CN114867491A - 用于肿瘤内和/或静脉内施用以治疗癌症的重组mva病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使癌症患者减小肿瘤体积和/或增加存活率的组合物和相关方法。所述组合物包含编码肿瘤相关抗原(“TAA”)以及4‑1BBL和/或CD40L的重组MVA，且可以任何合适的方式施用于受试者，包括通过静脉内和/或肿瘤内施用。

Description

用于肿瘤内和/或静脉内施用以治疗癌症的重组MVA病毒
发明领域
本发明涉及用于治疗癌症的疗法；所述治疗包括静脉内或肿瘤内施用的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，所述病毒包括编码4-1BBL(CD137L)的核酸。如本文所用的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒(也称为“重组MVA”或“rMVA”)是指包括至少一种编码肿瘤相关抗原(TAA)的多核苷酸的MVA。在更具体的方面，本发明包括静脉内或肿瘤内施用的重组MVA，其包括编码TAA的核酸和编码4-1BBL的核酸。在另外的方面，本发明包括静脉内或肿瘤内施用的重组MVA，其包括编码TAA的核酸和编码CD40L的核酸。在另外的方面，本发明包括静脉内和/或肿瘤内施用的重组MVA，其包括编码TAA、4-1BBL(CD137L)和CD40L的核酸。
发明背景
重组痘病毒已被用作针对传染性有机体的免疫疗法疫苗，并且最近还被用作针对肿瘤的免疫疗法疫苗(Mastrangelo等人(2000)J Clin Invest.105(8):1031-1034)。
一种已被证明可用作针对传染病和癌症的免疫疗法疫苗的痘病毒株是修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒(有时简称为“MVA”)。MVA是通过516次连续传代对安卡拉痘苗病毒株的鸡胚成纤维细胞(CVA)产生的(综述参见Mayr等人(1975)Infection 3：6-14)。由于这些长期传代，产生的MVA病毒的基因组缺失了约31kb的基因组序列，且因此被描述为高度限制复制到禽类细胞的宿主细胞(Meyer等人(1991)J.Gen.Virol.72：1031-1038)。在各种动物模型中表明，由此产生的MVA是显著无毒的(Mayr和Danner(1978)Dev.Biol.Stand.41：225-34)。已经描述了用于开发更安全的产品(例如疫苗或药物)的安全性增强的MVA病毒株(参见国际PCT公开案WO2002042480；也参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号，其全部以引用的方式并入本文中)。此类变体能够在非人类细胞和细胞系中，尤其是在鸡胚成纤维细胞(CEF)中进行生殖复制，但在人类细胞系，特别包括HeLa、HaCat和143B细胞系中无法复制。此类病毒株也不能在体内进行生殖复制，例如，在某些小鼠病毒株中，例如转基因小鼠模型AGR 129，其免疫严重受损且对复制病毒高度敏感(参见美国专利第6,761,893号)。已描述此类MVA变体和其衍生物，包括重组体，称为“MVA-BN”(参见国际PCT公开案WO2002/042480；也参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号)。
已显示使用编码肿瘤相关抗原(TAA)的痘病毒载体成功地使癌症患者减小肿瘤大小以及提高总体存活率(参见例如WO 2014/062778)。已经证明，当向癌症患者施用编码TAA(如HER2、CEA、MUC1和/或Brachyury)的痘病毒载体时，患者会产生强大且特异性的T细胞反应来对抗癌症(同上；另见Guardino等人((2009)Cancer Res.69(24)，doi 10.1158/0008-5472.SABCS-09-5089)，Heery等人(2015)JAMA Oncol.1：1087-95)。
一种被发现在许多癌症和肿瘤细胞上表达的TAA是内源性逆转录病毒(ERV)蛋白。ERV是侵入宿主生殖系的前外源形式的残余物，且此后通过遗传种群垂直传播(参见Bannert等人(2018)Frontiers in Microbiology，第9卷，第178条)。ERV诱导的基因组重组事件和正常细胞基因的失调已被证明对肿瘤形成有促进作用(同上)。此外，有证据表明某些ERV蛋白具有致癌特性(同上)。已发现ERV在多种癌症中表达，包括例如乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。(参见例如Bannert等人(2018)Front.Microbiol.9：178；Cegolon等人(2013)BMC Cancer 13：4；Wang-Johanning等人(2003)Oncogene 22：1528-35；Wang-Johanning等人.(2007)Int.J.Cancer 120：81-90；Wang-Johanning等人(2008)Cancer Res.68：5869-77；Wang-Johanning等人(2018)Cancer Res.78(13增刊)，AACR Annual Meeting 2018年4月，Abstract 1257；Contreras-Galindo等人(2008)J.Virol.82：9329-36；Schiavetti等人(2002)Cancer Res.62：5510-16；Maliniemi等人(2013)PLoS One 8：e76281；Fava等人(2017)Genes Dev.31：34-45，Muster等人(2003)Cancer Res.63：8735-41；Buscher等人(2005)Cancer Res.65：4172-80；Serafino等人(2009)Expt’l.Cell Res.315：849-62；Iramaneerat等人(2011)Int.J.Gynecol.Cancer21：51-7；Ishida等人(2006)Cancer Sci.97：1139-46；Goering等人(2011)Carcinogenesis32：1484-92；Agoni等人(2013)Front.Oncol.9：180；Li等人(2017)J.Mol.Diagn.19：4-23)。
除了对TAA的有效性外，当与例如CD40配体(CD40L)等CD40激动剂(参见WO 2014/037124)或与例如4-1BB配体(4-1BBL)等4-1BB激动剂组合时，例如MVA等痘病毒已被证明具有增强的功效(Spencer等人(2014)PLoS One 9：e105520)。
CD40/CD40L是肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子(“TNFR/TNF”)超家族的成员。虽然CD40在许多细胞类型，包括B细胞、巨噬细胞和DC上组成性表达，但其配体CD40L主要在活化的CD4+T细胞上表达(Lee等人(2002)J.Immunol.171(11)：5707-5717；Ma和Clark(2009)Semin.Immunol.21(5)：265-272)。感染或免疫后早期DC与CD4+T细胞之间的同源相互作用‘许可’DC引发CD8+T细胞反应(Ridge等人(1998)Nature 393：474-478)。DC许可引起共刺激分子的上调、存活率的增加和更好的DC交叉呈递能力。此过程主要通过CD40/CD40L相互作用介导(Bennet等人(1998)Nature 393：478-480；Schoenberger等人(1998)Nature 393：480-483)，但也存在不依赖CD40/CD40L的机制(CD70，LT.beta.R)。有趣的是，还提出了在DC上表达的CD40L与在CD8+T细胞上表达的CD40之间的直接相互作用，这为产生不依赖于辅助的CTL反应提供了可能的解释(Johnson等人(2009)Immunity 30：218-227)。
4-1BB/4-1BBL是TNFR/TNF超家族的成员。4-1BBL是一种在活化的B细胞、单核细胞和DC中表达的共刺激配体。4-1BB由自然杀手(NK)和自然杀手T(NKT)细胞、Treg和几种先天免疫细胞群(包括DC、单核细胞和中性粒细胞)组成型表达。有趣的是，4-1BB在活化的而非静息的T细胞上表达(Wang等人(2009)Immunol.Rev.229：192-215)。4-1BB连接诱导干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)的增殖和产生，并通过上调例如Bcl-xL等抗凋亡分子来增强T细胞存活(Snell等人(2011)Immunol.Rev.244：197-217)。重要的是，4-1BB刺激通过增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来增强NK细胞增殖、IFN-γ产生和溶细胞活性(Kohrt等人(2011)Blood 117：2423-32)。
目前正在通过不同的免疫治疗策略探索4-1BB/4-1BBL免疫轴。例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞的自体转移在大B细胞淋巴瘤中显示出临床益处，于2017年获得FDA批准。患者自体T细胞用CAR转导，所述CAR组合了源自肿瘤特异性抗体的细胞外域、CD3ζ细胞内信号传导域和4-1BB共刺激基序。添加4-1BB对于CAR T细胞的体内持久性和抗肿瘤毒性至关重要(Song等人(2011)Cancer Res.71：4617e27)。目前正在研究针对4-1BB的抗体。
几项研究已显示，靶向4-1BB/4-1BBL途径的激动性抗体在用作单一疗法时显示出抗肿瘤活性(Palazón等人(2012)Cancer Discovery 2：608-23)。针对4-1BB的激动性抗体(乌瑞芦单抗(Urelumab)，BMS；乌托鲁单抗(Utolimumab)，Pfizer)目前正在临床开发中。近年来，将4-1BBL与其它疗法组合的研究取得了不同程度的成功。例如，当向先前存在MC38(鼠类腺癌)肿瘤而非B16黑色素瘤肿瘤的小鼠施用CTLA-4和抗4-1BB抗体时，观察到显著的CD8+T细胞依赖性肿瘤消退，以及对这些肿瘤的长效免疫性。在另一个实例中，用抗4-1BB(Bristol-Myers Squibb(BMS)-469492)治疗仅使得M109肿瘤适度消退，但显著延迟了EMT6肿瘤的生长。
肿瘤微环境由多种细胞类型构成，从免疫细胞浸润到癌细胞、细胞外基质、内皮细胞和其它影响肿瘤进展的细胞参与者。这种复杂且纠缠的平衡不仅因患者而异，而且在同一受试者的病变内也会发生变化(Jiménez-Sánchez等人(2017)Cell 170(5)：927-938)。基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和程序性死亡配体1(PD-L1)表达的肿瘤分层强调了炎症环境对实现针对癌症的客观反应的重要性(Teng等人(2015)Cancer Res.75(11)：2139-45)。癌症基因组图谱(TCGA)对基因表达谱的泛癌分析支持肿瘤炎症特征与对免疫疗法的客观反应相关(Danaher等人(2018)J.Immunother.Cancer 6(1)：63)。
近年来，改善癌症疗法疫苗施用途径的尝试已从皮下注射扩大到静脉内施用途径。例如，已证明静脉内施用编码异源抗原的MVA疫苗能够诱导对所述抗原的强特异性免疫反应(参见WO 2014/037124)。此外，当MVA疫苗包括CD40L时，会产生增强的免疫反应。
长期以来，已有报道将细菌衍生材料(Coley毒素)接种到肿瘤病变中实现治愈反应，突出了局部感染在促进抗肿瘤反应中的作用(Coley(1906)Proc.R.Soc.Med.3(SurgSect)：1-48)。将病原体相关分子模式(PAMP)、细菌产物和病毒局部施用到肿瘤病变中会诱导抗菌程序，从而导致施用后的一系列事件，包括：i)分泌促炎性细胞因子，如I型、II型和III型干扰素和肿瘤坏死因子α(TNF-α)；ii)危险信号，例如警报素和热休克蛋白；和iii)释放肿瘤抗原(Aznar等人(2017)J.Immunol.198：31-39)。向肿瘤局部施用免疫疗法会诱导全身免疫反应，因为在未治疗的肿瘤病变中已评估消退((2018)Cancer Discov.8(6)：67)。
在过去几年中，已经报道了MVA疫苗的肿瘤内施用。发现肿瘤内注射表达GM-CSF的MVA和用DNA疫苗进行免疫延长了携带HPV16 E7肿瘤的小鼠的存活时间(Nemeckova等人(2007)Neoplasma 54：4)。MVA肿瘤内注射的其它研究无法证明对胰腺肿瘤生长的抑制作用(White等人(2018)PLoS One 13(2)：e0193131)。热灭活MVA的肿瘤内注射诱导的抗肿瘤免疫反应依赖于树突状细胞产生危险信号、I型干扰素和抗原交叉呈递(Dai等人(2017)Sci.Immunol.2(11)：eaal1713)。
许多癌症疫苗的活性涉及诱导针对肿瘤的适应性免疫反应。肿瘤特异性T细胞的有效活化包括：首先，抗原在肿瘤中但不在健康组织中的排他性和高表达，以最小化耐受诱导并有利于感受态T细胞库。其次，肿瘤抗原的有效加工和HLA分子在细胞内的负载。最后，免疫原性HLA/肽复合物在细胞表面上的呈现和其被肿瘤特异性T细胞识别。
显然，对其它癌症治疗，包括主动免疫疗法和癌症疫苗存在大量未满足的医疗需求。此外，需要能够在患者免疫反应的多个区域中诱导增强的免疫反应的疗法。在许多方面，本公开的实施方案通过提供增加和改进目前可用的癌症治疗的疫苗、疗法和联合疗法来满足这些需求。
发明内容
在本发明的多个实施方案中确定，当肿瘤内或静脉内施用时，编码肿瘤相关抗原(TAA)和4-1BB配体(本文中也称为41BBL、4-1BBL或CD137L)的重组MVA增加癌症患者的治疗有效性和/或增强对癌症患者的治疗。更具体地，确定了与单独施用重组MVA相比，本公开的各种实施方案导致肿瘤中的炎症增加、肿瘤中的调节性T细胞(Treg)减少和T细胞耗竭、肿瘤特异性T细胞的扩增和NK细胞的活化、肿瘤体积减小的增加和/或癌症受试者存活率的增加。
在本发明的多个实施方案中确定，当肿瘤内或静脉内施用时，编码肿瘤相关抗原(TAA)和CD40配体(CD40L)的重组MVA增强对癌症患者的治疗。更具体地，确定了与单独施用重组MVA相比，本公开的各种实施方案导致肿瘤中的炎症增加、肿瘤中的调节性T细胞(Treg)减少和T细胞耗竭、肿瘤特异性T细胞的扩增和NK细胞的活化、肿瘤体积减小的增加和/或癌症受试者存活率的增加。
在另外的实施方案中，本发明包括重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含编码4-1BBL(CD137L)的核酸和编码CD40L的核酸，当静脉内和/或肿瘤内施用时，其增强了对癌症患者的治疗。
因此，在一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的肿瘤内施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
在另一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和CD40L抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的肿瘤内施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
在另一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内和/或静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸、编码CD40L的第二核酸和编码4-1BBL(CD137L)的第三核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过不同注射途径(即，非肿瘤内注射或非静脉内注射)注射包括编码TAA、CD40L抗原和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
在另一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的静脉内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对TAA特异的CD8 T细胞反应。
在另一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内注射包括编码TAA和CD40L抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的静脉内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对TAA特异的CD8 T细胞反应。
在另一个实施方案中，本发明包括减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者静脉内和/或肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸、编码CD40L的第二核酸和编码4-1BBL的第三核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内或非肿瘤内注射包括编码TAA的第一核酸、编码CD40L抗原的第二核酸和编码4-1BBL抗原的第三核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的静脉内和/或肿瘤内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对TAA特异的CD8 T细胞反应。
在另一个实施方案中，本发明包括在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL抗原的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内注射包括编码异源肿瘤相关抗原和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，重组MVA的肿瘤内施用在肿瘤中产生增强的炎症反应。
在另一个实施方案中，本发明包括在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L抗原的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内注射包括编码异源肿瘤相关抗原和CD40L抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，重组MVA的肿瘤内施用在肿瘤中产生增强的炎症反应。
在另一个实施方案中，本发明包括在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内和/或静脉内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸、编码CD40L抗原的第二核酸和编码4-1BBL抗原的第三核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内或非静脉内注射包括编码异源肿瘤相关抗原的第一核酸、编码CD40L抗原的第二核酸和编码4-1BBL抗原的第三核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，重组MVA的肿瘤内和/或静脉内施用在肿瘤中产生增强的炎症反应。
在各种另外的实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的受试者的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，所述重组MVA包括a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和b)编码4-1BBL的第二核酸。
