una interacción fuerte que no precisa factores
celulares.
Se podrá apreciar que el uso de la interacción
tat/TAR para empaquetar ácidos nucleicos en el interior de una VLP
no está restringido al ARN1 modificado de la invención.
El ARN1 modificado de la invención es típicamente
de polaridad positiva y monocatenario. La invención también
suministra: (i) un ácido nucleico monocatenario complementario al
ARN1 de la invención, (ii) un ácido nucleico monocatenario
complementario a (i), (iii) un ácido nucleico monocatenario que
comprende una secuencia complementaria al ARN1 de la invención, (iv)
un ácido nucleico monocatenario que comprende una secuencia
complementaria a (i) y (v) un ácido nucleico bicatenario en el que
una de las hebras es (i), (ii), (iii) o (iv). El término "ácido
nucleico" incluye ARN, ADN y análogos como APN (ácido péptido
nucleico) y ADN o ARN con modificación del esqueleto (por ejemplo,
fosforotioatos, etc.). Se podrá apreciar que el ácido nucleico se
puede transcribir mediante la ARN polimerasa in vitro o
in vivo para producir el ARN1 modificado de la
invención.
La invención también suministra una VLP que
contiene un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, que
contiene un ARN1 modificado). La VLP es preferentemente una VLP de
un papilomavirus.
La invención también suministra una proteína L1
de un papilomavirus modificada, de modo que incluye un motivo de
una proteína tat de un virus de la inmunodeficiencia.
La invención también suministra un procedimiento
para producir una molécula de ARN1 modificado de la invención, que
comprende las etapas de: (a) obtención de un ácido nucleico que
contiene o que codifica la secuencia de ARN1 de un nodavirus y (b)
inserción de una secuencia heteróloga corriente abajo del ORF de la
replicasa y del ORF de B2 en el interior de dicha secuencia de
ARN1. Cuando se utiliza el FHV se debe tener en cuenta que su
replicasa muestra una actividad normal por debajo de los 28ºC.
La invención también suministra un procedimiento
para producir una VLP de la invención que comprende las etapas de:
transfección de una célula con un ácido nucleico según la
invención; transfección de una célula con un ácido nucleico que
codifica una proteína de la cápside de una VLP, opcionalmente
modificada de modo que incluya un motivo específico del ARN1
modificado; y purificación de la VLP de la célula. Este
procedimiento preferentemente se produce en levaduras. A fin de
introducir el ácido nucleico que codifica la VLP y el ARN1 en la
misma levadura, es posible aparear cepas haploides (por ejemplo,
una cepa haploide que expresa una proteína de la cápside se puede
aparear con una cepa haploide de un tipo de apareamiento opuesto que
expresa ARN1).
El ácido nucleico (especialmente ARN1 modificado)
y las VLP de la invención también se suministran para ser
utilizados como medicamentos. Son particularmente útiles para la
administración de genes, por ejemplo en la terapia génica.
La invención también suministra un procedimiento
para administrar una secuencia de ácidos nucleicos a una célula,
que comprende la etapa de introducir una VLP de la invención en el
interior de dicha célula. Este procedimiento se puede llevar a cabo
in vitro (células en cultivo) o in vivo.
Los nodavirus se dividen en alfanodavirus y
betanodavirus, e incluyen el virus Nodamura, el virus del
escarabajo negro, el virus Boolarra, el virus de FHV (FHV), el virus
de la lagarta (Ocneria dispar), el virus de Manawatu, el
virus del fletán atlántico, el virus de la necrosis nerviosa del pez
fugo, el virus de la necrosis nerviosa de la platija, el virus de
la necrosis nerviosa del hirame, el virus de la encefalitis de la
lubina, el virus de Pariacoto, el virus de la necrosis nerviosa del
mero gigante, el virus de la necrosis nerviosa del fletán, el
virus de la necrosis nerviosa del mero, el virus de la necrosis
nerviosa del mero moteado, el nodavirus del verrugato y el virus de
la necrosis nerviosa del lucio listado. Las moléculas de ARN1 de
cualquiera de estos virus se pueden usar según la invención. Sin
embargo, se prefieren el FHV y el virus de Nodamura porque son los
nodavirus mejor estudiados a nivel molecular. Se pueden encontrar
más detalles sobre los nodavirus en Garzon y Charpentier [pág.
351-370 de Atlas of invertebrate viruses
(eds. Adams y Bonami), CRC Press (1992)] y en Hendry [pág.
227-276 de Viruses of invertebrates (ed.
Kurstak), Marcel Dekker (1991)].
La Figura 1 muestra el ADNc obtenido a partir del
ARN1 del FHV. Se muestran en un recuadro los codones de inicio de la
replicasa (40), de B1 (2728) y de B2 (2738). Se muestran los marcos
de lectura de (a) la replicasa/B1 y de (b) B2 para todo el genoma.
Se subraya el comienzo del fragmento RapApep que se expresa en
E. Coli.
La Figura 2 es una representación esquemática del
plásmido pFHV[1,0]. El ribozima de HDV está sombreado, y el
terminador de la transcripción se señala en color negro.
La Figura 3 muestra los puntos de restricción de
la región ARN1 del pFHV[1.0].
La Figura 4 muestra la eliminación de un punto
BsshII del ARN1.
La Figura 5 muestra
pFHV-BsshII\Delta. Las Figuras 6 y 7 muestran la
construcción de pFHV-Mut\Delta y
pSK^{+}-ADH_{2}-ARN1/SpeI,
respectivamente. La Figura 8 muestra pBS24.2-6L1. La
Figura 9 muestra
pSL^{+}-ADH_{2}-ARN1-Mut\Delta.
La Figura 10 muestra la construcción de
pEGFP-1/TAR. La Figura 11 muestra
pFHV-EGFP1/TAR, en el que TAR se muestra con
guiones horizontales y la región codificadora de GFP punteada. La
Figura 12 muestra
pFHV-EGFP-1/TAR\Delta. La Figura
13 muestra la construcción de
pFHV-IRES-EGFP-1, en
el que el IRES se muestra con guiones verticales. La Figura 14
muestra la construcción de
pFHV-IRES-EGFP-1-b-TAR.
La Figura 15 muestra
pBS-ADH2-ARN1-EGFP-1/TAR\Delta
(19,6 kb). La Figura 16 muestra
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta
(18,1 kb). La Figura 17 muestra
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta(-)
(18,1 kb). La Figura 18 muestra
pBS-ADH2-ARN1-IRES-EGFP-1/b-TAR
(20,2 kb).