在各种另外的实施方案中，本发明包括用于治疗患有癌症的受试者的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，所述重组MVA包括a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和b)编码CD40L的第二核酸。
在各种另外的实施方案中，本发明包括用于治疗患有癌症的受试者的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，所述重组MVA包括：a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸；b)编码CD40L的第二核酸；和c)编码4-1BBL的第三核酸。
在另一个实施方案中，当与施用检查点抑制剂拮抗剂组合向患者肿瘤内施用编码4-1BBL抗原的重组MVA时，可增强癌症患者的治疗，更具体地增加肿瘤体积的减小和/或增加癌症患者的存活率。
在另一个实施方案中，当与施用检查点抑制剂拮抗剂组合向患者肿瘤内施用编码CD40L抗原的重组MVA时，可增强癌症患者的治疗，更具体地增加肿瘤体积的减小和/或增加癌症患者的存活率。
在另一个实施方案中，当与施用检查点抑制剂拮抗剂组合向患者肿瘤内和/或静脉内施用编码CD40L和4-1BBL抗原的重组MVA时，可增强癌症患者的治疗，更具体地增加肿瘤体积的减小和/或增加癌症患者的存活率。
在另一个实施方案中，本发明的重组MVA在施用抗体的同时或之后施用。在更优选的实施方案中，重组MVA在抗体之后施用。
在另一个实施方案中，本发明的重组MVA通过相同的施用途径并且在施用抗体的同时或之后施用。在另一个实施方案中，重组MVA通过不同的施用途径或在施用抗体之后施用。
在另一个实施方案中，本发明包括一种增强癌症患者的抗体疗法的方法，所述方法包括向癌症患者施用本发明的药物组合，其中与单独施用抗体疗法相比，施用药物组合增强由抗体疗法诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在优选的实施方案中，第一核酸编码作为内源性逆转录病毒(ERV)蛋白的TAA。在更优选的实施方案中，ERV蛋白来自人内源性逆转录病毒蛋白K(HERV-K)家族。在更优选的实施方案中，ERV蛋白选自HERV-K包膜和HERV-K gag蛋白。
在优选的实施方案中，第一核酸编码作为内源性逆转录病毒(ERV)肽的TAA。在更优选的实施方案中，ERV肽来自人内源性逆转录病毒蛋白K(HERV-K)家族。在更优选的实施方案中，ERV肽选自HERV-K包膜蛋白的假基因(HERV-K-MEL)。
在其它优选实施方案中，第一核酸编码选自由以下组成的组的TAA：癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸相关蛋白1(TRP2)、Brachyury、黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、叶酸受体1(FOLR1)以及其组合。
在一个或多个优选实施方案中，重组MVA是MVA-BN或其衍生物。
在各种另外的实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与免疫检查点分子拮抗剂或激动剂组合向癌症受试者施用。在进一步的实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与对TAA特异的抗体组合向癌症受试者施用以治疗患有癌症的受试者。在更优选的实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS的免疫检查点分子拮抗剂或激动剂组合施用。在最优选的实施方案中，免疫检查点分子拮抗剂或激动剂包括抗体。在最优选的实施方案中，免疫检查点分子拮抗剂或激动剂包括PD-1或PD-L1抗体。
本发明的其它目标和优点将在下面的描述中部分列出，并且部分将由描述而变得显而易见，或可以通过本发明的实践来学习。本发明的目标和优点将借助在所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和达到。
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明本发明的一个或多个实施方案，并且连同描述一起用来解释本发明的原理。
附图说明
图1A、1B、1C和1D说明MVA-OVA-4-1BBL感染的肿瘤细胞对4-1BBL介导的CD8 T细胞共刺激会影响细胞因子产生，而无需DC。相比之下，MVA-OVA-CD40L仅在DC存在下增强细胞因子产生。如实施例2中所述，在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10细胞用MVA-OVA、MVA-OVA-CD40L或MVA-OVA-4-1BBL感染，并在DC存在下在指示时收获和共培养感染的肿瘤细胞。从OT-I小鼠中磁性纯化初始OVA(257-264)特异性CD8+T细胞并添加到共培养物中。培养细胞并收集上清液用于通过Luminex进行细胞因子浓度分析。显示了IL-6(图1A)、GM-CSF(图1B)、IL-2(图1C)和IFN-γ(图1D)的上清液浓度。数据显示为平均值±SEM。
图2A和图2B显示MVA-OVA-4-1BBL感染的肿瘤细胞直接(即不需要DC)驱动抗原特异性CD8 T细胞分化为活化的效应T细胞，而CD40L介导的MVA-OVA-CD40L感染的肿瘤细胞的共刺激依赖于DC的存在。如实施例3中所述，在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10(黑色素瘤模型)细胞用MVA-OVA、MVA-OVA-CD40L或MVA-OVA-4-1BBL感染。第二天，收获感染的肿瘤细胞并在DC存在下共培养(当指示时)。从OT-I小鼠中磁性纯化初始OVA(257-264)特异性CD8+T细胞，并以1:5的比率添加到共培养物中。细胞在37℃5％CO2下培养48小时。然后对细胞染色并通过流式细胞仪进行分析。图2A显示T-bet对OT-I CD8+T细胞(图中以“CD8+”指示)的GMFI；图2B显示OT-I CD8+T细胞的CD44+颗粒酶B+IFNγ+TNFα+的百分比。数据显示为平均值±SEM。
图3A、3B、3C、3D和3E说明用编码CD40L或4-1BBL的MVA感染会诱导肿瘤细胞系和巨噬细胞中的肿瘤细胞死亡。如实施例4所述，肿瘤细胞系B16.OVA(图3A和3B)、MC38(图3C)和B16.F10(图3D)用指定MOI的载体感染20小时。通过流式细胞仪分析细胞的活力；图3A、3C、3D和3E显示死细胞的百分比(“活/死+”)。图3B：来自图3A的上清液中的HMGB1通过ELISA进行量化。图3E：骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)以指定MOI感染20小时。通过流式细胞仪分析细胞的活力。数据呈现为平均值±SEM。
图4A和4B显示rMVA-4-1BBL在体内诱导NK细胞活化。如实施例5中所述，C57BL/6小鼠(n＝5/组)用生理盐水或5×107TCID50“rMVA”(＝MVA-OVA)、“rMVA-4-1BBL”(＝MVA-OVA-4-1BBL)或5×107TCID50 rMVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)进行静脉内免疫。24小时后，处死小鼠并处理脾以用于流式细胞仪分析。显示了CD69(A)和CD70(B)的几何平均荧光强度(GMFI)。数据显示为平均值±SEM。
图5A和5B显示静脉内rMVA-4-1BBL免疫促进体内血清IFN-γ分泌。如实施例6中所述，C57BL/6小鼠(n＝5/组)用生理盐水或5×107TCID50“rMVA”(＝MVA-OVA)、“rMVA-4-1BBL”(＝MVA-OVA-4-1BBL)或5×107TCID50 rMVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)进行静脉内免疫。图5A：6小时后，小鼠被放血，从全血中分离血清，并通过Luminex测定血清中的IFN-γ浓度。图5B：3、21和45小时后，向小鼠静脉注射布雷菲德菌素(Brefeldin)A以停止蛋白质分泌。免疫后6、24和48小时处死小鼠并通过流式细胞仪分析脾细胞。数据显示为平均值±SEM。
图6显示静脉内“rMVA-4-1BBL”(＝MVA-OVA-4-1BBL)免疫促进携带B16.OVA肿瘤的小鼠的血清IFN-γ分泌。如实施例7中所述，在肿瘤接种后第7天将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受i.v.(静脉内)PBS或5×107TCID50 rMVA(＝MVA-OVA)或rMVA-4-1BBL。6小时后，小鼠被放血，从全血中分离血清，并通过Luminex测定血清中的IFN-γ浓度。数据显示为平均值±SEM。
图7A、7B、7C和7D显示静脉内“rMVA-4-1BBL”(＝MVA-OVA-4-1BBL)初免和加强免疫之后的抗原和载体特异性CD8+T细胞扩增。如实施例8中所述，C57BL/6小鼠(n＝4/组)在第0天接受用盐水或5×107TCID50“rMVA”(＝MVA-OVA)、rMVA-4-1BBL或5×107TCID50 rMVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)的静脉内初免，且在第41天接受加强免疫。在初免后第6、21、35、48和64天对小鼠放血，并进行外周血的流式细胞仪分析。图7A显示外周血白细胞(PBL)中抗原(OVA)特异性CD8+T细胞的百分比；图7B显示PBL中载体(B8R)特异性CD8+T细胞的百分比。在初免后第70天处死小鼠。收获脾脏并进行流式细胞仪分析。图7C显示活细胞中抗原(OVA)特异性CD8+T细胞的百分比；且图7D显示活细胞中载体(B8R)特异性CD8+T细胞的百分比。数据显示为平均值±SEM。
图8显示与没有4-1BBL的重组MVA相比，静脉内注射编码4-1BBL的MVA病毒的抗肿瘤作用增加。如实施例9中所述，在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受PBS或5×107TCID50 MVA-OVA(图中的“rMVA”)或MVA-OVA-4-1BBL(图中“rMVA-4-1BBL”)的静脉内施用。定期测量肿瘤生长。
图9A、9B、9C和9D显示肿瘤内注射编码4-1BBL或CD40L的MVA病毒增强的抗肿瘤作用。如实施例10中所述，在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)、第12天和第15天(灰色虚线)将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝4-5/组)分组并接受PBS或5×107TCID50的MVA-OVA(图中标记为“rMVA”)、MVA-OVA-CD40L(图中标记为“rMVA-CD40L”)或MVA-OVA-4-1BBL(图中标记为“rMVA-4-1BBL”)的肿瘤内施用。定期测量肿瘤生长。
图10A、10B和10C显示肿瘤内注射用CD40L编码的MVA病毒对已确定的结肠癌的抗肿瘤作用。如实施例11中中所述，在肿瘤接种后第14天(黑色虚线)、第19天和第22天(黑色虚线)将携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受PBS或5×107TCID50 MVA-TAA(图中标记为“rMVA”)或MVA-TAA-CD40L(图中标记为“rMVA-CD40L”)的肿瘤内(i.t.)施用。定期测量肿瘤生长。在这些实验中，重组MVA编码的TAA包括抗原AH1A5、p15E和TRP2。
图11说明检查点阻断和肿瘤靶向抗体与rMVA-4-1BBL(本文中也称为“MVA-OVA-4-1BBL”)的肿瘤内(i.t.)施用协同作用。如实施例12中所述，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并在指示时(钩号)腹膜内接受200μg IgG2a、抗TRP-1或抗PD-1抗体。在肿瘤接种后第13天(黑色虚线)、第18天和第21天(灰色虚线)用PBS或5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫。定期测量肿瘤生长。
图12表明，与抗CD137抗体治疗相比，肿瘤内MVA-OVA-4-1BBL注射产生优异的抗肿瘤效果。如实施例13中所述，C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。七天后，当肿瘤测量超过5×5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS、5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL或10μg抗4-1BB(3H3)抗体。定期测量肿瘤生长。在图12A中，显示了肿瘤平均体积。图12B：在初免后第12天，外周血淋巴细胞用OVA-dextramer染色并通过FACS进行分析。显示了CD8+T细胞中OVA dextramer+CD44+T细胞的百分比。
图13显示静脉注射编码内源性逆转录病毒抗原Gp70的MVA病毒的抗肿瘤作用。如实施例14中所述，Balb/c小鼠皮下(s.c.)接受5×105个CT26.wt细胞。在肿瘤接种后第12天，当肿瘤测量超过5×5mm时，将携带CT26.wt肿瘤的小鼠(n＝5/组)分组并接受i.v.(静脉内)PBS或5×107TCID50的MVA、rMVA-Gp70或rMVA-Gp70-CD40L。定期测量肿瘤生长。显示了肿瘤平均直径(图13A)和肿瘤平均体积(图13B)。图13C：免疫后7天，血细胞被再刺激，并且显示了刺激后血液中CD8+CD44+IFN-γ+细胞的百分比。
图14显示静脉注射编码内源性逆转录病毒抗原Gp70加上CD40L的MVA病毒的抗肿瘤作用。如实施例15中所述，C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.F10细胞。七天后，当肿瘤测量超过5×5mm时，将携带B16.F10肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受i.v.(静脉内)PBS或5×107TCID50 MVA、rMVA-Gp70或rMVA-Gp70-CD40L。定期测量肿瘤生长。显示了免疫后7天用p15e肽刺激后血液中的肿瘤平均体积(图14A)和CD8+CD44+IFN-γ+细胞的百分比(图14B)。
图15：4-1BBL佐剂化可以增加细胞因子/趋化因子MVA-BN骨架对IT免疫的反应。本文中的“辅助”意指重组MVA的特定编码蛋白质或组分增加由重组MVA的其它编码蛋白质或组分产生的免疫反应。此处，将5×105个B16.OVA细胞皮下(s.c.)植入至C57BL/6小鼠体内(参见实施例23)。在第10天，用PBS或2×108TCID50 MVA-BN、MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫(n＝6只小鼠/组)。6小时后，提取肿瘤并处理肿瘤裂解物。通过Luminex分析细胞因子/趋化因子谱。图15显示免疫小鼠中细胞因子/趋化因子上调。
图16：MVA-OVA-4-1BBL增加了对肿瘤内(i.t.)免疫的细胞因子/趋化因子促炎性反应。将5×105个B16.OVA细胞皮下(s.c.)植入至C57BL/6小鼠体内(参见实施例23和24)。在第10天，用PBS或2×108TCID50的MVA-BN、MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫(n＝6只小鼠/组)。6小时后，提取肿瘤并处理肿瘤裂解物。通过Luminex分析细胞因子/趋化因子谱。图16显示与MVA-BN相比，在MVA-OVA-4-1BBL免疫小鼠中上调的那些细胞因子/趋化因子。
图17：肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL后肿瘤微环境(TME)和肿瘤引流淋巴结(TdLN)的定量和定性T细胞分析。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。九至十三天后，当肿瘤测量超过5×5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS、2×108TCID50 MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例25)。免疫后一天、三天和七天，处死小鼠，并用胶原酶/DNA酶消化肿瘤和肿瘤引流淋巴结(TdLN)，并通过流式细胞仪进行分析。显示了每毫克肿瘤和每TdLN的CD45+细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和OVA特异性CD8+T细胞的数量。
图18：肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL后TME和引流LN的定量和定性T细胞分析。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。九至十三天后，当肿瘤测量超过5.5×5.5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或2×108TCID50 MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例26)。免疫后一天、三天和七天，处死小鼠，并用胶原酶/DNA酶消化肿瘤和TdLN(肿瘤引流淋巴结)，并通过流式细胞仪进行分析。图18A：显示了肿瘤(左图)和TdLN(右图)中OVA特异性CD8+T细胞中Ki67+细胞的百分比。图18B：显示了i.t.免疫后七天肿瘤中OVA特异性CD8+T细胞中PD1的GMFI。图18C：显示了i.t.免疫后七天肿瘤中的OVA特异性Teff/Treg比。
图19：肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL后TME和肿瘤引流淋巴结(TdLN)的定量和定性NK细胞分析。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。九至十三天后，当肿瘤测量超过5.5×5.5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或2×108TCID50 MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例27)。免疫后一天、三天和七天处死小鼠，并用胶原酶/DNA酶消化肿瘤和肿瘤引流淋巴结(TdLN)，并通过流式细胞仪进行分析。显示了每毫克肿瘤和TdLN的NK细胞数以及肿瘤和TdLN中NK细胞的CD69、颗粒酶B和Ki67表面标志物的GMFI。
图20：MVA-OVA-4-1BBL介导的抗肿瘤作用的CD8 T细胞依赖性。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。七天后，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或2×108TCID50MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例28)。在第一次注射后的第5天和第8天，重复这些肿瘤内(i.t.)注射(垂直虚线)。此外，IgG2b同型对照抗体(左图和中图)或抗CD8抗体(2.43；右图)在第一次免疫前第-1天和第一次免疫后第1、4、7、11天腹膜内(i.p.)注射(100μg/小鼠)。定期测量肿瘤生长，并显示肿瘤平均直径。
图21：MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL介导的抗肿瘤作用的Batf3+DC依赖性。C57BL/6小鼠或Batf3-/-小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。七天后(垂直虚线)，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或2×108TCID50的MVA、MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例29)。在第一次肿瘤内注射后的第5天和第8天，重复i.t.注射(垂直虚线)。定期测量肿瘤生长。图21A：显示了肿瘤平均直径。图21B：第一次免疫后11天抽血并分析抗原特异性T细胞(即OVA257-264特异性T细胞)的存在。显示CD8+T细胞中OVA特异性T细胞的百分比。
图22：NK细胞在携带B16.OVA黑色素瘤的小鼠中对MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施用的作用。C57BL/6或IL15Rα-/-小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.OVA细胞。七天后，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或2×108TCID50的MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL(参见实施例30)。在第一次注射后的第5天和第8天重复治疗。定期测量肿瘤生长。显示了肿瘤平均直径(图22A)和存活百分比(图22B)。第一次免疫后11天，抽血并分析抗原特异性T细胞的存在(图22C)。显示了CD8+T细胞中OVA257-264-dextramer+(SIINFEKL+)CD44+T细胞的百分比。
图23显示响应用MVA-OVA-4-1BBL进行IT免疫的NK细胞依赖性细胞因子/趋化因子谱。将5×105个B16.OVA细胞皮下(s.c.)植入至C57BL/6和IL15Rα-/-小鼠中(参见实施例31)。在第7天，用PBS或2×108TCID50 MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫(n＝2-3只小鼠/组)。6小时后，提取肿瘤并处理肿瘤裂解物。通过Luminex分析细胞因子/趋化因子谱。图23显示在MVA-OVA-4-1BBL肿瘤内(i.t.)免疫后在不存在IL15Rα的情况下减少的那些细胞因子/趋化因子。
图24显示在携带B16.F10黑色素瘤的小鼠中，与MVA-gp70-4-1BBL相比，用MVA-gp70-CD40L进行肿瘤内免疫的抗肿瘤功效。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.F10细胞。七天后，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或5×107TCID50的MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-4-1BBL或MVA-CD40L(参见实施例32)。在第一次注射后的第5天和第8天重复治疗。定期测量肿瘤生长。图24A显示肿瘤平均直径，且图24B显示用MVA-gp70-4-1BBL治疗的小鼠中白癜风的出现。第一次免疫后11天，抽血并分析抗原特异性T细胞的存在。p15E再刺激后CD8+T细胞内产生IFNγ的CD44+T细胞的百分比如图24C中所示。
图25：MVA-gp70-4-1BBL-CD40L在携带B16.F10黑色素瘤的小鼠中的肿瘤内施用的抗肿瘤功效。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.F10细胞。七天后，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或5×107TCID50的MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-gp70-4-1BBL-CD40L、MVA-4-1BBL、MVA-CD40L或MVA-4-1BBL-CD40L(参见实施例33)。在第一次注射后的第5天和第8天重复治疗。定期测量肿瘤生长。肿瘤平均直径显示在图25A中。第一次免疫后十一天，抽血并用p15e肽再刺激。CD8+T细胞中IFNγ+CD44+T细胞的百分比如图25B中所示。
图26：辅以CD40L或4-1BBL的MVA-gp70在携带CT26肿瘤的小鼠中的抗肿瘤功效。Balb/c小鼠皮下(s.c.)接受5×105个Ct26wt细胞。十三天后，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或5×107TCID50MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-gp70-4-1BBL-CD40L、MVA-4-1BBL、MVA-CD40L和MVA-4-1BBL-CD40L(参见实施例34)。在第一次注射后的第5天和第8天重复治疗。定期测量肿瘤生长。图26A显示肿瘤平均直径，且图26B显示存活百分比。图26C：第一次免疫后十一天，抽血并用AH1肽再刺激；显示了CD8+T细胞中IFNγ+CD44+T细胞的百分比。
图27：肿瘤内注射进一步包括4-1BBL和/或CD40L的MVA-gp70后肿瘤微环境(TME)和肿瘤引流淋巴结(TdLN)的定量和定性T细胞分析。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.F10细胞。九天后，当肿瘤测量超过5×5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或5×107TCID50的MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L或MVA-gp70-4-1BBL-CD40L(参见实施例35)。免疫后三天，处死小鼠，并收集肿瘤以及肿瘤引流淋巴结(TdLN)，用胶原酶/DNA酶消化，并通过流式细胞仪进行分析。图27显示每毫克肿瘤和每TdLN的CD8+T细胞、p15E特异性CD8+T细胞和Ki67+p15E特异性CD8+T细胞的数量。数据代表平均值±SEM。
图28显示肿瘤内注射进一步表达4-1BBL和/或CD40L的MVA-gp70后肿瘤微环境(TME)和肿瘤引流淋巴结(TdLN)的定量和定性T细胞分析。C57BL/6小鼠皮下(s.c.)接受5×105个B16.F10细胞(参见实施例36)。九天后，当肿瘤测量超过5.5×5.5mm时，将小鼠分组并肿瘤内注射PBS或5×107TCID50的MVA-Gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L和MVA-gp70-4-1BBL-CD40L。免疫后三天，处死小鼠，并收集肿瘤以及TdLN并用胶原酶/DNA酶消化，并通过流式细胞仪分析产生的单个细胞。显示了每毫克肿瘤和TdLN中NK细胞、Ki67+NK细胞和颗粒酶B+NK细胞的数量。数据显示为平均值±SEM。
图29：在携带CT26.WT肿瘤的小鼠中静脉内施用辅以4-1BBL和/或CD40L的MVA-gp70的抗肿瘤功效。Balb/c小鼠皮下(s.c.)接受5×105个CT26.WT细胞。十二天后，将小鼠分组并静脉内注射PBS或5×107TCID50的MVA-Gp70、MVA-Gp70-4-1BBL、MVA-Gp70-CD40L、MVA-Gp70-4-1BBL-CD40L和MVA-4-1BBL-CD40L(参见实施例37)。图29A显示肿瘤平均直径，且图29B显示存活百分比。第一次免疫后七天，抽血并用AH1肽再刺激；图29C将CD8+T细胞中IFNγ+CD44+T细胞的百分比显示为平均值±SEM。
图30说明基于MVA的载体MVA-HERV-FOLR1-PRAME-h4-1-BBL(“MVA-mBN494”或“MVA-BN-4IT”)(图30A)，且另外显示载体将TAA加载到感染细胞的HLA中的能力(图30B)以及以功能性，即h4-1-BB受体结合形式表达h4-1-BBL的能力(图30C)。有关更多详细信息，参见实施例38和39。
图31说明基于MVA的载体“MVA-mBN502”(图31C)，且另外显示ERVK-env/MEL(图31A；如在MVA-mBN494中使用)和ERVK-env/MEL_03(图31B；如在MVA-mBN502中使用)的示意图。
具体实施方式
应理解，以上发明内容和以下具体实施方式都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。
在本申请中描述和说明，本发明的重组MVA和方法增强癌症患者免疫反应的多个方面。在各个方面，本发明证明当将包含肿瘤相关抗原(TAA)和4-1BBL抗原的重组MVA向癌症受试者肿瘤内或静脉内施用时，在受试者中实现增加的抗肿瘤作用。如本文更详细描述的，这种增加的抗肿瘤作用包括肿瘤体积的更大减小、增加的总体存活率、增强的CD8 T细胞对TAA的反应和增强的炎症反应，例如增加的NK细胞活性、细胞因子产量增加等等。
在本申请中描述和说明，本发明的重组MVA和方法增强癌症患者免疫反应的多个方面。在各个方面，本发明证明当将包含肿瘤相关抗原(TAA)和CD40L抗原的重组MVA向癌症受试者肿瘤内或静脉内施用时，在受试者中实现增强的抗肿瘤作用。如本文更详细描述的，这种增加的抗肿瘤作用包括肿瘤体积的更大减少、增加的总体存活率、增强的CD8 T细胞对TAA的反应和增强的炎症反应，例如增加的NK细胞活性、细胞因子的增加生产等等。
在另外的方面，本发明的各种实施方案证明当包含肿瘤相关抗原(TAA)和4-1BBL抗原的重组MVA与至少一种免疫检查点分子拮抗剂/激动剂组合在肿瘤内施用时，肿瘤减小增加并且癌症受试者的总体存活率提高。
在更进一步的方面，本发明的各种实施方案证明当包含肿瘤相关抗原(TAA)和4-1BBL抗原的重组MVA与肿瘤特异性抗体组合在肿瘤内施用时，肿瘤减小增加并且癌症受试者的总体存活率提高。
虽然重组MVA病毒先前已编码4-1BBL抗原，但编码4-1BBL的MVA的免疫原性益处尚不清楚(参见例如Spencer等人(2014)PLoS One 9(8)：e105520)。在Spencer中，4-1BBL和转基因抗原在MVA载体或腺病毒载体中的共表达导致小鼠CD8 T细胞反应增加；然而，在肌肉内施用编码4-1BBL的腺病毒载体后，非人类灵长类动物的IFN-γ反应没有任何增加(同上，第2、6页)。此外，使用编码4-1BBL的MVA作为治疗癌症和破坏肿瘤和/或肿瘤细胞的一部分的免疫原性益处是未知的。
本公开的各种实施方案证明编码4-1BBL和TAA的MVA(在本文中称为MVA-TAA-4-1BBL)可有效治疗受试者(例如人)的癌症。在本文中显示和描述，MVA-TAA-4-1BBL的施用可以增强癌症受试者免疫反应的多个方面，并且可以有效地减少和杀死肿瘤细胞。本公开的各种实施方案的一种或多种增强的抗肿瘤作用总结如下。
静脉内施用编码4-1BBL的重组MVA产生增强的抗肿瘤作用。在至少一个方面，本发明包括静脉内施用的编码TAA和4-1BBL抗原的重组MVA(rMVA-TAA-4-1BBL)，其中与静脉内施用不含4-1BBL的重组MVA相比，或与非静脉内施用编码4-1BBL的重组MVA(例如皮下施用编码4-1BBL的重组MVA)相比，静脉内施用增强了抗肿瘤作用。这些增强的抗肿瘤作用包括增强的NK细胞反应(如图4中所示)、如由IFN-γ分泌增加所示的增强的炎症反应(如图5和6中所示)、增加的抗原和载体特异性CD8 T细胞扩增(如图7中所示)和增加的肿瘤减小(如图8中所示)。
肿瘤内施用编码4-1BBL的重组MVA可增强肿瘤中的炎症。在本发明的另一个方面，确定了在没有抗原交叉呈递DC的情况下，用MVA-OVA-4-1BBL而不是用MVA-OVA-CD40L感染肿瘤细胞会活化抗原特异性CD8+T细胞以产生T细胞衍生的细胞因子，例如GM-CSF、IL-2和IFN-γ(图1A-1D)。这在GM-CSF的情况下是出乎意料的，GM-CSF是一种由初始T细胞在活化后产生的生长因子，可诱导树突状细胞和骨髓细胞亚群的成熟(Min等人(2010)J.Immunol.184：4625-4629)。在存在抗原交叉呈递DC的情况下，被rMVA-CD40L感染的肿瘤细胞刺激的抗原特异性CD8+T细胞会产生IFN-γ，但不会像rMVA-4-1BBL那样产生IL-2或GM-CSF(图1A-1D)。有趣的是，检测到大量IL-6，一种由DC产生的关键细胞因子(图1A)。
在一个有利的方面，肿瘤中增强的炎症可使得在肿瘤部位具有大量杀死肿瘤细胞的TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)(参见例如Lanitis等人(2017)Annals Oncol.28(suppl 12)：xii18-xii32)。鉴于TIL、细胞因子和其它炎症分子的数量增加，这些发炎的肿瘤，也称为“热”肿瘤，能够增强肿瘤细胞破坏。
编码4-1BBL的重组MVA的肿瘤内施用可减小肿瘤体积并提高总体存活率。在一个方面，本发明包括一种肿瘤内施用的编码4-1BBL抗原的重组MVA(MVA-4-1BBL)，其中与没有4-1BBL的重组MVA的肿瘤内施用相比，所述肿瘤内施用增强了癌症受试者的抗肿瘤作用。
虽然重组MVA病毒先前已在肿瘤内施用(参见例如White等人(2018)PLoS One 13：e0193131和Nemeckova等人(2007)Neoplasma 54：326-33)，但研究产生了不同的结果。例如，在Nemeckova中，发现肿瘤内注射表达GM-CSF的痘苗病毒MVA和用DNA疫苗进行免疫延长了携带HPV16诱导肿瘤的小鼠的存活时间(参见Nemeckova，摘要)。另外，White等人无法证明在肿瘤内注射MVA后对胰腺肿瘤生长的抑制作用(参见White，摘要)。
作为本公开的一部分，将包含一种或多种编码TAA和4-1BBL的核酸的重组MVA肿瘤内施用于受试者。如图9中所示，与重组MVA TAA相比，MVA-TAA-4-1BBL的肿瘤内注射表明肿瘤体积显著减小。
与免疫检查点分子拮抗剂或激动剂组合施用的编码4-1BBL的重组MVA的肿瘤内施用产生增强的抗肿瘤作用。在各种实施方案中，本发明包括与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用MVA-TAA-4-1BBL。优选地，MVA-TAA-4-1BBL的施用是静脉内或肿瘤内施用。本发明的MVA与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合是有利的，因为所述组合提供更有效的癌症治疗。例如，本发明的组合和/或组合疗法增强癌症患者免疫反应的多个方面。在至少一个方面，所述组合协同地增强先天性和适应性免疫反应两者，并且当与免疫检查点分子的拮抗剂或激动剂组合时，减小肿瘤体积并增加癌症患者的存活率。
本申请中提供的数据表明，MVA-TAA-4-1BBL在与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合时产生增强的抗肿瘤作用。实际上，如图11中所示，与PD-1本身相比，当MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施用与腹膜内施用的PD-1抗体组合时，肿瘤体积减小。
与肿瘤相关抗原(TAA)特异性抗体组合施用的编码4-1BBL的重组MVA的肿瘤内施用产生增强的抗肿瘤作用。在各种实施方案中，本发明包括与对TAA特异的抗体组合施用MVA-TAA-4-1BBL。优选地，MVA-TAA-4-1BBL的施用是静脉内或肿瘤内施用。本发明的MVA与TAA特异性抗体组合是有利的，并且可以共同作用以提供更有效的癌症治疗。
在一个示例性方面中，通过施用MVA-TAA-4-1BBL诱导的增强的NK细胞反应与TAA特异性抗体协同作用以增强受试者的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。癌症受试者中这种增强的ADCC导致肿瘤细胞杀灭和肿瘤破坏的增加。
本申请中提供的数据表明，MVA-TAA-4-1BBL在与TAA特异性抗体组合时产生增强的抗肿瘤作用。实际上，如图11中所示，与TRP-1抗体本身相比，当MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施用与腹膜内TRP-1抗体组合时，肿瘤体积减小。
根据本发明作为初免和加强免疫的一部分施用MVA-TAA-4-1BBL增加抗原和载体特异性CD8+T细胞扩增。在其它方面，本发明提供一种方法，其中MVA-TAA-4-1BBL作为同源和/或异源初免-加强方案的一部分施用。优选地，MVA-TAA-4-1BBL的施用是静脉内或肿瘤内施用。如图7中所示，通过静脉内施用MVA-TAA-4-1BBL，在初免和加强期间，抗原和载体特异性CD8+T细胞扩增增加。
定义
除非上下文另外明确指出，否则如在本文中使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸，并且提及“所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可修改或替代本文所述方法的等效步骤和方法。
除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指所述系列中的每个要素。本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。此类等效物意图由本发明涵盖。
在整个说明书和下面的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变型应理解为包含规定的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”来替代，或者有时在本文中使用时用术语“具有”来替代。任何上述术语(包含、含有、包括、具有)，尽管不太优选，但无论何时在本发明的一个方面或实施方案的上下文中使用，都可以用术语“由......组成”替代。当在本文中使用时，“由......组成”不包括权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不会实质影响权利要求书的基本和新颖特征的材料或步骤。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包括单独的和组合的选项。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指第一个要素在没有第二个要素的情况下的适用性。第二个选项是指第二个要素在没有第一个要素的情况下的适用性。第三个选项是指第一个和第二个要素在一起的适用性。这些选项中的任何一个都被理解为落入所述含义内，且因此满足本文所用术语“和/或”的要求。超过一个选项的同时适用性也被理解为落入所述含义内，且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所述的“突变的”或“修饰的”蛋白质或抗原是如本文所定义的对核酸或氨基酸的任何修饰，例如缺失、添加、插入和/或取代。
关于本文所述的核酸序列的“序列同源性或同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比的序列同一性之后，并在不将任何保守取代视为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参考序列(即，衍生其的核酸序列)中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。为了测定核苷酸序列同一性或同源性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