La Figura 19 muestra la transferencia de Northern
del ARN total de levaduras transformadas con los vectores de las
Figuras 16-18. La calle 1 muestra un control
negativo (ARN total de AB110), la calle 2 es un clon 5 RepA(+), la
calle 3 es un clon 7 RepA(+), la calle 4 es un clon 3 RepA(-), la
calle 5 es un clon 4 RepA(-) y la calle 6 es
RepA(+)-GFP. También se muestran los ARNr de
levadura 26S (2250 pb) y 18S (1650 pb).
La Figura 20 muestra la transferencia de Northern
para EGFP-1 del ARN total de levaduras
transformadas con el vector de la Figura 18. La calle 1 muestra el
ARN extraído a partir de un cultivo inducido después de 24 horas, la
calle 2 después de 48 horas, la calle 3 después de 72 horas, y la
calle 4 es un control negativo (ARN total de AB110).
La Figura 21 muestra constructos de la expresión
de la replicasa y de B2 marcadas con His en E. Coli, y la
Figura 22 muestra el SDS-PAGE de las proteínas que
se expresan a partir de estos constructos. La calle 1 de
22(A) es un marcador MW más la fracción 14, las calles 2 a 9
son las fracciones 15 a 22 y la calle 10 es el flujo libre a través
de la columna. La calle 1 de la Figura 22(B) es la fracción
soluble de la lisis celular, la calle 2 es el flujo libre a través
de la columna, las calles 3 a 11 son las fracciones 21 a 29, y la
calle 12 es un marcador MW.
La Figura 23 muestra la espectrometría de masas
de RepApep.
La Figura 24 es un transferencia de Western de
extractos proteicos totales de levaduras transformadas con el
vector de la Figura 15. Las calles 1 a 5 son extractos a los que se
hace inmunorreaccionar con suero de cinco ratones inmunizados a una
dilución de 1:5000, y la calle 6 es un control negativo que
comprende una mezcla de sueros previos a la inmunización.
La Figura 25 es una Transferencia de Western de
extractos proteicos totales de varias cepas de levadura a lo largo
de un periodo de 72 horas. La calle 1 es un control negativo, la
calle 2 es un extracto proteico total del clon 5 de
pBD-R1-G/T\Delta a las 48 horas,
las calles 3 a 5 son extractos proteicos totales del clon número 7
de cepas de RepA(+)-GFP a las 24, 28 y 72 horas, y
las calles 6 a 8 muestran lo mismo para el clon número 9. La Figura
26 es un Transferencia de Western de extractos proteicos totales de
cepas RepA(+)-GFP. La calle 1 es un control
negativo (extracto proteico total de AB110). La calle 2 muestra
proteínas de un cultivo inducido después de 24 horas, la calle 3
después de 48 horas y la calle 4 después de 72 horas.
La Figura 27 muestra la construcción de
pBS-ADH_{2}/GAP-6L1\Delta4-Tat.
La Figura 28 muestra un Transferencia de Western
de la proteína 6L1\Delta4-tat purificada con CsCl
en condiciones no reductoras usando anti-6L1
(1:5000).
La Figura 29 ilustra la expresión y el
empaquetamiento del ARN1 modificado en VLP en levaduras.
La Figura 30 muestra una transferencia de
Northern del ARN total de cepas de levadura RepA(-) (calle 2
cultivadas durante 24 horas, calle 3 cultivadas durante 48 horas),
2 cepas RepA(+) diferentes (calles 4 y 5 cultivadas durante 24
horas y calles 6 y 7 cultivadas durante 48 horas) y cepa
RepA(+)-IRES-EGFP/hTar (calle 8
cultivada durante 24 horas y calle 9 cultivada durante 48 horas).
También se muestra un ARN control negativo (calle 1) y los
marcadores del peso molecular del ARN. Las flechas indican la
posición de las señales que corresponden al ARN3.
La Figura 31 representa una transferencia de
Northern de los ARN de (1) la calle 3 y (2) la calle 6 de la Figura
30.
La Figura 32 muestra una transferencia de
Northern como se describe en la Figura 30, pero usando una sonda
distinta. Las flechas indican la posición de las señales que
corresponden a la hebra no codificadora del ARN1.
La Figura 33 muestra un experimento de extensión
de un cebador sobre el ARN total a partir de cepas de levaduras
RepA(-) (calle 2), RepA(+) (calle 3),
RepA(+)-EGFP/hTar (calle 4) y
RepA(+)-IRES-EGFP/bTAR (calle 5)
cultivadas durante 48 horas. También se presenta un ARN control
negativo (calle 1) y un control positivo en un ARN1 transcrito in
vitro (calle 6). Las letras a, b, c y d de la calle 4
identifican bandas (tres de ellas también son visibles en las
calles 3 y 5) que corresponden a los nucleótidos que se indican en
la secuencia 5' del ARN1.
La Figura 34 muestra un experimento de mapeo con
S1 usando los mismos ARN totales que se describen en la Figura 33.
También se describen los resultados de las reacciones con S1 usando
un ARN control negativo (calle 1) y un control positivo en un ARN1
transcrito in vitro (calle 6).
La Figura 35 muestra los resultados que se
obtienen mediante RT-PCR usando ácidos nucleicos
extraídos de HPV-6VLP diploides que coexpresan
ARN1-IRES/GFP/hTar y HPV-6 L1/hTAT.
La Figura 35A muestra el ARN de la levadura control (calles 1 y 3)
y los ácidos nucleicos derivados de las VLP (calles 2 y 4); la
Figura 35B muestra el ARN de la levadura (calle 1) y ácidos
nucleicos derivados de VLP no tratadas (calle 3) o tratadas con
Benzonase (calle 2); la Figura 35C muestra el ARN de la levadura
(calle 1) y ácidos nucleicos derivados de VLP no tratadas (calle 3)
o tratadas con ARNasa (calle 2) en presencia de ARN de ratón como
control interno.
La secuencia del ARN1 del genoma del FHV se
obtiene del GenBank con el número de acceso X77156. En la Figura 1
se muestra un ADNc bicatenario (3107 pb) que corresponde al
ARN1.
Este ADNc se presenta en el plásmido
pFHV[1,0], descrito por Ball [J. Virol. (1995)
69:720-727], que se usó en experimentos posteriores.
PFHV[1,0] también incluye: un promotor T7 de 18 pb corriente
arriba de la secuencia del ARN1, con un solo G entre el promotor y
el extremo 5' del ARN1; un ribozima del virus delta de la hepatitis
(89 pb) situado corriente abajo de la secuencia del ARN1, de modo
que la escisión del ribozima genera el extremo 3' natural del ARN1;
y un terminador de la transcripción T7 de 136 bp que parece
facilitar la actividad del ribozima. Esto se muestra en la Figura
2.