例如，Smith和Waterman((1981)Advances in Applied Mathematics2：482-489)的局部同源算法提供了核酸序列的适当比对。此算法可以通过使用由Dayhoff，Atlas ofProtein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff编，第5增刊3：353-358，NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA开发，且由Gribskov((1986)Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763)标准化的评分矩阵而应用于氨基酸序列。确定序列同一性百分比的此算法的示例性实施由遗传学计算机组(Madison，Wisconsin，USA)在“BestFit”实用应用程序中提供。此方法的默认参数在Wisconsin Sequence AnalysisPackage Program Manual，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA获得)中描述。在本发明的上下文中确立同一性百分比的优选方法是使用由University of Edinburgh拥有版权、由Collins和Sturrok开发并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，California，USA)分发的MPSRCH程序包。从这套软件包中，可以采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表(例如，空位开放罚分为12，空位扩展罚分为1且空位为6)。从生成的数据中，“Match”值反映了“序列同一性”。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其它合适的程序在本领域中通常是已知的，例如，另一种比对程序是使用默认参数的BLAST。例如，可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；股＝两个；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分数；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的详情可在下列网址中找到：blast.ncbi.nlm.nih.gov/。
术语“初免-加强疫苗接种”或“初免-加强方案”是指使用靶向特定抗原的疫苗的第一次初免注射，随后每隔一段时间注射一次或多次相同疫苗的加强注射的疫苗接种策略或方案。初免-加强疫苗接种可以是同源的或异源的。同源初免-加强疫苗接种使用包括相同的用于初免注射和一次或多次加强注射的抗原和载体的疫苗。异源初免-加强疫苗接种使用包括相同的用于初免注射和一次或多次加强注射的抗原但不同的用于初免注射和一次或多次加强注射的载体的疫苗。例如，同源初免-加强疫苗接种可以使用包括表达用于初免注射的一种或多种抗原的核酸的重组痘病毒，和表达用于一次或多次加强注射的一种或多种抗原的相同重组痘病毒。相比之下，异源初免-加强疫苗接种可以使用包括表达用于初免注射的一种或多种抗原的核酸的重组痘病毒，和表达用于一次或多次加强注射的一种或多种抗原的不同重组痘病毒。
术语“重组体”意指半合成或合成来源的多核苷酸、病毒或载体，其在自然界中不存在，或者以自然界中不存在的排列与另一多核苷酸连接。如本文所用，“重组MVA”或“rMVA”通常意指修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其包括至少一种编码肿瘤相关抗原(TAA)的多核苷酸。
如本文所用，减小肿瘤体积或肿瘤体积的减小可以表征为肿瘤体积和/或大小的减小，但也可以根据本领域理解的临床试验终点来表征。与肿瘤体积和/或大小减小相关的一些示例性临床试验终点可包括但不限于缓解率(RR)、客观缓解率(ORR)等。
如本文所用，存活率的提高可以表征为癌症患者存活率的提高，但也可以根据本领域理解的临床试验终点来表征。与存活率的提高相关的一些示例性临床试验终点包括但不限于总体存活率(OS)、无进展存活期(PFS)等。
如本文所用，“转基因”或“异源”基因被理解为不存在于野生型痘病毒基因组(例如牛痘、鸡痘或MVA)中的核酸或氨基酸序列。本领域技术人员理解，“转基因”或“异源基因”当存在于痘病毒，例如痘苗病毒中时，将以如下的方式掺入痘病毒基因组中：在将重组痘病毒施用于宿主细胞后，其表达为对应的异源基因产物，即“异源抗原”和\或“异源蛋白质”。通常通过将异源基因与允许在痘病毒感染细胞中表达的调节元件可操作地连接来实现表达。优选地，调节元件包括天然的或合成的痘病毒启动子。
“载体”是指可包括异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包括用于预防或治疗目的的所关注序列，且可任选地呈表达盒的形式。如本文所用，载体不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。所述术语包括克隆载体和病毒载体。
组合和方法
在各种实施方案中，本发明包括重组MVA，其包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸，与由非肿瘤内施用包括编码TAA的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组MVA病毒诱导的炎症反应和T细胞反应相比，所述重组MVA在肿瘤内施用时诱导炎症反应和增强的T细胞反应。
在各种额外实施方案中，本发明包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸，与由肿瘤内施用包括编码TAA的第一核酸的重组MVA病毒诱导的肿瘤内炎症反应和T细胞反应相比，所述重组MVA在肿瘤内施用时诱导增强的肿瘤内炎症反应和增强的T细胞反应。
肿瘤中增强的炎症反应。在本公开的各个方面，确定了与单独施用重组MVA相比，肿瘤内施用编码TAA和4-1BBL的重组MVA诱导肿瘤中增强的炎症反应。在至少一个方面，根据本公开的肿瘤中“增强的炎症反应”的特征在于以下一者或多者：1)IFN-γ表达的增加和/或2)颗粒酶B(GraB)在肿瘤和/或肿瘤细胞中的表达的增加。因此，根据本公开的肿瘤和/或肿瘤细胞中的炎症反应是否增强可通过测量以确定一种或多种指示炎症反应增加的分子的表达是否增加来确定，包括本领域已知的趋化因子和细胞因子的分泌。示例性炎症反应标志物包括一种或多种可用于测量NK细胞频率和/或活性的标志物，包括以下一种或多种：IFN-γ和/或颗粒酶B(GraB)。这些分子和其测量是本领域所理解并且可以根据已知技术进行的经过验证的分析。参见例如Borrego等人((1999)Immunology 7(1)：159-165)。
增强的NK细胞反应。在本公开的多个另外的方面，确定了与单独施用重组MVA相比，肿瘤内施用或静脉内施用编码TAA和4-1BBL的重组MVA诱导肿瘤或肿瘤环境中增强的NK细胞反应。在一个方面，根据本公开的“增强的NK细胞反应”的特征在于以下一者或多者：1)NK细胞频率增加，2)NK细胞活化增加，和/或3)NK细胞增殖增加。因此，根据本公开是否增强NK细胞反应可以通过测量一种或多种分子的表达来确定，所述一种或多种分子指示增加的NK细胞频率、增加的NK细胞活化和/或增加的NK细胞增殖。可用于测量NK细胞频率和/或活性的示例性标志物包括以下中的一种或多种：NKp46、IFN-γ、CD69、CD70、NKG2D、FasL、颗粒酶B、CD56和/或Bcl-XL。可用于测量NK细胞活化的示例性标志物包括以下中的一种或多种：IFN-γ、CD69、CD70、NKG2D、FasL、颗粒酶B和/或Bcl-XL。可用于测量NK细胞增殖的示例性标志物包括：Ki67。这些分子和其测量是本领域所理解并且可以根据已知技术进行的经过验证的分析(参见例如Borrego等人(1999)Immunology 7(1)：159-165)。此外，用于测量分子的分析可以在本公开的实施例5和6中找到。至少在一个方面，1)NK细胞频率的增加可以定义为与预处理/基线相比，CD3-NKp46+细胞增加至少2倍；2)NK细胞活化的增加可以定义为与预处理/基线表达相比，IFN-γ、CD69、CD70、NKG2D、FasL、颗粒酶B和/或Bcl-XL表达增加至少2倍；和/或3)NK细胞增殖的增加定义为与预处理/基线表达相比，Ki67表达增加至少1.5倍。
增强的T细胞反应。根据本申请，“增强的T细胞反应”的特征在于以下一者或多者：1)CD8 T细胞频率增加；2)CD8 T细胞活化增加；和/或3)CD8 T细胞增殖增加。因此，根据本申请是否增强T细胞反应可以通过测量一种或多种分子的表达来确定，所述一种或多种分子指示1)CD8 T细胞频率增加，2)CD8 T细胞活化增加；和/或3)CD8T细胞增殖增加。可用于测量CD8 T细胞频率、活化和增殖的示例性标志物分别包括CD3、CD8、IFN-γ、TNF-α、IL-2、CD69和/或CD44和Ki67。如本申请所示，测量抗原特异性T细胞频率也可以通过MHC多聚体，例如五聚体或dextramer来测量。此类测量和分析以及其它适用于评估本发明的方法和组合物的测量和分析在本领域中得到验证和理解。
在一个方面，CD8 T细胞频率增加的特征在于与预处理/基线相比，IFN-γ和/或dextramer+CD8 T细胞增加至少2倍。CD8 T细胞活化增加的特征在于与预处理/基线表达相比，CD69和/或CD44表达增加至少2倍。CD8 T细胞增殖增加的特征在于与预处理/基线表达相比，Ki67表达增加至少2倍。
在另一个方面，增强的T细胞反应的特征在于效应细胞因子的CD8 T细胞表达增加和/或细胞毒性效应功能增加。效应细胞因子表达的增加可以通过与预处理/基线相比，IFN-γ、TNF-α和/或IL-2中的一种或多种的表达来测量。可以通过CD107a、颗粒酶B和/或穿孔素中的一种或多种的表达和/或靶细胞的抗原特异性杀灭来测量细胞毒性效应功能的增加。
本文所述的分析、细胞因子、标志物和分子以及其测量在本领域中得到验证和理解，并且可以根据已知技术进行。此外，用于测量T细胞反应的分析可以在工作实施例中找到，其中分析了T细胞反应，包括但不限于实施例2、3、8、13和14。
本发明实现的增强的T细胞反应与增强的NK细胞反应和增强的炎症反应组合特别有利，因为增强的T细胞有效地靶向和杀死那些已经逃避和/或存活超过超过癌症患者初始先天免疫反应的肿瘤细胞。
在另外的实施方案中，本文所述的组合和方法用于治疗人类癌症患者。在优选的实施方案中，癌症患者罹患和/或被诊断患有选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、宫颈癌或结肠直肠癌。在另外的实施方案中，本文所述的组合和方法用于治疗罹患和/或被诊断患有乳腺癌、结肠直肠癌或黑色素瘤，优选黑色素瘤，更优选结肠直肠癌或最优选结肠直肠癌的人类癌症患者。
某些示例性肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，在受试者中产生针对细胞相关多肽抗原的免疫应答。在某些此类实施方案中，细胞相关多肽抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
术语“多肽”是指两个或多个氨基酸通过肽键或修饰的肽键彼此接合的聚合物。氨基酸可以是天然存在的以及非天然存在的，或天然存在的氨基酸的化学类似物。所述术语还指蛋白质，即包括至少一个多肽的功能性生物分子；当包括至少两个多肽时，这些多肽可以形成复合物、共价连接或可以非共价连接。蛋白质中的多肽可以被糖基化和/或脂化和/或包括辅基。
内源性逆转录病毒蛋白(ERV)。优选地，TAA包含在内源性逆转录病毒蛋白(ERV)中。更优选地，ERV是来自人HERV-K蛋白家族的ERV。最优选地，HERV-K蛋白选自HERV-K包膜(env)蛋白、HERV-K群特异性抗原(gag)蛋白和HERV-K“黑色素瘤风险标志物”(mel)蛋白(参见例如Cegolon等人(2013)BMC Cancer 13:4)。
ERV占人类基因组的8％，且源自数百万年前的生殖系感染。插入我们基因组中的那些元件中的大部分都发生了严重突变，并且因此不会被转录或翻译。然而，一小部分最近获得的ERV仍有功能并被翻译，并且在一些情况下甚至产生病毒颗粒。ERV的转录非常受限，因为所述基因座通常是高度甲基化的，并且因此不会在体细胞中转录(Kassiotis(2016)Nat.Rev.Immunol.16：207-19)。只有在一些情况下，例如细胞应激(化学物质、UV辐射、激素、细胞因子)，ERV才能被重新活化。重要的是，ERV也在许多不同类型的癌症中表达，但不在正常组织中表达(Cegolon等人(2013)BMC Cancer 13：4；Wang-Johanning等人(2003)Oncogene 22：1528-35)。这种非常有限的表达模式确保ERV不会或很少暴露于免疫耐受机制，这可能会产生有能力的ERV特异性T细胞库。以这种方式，ERV可在MVA中用作肿瘤抗原(“TAA”)。
在各种另外的实施方案中，TAA包括但不限于单独或组合的HER2、PSA、PAP、CEA、MUC-1、FOLR1、PRAME、生存素、TRP1、TRP2或Brachyury。这种示例性组合可包括CEA和MUC-1，例如在也称为CV301的MVA中。其它示例性组合可包括PAP和PSA。
在更进一步的实施方案中，另外的TAA可包括但不限于5α还原酶、甲胎蛋白、AM-1、APC、April、BAGE、β-连环蛋白、Bcl12、bcr-abl、CA-125、CASP-8/FLICE、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33 CD35、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3，E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、FGF8b、FGF8a、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、GAGE-家族、胃泌素17、胃泌素释放激素、GD2/GD3/GM2、GnRH、GnTV、GP1、gp100/Pmel17、gp-100-in4、gp15、gp75/TRP1、hCG、乙酰肝素酶、Her2/neu、HMTV、Hsp70、hTERT、IGFR1、IL-13R、iNOS、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、MAGE-家族、乳腺珠蛋白、MAP17、melan-A/MART-1、间皮素、MIC A/B、MT-MMPs、粘蛋白、NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白、PAI-1、PDGF、uPA、PRAME、前列腺碱性蛋白(probasin)、祖细胞生成素(progenipoietin)、PSA、PSM、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX-家族、STAT3、STn、TAG-72、TGF-α、TGF-β、胸腺素-β-15、TNF-α、TRP1、TRP2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、p16INK4和谷胱甘肽-S-转移酶。
优选的PSA抗原包括155位异亮氨酸到亮氨酸的氨基酸变化(参见美国专利7,247,615，其以引用方式并入本文中)。
在本发明的一个或多个优选实施方案中，异源TAA选自HER2和/或Brachyury。
可使用任何TAA，只要它实现本发明的至少一个目标或期望目的，例如，在施用含有它的MVA后刺激免疫反应。TAA，包括本文提及的TAA的示例性序列是本领域已知的并且适用于本发明的组合物和方法。用于本发明的组合物和方法的TAA序列可以与本领域已知的或本文公开的序列相同，或者它们可以与本领域已知或本文公开的核苷酸或氨基酸序列共享小于100％的同一性，例如至少90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％或更多的序列同一性。因此，用于本发明的组合物或方法的TAA序列可以与本领域已知和/或本文公开的参考序列相差小于20，或小于19、18、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸或氨基酸，只要其实现本发明的至少一个目标或期望目的。本领域技术人员熟悉用于评估TAA以确保它们适用于本发明的MVA或方法的技术和分析。
修饰的肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，修饰细胞相关多肽抗原，以使得当与APC表面上的MHC I类分子结合呈递时，针对在其表面上呈递衍生自多肽抗原的表位的细胞诱导CTL反应。在某些此类实施方案中，至少一个第一外源TH表位在呈递时与APC表面上的MHC II类分子相关。在某些此类实施方案中，细胞相关抗原是肿瘤相关抗原。
能够呈递表位的示例性APC包括树突状细胞和巨噬细胞。其它示例性APC包括任何能够同时呈递以下者的胞饮或吞噬APC：1)与MHC I类分子结合的CTL表位；和2)与MHC II类分子结合的TH表位。
在某些实施方案中，对一种或多种TAA，例如但不限于HERV-Kenv、HERV-K gag、HERV-K mel、CEA、MUC-1、PAP、PSA、PRAME、FOLR1、HER2、生存素、TRP1、TRP2或Brachyury进行修饰，以便在向受试者施用后，引发主要与本文所述的一种或多种TAA反应的多克隆抗体。此类抗体可以攻击和消除肿瘤细胞，并防止转移细胞发展成转移瘤。这种抗肿瘤作用的效应机制将通过补体和抗体依赖性细胞毒性来介导。此外，诱导的抗体还可以通过抑制生长因子依赖性寡二聚化和受体的内化来抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，此类修饰的TAA可诱导针对肿瘤细胞展示的已知和/或预测的TAA表位的CTL反应。
在某些实施方案中，修饰的TAA多肽抗原包括细胞相关多肽抗原的CTL表位和变异，其中所述变异包括至少一个CTL表位或外源TH表位。在一个非限制性实例中，某些此类修饰的TAA可包括一种或多种包括至少一个CTL表位的HER2多肽抗原，和包括外源TH表位的至少一个CTL表位的变异，并且产生其的方法描述于美国专利第7,005,498号和美国专利公开案第2004/0141958号和第2006/0008465号中。
在一个非限制性实例中，某些此类修饰的TAA可包括一种或多种包括至少一个CTL表位的MUC-1多肽抗原，和包括外源表位的至少一个CTL表位的变异，并且产生其的方法描述于美国专利公开案第2014/0363495号中。
其它混杂的T细胞表位包括能够结合由不同HLA-DR编码的大部分HLA-DR分子的肽。参见例如WO 98/23635(Frazer IH等人，转让给The University of Queensland)；Southwood等人(1998)J.Immunol.160：3363 3373；Sinigaglia等人(1988)Nature 336：778780；Rammensee等人(1995)Immunogenetics 41：178 228；Chicz等人(1993)J.Exp.Med.178：27 47；Hammer等人(1993)Cell 74：197 203；和Falk等人(1994)Immunogenetics 39：230 242。后一个参考文献还涉及HLA-DQ和-DP配体。这些参考文献中列出的所有表位都与本文所述的候选天然表位相关，与这些表位共享共同基序的表位也是如此。
在某些其它实施方案中，混杂T细胞表位是能够结合大部分单倍型的人工T细胞表位。在某些此类实施方案中，人工T细胞表位是如WO 95/07707和相应论文Alexander等人(1994)Immunity 1：751 761中所述的泛DR表位肽(“PADRE”)。
4-1BBL(在本文中也称为“41BBL”或“4-1BB配体”)。如本公开所说明的，包括4-1BBL作为重组MVA和相关方法的一部分在对癌症受试者肿瘤内或静脉内施用时诱导增加和增强的抗肿瘤作用。因此，在各种实施方案中，除了编码TAA之外，还有编码4-1BBL抗原的重组MVA。