Para facilitar la clonación se hicieron varios
cambios al ARN1.
Eliminación de un punto BssHII. Como se
muestra en la Figura 3, la secuencia natural del ARN1 incluye dos
puntos de restricción BsshII muy próximos (nucleótidos 1270 y
1278). Uno de los dos se eliminó introduciendo una mutación silente
que no afectó a la secuencia de aminoácidos de la replicasa.
El fragmento SphI/BssHII del ARN1 se sustituyó
por un fragmento que se generó mediante PCR usando los cebadores
RI900-f y RI1272M-r (Tabla I). El
primer cebador incluía el punto SphI necesario para la clonación,
mientras que la secuencia del cebador inverso incluía una mutación
de G a A en la posición 1271, eliminando de esta manera uno de los
dos puntos de restricción BsshII (Figura 4) sin alterar el ORF de
la replicasa. El plásmido resultante se denominó
pFHV-BssHII\Delta (Figura 5).
Introducción de puntos adicionales. A fin
de insertar secuencias heterólogas en el ARN1 se introdujeron dos
puntos de restricción adicionales: un punto SacII en la posición
3062 y un punto NotI en la posición 3072 (corriente abajo desde los
codones de terminación de la traducción de los ORF de la replicasa y
de B2). Además, se insertó un punto SaII único en el
pFHV[0,1] corriente abajo desde el terminador de la
transcripción T7 (nucleótido 3337). Estos puntos se introdujeron
mediante amplificación con PCR, como se señala a continuación
(Figura 6):
- -
- los cebadores ApaI-ant y DRS-inv (Tabla I) amplificaron un fragmento de ARN1 entre el punto ApaI (posición 2349) y la posición 3101. Se consiguió la introducción de los puntos de restricción SacII y NotI introduciendo las dos secuencias en el cebador DRS-inv (Figura 6a).
- -
- Los cebadores DRS-ant (complementario a DRS-inv) y RI-KpnI-inv amplificaron un fragmento que abarcaba la región desde el nucleótido 3039 hasta el punto KpnI (posición 3368) (Figura 6a).
La fusión de los dos fragmentos de ADN se
consiguió desnaturalizando y mezclando cantidades iguales de los
dos productos de amplificación que se unieron mediante una región
complementaria de 62 pb presente en los dos fragmentos obtenidos
mediante PCR. Después de los ciclos de elongación con la Taq
polimerasa en presencia sólo de dNTP y de los ciclos de
amplificación en presencia de Taq y de los cebadores
ApaI-f y RI-KpnI-r,
se obtuvo un fragmento de fusión de ADN de punta plana (Figura 6b),
que posteriormente se clonó en el vector pCR2.1 para comprobar la
secuencia del ADN. El fragmento ApaI-KpnI se
escindió de pCR2.1 y se usó para remplazar al fragmento homólogo de
pFHV[1,0] y pFHV-BsshII\Delta,
obteniéndose un plásmido denominado pFHV-Mut (no se
muestra) y un plásmido denominado pFHV-Mut\Delta
(Figura 6c), que contiene todo el ADNc del ARN1 con sólo un punto
BsshII y los nuevos puntos de restricción SacII, NotI y SaII.
A fin de expresar el ARN1 (y versiones
modificadas del mismo) en la levadura, se clonó el ADNc en un
vector de la levadura, corriente abajo de un promotor específico de
la levadura. Este vector dirige la transcripción de las moléculas de
ARN1 que codifican la replicasa y (después de la escisión del
ribozima) que tienen extremos 5' y 3' compatibles con la
autorreplicación. El procedimiento general se muestra en la Figura
7.
Clonación de ADH_{2}/GAP en pBluescript
SK+. El promotor que se usó para la expresión fue el promotor
ADH_{2}/
GAP. Como fuente de este promotor se usó el vector de expresión en levadura pBS24.1-6L1 (Figura 8; véase también el documento WO00/09699), El fragmento de ADN ADH_{2}/GAP-6L1 se extrajo desde el plásmido PBS24.1-6L1 mediante digestión con SacI y SaII, y se clonó en pBluescript-SK+ (Stratagene) digerido con los mismos enzimas. El constructo resultante se denominó pSK+-ADH-6L1.
GAP. Como fuente de este promotor se usó el vector de expresión en levadura pBS24.1-6L1 (Figura 8; véase también el documento WO00/09699), El fragmento de ADN ADH_{2}/GAP-6L1 se extrajo desde el plásmido PBS24.1-6L1 mediante digestión con SacI y SaII, y se clonó en pBluescript-SK+ (Stratagene) digerido con los mismos enzimas. El constructo resultante se denominó pSK+-ADH-6L1.
Amplificación mediante PCR del promotor
ADH_{2}/GAP. Una porción del promotor de la levadura se
amplificó mediante PCR que se realizó con
pSK+-ADH-6L1 usando el cebador ADH/Sac (Tabla I),
que se une al promotor de la levadura en el punto SacI, y el
cebador inverso P-R1inv, que se une al promotor en
la fusión con el gen 6L1, que de manera adicional incluía 13
nucleótidos de ARN1 (Figura 7a).
Amplificación mediante PCR de ARN1/Sph.
Una porción del ADNc del ARN1 del pFHV[1.0] se amplificó
usando el cebador ARN-1ant, que se une al extremo 5'
del ARN1 (+1 posición), y el cebador inverso
ARN1-inv, que se une en el punto de restricción
único SphI en el nucleótido 1021 (Figura 7b).
Fusión ADH2-ARN1/Sph. La
fusión se obtuvo desnaturalizando y mezclando cantidades iguales de
los dos productos de amplificación de las Figuras 7a y b,
favoreciendo de esta manera la unión de la región complementaria de
13 pb que está presente en los dos fragmentos obtenidos mediante
PCR (Figura 7c). Después de los ciclos de elongación sólo con Taq en
presencia de dNTP y de los ciclos de amplificación en presencia de
Taq y de los cebadores ADH/SAC y ARN1-inv, se
obtuvo un fragmento de fusión de ADN de punta plana.
Clonación de ADH2-ARN1/Sph en
pCR2.1. Este producto de la PCR de punta plana se clonó en
pCR2.1 (Invitrogen), dando lugar al plásmido
pCR-ADH2/ARN1 (Figura 7d). Se verificó la secuencia
de su ADN y se confirmó la secuencia de fusión promotor/ARN1
esperada TAAATCTA/GTTTCGAAA, aunque hubo algunas mutaciones en
otras regiones del producto amplificado. Sin embargo, el único clon
que tenía una secuencia amplificada correcta tenía una mutación que
eliminaba el punto SphI, necesario para las etapas posteriores
(Figura 7d).
Clonación del producto de fusión
ADH2-ARN1 en pSK+-ADH2-6L1. Para
superar este problema, el producto de fusión se escindió de pCR2.1
en forma de fragmento SacI-Spe y se clonó en
pSK+-ADH2-6L1 (figura 7e) digerido con los mismos
enzimas de restricción, obteniéndose así el constructo final
pSK+-ADH2-ARN1/SpeI (Figura 7f).
Introducción del ARN1 modificado en el vector
de la levadura. El fragmento EagI-KpnI de
pFHV-BsshII\Delta (Figura 5) se insertó en el
lugar del fragmento correspondiente de
pSK+-ADH2-ARN1/SpeI (Figura 7f), generando un
constructo denominado
pSK+-ADH2-ARN1-BsshII\Delta. El
fragmento BsshII\Delta-KpnI de este constructo
fue sustituido por el correspondiente fragmento de
pFHV-Mut\Delta (Figura 6c), generando un plásmido
denominado
pSK+-ADH2-ARN1-Mut\Delta (Figura
9).
Se hizo una inserción heteróloga en el interior
de la secuencia del ARN1. Se insertó un gen para expresar la
proteína fluorescente verde (GFP) [Chalfie y col. (1994)
Science 263:802-806] corriente abajo de los
marcos de lectura abiertos de la replicasa y de B2, junto con una
secuencia TAR del VIH.
Para hacer la inserción heteróloga el punto de
partida fue el plásmido peGFP-1 (Clontech) digerido
con BsrgI y NotI. Se obtuvo una secuencia de ADNbc con extremos
cohesivos con BsrgI (5') y NotI (3') y que incluía la secuencia TAR
del VIH-1 (nucleótidos 454-520 del
genoma del VIH-1, acceso K03455) fusionando dos
oligonucleótidos complementarios, TAR-ant y
TAR-inv, y esto se insertó en el peGFP digerido
para formar peGFP-1/TAR (Figura 10). El
oligonucleótido TAR mantenía el ORF del EGFP y también incluía un
codón de terminación de la traslación inmediatamente corriente
abajo del punto BsrgI, seguido inmediatamente por nuevos puntos de
restricción BstEII y NheI. También se ha insertado con éxito una
secuencia TAR corriente arriba del ORF de la replicasa.
El fragmento SacII-NotI de
peGFP-1/TAR, que incluye la secuencia codificadora
de GFP seguida por la secuencia TAR del VIH-1, se
clonó en el pFHV-Mut digerido con los mismos enzimas
de restricción, obteniéndose un plásmido denominado
pFHV-eGFP-1/TAR (Figura 11). El
fragmento SphI/SacII de este plásmido se sustituyó por el fragmento
correspondiente de pFHV-Mut\Delta (Figura 6c)
para generar pFHV-eGFP-1/TAR\Delta
(Figura 12) con sólo un punto de restricción BsshII.
Los ARN policistrónicos se pueden traducir en
células de mamífero mediante la inserción de un punto de entrada
ribosómico interno (IRES) [Parks y col. (1986) J. Virol.
60:376-384] entre los dos genes de interés,
permitiendo de esta manera la traducción independiente de la
caperuza del segundo gen (corriente abajo). Para facilitar la
expresión debida a la inserción heteróloga se insertó de esta
manera el IRES del virus de la encefalomiocarditis delante del gen
eGFP-1. Este IRES típicamente permite la traducción
de la proteína de eGFP sólo en células de mamíferos, puesto que la
traducción mediada por IRES esta inhibida selectivamente en las
levaduras [Venkatesan y col. (1999) Nucl. Acids Res.
27:562-572].
El plásmido
pCMV-IRES/EGFP-1 (Figura 13) se
digerido con EcoRI, se trató con el enzima Klenow para hacer que el
punto tuviera el extremo plano y, después de la inactivación de los
enzimas, se digirió con NotI, generando un fragmento de punta plana
en 5' y digerido con NotI en 3' que contenía el IRES del ECMV
fusionando al gen EGFP-1. De manera similar, el
plásmido pFHV-Mut\Delta (Figura 6c) se digirió
con SacII, se trató con el enzima Klenow y posteriormente se
digirió con NotI. El fragmento
IRES-EGFP-1 se clonó en el plásmido
digerido, dando lugar a
pFHV-IRES-EGFP-1
(Figura 13).
Para facilitar el empaquetamiento del ARN que se
expresa a partir de este constructo, el TAR del VIB (nucleótidos
5-30 del genoma del VIB, acceso M32690) se insertó
corriente abajo desde el gen EGFP. La secuencia TAR se construyó
uniendo dos oligonucleótidos complementarios
(b-TAR-ant y
b-TAR-inv) con extremos cohesivos
compatibles con NotI. Esto también introdujo dos nuevos puntos de
restricción, BstEII (próximo al punto NotI 5') y XhoI (próximo al
punto NotI 3'). El fragmento NotI bicatenario se clonó en a
pFHV-IRES-EGFP-1
digerido con NotI para dar lugar a
pFHV-IRES-EGFP-1/b-TAR
(Figura 14). Se confirmó la orientación correcta del fragmento
NotI.
Se construyeron cuatro plásmidos de expresión en
levaduras con la siguiente disposición básica de 5' a 3': promotor
específico de levadura, ARN1 modificado, ribozima de HDV, terminador
17 y punto de poliA de la levadura.
Inicialmente se sustituyó el fragmento
SacI-BsshII de pBS24.1-6L1 (Figura
8) por el fragmento correspondiente de
pSK+-ADH2-ARN1/BsshII\Delta para dar lugar al
plásmido
pBS-ADH2-ARN1/BsshII\Delta-6L1,
en el que parte del ADNc del ARN1 estaba fusionado con el extremo 3'
de la secuencia del gen de L1 (no se muestra). Esto se manipuló
como se señala a continuación:
- 1.
- El fragmento BsshII-SaII L1 se sustituyó por el fragmento BsshII-SaII de pFHV-EGFP-1/TAR\Delta, dando lugar a pBS-ADH2-ARN1-EGFP-1/TAR\Delta (Figura 15).
- 2.
- El fragmento BsshII-SaII L1 se sustituyó por el fragmento BsshII-SaII de pFHV-Mut\Delta, dando lugar a pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta (Figura 16).