4-1BB/4-1BBL是TNFR/TNF超家族的成员。4-1BBL是一种在活化的B细胞、单核细胞和DC中表达的共刺激配体。4-1BB由自然杀手(NK)和自然杀手T(NKT)细胞、Treg和几种先天免疫细胞群(包括DC、单核细胞和中性粒细胞)组成型表达。有趣的是，4-1BB在活化的而非静息的T细胞上表达(Wang等人(2009)Immunol.Rev.229：192-215)。4-1BB连接诱导干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)的增殖和产生，并通过上调例如Bcl-xL等抗凋亡分子来增强T细胞存活(Snell等人(2011)Immunol.Rev.244：197-217)。重要的是，4-1BB刺激通过增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来增强NK细胞增殖、IFN-γ产生和溶细胞活性(Kohrt等人(2011)Blood 117：2423-32)。
在一个或多个优选实施方案中，4-1BBL由本发明的MVA编码。在一个或多个其它优选实施方案中，4-1BBL是人4-1BBL。在更优选的实施方案中，4-1BBL包括编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO：3具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，即，与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列相差少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在更优选的实施方案中，4-1BBL包括编码包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的核酸。在另外的实施方案中，编码4-1BBL的核酸包括与SEQ ID NO:4具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，即，与SEQ ID NO:4中列出的核酸序列在序列中相差少于20、10、5、4、3、2或1个核酸。在更优选的实施方案中，4-1BBL含有包含SEQ ID NO：4的核酸。
CD40L。如本公开所说明的，包括CD40L作为组合和相关方法的一部分进一步增强肿瘤体积的减小，延长无进展存活期并提高本发明实现的存活率。因此，在各种实施方案中，所述进一步包括向癌症患者施用CD40L。在优选的实施方案中，CD40L被编码为如本文所述的重组MVA的一部分。
虽然CD40在许多细胞类型上组成型表达，包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，但其配体CD40L主要在活化的T辅助细胞上表达。感染或免疫后早期树突状细胞和T辅助细胞之间的同源相互作用‘许可’树突状细胞引发CTL反应。树突状细胞许可引起共刺激分子的上调、存活率的增加和更好的交叉呈递能力。此过程主要通过CD40/CD40L相互作用介导。然而，描述了CD40L的各种配置，从膜结合到可溶性(单体到三聚体)，其诱导不同的刺激，诱导或抑制APC的活化、增殖和分化。
在一个或多个优选实施方案中，CD40L由本发明的MVA编码。在一个或多个其它优选实施方案中，CD40L是人CD40L。在更优选的实施方案中，CD40L包括编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，即，与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列相差少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在更优选的实施方案中，CD40L包括编码包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸。在另外的实施方案中，编码CD40L的核酸包括与SEQ ID NO：2具有至少90％、95％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，即，与SEQ ID NO：2中列出的核酸序列在序列中相差少于20、10、5、4、3、2或1个核酸。在更优选的实施方案中，CD40L含有包含SEQ ID NO：2的核酸。
免疫检查点分子拮抗剂。如本文所述，至少在一方面，本发明包括免疫检查点拮抗剂的用途。此类免疫检查点拮抗剂用于干扰和/或阻断免疫检查点分子的功能。一些优选的免疫检查点拮抗剂包括细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3(TIM-3)。
此外，示例性免疫检查点拮抗剂可包括但不限于CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体(TIGIT)和T细胞活化的V域Ig抑制剂(VISTA)。
此类免疫检查点分子拮抗剂可包括特异性结合至免疫检查点分子并抑制和/或阻断免疫检查点分子的生物活性和功能的抗体。
其它免疫检查点分子拮抗剂可包括干扰免疫检查点分子表达的反义核酸RNA；和干扰免疫检查点分子表达的小干扰RNA。
拮抗剂还可呈抑制或阻断免疫检查点功能的小分子形式。这些的一些非限制性实例包括NP12(Aurigene)、Tsinghua Univ的(D)PPA-1、高亲和力PD-1(Stanford)；BMS-202和BMS-8(Bristol Myers Squibb(BMS)和CA170/CA327(Curis/Aurigene)；以及CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3和TIM-3的小分子抑制剂。
拮抗剂可另外呈抑制或阻断免疫检查点分子功能的
Figure BDA0003693522260000381
形式。参见例如Rothe等人((2018)BioDrugs 32(3)：233–243)。
预期拮抗剂可另外呈
Figure BDA0003693522260000382
形式。Affimers是抑制或阻断免疫检查点分子功能的Fc融合蛋白。其它可作为免疫检查点拮抗剂的融合蛋白是免疫检查点融合蛋白(例如抗PD-1蛋白AMP-224)和抗PD-L1蛋白，例如US2017/0189476中所述的那些。
候选免疫检查点分子拮抗剂可通过本领域已知和/或在本申请中公开的多种技术筛选功能，例如在体外或小鼠模型中干扰免疫检查点分子功能的能力。
ICOS激动剂。本发明进一步包括ICOS激动剂。ICOS激动剂活化ICOS。ICOS是一种在活化的T细胞上表达的阳性共刺激分子，并且与其配体结合可促进其增殖(Dong(2001)Nature 409：97-101)。
在一个实施方案中，激动剂是ICOS-L，一种ICOS天然配体。激动剂可呈ICOS-L的突变形式，其保留结合和活化特性。可针对在体外刺激ICOS的活性来筛选ICOS-L的突变形式。
免疫检查点拮抗剂或激动剂的抗体。在优选的实施方案中，免疫检查点分子拮抗剂和/或激动剂各自包括抗体。如本文所述，在各种实施方案中，抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域中熟知的技术制备。此类抗体通过抗体的抗原结合位点特异性结合至免疫检查点分子(与非特异性结合相反)。免疫检查点肽、片段、变体、融合蛋白等可用作免疫原以产生与其免疫反应的抗体。更具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。
在更优选的实施方案中，本发明的抗体是被主权国家政府批准用于治疗人类癌症患者或在批准过程中的那些。已经获得批准或在批准过程中的这些抗体的一些非限制性实例包括以下抗体：CTLA-4(
Figure BDA0003693522260000391
和替西木单抗(Tremelimumab))；PD-1(派姆单抗(Pembrolizumab)、拉利珠单抗(Lambrolizumab)、Amplimmune-224(AMP-224))、Amplimmune-514(AMP-514)、纳武单抗(Nivolumab)、MK-3475(Merck)、BI 754091(Boehringer Ingelheim))和PD-L1(阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelulmab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、MPDL3280A(Roche)、MED14736(AZN)、MSB0010718C(Merck))；LAG-3(IMP321、BMS-986016、BI754111(Boehringer Ingelheim)、LAG525(Novartis)、MK-4289(Merck)、TSR-033(Tesaro)。
在一个示例性方面，免疫检查点分子CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS以及基于CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS的氨基酸序列的肽可用于制备与CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或ICOS特异性结合的抗体。术语“抗体”意在包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段，例如F(ab')2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体片段(VHH或纳米抗体)、二价抗体片段(双价抗体)以及任何重组和合成产生的结合配偶体。
肿瘤相关抗原(TAA)特异性抗体。在本发明的多个实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与TAA特异性抗体组合或组合施用。在更具体的实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与特异性针对在肿瘤细胞的细胞膜上表达的抗原的抗体组合或组合施用。本领域理解在许多癌症中，一种或多种抗原在肿瘤细胞膜上表达或过表达。参见例如Durig等人(2002)Leukemia 16：30-5；Mocellin等人(2013)Biochim.Biophys.Acta 1836：187-96；Arteaga(2011)Nat.Rev.Clin.Oncol.，doi:10.1038/nrclinonc.2011.177；Finn(2017)Cancer Immunol.Res.5：347-54；Ginaldi等人(1998)J.Clin.Pathol.51：364-9。用于确定抗原是否在肿瘤细胞上表达或过表达的分析是本领域中易于理解的(同上)，以及产生针对特定抗原的抗体的方法。
在更具体的实施方案中，药物组合和相关方法包括抗体，其中抗体a)特异性针对在肿瘤细胞膜上表达的抗原和b)包括Fc结构域。在至少一个方面，抗体的特征(例如，a)和b))使得抗体能够结合至效应细胞并与其相互作用，例如NK细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和/或树突状细胞，并使得抗体能够结合在肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原。在一个优选的实施方案中，抗体包括Fc结构域。在另一个优选的实施方案中，抗体能够与NK细胞结合并相互作用。
本公开考虑的针对在肿瘤细胞上表达的抗原的一些示例性抗体包括但不限于抗CD20(例如利妥昔单抗(rituximab)；奥法木单抗(ofatumumab)；托西木单抗(tositumomab))、抗CD52(例如阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA0003693522260000411
)、抗EGFR(例如西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA0003693522260000412
帕尼单抗(panitumumab))、抗CD2(例如西利珠单抗(Siplizumab))、抗CD37(例如BI836826)、抗CD123(例如JNJ-56022473)、抗CD30(例如XmAb2513)、抗CD38(例如达雷木单抗(daratumumab)
Figure BDA0003693522260000413
)、抗PDL1(例如阿维鲁单抗、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗)、抗GD2(例如3F8、ch14.18、KW-2871、地努妥昔单(dinutuximab))、抗CEA、抗MUC1、抗FLT3、抗CD19、抗CD40、抗SLAMF7、抗CCR4、抗B7-H3、抗ICAM1、抗CSF1R、抗CA125(例如奥戈伏单抗(Oregovomab))、抗FRα(例如MOv18-IgG1、索星-米妥昔单抗(Mirvetuximab soravtansine)(IMGN853)、MORAb-202)、抗间皮素(例如MORAb-009)、抗TRP2和抗HER2(例如曲妥珠单抗、Herzuma、ABP 980和/或帕妥珠单抗)。
在一个更优选的实施方案中，作为本发明的一部分包括的抗体包括在施用于患者时与肿瘤细胞上的相应抗原结合并诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体。在一个更优选的实施方案中，抗体包括被批准或预批准用于治疗癌症的抗体。
在更优选的实施方案中，抗体是抗HER2抗体、抗EGFR抗体和/或抗CD20抗体。
在最优选的实施方案中，抗HER2抗体选自帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、Herzuma、ABP980和曲妥珠单抗恩他新偶联物(Ado-trastuzumab emtansine)。
在最优选的实施方案中，抗EGFR抗体和抗CD20分别是西妥昔单抗和利妥昔单抗。
如本文所述，在各种实施方案中，抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域中熟知的技术制备。此类抗体通过抗体的抗原结合位点特异性结合至TAA(与非特异性结合相反)。TAA肽、片段、变体、融合蛋白等可用作免疫原以产生与其免疫反应的抗体。更具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。
抗体。在本发明的多个实施方案中，本文所述的重组MVA和方法与1)免疫检查点拮抗剂或激动剂抗体或2)TAA特异性抗体组合和/或组合施用。
预期抗体可以是合成的、单克隆的或多克隆的，并且可以通过本领域中熟知的技术制备。此类抗体通过抗体的抗原结合位点特异性结合至免疫检查点分子或TAA(与非特异性结合相反)。免疫检查点和/或TAA肽、片段、变体、融合蛋白等可用作免疫原以产生与其免疫反应的抗体。更具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。
这些抗原决定簇或表位可以是线性的或构象的(不连续的)。线性表位由多肽的单个氨基酸部分构成，而构象或不连续表位由来自多肽链不同区域的氨基酸部分构成，所述氨基酸部分在蛋白质折叠时非常接近(Janeway，Jr.和Travers，Immuno Biology 3:9(Garland Publishing Inc.，第2版，1996))。因为折叠的蛋白质具有复杂的表面，所以可用表位的数量相当多；然而，由于蛋白质的构象和空间位阻，实际结合至表位的抗体数量少于可用表位的数量(Janeway，Jr.和Travers，Immuno Biology 2:14(Garland PublishingInc.，第2版，1996))。可以通过本领域中已知的任何方法鉴定表位。
本发明中包括特异性结合至TAA或例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或ICOS等免疫检查点分子并阻断其功能(“拮抗剂抗体”)或增强/活化其功能(“激动剂抗体”)的抗体，包括scFV片段。此类抗体可以通过常规方式产生。
在一个实施方案中，本发明包括针对TAA或免疫检查点分子或阻断(“拮抗剂抗体”)或增强/活化(“激动剂抗体”)免疫检查点分子或TAA功能的单克隆抗体。
抗体能够以高亲合力和特异性与其靶标结合。它们是相对较大的分子(约150kDa)，当抗体结合位点位于蛋白质-蛋白质相互作用位点附近时，它们可以在空间上抑制两种蛋白质(例如PD-1与其靶配体)之间的相互作用。本发明进一步包括与紧邻免疫检查点分子配体结合位点的表位结合的抗体。
在各种实施方案中，本发明包括干扰分子间相互作用(例如蛋白质-蛋白质相互作用)的抗体，以及干扰分子内相互作用(例如分子内的构象变化)的抗体。可以针对阻断或增强/活化免疫检查点分子的生物活性的能力筛选抗体。多克隆和单克隆抗体都可以通过常规技术来制备。
在一个示例性方面，TAA或免疫检查点分子CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS以及基于TAA或CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS的氨基酸序列的肽可用于制备与TAA或CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或ICOS特异性结合的抗体。术语“抗体”意在包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段，例如F(ab')2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体片段(VHH或纳米抗体)、二价抗体片段(双价抗体)以及任何重组和合成产生的结合配偶体。在另一个示例性方面，如果抗体以大于或等于约107M-1的Kd结合，则抗体被定义为特异性结合至免疫检查点分子。结合配偶体或抗体的亲和力可以使用常规技术，例如由Scatchard等人((1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660)描述的那些技术容易地确定。
使用本领域中熟知的程序，可以容易地从多种来源产生多克隆抗体，例如马、牛、山羊、绵羊、犬、鸡、兔、小鼠或大鼠。一般而言，纯化的TAA或CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS或基于适当结合的CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS的氨基酸序列的肽典型地通过胃肠外注射向宿主动物施用。加强免疫后，收集少量血清样本并测试其对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽的反应性。可用于此类测定的各种分析的实例包括在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988中描述的那些；以及例如对流免疫电泳(CIEP)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测分析(ELISA)、斑点印迹分析和夹心分析等程序。参见美国专利第4,376,110号和第4,486,530号。
可以使用熟知的方法容易地制备单克隆抗体。参见例如以下各者中所述的程序：美国专利第RE 32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号、第4,411,993号；MonoclonalAntibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKeam和Bechtol(编)(1980)。
例如，宿主动物，例如小鼠可以用分离和纯化的免疫检查点分子腹膜内注射至少一次，且优选以约3周的间隔注射至少两次。接着通过传统的斑点印迹技术或抗体捕获(ABC)对小鼠血清进行分析，以确定哪种动物最适合融合。大约两到三周后，向小鼠静脉内给予大量免疫检查点分子。随后按照既定方案将小鼠处死，且将脾细胞与市售的骨髓瘤细胞，如Ag8.653(ATCC)融合。简而言之，将骨髓瘤细胞在培养基中洗涤数次，并以约三个脾细胞比一个骨髓瘤细胞的比例与小鼠脾细胞融合。融合剂可以是本领域中使用的任何合适的试剂，例如聚乙二醇(PEG)。融合物被涂铺到含有允许融合细胞选择性生长的培养基的板中。接着可以使融合的细胞生长大约八天。收集所得杂交瘤的上清液并添加到首先用山羊抗小鼠Ig涂布的板上。洗涤后，将标记，例如标记的免疫检查点分子多肽添加到每个孔中，然后进行培育。随后可以检测到阳性孔。阳性克隆可以在大量培养中生长，且随后在蛋白A柱(Pharmacia)上纯化上清液。
本发明的单克隆抗体可以使用替代技术，例如以引用方式并入本文中的Alting-Mees等人((1990)Strategies in Mol.Biol.3：1-9，"Monoclonal Antibody ExpressionLibraries：A Rapid Alternative to Hybridomas")中描述的那些技术产生。类似地，可以使用重组DNA技术构建结合配偶体，以并入编码特定结合抗体的基因的可变区。这种技术描述于Larrick等人((1989)Biotechnology 7：394)中。
可以通过常规技术产生的此类抗体的抗原结合片段也包括在本发明中。此类片段的实例包括但不限于Fab和F(ab')2片段。还提供了通过基因工程改造技术产生的抗体片段和衍生物。
本发明的单克隆抗体包括嵌合抗体，例如鼠类单克隆抗体的人源化形式。此类人源化抗体可以通过已知技术制备，并且在将抗体施用于人时具有降低免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包括鼠类抗体的可变区(或仅其抗原结合位点)和源自人抗体的恒定区。或者，人源化抗体片段可包括鼠类单克隆抗体的抗原结合位点和源自人抗体的可变区片段(缺乏抗原结合位点)。产生嵌合和进一步工程改造的单克隆抗体的程序包括在以下文献中所述的那些：Riechmann等人((1988)Nature 332：323)，Liu等人((1987)Proc.Nat’l.Acad.Sci.84：3439)，Larrick等人((1989)Bio/Technology 7：934)，以及Winter和Harris((1993)TIPS 14：139)。转基因产生抗体的程序可见于GB 2,272,440、美国专利第5,569,825号和第5,545,806号中，其均以引用方式并入本文中。
可以使用通过基因工程方法产生的抗体，例如包括人类和非人类部分的嵌合和人源化单克隆抗体，其可以使用标准重组DNA技术制备。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过基因工程使用本领域中已知的标准DNA技术生产，例如使用以下各者中所述的方法：Robinson等人国际公开案第WO 87/02671号；Akira等人欧洲专利申请0184187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请0171496；Morrison等人欧洲专利申请0173494；Neuberger等人PCT国际公开案第WO 86/01533号；Cabilly等人美国专利第4,816,567号；Cabilly等人欧洲专利申请0125023；Better等人，(1988)Science 240：1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Nat’l.Acad.Sci.84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Nat’l.Acad.Sci.84：214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；Winter美国专利第5,225,539号；Jones等人(1986)Nature 321：552 525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.141：4053-4060。
就合成和半合成抗体而言，此类术语旨在涵盖但不限于抗体片段、同型转换抗体、人源化抗体(例如小鼠-人、人-小鼠)、杂交体、具有多种特异性的抗体以及完全合成的抗体样分子。
对于治疗应用，具有人恒定区和可变区的“人”单克隆抗体通常是优选的，以最小化患者对抗体的免疫反应。此类抗体可以通过使含有人免疫球蛋白基因的转基因动物免疫来产生。参见Jakobovits等人Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。
抗TAA或免疫检查点分子的人单克隆抗体也可以通过使用由源自受试者的淋巴细胞的mRNA制备的免疫球蛋白轻链和重链cDNA构建组合免疫球蛋白文库，例如Fab噬菌体展示文库或scFv噬菌体展示文库来制备。参见例如McCafferty等人PCT公开案WO 92/01047；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；和Griffths等人(1993)EMBO J.12：725-734。另外，抗体可变区的组合文库可以通过突变已知的人抗体来产生。例如，已知结合免疫检查点分子的人抗体的可变区可以被突变，例如通过使用随机改变的诱变寡核苷酸，以产生突变的可变区文库，然后可以对其进行筛选以结合至免疫检查点分子。在免疫球蛋白重链和/或轻链的CDR区内诱导随机诱变的方法、使随机重链和轻链交叉以形成配对的方法和筛选方法可见于例如以下各者中：Barbas等人PCT公开案WO 96/07754；Barbas等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89：4457-4461。
免疫球蛋白文库可以通过优选来源于丝状噬菌体的一群展示包装表达，以形成抗体展示文库。特别适合用于产生抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如以下各者中：Ladner等人美国专利第5,223,409号；Kang等人PCT公开案WO 92/18619；Dower等人PCT公开案WO 91/17271；Winter等人PCT公开案WO 92/20791；Markland等人PCT公开案WO 92/15679；Breitling等人PCT公开案WO 93/01288；McCafferty等人PCT公开案WO 92/01047；Garrard等人PCT公开案WO 92/09690；Ladner等人PCT公开案WO 90/02809；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370 1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；Griffths等人(1993)前述；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)Proc.Nat’l.Acad.Sci.89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nucl.Acid Res.19：4133-4137；和Barbas等人(1991)Proc.Nat’l.Acad.Sci.88：7978-7982。一旦展示在展示包装(例如丝状噬菌体)的表面上，就筛选抗体文库以鉴定和分离表达结合TAA或免疫检查点分子的抗体的包装。
重组MVA。在本发明的更优选实施方案中，本文公开的一种或多种蛋白质和核苷酸包括于重组MVA中。如本公开所描述和说明的，本公开的重组MVA的静脉内施用在各个方面在癌症患者中诱导增强的免疫反应。因此，在一个或多个优选实施方案中，本发明包括重组MVA，其包括编码本文所述的一种或多种TAA的第一核酸和编码CD40L的第二核酸。
可用于实践本发明并且已按照布达佩斯条约的要求保藏的MVA病毒株的实例是病毒株MVA 572，其于1994年1月27日保藏在European Collection of Animal CellCultures(ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，Public HealthLaboratory Service，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，United Kingdom，保藏号为ECACC 94012707，并且2000年12月7日以ECACC 00120707保藏的MVA 575、2000年8月30日以编号V00083008保藏在European Collection of Cell Cultures(ECACC)的MVA-BN以及其衍生物是另外的示例性菌株。
如本文所述，MVA-BN的“衍生物”是指表现出与MVA-BN基本相同的复制特征但在其基因组的一个或多个部分中表现出差异的病毒。MVA-BN以及其衍生物不能复制，意味着不能在体内和体外进行生殖复制。更具体地说，在体外，MVA-BN或其衍生物已被描述为能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)中进行生殖复制，但不能在人角质形成细胞系HaCat(Boukamp等人(1988)J.Cell Biol.106：761-771)、人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)和人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)中进行生殖复制。另外，MVA-BN或其衍生物在Hela细胞和HaCaT细胞系中的病毒扩增率比MVA-575小至少两倍，更优选地小三倍。MVA-BN和其衍生物的这些特性的测试和分析描述于WO 02/42480(美国专利申请第2003/0206926号)和WO 03/048184(美国专利申请第2006/0159699号)中。
如先前段落中所述的术语在体外人类细胞系中“不能进行生殖复制”或“无生殖复制的能力”例如描述于WO 02/42480中，其还教导了如何获得具有如上所述的所需特性的MVA。所述术语适用于使用WO 02/42480或美国专利第6,761,893号中所述的分析在感染后4天具有小于1的体外病毒扩增率的病毒。
术语“无法进行生殖复制”是指病毒在感染后4天在如先前段落中所述的体外人类细胞系中的病毒扩增率低于1。WO 02/42480或美国专利第6,761,893号中所述的分析可适用于病毒扩增率的测定
病毒在如先前段落中所述的体外人类细胞系中的扩增或复制通常表示为由受感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于感染细胞的病毒量(输入)的比率，称为“扩增率”。“1”的扩增率定义了一种扩增状态，其中从受感染细胞产生的病毒量与最初用于感染细胞的量相同，意味着受感染细胞允许病毒感染和繁殖。相反，小于1的扩增率，即与输入水平相比输出减少，表明缺乏繁殖复制，且因此病毒减弱。
本文中的“辅助”意指重组MVA的特定编码蛋白质或组分增加由重组MVA的其它编码蛋白质或组分产生的免疫反应。
表达盒/控制序列。在各个方面，本文所述的一种或多种核酸包含在一个或多个表达盒中，其中一种或多种核酸可操作地连接至表达控制序列。“可操作地连接”意指所描述的组分是相关的，允许它们以它们预期的方式发挥作用，例如转录待表达的核酸的启动子。与编码序列可操作地连接的表达控制序列被接合，以使得编码序列的表达在与表达控制序列相容的条件下实现。表达控制序列包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、编码蛋白质的开放阅读框开头处的起始密码子、内含子的剪接信号和框内终止密码子。合适的启动子包括但不限于SV40早期启动子、RSV启动子、逆转录病毒LTR、腺病毒主要晚期启动子、人CMV立即早期I启动子和各种痘病毒启动子，包括但不限于以下痘苗病毒或MVA衍生和FPV衍生启动子：30K启动子、I3启动子、PrS启动子、PrS5E启动子、Pr7.5K、PrHyb启动子、Pr13.5长启动子、40K启动子、MVA-40K启动子、FPV 40K启动子、30k启动子、PrSynIIm启动子、PrLE1启动子和PR1238启动子。额外启动子进一步描述于WO 2010/060632、WO 2010/102822、WO 2013/189611、WO 2014/063832和WO 2017/021776中，其以引用方式整体并入本文中。
额外的表达控制序列包括但不限于前导序列、终止密码子、多腺苷酸化信号以及在所需宿主系统中适当转录和随后翻译编码所需重组蛋白(例如HER2、Brachyury和/或CD40L)的核酸序列所必需的任何其它序列。痘病毒载体还可含有在所需宿主系统中转移和随后复制含有核酸序列的表达载体所必需的额外元件。本领域技术人员将进一步理解，此类载体容易使用常规方法构建(Ausubel等人，(1 987)，“Current Protocols inMolecular Biology,”John Wiley and Sons，New York，N.Y.)，并且是可商购的。
施用组合的方法和给药方案。在一个或多个方面，本发明的组合可以作为同源和/或异源初免-加强方案的一部分施用。图7中所示的数据部分说明了同源初免加强方案增加了受试者的特异性CD8和CD4 T细胞反应。因此，在一个或多个实施方案中，存在用于使癌症患者减小肿瘤大小和/或增加存活率的组合和/或方法，其包括向癌症患者施用本公开的组合，其中所述组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用。
产生包括转基因的重组MVA病毒
本文提供的重组MVA病毒可以通过本领域中已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列插入至痘病毒基因组中的方法是本领域技术人员熟知的。例如，标准分子生物学技术，如DNA克隆、DNA和RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术的方法描述于Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版，Sambrook等人，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))中，并且处理和操纵病毒的技术描述于VirologyMethods Manual(Mahy等人(编)，Academic Press(1996))中。同样，关于MVA的处理、操纵和基因工程的技术和专门知识描述于以下各者中：Molecular Virology：A PracticalApproach(Davison和Elliott(编)，The Practical Approach Series，IRL Press atOxford University Press，Oxford，UK(1993)(参见例如“第9章：Expression of genes byVaccinia virus vectors”))和Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Son，Inc.(1998)(参见例如第16章，第IV部分：“Expression of proteins in mammaliancells using vaccinia viral vector”))。
对于本文公开的各种重组MVA病毒的产生，可应用不同的方法。可将待插入至病毒中的DNA序列置于大肠杆菌质粒构建体中，其中插入了与痘病毒DNA片段同源的DNA。另外，可将待插入的DNA序列与启动子连接。启动子-基因连接可定位在质粒构建体中，使得启动子-基因连接的两端侧接与DNA序列同源的DNA，所述DNA序列侧接含有非必需基因座的痘病毒DNA区域。所得质粒构建体可以通过在大肠杆菌中的繁殖进行扩增并分离。可将含有待插入的DNA基因序列的分离质粒转染到例如鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞培养物中，同时用MVA病毒感染培养物。质粒中的同源MVA病毒DNA与病毒基因组之间的重组分别可以产生被外源DNA序列的存在修饰的痘病毒。
根据一个优选的实施方案，合适的细胞培养物的细胞，例如CEF细胞可以被MVA病毒感染。随后可以用第一质粒载体转染被感染的细胞，所述第一质粒载体包括一个或多个外源或异源基因，例如本公开中提供的一种或多种核酸；优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上所阐述，质粒载体还包括能够引导外源序列插入至MVA病毒基因组的选定部分中的序列。任选地，质粒载体还含有一个盒，所述盒包括与痘病毒启动子可操作地连接的标记和/或选择基因。合适的标记或选择基因是例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖基转移酶或其它标记的基因。选择或标记盒的使用简化了产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，重组痘病毒也可以通过PCR技术进行鉴定。随后，另一细胞可以用如上所述获得的重组痘病毒感染，并用包括一个或多个第二外源或异源基因的第二载体转染。如果将此基因引入至痘病毒基因组的不同插入位点中，则第二载体在引导一个或多个第二外源基因整合到痘病毒基因组中的痘病毒同源序列方面也不同。在发生同源重组后，可以分离包括两个或更多个外源或异源基因的重组病毒。为了将额外的外源基因引入至重组病毒中，感染和转染的步骤可以通过使用在先前步骤中分离的重组病毒进行感染和通过使用包含另外一个或多个外源基因的另外的载体进行转染来重复。
或者，如上所述的感染和转染步骤是可互换的，即，可以首先用包括外源基因的质粒载体转染合适的细胞，且接着用痘病毒进行感染。作为另一替代方案，也可以将每个外源基因引入至不同的病毒中，用所有获得的重组病毒共感染细胞，并筛选包括所有外源基因的重组体。第三种替代方案是在体外连接DNA基因组和外源序列，并使用辅助病毒重建重组的痘苗病毒DNA基因组。第四种替代方案是在大肠杆菌或另一种细菌物种中，在作为细菌人工染色体(BAC)克隆的MVA病毒基因组与线性外源序列之间进行同源重组，所述线性外源序列两侧为与侧接MVA病毒基因组中的所需整合位点的序列同源的DNA序列。
本公开的一种或多种核酸可以插入至MVA病毒或MVA病毒载体的任何合适部分中。MVA病毒的合适部分是MVA基因组的非必需部分。MVA基因组的非必需部分可以是MVA基因组的基因间区或已知缺失位点1-6。或者或另外，重组MVA的非必需部分可以是MVA基因组的编码区，其对于病毒生长是非必需的。然而，插入位点不限于MVA基因组中的这些优选插入位点，因为在本发明的范围内的是本发明的核酸(例如HER2、Brachyury、HERV-K-env、HERV-K-gag、PRAME、FOLR1和CD40L和/或4-1BBL)和本文所述的任何伴随启动子可以插入病毒基因组的任何位置，只要有可能获得可在至少一种细胞培养系统，例如鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中扩增和繁殖的重组体。
优选地，本发明的核酸可插入至MVA病毒的一个或多个基因间区(IGR)中。术语“基因间区”优选指位于MVA病毒基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间，优选在MVA病毒基因组的两个必需ORF之间的那些病毒基因组部分。对于MVA，在某些实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR 148/149。
对于MVA病毒，核苷酸序列可另外或替代地插入至一个或多个已知缺失位点，即MVA基因组的缺失位点I、II、III、IV、V或VI中。术语“已知缺失位点”是指MVA基因组的以下部分：通过相对于衍生MVA的亲本病毒，特别是亲本绒毛尿囊痘苗病毒安卡拉(CVA)的基因组在第516代表征的CEF细胞上连续传代而缺失，例如，如Meisinger-Henschel等人((2007)J.Gen.Virol.88：3249-3259)中所述。
疫苗
在某些实施方案中，本公开的重组MVA可以配制为疫苗的一部分。对于疫苗的制备，MVA病毒可以转化为生理上可接受的形式。