- 3.
- Relleno del punto BsshII único (1273) de pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta, con interrupción del ORF de la replicasa, generando pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta(-) (Figura 17).
- 4.
- Sustitución del fragmento BsshII-SaII (incluyendo parte de la secuencia de ADNc del ARN1 modificado) de pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta por el correspondiente fragmento BsshII-SaII (incluyendo IRES-EGFP-1/b-TAR) de pFHV-IRES-EGFP-1/b-TAR para generar un plásmido denominado pBS-ADH2-ARN1-IRES-EGFP-1/b-TAR (Figura 18).
Los plásmidos
pBS-ADH2-ARN1-EGFP-1/TAR\Delta,
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta,
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta(-)
y
pBS-ADH2-ARN1-IRES-EGFP-1/b-TAR
(Figuras 15-18) se introdujeron mediante
transformación en una cepa AB110 que se había obtenido previamente
en el laboratorio (documento WO00/09699) y que expresa la proteína
L2 del HPV-16. Las cepas resultantes se denominaron
pBS-RI-G/T\Delta (se
seleccionaron los clones 4 y 5),
pBS-RI-Mut\Delta (se seleccionaron
los clones 1 y 3),
pBS-RI-Mut\Delta(-) (se
seleccionaron los clones 5 y 7) y
pBS-RI-IRES-G/b-TAR
(se seleccionaron los clones 5 y 9), respectivamente.
Confirmación de la replicación del ARN.
Los ADN totales se extrajeron de las cepas
pBS-RI-Mut\Delta,
pBS-RI-Mut\Delta(-) y
pBS-RI-IRES-G/b-TAR,
y se denominaron RepA(+), RepA(-) y RepA(+)-GFP,
respectivamente. Estos ARN, junto con un ARN control negativo de la
cepa AB110 denominado c-, se analizaron mediante Transferencia de
Northern usando una sonda de ADN (600 pb) no radiactiva (kit de
marcado BrightStar Psoralen-Biotin, Ambion) obtenida
mediante la PCR que se llevó a cabo en pFHV[1.0] usando los
cebadores APAI-ant y repA-inv.
La Figura 19 muestra los resultados, que indican
que sólo se detectan señales intensas de hibridación con el ARN
extraído de los clones de levadura que se diseñaron para que
expresaran el ORF de la replicasa, tanto cuando la secuencia del
ARN1 no tiene inserciones (calles 2 y 3) como cuando la secuencia
IRESegfp-bTAR se introduce corriente abajo desde los
ORF de la replicasa y de B2 (calle 6). Se detecta una señal mucho
más débil con ARN de clones de levadura transformados con un
plásmido en el que el ORF de la replicasa está interrumpido (calles
4 y 5), mientras que no se detecta ninguna señal con el ARN control
negativo.
Estos resultados confirman que la replicasa puede
mantener la autorreplicación del ARN1 incluso cuando se introduce
en la secuencia del ARN de tipo natural un inserto heterólogo (un
gen extraño).
Para confirmar que el ARN1 modificado
autorreplicante contenía la secuencia
IRES-EGFP/b-TAR se realizó una
transferencia de Northern usando una sonda no radiactiva de ADN de
toda la región del EGFP. El experimento confirmó la expresión del
ARN1 recombinante a las 24, 48 y 72 horas (Figura 20).
Confirmación de la expresión de la
proteína. Además de confirmar la autorreplicación a nivel del
ARN, también se ensayó la expresión de la proteína usando
anticuerpos anti-replicasa.
Para obtener anticuerpos
anti-replicasa se expresó en E. Coli la
porción C-terminal de la replicasa
(DVWEK...
SNNRK, denominado RepApep). Esta proteína incluye la proteína B1 completa, de modo que, de manera ventajosa, los anticuerpos anti-RepApep deben detectar la expresión de B1 y la de la replicasa. La misma región se expresó también con un desplazamiento del marco de lectura de +1 para obtener la proteína B2 expresada en bacterias. La detección de las proteínas B1 o B2 confirmaría la autorreplicación.
SNNRK, denominado RepApep). Esta proteína incluye la proteína B1 completa, de modo que, de manera ventajosa, los anticuerpos anti-RepApep deben detectar la expresión de B1 y la de la replicasa. La misma región se expresó también con un desplazamiento del marco de lectura de +1 para obtener la proteína B2 expresada en bacterias. La detección de las proteínas B1 o B2 confirmaría la autorreplicación.
La porción Rep-Apep del ORF de la
replicasa se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores
RepA-dir y RepA-inv que contenían
los puntos de restricción NheI (5') y XhoI (3'). El producto con el
extremo romo que se obtuvo mediante PCR se clonó en
pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen) y se
verificó la secuencia de los insertos de diferentes clones. El
fragmento NheI(5')-XhoI(3') se extrajo
de uno de los clones correctos mediante digestión con los enzimas de
restricción y se clonó en pTrc-HisA (Invitrogen),
generando un plásmido denominado
pTrc-RepApep-His_{6} que contenía
un ORF en el que RepApep estaba en un marco que tenía una cola de
hexahistidina (Figura 21a).
Se amplificó todo el ORF de B2 mediante PCR
usando los cebadores B2-dir y
B2-inv que contenían los mismos puntos NheI y XhoI.
El producto de la PCR se digirió con los dos enzimas y se clonó
directamente en pTrc-HisA (Invitrogen), generando
un plásmido denominado
pTrc-B2-His_{6} que contenía un
ORF en el que B2 estaba en un marco que tenía una cola de
hexahistidina (Figura 21b).
Los extractos proteicos solubles totales de los
clones bacterianos que expresaban cualquiera de las dos proteínas
recombinantes fueron sometidos a IMAC (cromatografía de afinidad
por iones metálicos inmovilizados) usando resina
Ni-NTA (Hoffmann-La Roche) y se
recogieron fracciones enriquecidas en las proteínas RepApep y B2
(Figura 22). La proteína RepApep mostró un perfil inesperado de
migración en la SDS-PAGE, de modo de la proteína
purificada se sometió a espectrometría de masas (Figura 23), que
confirmó el peso molecular esperado de 15-16
kDa.
Las fracciones que contenían las proteínas
enriquecidas se combinaron, se dializaron frente a SSTF y el
contenido proteico se midió mediante una prueba de BCA (Pierce).