下面是一个示例性制备。纯化的病毒在-80℃下储存，滴度为5×108TCID50/ml，配制于10mM Tris、140mM NaCl，pH 7.4中。对于疫苗注射剂的制备，例如，1×108-1×109个病毒颗粒可以在安瓿(优选玻璃安瓿)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。或者，疫苗注射剂可以通过逐步冷冻干燥制剂中的病毒来制备。在某些实施方案中，制剂含有额外的添加剂，例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或其它添加剂，例如包括但不限于适用于体内施用的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。接着将安瓿密封并且可在合适的温度下，例如在4℃与室温之间储存几个月。然而，只要不需要，安瓿优选在低于-20℃的温度下，最优选在约-80℃下储存。
在涉及疫苗接种或疗法的各种实施方案中，将冻干物溶解在0.1至0.5ml的水溶液中，优选生理盐水或Tris缓冲液，例如10mM Tris、140mM NaCl pH 7.7。预期本公开的重组MVA、疫苗或药物组合物可以104至1010TCID50/ml、105至5×109TCID50/ml、106至5×109TCID50/ml或107至5×109TCID50/ml的浓度范围在溶液中配制。人类的优选剂量包括106至1010TCID50，包括106TCID50、107TCID50、108TCID50、5×108TCID50、109TCID50、5×109TCID50或1010TCID50的剂量。施用剂量和次数的优化在本领域技术人员的技能和知识范围内。
在一个或多个优选实施方案中，如本文所述，将重组MVA静脉内施用于癌症患者。在其它实施方案中，将重组MVA肿瘤内施用于癌症患者。在其它实施方案中，将重组MVA同时或在不同时间静脉内和肿瘤内施用于癌症患者。
在一些实施方案中，MVA被设计成含有TAA以及共刺激分子，并且旨在适合于静脉内或肿瘤内施用，或通过两种施用途径施用。此类MVA可表达一种或多种TAA，包括人内源性逆转录病毒K超家族(HERV-K)的蛋白质，例如HERV-K-env、HERV-K-gag或HERV-K-mel，或其合成变体，例如实施例38中所述的那些。
在另外的实施方案中，将重组MVA施用于患者，并且免疫检查点拮抗剂或激动剂，或优选抗体也可以全身或局部施用，即通过腹膜内、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、皮内或本领域技术人员已知的任何其它施用途径施用。
试剂盒、组合物和使用方法。在各种实施方案中，本发明涵盖试剂盒、药物组合、药物组合物和/或免疫原性组合，其包含a)包含本文所述的核酸的重组MVA和/或b)本文所述的一种或多种抗体。
预期试剂盒和/或组合物可包含一个或多个本公开的重组痘病毒的容器或小瓶、一个或多个本公开的抗体的容器或小瓶以及用于施用重组MVA和抗体的说明书。预期在更具体的实施方案中，试剂盒可包括在第一次初免施用中施用重组MVA和抗体，且接着施用重组MVA和抗体的一次或多次后续加强施用的说明书。
本文提供的试剂盒和/或组合物通常可包括一种或多种药学上可接受的和/或批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。合适的载体典型地是大的、缓慢代谢的分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
某些示例性实施方案
实施方案1是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的肿瘤内施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案2是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的静脉内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对TAA特异的CD8T细胞反应。
实施方案3是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA和4-1BBL抗原相比，重组MVA的施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案4是一种在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL抗原的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内注射包括编码异源肿瘤相关抗原和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，重组MVA的肿瘤内施用在肿瘤中产生增强的炎症反应。这种增强的炎症反应在本文中别处讨论且可包括例如NK细胞和T细胞的诱导。
实施方案5是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者施用包括编码内源性逆转录病毒抗原(ERV)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA和4-1BBL抗原相比，重组MVA的施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案6是根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案7是根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中TAA是内源性逆转录病毒(ERV)蛋白。
实施方案8是根据实施方案7所述的方法，其中ERV是在肿瘤细胞中表达的ERV蛋白。
实施方案9是根据实施方案7至8中任一项所述的方法，其中ERV来自人内源性逆转录病毒蛋白K(HERV-K)家族。
实施方案10是根据实施方案9所述的方法，其中所述HERV-K蛋白选自HERV-K包膜蛋白、HERV-K gag蛋白和HERV-K mel蛋白。
实施方案11是根据实施方案9所述的方法，其中所述HERV-K蛋白选自HERV-K包膜蛋白、HERV-K gag蛋白、HERV-K mel肽(peptide)以及其免疫原性片段。
实施方案12是根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中TAA选自由以下组成的组：癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸相关蛋白1(TRP2)、Brachyury、FOLR1、PRAME、p15以及其组合。
实施方案13是根据实施方案1至6和12中任一项所述的方法，其中TAA选自由癌胚抗原(CEA)和粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)组成的组，或者是作为AH1A5、p15E和TRP2的复合物或组合的TAA，例如如实施例1中所述。
实施方案14是根据实施方案1至6和12中任一项所述的方法，其中TAA选自由PAP或PSA组成的组。
实施方案15是根据实施方案1至6、12和14中任一项所述的方法，其中TAA是PSA。
实施方案16是根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中TAA选自：5-α-还原酶、α-胎蛋白(AFP)、AM-1、APC、April、B黑色素瘤抗原基因(BAGE)、β-连环蛋白、Bcl12、bcr-abl、Brachyury、CA-125、半胱天冬酶-8(CASP-8，也称为FLICE)、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21/补体受体2(CR2)、CD22/BL-CAM、CD23/FcεRII、CD33、CD35/补体受体1(CR1)、CD44/PGP-1、CD45/白细胞共同抗原(“LCA”)、CD46/膜辅因子蛋白(MCP)、CD52/CAMPATH-1、CD55/衰变加速因子(DAF)、CD59/保护素、CDC27、CDK4、癌胚抗原(CEA)、c-myc、环氧合酶-2(cox-2)、在结肠直肠癌基因中缺失(“DCC”)、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、成纤维细胞生长因子8a(FGF8a)、成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、G黑色素瘤抗原基因家族(GAGE-家族)、胃泌素17、胃泌素释放激素、神经节苷脂2(GD2)/神经节苷脂3(GD3)/神经节苷脂-单唾液酸-2(“GM2”)、促性腺激素释放激素(GnRH)、UDP-GlcNAc:R1Man(α1-6)R2[GlcNAc:Man(α1-6)]β1,6-N
Figure BDA0003693522260000571
-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT V)、GP1、gp100/Pme117、gp-100-in4、gp15、gp75/酪氨酸相关蛋白-1(gp75/TRP-1)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、乙酰肝素酶、HER2、人乳腺肿瘤病毒(HMTV)、70千道尔顿热休克蛋白(“HSP70”)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、胰岛素样生长因子受体-1(IGFR-1)、白介素-13受体(IL-13R)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、黑色素瘤抗原编码基因1(MAGE-1)、黑色素瘤抗原编码基因2(MAGE-2)、黑色素瘤抗原编码基因3(MAGE-3)、黑色素瘤抗原编码基因4(MAGE-4)、乳腺珠蛋白、MAP17、Melan-A/黑色素瘤抗原被T细胞识别-1(MART-1)、间皮素、MIC A/B、MT-MMPs、粘蛋白、睾丸特异性抗原NY-ESO-1、骨连接蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白、PAI-1、血小板源性生长因子(PDGF)、μPA、PRAME、前列腺碱性蛋白、祖细胞生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX-家族、STAT3、STn、TAG-72、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、胸腺素-β-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TP1、TRP-2、酪氨酸酶、血管内皮生长因子(VEGF)、ZAG、p16INK4和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。由以下组成的组：癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸组成相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸相关蛋白1(TRP2)、Brachyury和其组合。
实施方案17是根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述重组MVA进一步包括编码CD40L抗原的第三核酸。
实施方案18是根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其进一步包括向受试者施用至少一种免疫检查点分子拮抗剂或激动剂。
实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中所述免疫检查点分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS。
实施方案20是根据实施方案18至19中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子是PD-1和/或PD-L1。
实施方案21是根据实施方案20所述的方法，其中所述免疫检查点分子拮抗剂进一步包括LAG-3的拮抗剂。
实施方案22是根据实施方案18至21中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子拮抗剂包括抗体。
实施方案23是根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其进一步包括向受试者施用特异性针对第二TAA的抗体。
实施方案24是根据实施方案23所述的方法，其中特异性针对第二TAA的抗体特异性针对在肿瘤细胞膜上表达的抗原。
实施方案25是根据实施方案23所述的方法，其中特异性针对第二TAA的抗体a)特异性针对在肿瘤细胞膜上表达的抗原和b)包括Fc结构域。
实施方案26是用于根据实施方案1至25中任一项所述的方法的药物组合物。
实施方案27是用于根据实施方案1至25中任一项所述的方法的疫苗。
实施方案28是一种用于治疗患有癌症的受试者的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，所述重组MVA包括a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和b)编码4-1BBL的第二核酸。
实施方案29是根据实施方案28所述的重组MVA，其中TAA是内源性逆转录病毒(ERV)蛋白。
实施方案30是根据实施方案29所述的重组MVA，其中ERV蛋白来自人内源性逆转录病毒蛋白K(HERV-K)家族。
实施方案31是根据实施方案30所述的重组MVA，其中逆转录病毒蛋白K选自HERV-K包膜蛋白、HERV-K gag蛋白和HERV-Kmel蛋白。
实施方案32是根据实施方案28至31中任一项所述的重组MVA，其进一步包括编码CD40L的第三核酸。
实施方案33是一种药物组合，其包括a)根据实施例28至32中任一项所述的重组MVA和b)免疫检查点分子拮抗剂或激动剂中的至少一种。
实施方案34是根据实施方案33所述的药物组合，其中所述免疫检查点分子拮抗剂或激动剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和ICOS的拮抗剂或激动剂。
实施方案35是根据实施方案34所述的药物组合，其中免疫检查点分子拮抗剂是PD-1和/或PD-L1的拮抗剂。
实施方案36是根据实施方案35所述的药物组合，其中所述免疫检查点分子拮抗剂进一步包括LAG-3的拮抗剂。
实施方案37是根据实施方案33至36中任一项所述的药物组合，其中所述免疫检查点分子拮抗剂包括抗体。
实施方案38是一种药物组合，其包括a)根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA，b)特异性针对第二TAA的抗体。
实施方案39是根据实施方案38所述的药物组合，其中特异性针对第二TAA的抗体特异性针对在肿瘤细胞膜上表达的抗原。
实施方案40是根据实施方案39所述的药物组合，其中特异性针对第二TAA的抗体a)特异性针对在肿瘤细胞膜上表达的抗原和b)包括Fc结构域。
实施方案41是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于减小肿瘤大小和/或增加患有癌性肿瘤的受试者的存活率。
实施方案42是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于减小肿瘤大小和/或增加患有癌性肿瘤的受试者的存活率的方法中，所述方法包括向受试者肿瘤内施用如实施方案28至32所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物或根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，肿瘤内施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案43是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于减小肿瘤大小和/或增加患有癌性肿瘤的受试者的存活率的方法中，所述方法包括向受试者静脉内施用如实施方案28至32所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物或根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其中与非静脉内施用包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，静脉内施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案44是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于在癌症受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法中，所述方法包括向受试者肿瘤内施用如实施方案28至32所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物或根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，肿瘤内施用增强受试者的癌性肿瘤中的炎症反应。
实施方案45是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于治疗受试者的癌症的方法中。
实施方案46是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于治疗癌症的方法中，其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、宫颈癌或结肠直肠癌。
实施方案47是根据实施方案44所述的重组MVA，其中增强的炎症反应定位于肿瘤。
实施方案48是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和CD40L的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的肿瘤内施用使受试者增强癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案49是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内注射包括编码TAA和CD40L抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，重组MVA的静脉内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对TAA特异的CD8T细胞反应。
实施方案50是一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向受试者施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码CD40L的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA和CD40L抗原相比，重组MVA的施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