Las proteínas se usaron para inmunizar a grupos de cinco ratones
cada uno tres veces (RepApep, 50 \mug/dosis) o cuatro veces
(proteína B2, 25 \mug/dosis) a intervalos de dos semanas. Las
vacunas se administraron por vía intraperitoneal (IP) usando 200
\mug de antígeno y el mismo volumen de MF59 [Ott y cols. (1995)
pág. 277-296 de Vaccine design. The subunit and
adjuvant approach (eds. Powell y Newman), Plenum Press]. Se
recogieron sueros preinmunización antes de la inmunización y se
obtuvieron muestras de suero dos semanas después de cada
inmunización.
Las muestras de suero de los cinco ratones
inmunizados con RepApep se estudiaron a una dilución de 1:5000 en
extractos proteicos totales preparados a partir de la cepa de
levadura pBS-RI-G/T\Delta (clon
4), y en todos ellos se observó la detección de una proteína de
\sim110 kDa, de acuerdo con la existencia de la replicasa
expresada en la levadura (Figura 24).
La misma dilución de suero que se usó en la calle
4 de la Figura 24 se utilizó para el análisis de transferencia de
Western en extractos proteicos totales de diferentes cepas de
levadura cultivadas en condiciones de inducción durante períodos de
tiempo variables. El experimento confirmó que la ARN1 replicasa
está presente a las 24, 48 y 72 horas en cepas que expresan el ARN1
modificado (Figura 25).
El suero que se usó en la calle 4 de la Figura 24
se usó para el análisis de Transferencia de Western de un extracto
proteico total preparado después de una inducción de 24, 48 y 72
horas a partir de la cepa de levadura portadora de
pBS-RI-G/T\Delta (Figura 26). Se
detectó una banda proteica (calles 2 y 3) entre los marcadores de
peso molecular 20 kDa y 7 kDa que no está presente en el extracto
del control negativo (calle 1) ni en el extracto preparado después
de una inducción de 72 horas (calle 4). Esto concuerda con la
síntesis de la proteína B1 en la levadura, lo que de nuevo confirma
la autorreplicación del ARN1 modificado. La ausencia de proteína B1
a las 72 horas concuerda con los datos de expresión de B1 y B2 que
previamente se obtuvieron en células de mamíferos [Johnson &
Ball (1999) J. Virol. 73:7933-7942].
Confirmación de la expresión del ARN3. Se
extrajeron ARN totales de las cepas de levadura que expresaban los
plásmidos
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta(-),
pBS-ADH2-ARN1-Mut\Delta
y
pBS-ADH2-ARN1-IRES-EGFP-1/b-Tar,
cultivadas durante 24 y 48 horas y denominadas RepA(-), RepA(+) y
RepA(+)IGFP/b-Tar, respectivamente. Estos ARN se
analizaron mediante análisis de Transferencia de Northern usando la
sonda de ADN bicatenario no radiactiva de la Figura 19. La Figura 30
muestra que la sobreexposición de la película revela una señal débil
que corresponde a una especie de ARN que migra como era de esperar
para el ARN3 y que se detecta tanto a las 24 como a las 48 horas en
la cepa RepA(+) (calles 4 a 7). Se realizó una transferencia de
Northern usando el ARN de la calle 6 durante un periodo de tiempo
mayor en gel de agarosa y el filtro se cortó antes de la hibridación
para incluir solamente el área en el que había ARN3 (Figura 31).
Esto confirma la existencia de ARN3. En el caso del ARN procedente
de la cepa RepA(+)IGFP/b-Tar (Figura 30, calles 8 y
9), no se pudo observar el correspondiente ARN3 (que migraría más
lentamente debido la inserción), probablemente enmascarado por las
intensa señal de hibridación del ARN1.
Confirmación de la hebra de ARN no
codificadora. Los ARN extraídos de las cepas RepA(-), RepA(+) y
RepA(+)IGFP/b-Tar cultivadas a las 24 y 48 horas se
analizaron mediante Transferencia de Northern usando una sonda no
radiactiva específica de hebra (kit de marcado BrightStar
Psoralen-Biotin, Ambion) para detectar la hebra de
ARN no codificadora. La sonda específica de hebra era un transcrito
in vitro que se obtuvo usando el plásmido
pFHV-Mut\Delta linealizado con SacII. La Figura
32 muestra que se detecta una señal de hibridación intensa que
corresponde a un ARN del tamaño esperado sólo en los clones que
expresan la proteína replicasa, tanto cuando la secuencia de ARN1 no
tiene inserciones (calles 4 y 5) como cuando se introduce la
secuencia IRES-EGFP/b-Tar corriente
abajo del ORF de B2 (calles 6 y 7). No se detecta ninguna señal en
el ARN control (calle 1) ni cuando el ORF de la replicasa está
interrumpido (calles 2 y 3).
Análisis de extensión de cebadores y de mapeo
de S1 de ARN1. El análisis estándar de extensión de cebadores se
realizó con ARN total de las cepas RepA(-), RepA(+) y
RepA(+)IGFP/b-Tar usando la transcriptasa inversa
AMV y el oligonucleótido R1-120 marcado con T4
cinasa.
Los productos de la extensión se colocaron en gel
de poliacrilamida desnaturalizada/urea al 8% con una secuencia
control insertada en el plásmido pSK+-ADH2-ARN1/Spel
(Figura 7f) usando el mismo cebador. La Figura 33 muestra que se
pueden detectar productos de extensión más cortos.
El análisis del mapeo de S1 se realizó usando los
mismos ARN. La sonda fue un fragmento bicatenario obtenido mediante
PCR a partir del plásmido pSV40-FHV[0,0]
usando los oligonucleótidos AZ15-ant (nucleótido
6285 del plásmido) y R1-120. El fragmento que se
obtuvo mediante PCR se marcó con T4 cinasa, se digirió con NcoI
para eliminar el marcado radiactivo de la hebra que tenía la misma
polaridad que el ARNm que se quería detectar, y se purificó en gel.
Se hibridaron alícuotas de la sonda radiactiva con los ARN totales y
se realizó digestión con nucleasa S1 en condiciones estándar. A
modo de control, también se hibridó con la sonda y se digirió con
S1 un ARN1 de pFHV[1,0] transcrito in vitro con T7.
Los productos tratados con S1 se colocaron sobre un gel de
poliacrilamida desnaturalizada/urea al 8% junto con una secuencia de
ADN obtenida usando el cebador RI-90inv que era
complementaria a ARN1.
Como se muestra en la Figura 34, se pueden
detectar bandas correspondientes a ARN de longitud completa en
muestras que expresan la replicasa A sin o con las inserciones GFP
e IRES-GFP (calles 3, 4 y 5).
Clonación y secuenciado del extremo 5' del
ARN1. Se usó el ARN total procedente de la cepa
RepA(+)-IGFP/b-Tar para clonar el
extremo 5' de la especie de ARN1. La clonación se llevó a cabo
usando el kit Ambion First Choice^{TM} RLM-RACE,
que permite la clonación selectiva de moléculas de ARNm con
caperuza. Los cebadores que se usaron fueron:
- 1)
- Transcripción inversa con R1-inv.
- 2)
- PCR externa con el cebador del adaptador de ARN externo que se suministra con el kit y el cebador inverso AZ-9inv (nucleótido 426 de ARN1).
- 3)
- PCR interna con el cebador del adaptador de ARN interno que se suministra con el kit y con R1-120.
La clonación del producto final de la PCR se
llevó a cabo en el vector de punta plana pZero (Invitrogen). El
secuenciado de 10 clones reveló que la secuencia clonada de todos
ellos comenzaba con AAAACAG (nucleótido 16 de la secuencia de
ARN1). Esto corresponde al producto c que se muestra en la Figura
33. De esta manera, la banda d de la Figura 33 puede representar un
producto de degradación de c, y la banda b puede ser una forma con
caperuza.
Clonación y secuenciado del extremo 5' de
ARN3. Usando los mismos procedimientos experimentales se clonó
la región 5' de ARN3 a partir de los mismos clones de levadura. Los
cebadores que se usaron fueron:
- 1)
- Transcripción inversa con AZ-5inv (nt3101 del ARN1)
- 2)
- PCR externa con el cebador del adaptador de ARN externo que se suministra con el kit y el cebador inverso AZ-5inv.
- 3)
- PCR interna con el cebador del adaptador de ARN interno que se suministra con el kit y con R3-2809inv (nt 2830 del ARN1).
Los productos finales de la PCR se digirieron con
NcoI (nt 2801 del ARN1) y BamHI (en el interior del cebador del
adaptador interno) y se clonaron en pTRC-HisB
(Invitrogen) digerido con los mismos enzimas.
El secuenciado de 10 clones obtenidos mediante
PCR dinámica que se realizó con ARN de la cepa RepA(+) reveló la
misma secuencia en todos los casos, comenzando en el nucleótido
2721 del ARN1 (GTTACCAA...). Esto corresponde al punto de inicio
del ARN3 que ya se había descrito en la literatura.
El secuenciado de 18 clones obtenidos mediante
PCR dinámica que se realizó con ARN de la cepa
RepA(+)-IGFP/b-Tar reveló que
ninguno corresponde al punto de inicio de la transcripción de ARN3,
sino que todos ellos se inician con secuencias corriente arriba que
pertenecen a ARN1.
Para promover el empaquetamiento del ARN1
modificado que tenía un inserto TAR, se modificó la proteína de
cubierta L1 de HPV-6 para que incluyera un motivo
tat complementario en su extremo C-terminal.
La construcción del vector de expresión en
levadura para conseguir esto incluyó varias etapas (Figura 27). En
primer lugar, el plásmido pBS24.1-6L1 (Figura 8) se
digirió con BsshII y SaII, eliminando de esta manera los últimos 4
aminoácidos de la proteína L1. Este plásmido expresa en la levadura
la proteína L1 de la cápside de HPV. Se insertó un ADNbc
BsshII-SaII corto que se obtuvo fusionando los
oligonucleótidos complementarios 6L1\Delta4 y 6L1\Delta4inv,
reconstituyendo de este modo el ORF de L1, dándole un codón de
terminación de la traducción y un nuevo punto de restricción NotI.
El plásmido resultante de expresión en la levadura se denominó
pBS24.1- 6L1\Delta4. La amplificación mediante PCR del dominio de
unión al TAR del VIH-1 de tat (aminoácidos 36 a 72)
se realizó con un plásmido que contenía el ADNc de la cepa IIIB del
VIH-1 usando los cebadores Tat-dir y
Tat-inv, y que también incluía un punto BsshII en
el extremo 5' u puntos NotI y SaII en el extremo 3'. El fragmento
resultante de punta plana se clonó en el plásmido pCR2.1 y se
secuenció. El fragmento BsshII-SaII se extrajo de
pCR2.1 y se ligó con pBS24.1-6L1\Delta4 digerido
con los mismos enzimas de restricción. El plásmido resultante se
denominó
pBS24.1-6L1\Delta4-Tat.
pBS24.1-6L1\Delta4-Tat
se introdujo mediante transformación en una cepa JSC310 que
previamente se había obtenido en el laboratorio (documento
WO00/09699) y que expresa la proteína L2 del HPV-6.
Se analizaron diferentes clones obtenidos en los experimentos de
transformación para detectar la expresión de
6L1\Delta4-Tat y se seleccionó el clon 2 para los
experimentos posteriores.
El clon 2 se cultivó en condiciones de inducción
y se realizó la purificación de las VLP mediante gradiente de
cloruro de cesio (CsCl), como se describe en el documento
WO00/09699. La fracción purificada con CsCl correspondiente a una
densidad de 1,28-1,29 g/cm^{3} se colocó en
condiciones no reductoras en SDS-PAGE y se analizó
mediante Transferencia de Western usando un anticuerpo
anti-6L1 (Figura 28). La detección de una banda que
migraba más despacio que la proteína marcadora de peso molecular
115 kDa indica que se forman puentes disulfuro entre diferentes
monómeros L1/Tat, que es un requisito conocido para el
autoensamblado eficiente de las VLP del HPV [Sapp y col. (1998)
J. Virol. 72:6186-89].
La expresión de la replicasa, la autorreplicación
del ARN1 modificado que contiene un inserto TAR, la expresión de
L1-Tat y el empaquetamiento del ARN1 modificado se
ilustran en la Figura 29. Todas las etapas tienen lugar en la misma
célula de levadura, dando lugar a VLP infecciosas para administrar
un gen de interés a células de mamíferos.
El clon 2 de la cepa de levadura JSC310 que
contiene el plásmido
pBS24.1-6L1\Delta4-Tat se apareó
con la cepa AB110 que contiene el plásmido
pBS-ADH2-ARN1-EGFP-1/TAR\Delta
para obtener un clon diploide que coexpresa el derivado de ARN1
recombinante (que contiene el gen GFP y la secuencia humana TAR) y
la proteína L1/bTAT recombinante de HPV6. Se estudió la expresión de
las proteínas L1 y replicasa A y los niveles de transcripción de
ARN1-EGFP-1/TAR en diferentes
clones del experimento de apareamiento. Se eligió un clon diploide y
se cultivó en condiciones de inducción. Se realizó la purificación
de las VLP en gradiente de CsCl según se describe en el documento
WO00/09699.
Se combinaron y se dializaron frente a SSTF las
fracciones purificadas con CsCl correspondientes a una densidad de
1,28-1,29 g/cm^{3}. Las VLP dializadas se usaron
para diferentes experimentos que se realizaron siguiendo diferentes
procedimientos, que se describen en la Figura 35.
En la Figura 35A las VLP se trataron con fenol,
fenol-cloroformo, cloroformo y etanol y se
precipitaron para obtener un material desprovisto de proteínas. Las
alícuotas del sedimento final de ácidos nucleicos suspendidas en
agua se sometieron a RT-PCR sin ningún tratamiento
adicional usando el kit OneStep RT-PCR (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del kit. Los cebadores que se usaron
fueron R1-235ant (nucleótido 235 del ARN1) y
R1-1272M-inv, dando lugar a la banda
esperada de 1037 nt (calles 2 y 4, que son la misma muestra repetida
en dos análisis mediante PCR dinámica diferentes). Se incluyó como
control un ARN de levadura no relacionado.
En la Figura 35B se sometió una alícuota de 100
\mul de las VLP combinadas a un tratamiento durante 24 horas a
37ºC con 25 unidades de Benzonase (Merck) antes de la extracción con
fenol/cloroformo. El sedimento final de ácidos nucleicos se sometió
a RT-PCR usando los mismos cebadores que antes. Se
observa la banda de 1037 nt, tanto cuando las VLP se habían tratado
previamente con Benzonase (calle 2) como sin el tratamiento con
Benzonase.
En la Figura 35C se sometió una alícuota de las
VLP combinadas a un tratamiento durante una hora a 37ºC con 1
\mug de ARNasa A antes de la extracción con fenol/cloroformo. Se
incluyó en la muestra ARN total de ratón como control interno del
tratamiento con ARNasa. Después de la extracción con
fenol/cloroformo, el sedimento final de ácidos nucleicos se sometió
a RT-PCR usando dos conjuntos diferentes de
cebadores, los dos cebadores de ARN1 que se usaron para la Figura
35A y dos cebadores que amplifican una banda de \sim600
nucleótidos correspondiente al ARNm de la GAPDH de ratón. Mientras
que la banda de ARN1 (flecha hueca) es visible tanto cuando las VLP
se han tratado previamente con ARNasa (calle 2) como sin ningún
tratamiento con ARNasa (calle 3), el ARNm de la GAPDH se puede
amplificar (flecha negra) a partir de la muestra no tratada (calle
3) y apenas es visible después del tratamiento con ARNasa.
Claims (28)
1. Una molécula modificada de ARN1 de un
nodavirus que incluye una inserción heteróloga corriente abajo del
ORF de la replicasa de dicho ARN1.
2. La molécula de ARN1 de la reivindicación 1, en
la que la inserción heteróloga está también corriente abajo del ORF
de B2 de dicho ARN1.
3. La molécula de ARN1 de la reivindicación 2, en
la que la inserción heteróloga está más de 5 nucleótidos corriente
abajo de los ORF de la replicasa y de B2.
4. La molécula de ARN1 de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que la inserción heteróloga está
más de 5 nucleótidos corriente arriba del extremo 3' del ARN1.
5. La molécula de ARN1 de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que la inserción heteróloga
comprende una región codificadora de proteínas.
6. La molécula de ARN1 de la reivindicación 5, en
la que la inserción heteróloga comprende un IRES que está corriente
arriba de la región codificadora de proteínas.
7. La molécula de ARN1 de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el ARN1 comprende una
secuencia que puede interactuar específicamente con una secuencia
proteica.
8. La molécula de ARN1 de la reivindicación 7, en
la que la secuencia que puede interactuar específicamente con una
secuencia proteica es una secuencia TAR.
9. La molécula de ARN1 de la reivindicación 8, en
la que la secuencia TAR está en el interior de la inserción
heteróloga.
10. Una VLP que contiene la molécula de ARN1 de
cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
11. La VLP de la reivindicación 10, en la que la
VLP es una VLP de un papilomavirus.
12. La VLP de la reivindicación 11, en la que la
proteína L1 de la VLP comprende una secuencia tat, y la molécula de
ARN1 encapsidada es la molécula de ARN1 de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8.
13. La VLP de la reivindicación 12, en la que las
secuencias tat y TAR proceden de un VIH o de un VIB.
14. Un ácido nucleico monocatenario
complementario al ARN1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
15. Un ácido nucleico monocatenario
complementario al ácido nucleico de la reivindicación 14.
16. Un ácido nucleico monocatenario que comprende
una secuencia complementaria al ARN1 de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9.
17. Un ácido nucleico bicatenario, en el que una
de las hebras es el ácido nucleico monocatenario de cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 16.
18. Un procedimiento para producir el ARN1 de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas
de: (a) obtención del ácido nucleico que comprende o codifica una
secuencia de ARN1 de un nodavirus y (b) inserción de una secuencia
heteróloga corriente abajo del ORF de la replicasa en el interior de
dicha secuencia de ARN1.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que la etapa (b) supone la inserción de una secuencia heteróloga
corriente abajo de los ORF de la replicasa y de B2 en el interior de
dicha secuencia de ARN1.
20. Un procedimiento para producir la VLP de una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que comprende las etapas
de: transfección de una célula con un ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17; transfección de una
célula con un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside
de una VLP, opcionalmente modificada para que incluya un motivo
específico del ARN1 modificado; y purificación de las VLP de la
célula.
21. Un procedimiento para la administración in
vitro de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en una
célula, que comprende la etapa de introducción de la VLP de una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el interior de dicha
célula, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés es la
molécula de ARN1 modificado que está contenida en dicha VLP.
22. El ARN1 de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para su uso como medicamento.
23. La VLP de una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 para su uso como medicamento.
24. Un procedimiento para la administración in
vitro de una secuencia de ácidos nucleicos en una célula, que
comprende la etapa de introducir una VLP de una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 en el interior de dicha célula.
25. El uso de la interacción tat/TAR para
empaquetar los ácidos nucleicos en el interior de una VLP.
26. ARN que comprende una secuencia del ARN1 de
un nodavirus, caracterizado porque la secuencia de ARN1
contiene una inserción heteróloga corriente abajo del ORF de su
replicasa.
27. El ARN de la reivindicación 26, en el que la
inserción heteróloga está corriente abajo del ORF de B2.
28. Uso de la VLP según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 en la fabricación de un medicamento para la
administración de un ácido nucleico a una célula.
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