实施方案51是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于减小肿瘤大小和/或增加患有癌性肿瘤的受试者的存活率的方法中，所述方法包括向受试者静脉内和/或肿瘤内施用如实施方案28至32所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物或根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其中与选自以下各组的任何MVA的非静脉内或非肿瘤内施用相比，所述静脉内和/或肿瘤内施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率：1)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸和编码4-1BBL抗原的第二核酸；2)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸和编码CD40L抗原的第二核酸；或3)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸、编码4-1BBL抗原的第二核酸和编码CD40L抗原的第三核酸。
实施方案52是根据实施方案28至32中任一项所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物、根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其用于减小肿瘤大小和/或增加患有癌性肿瘤的受试者的存活率的方法中，所述方法包括向受试者静脉内和肿瘤内施用如实施方案28至32所述的重组MVA、根据实施方案27所述的疫苗、根据实施方案26所述的药物组合物或根据实施方案33至40中任一项所述的药物组合，其中与选自以下各组的任何MVA的非静脉内或非肿瘤内施用相比，所述静脉内和肿瘤内施用使受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率：1)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸和编码4-1BBL抗原的第二核酸；2)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸和编码CD40L抗原的第二核酸；或3)重组MVA病毒，其包括编码TAA的第一核酸、编码4-1BBL抗原的第二核酸和编码CD40L抗原的第三核酸。所述静脉内和肿瘤内施用可同时或在不同时间进行，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
更进一步的实施方案
在一个方面，本发明提供重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包括：
(a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸；
(b)编码4-1BB配体(4-1BBL)的第二核酸；和
(c)至少一种另外的编码TAA的核酸。
在一个实施方案中，重组MVA进一步包括：
(d)编码CD40配体(CD40L)的核酸。
在一个实施方案中，重组MVA包括两个、三个、四个、五个、六个或更多个各自编码不同TAA的核酸。
在重组MVA的一个实施方案中，TAA选自由以下组成的组：内源性逆转录病毒(ERV)蛋白、内源性逆转录病毒(ERV)肽、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸相关蛋白1(TRP2)、Brachyury、p15、AH1A5、叶酸受体α(FOLR1)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)和MEL；以及其组合。
在重组MVA的一个实施方案中，ERV蛋白来自人内源性逆转录病毒K(HERV-K)家族，优选地选自HERV-K包膜(HERV-K-env)蛋白和HERV-K gag蛋白。
在重组MVA的一个实施方案中，ERV肽来自人内源性逆转录病毒K(HERV-K)家族，优选地选自HERV-K包膜蛋白的假基因(HERV-K-env/MEL)。
在另一方面，本发明提供重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包括：
(i)编码HERV-K-env/MEL的核酸；
(ii)编码HERV-K gag的核酸；
(iii)编码优选表达为融合蛋白的FOLR1和PRAME的核酸；和(iv)编码4-1BBL的核酸。
在一个实施方案中，重组MVA进一步包括：
(v)编码CD40L的核酸。
在一个实施方案中，(i)中的核酸编码包括HERV-K-env表面(SU)和跨膜(TM)单元的HERV-K-env/MEL，其中TM单元发生突变，优选地其中TM单元发生突变以使得免疫抑制域失活。优选地，HERVK-MEL被插入突变的TM单元内。更优选地，HERVK-MEL取代TM单元的一部分免疫抑制域。
在一个实施方案中，(i)中的核酸序列编码包括如SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列。
在一个实施方案中，(i)中的核酸序列包括如SEQ ID NO：8中所示的核酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，(i)中的核酸编码包括HERV-K-env表面(SU)和跨膜(TM)单元的HERVK-env/MEL，其中TM单元缩短至少于20个氨基酸，优选少于10个氨基酸，更优选少于8个氨基酸，最优选6个氨基酸。
在一个实施方案中，(i)中的核酸编码包括HERV-K-env表面(SU)单元的HERVK-env/MEL，其中HERV-K-env SU单元的RSKR弗林蛋白酶裂解位点缺失。优选地，HERVK-MEL连接到HERV-Kenv SU单元的C端。
在一个实施方案中，(i)中的核酸编码包括异源膜锚的HERVK-env/MEL，优选源自人PDGF(血小板源性生长因子)受体。
在一个实施方案中，(i)中的核酸序列编码包括如SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列。
在一个实施方案中，(i)中的核酸序列包括如SEQ ID NO：12中所示的核酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，重组MVA源自MVA-BN。
在另一个方面，本发明提供包括本发明的重组MVA的药物制剂或组合物。
在一个实施方案中，药物制剂或组合物适于肿瘤内和/或静脉内施用，优选肿瘤内施用。
在另一个方面，本发明提供用作药剂或疫苗的重组MVA。
在另一个方面，本发明提供用于治疗癌症，优选黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌或卵巢癌的重组MVA。
在另一个方面，本发明提供本发明的重组MVA用于增强癌性肿瘤的炎症反应、减小癌性肿瘤的大小、延缓或阻止癌性肿瘤的生长和/或增加受试者，优选人类的总体存活率。
在一个实施方案中，所使用的重组MVA是肿瘤内和/或静脉内施用的，优选肿瘤内施用的。
23.在一个实施方案中，使用的重组MVA与TAA特异性抗体组合使用。
24.在一个实施方案中，使用的重组MVA与免疫检查点分子拮抗剂或激动剂组合使用。
在另一个方面，本发明提供一种治疗方法，其中施用的重组MVA是根据本发明的重组MVA。
实施例
以下实施例说明本发明，但不应被解释为以任何方式限制权利要求书的范围。
实施例1：重组MVA-TAA-4-1BBL和MVA-TAA-CD40L的构建
包含本公开的元件的重组MVA病毒的产生是通过将指定转基因与其启动子插入到载体MVA-BN中来完成的。使用含有转基因和选择盒的重组质粒以及与MVA-BN内的目标基因座同源的序列插入转基因。通过将重组质粒转染到MVA-BN感染的CEF细胞中来实现病毒基因组与重组质粒之间的同源重组。然后在第二步中，在表达CRE重组酶的质粒的帮助下删除了选择盒，所述质粒特异性针对侧接选择盒的loxP位点，因此切除了中间序列。或者，选择盒的删除是通过使用MVA衍生的内部重复序列进行MVA介导的重组来实现的。
对于MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL的构建，重组质粒包括转基因OVA或OVA和4-1BBL，每个前面都有一个启动子序列，以及与MVA-BN内的目标插入位点相同的序列，以允许同源重组进入病毒基因组。
对于MVA-OVA-CD40L的构建，重组质粒包括转基因OVA和CD40L，每个前面都有一个启动子序列，以及与MVA-BN内的目标插入位点相同的序列，以允许同源重组进入病毒基因组。
对于MVA-gp70-4-1BBL的构建，重组质粒包括两种转基因gp70和4-1BBL，每个前面都有一个启动子序列，以及与MVA-BN内的目标插入位点相同的序列，以允许同源重组进入病毒基因组。
对于MVA-HERV-K、MVA-HERV-K-4-1BBL和MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L的构建，重组质粒分别包括HERV-K、HERV-K和4-1BBL以及HERV-K、4-1BBL和CD40L转基因。每个转基因或每组转基因之前都有一个启动子序列，以及与MVA-BN内的目标插入位点相同的序列，以允许同源重组进入病毒基因组。
对于MVA-AH1A5-p15E-TRP2和MVA-AH1A5-p15E-TRP2-CD40L的构建，重组质粒包括转基因AH1A5-p15E-TRP2或AH1A5-p15E-TRP2和CD40L，每个前面都有一个启动子序列，以及与MVA-BN内的目标插入位点相同的序列，以允许同源重组进入病毒基因组。
为了产生上述mBN MVA，CEF细胞培养物分别用MVA-BN接种并分别用对应的重组质粒转染。转而将来自这些细胞培养物的样品接种到含有诱导选择压力的药物的培养基中的CEF培养物中，并通过噬斑纯化分离表达荧光的病毒克隆。这些病毒克隆中含有荧光蛋白的选择盒的丢失在第二步中由CRE介导的重组(涉及每个构建体中选择盒两侧的两个loxP位点)或MVA介导的内部重组介导。在第二重组步骤之后，只有启动子插入MVA-BN的靶向位点中的转基因序列(例如OVA、4-1BBL、gp70、HERV-K和/或CD40L)被保留。制备缺乏选择盒的噬斑纯化病毒的储备液。
在用所述构建体接种的细胞中证实了所鉴定转基因的表达。
本文所述的构建体的产生是通过在细菌人工染色体(BAC)中使用MVA-BN的克隆形式进行的。重组质粒含有所述的转基因序列，每个序列都位于启动子的下游。质粒包括的序列也存在于MVA中，且因此允许特异性靶向整合位点。简而言之，通过将BAC DNA转染到BHK-21细胞中并用Shope纤维瘤病毒作为辅助病毒对其进行重复感染而从BAC中重组感染性病毒。在CEF细胞培养物上进行三次额外传代后，获得了不含辅助病毒的构建体版本。示例性MVA生成还发现于Baur等人((2010)Virol.84：8743-52，"Immediate-early expression ofa recombinant antigen by modified vaccinia virus Ankara breaks theimmunodominance of strong vector-specific B8R antigen in acute and memory CD8T-cell responses”)中。
实施例2：4-1BBL介导的MVA-OVA-4-1BBL感染的肿瘤细胞对CD8 T细胞的共刺激影 响细胞因子的产生，而不需要DC
在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10(黑色素瘤模型)细胞用MVA-OVA、MVA-OVA-CD40L或MVA-OVA-4-1BBL以10的MOI感染，并在37℃与5％CO2下培养过夜。第二天，在37℃与5％CO2下，收获感染的肿瘤细胞并且当指示时在DC存在下以1:1比率共培养4小时。从OT-I小鼠中磁性纯化初始OVA(257-264)特异性CD8+T细胞，并以1:5的比率添加到共培养物中。细胞在37℃与5％CO2下培养48小时。接着收集培养上清液用于通过Luminex进行细胞因子浓度分析。结果在图1中显示为以下各者的上清液浓度：IL-6(图1A)；GM-CSF(图1B)；IL-2(图1C)；和IFN-γ(图1D)。数据表示为平均值±SEM。
与先前报道的一致，MVA-OVA-CD40L对DC的活化和其抗原呈递能力有很大影响。因此，MVA-OVA-CD40L感染的FLDC产生大量的IL-6(图1A)。重要的是，OVA特异性T细胞反应可以在DC存在下完全诱导，但不能直接由MVA-CD40L感染的B16.F10细胞本身诱导(图1B和1C)。这些结果表明DC明确要求发挥MVA-OVA-CD40L的益处。相反，MVA-OVA-4-1BBL不诱导DC中的IL-6产生，但MVA-OVA-4-1BBL感染的B16.F10细胞以DC非依赖性方式引起T细胞活化细胞因子IFN-γ、IL-2和GM-CSF的分泌(图1A-1D)。
实施例3：MVA-OVA-4-1BBL感染的肿瘤细胞直接(即，不需要DC)驱动抗原特异性 CD8 T细胞分化成活化的效应T细胞
在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10(黑色素瘤模型)细胞用MVA-OVA、MVA-OVA-CD40L或MVA-OVA-4-1BBL以10的MOI感染，并在37℃与5％CO2下培养过夜。第二天，在37℃与5％CO2下，收获感染的肿瘤细胞并且当指示时在DC存在下以1:1比率共培养4小时。同时，从OT-I小鼠中磁性纯化初始OVA(257-264)特异性CD8+T细胞，并以1:5的比率添加到共培养物中。细胞在37℃5％CO2下培养48小时。然后对细胞染色并通过流式细胞仪进行分析。结果在图2中显示为OT-I CD8+T细胞上T-bet的GMFI(图2A)和OT-I CD8+T细胞的CD44+颗粒酶B+IFN-γ+TNFα+的百分比(图2B)。数据显示为平均值±SEM。
结果显示，在不存在交叉呈递DC的情况下，颗粒酶B+和IFNγ+细胞毒性效应T细胞的诱导依赖于4-1BBL(图2B)。与图1中呈现的结果一起，这些发现表明，与通过激活DC发挥作用的MVA编码的CD40L相比，由MVA编码的4-1BBL以不依赖DC的方式直接作用于T细胞。
实施例4：感染编码CD40L或4-1BBL的MVA会在肿瘤细胞系和巨噬细胞中诱导肿瘤 细胞死亡
肿瘤细胞系B16.OVA(图3A和3B)、MC38(图3C)和B16.F10(图3D)以指定MOI感染20小时。接着，通过流式细胞仪分析细胞的活力。来自图3A的样品中的血清HMGB1通过ELISA进行量化(图3B)。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)以指定MOI感染20小时。接着通过流式细胞仪分析细胞的活力。结果在图3A-3E中示出。数据呈现为平均值±SEM。
如图3A和3B中所示，与PBS处理的肿瘤细胞相比，MVA-OVA或MVA-OVA-CD40L感染导致细胞死亡的轻度诱导。有趣的是，MVA-OVA-4-1BBL感染在感染后18小时显著增强了肿瘤细胞死亡。
为了进一步证实非抗原细胞系中的这些结果，我们使用感染了MVA、MVA-CD40L和MVA-4-1BBL(其中没有一个编码TAA)的MC38(图3C)和B16.F10(图3D)肿瘤细胞进行了类似的分析。始终如一地，感染这些MVA会在这些肿瘤细胞系中诱导细胞死亡，并有效地杀死骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)(图3E)。总之，这些数据表明，MVA感染导致肿瘤细胞和巨噬细胞死亡，所述死亡在重组MVA表达CD40L或4-1BBL时增加。
肿瘤细胞的溶瘤病毒感染导致所谓的免疫原性细胞死亡(ICD)的诱导(Workenhe等人(2014)Mol.Ther.22：251-56)。ICD包括释放细胞内蛋白质，如钙网蛋白、ATP或HMGB1，它们对免疫系统起警报作用，导致抗原呈递增强，且从而诱导抗肿瘤免疫。我们测试了MVA感染是否会通过分泌的HMGB1诱导ICD。出乎意料的是，我们发现与MVA-OVA相比，MVA-OVA-4-1BBL和MVA-OVA-CD40L诱导HMGB1的显著增加(图3B)。
实施例5：编码4-1BBL的MVA在体内诱导NK细胞活化
C57BL/6小鼠(n＝5/组)用生理盐水或5×107TCID50 MVA-OVA(图4中的“rMVA”)、5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL(图4中的“rMVA-4-1BBL”)或5×107TCID50 MVA-OVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)进行静脉内免疫。24小时后，处死小鼠并处理脾以用于流式细胞仪分析。结果如图4A和图4B中所示。显示了CD69(图4A)和CD70(图4B)的几何平均荧光强度(GMFI)。数据显示为平均值±SEM，代表两个独立实验。
结果显示，与在没有4-1BBL的情况下IV施用MVA-OVA相比，通过向MVA-OVA中添加4-1BBL提高了NK细胞反应的质量，并且与MVA-OVA相比，两种NK细胞活化标志物CD69和CD70都被强烈上调(图4A和B)。联合注射阻断4-1BBL抗体显示，MVA-OVA诱导的NK细胞活化完全不依赖于4-1BBL，但可在MVA-OVA-4-1BBL传递过多的4-1BBL信号时增强。
实施例6：用编码4-1BBL的MVA进行静脉内免疫促进体内血清IFN-γ分泌
C57BL/6小鼠(n＝5/组)用生理盐水或5×107TCID50“rMVA”(＝MVA-OVA)、5×107TCID50“rMVA-4-1BBL”(＝MVA-OVA-4-1BBL)或5×107TCID50 MVA-OVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)进行静脉内免疫。结果在图5A和5B中示出。数据显示为平均值±SEM。图5A：6小时后，小鼠被放血，从全血中分离血清，并通过Luminex测定血清中的IFN-γ浓度。图5B：3、21和45小时后，向小鼠静脉注射布雷菲德菌素A以停止蛋白质分泌。免疫后6、24和48小时处死小鼠并通过流式细胞仪分析脾细胞。
4-1BB介导的NK细胞活化与NK效应细胞因子IFNγ的血清水平增加一致(图5A)。已知NK细胞在活化后会产生大量的IFN-γ。为了确定血清中增加的IFN-γ水平是否可能源自NK细胞，在静脉内注射指定重组MVA载体后的不同时间点测定产生IFN-γ的NK细胞的比例。注射后6小时，当测量到高血清IFN-γ水平时，IFN-γ+NK细胞的百分比最高，且此后缓慢下降(图5B)。当使用MVA-OVA-4-1BBL时，观察到最高频率的IFN-γ阳性NK细胞。总之，这些数据表明，rMVA-4-1BBL的静脉内免疫导致NK细胞的强烈活化和NK细胞效应细胞因子IFN-γ的产生增加。
实施例7：静脉内rMVA-4-1BBL免疫促进携带B16.OVA肿瘤的小鼠的血清IFN-γ分 泌
在肿瘤接种后第7天将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受i.v.(静脉内)PBS或5×107TCID50MVA-OVA(图中的“rMVA”)或MVA-OVA-4-1BBL(图中的“rMVA-4-1BBL”)。6小时后，小鼠被放血，从全血中分离血清，并通过Luminex测定血清中的IFN-γ浓度。结果如图6中所示。数据显示为平均值±SEM。
图6中显示的数据表明，在黑色素瘤模型中也可以获得与其它实验中所报道类似的对NK细胞的影响。免疫后6小时，MVA-OVA-4-1BBL免疫的荷瘤小鼠的血清IFN-γ水平大幅提高，表明强烈的NK细胞活化(图6)。
实施例8：静脉内rMVA-4-1BBL初免和加强免疫增强抗原和载体特异性CD8+T细胞 扩增
图7A-7D显示静脉内rMVA-4-1BBL初免和加强免疫后的抗原和载体特异性。C57BL/6小鼠(n＝4/组)在第0天接受用盐水或5×107TCID50 rMVA(＝MVA-OVA)、5×107TCID50rMVA-4-1BBL(＝MVA-OVA-4-1BBL)或5×107TCID50 rMVA结合200μg抗4-1BBL抗体(克隆TKS-1)的静脉内初免，且在第41天接受加强免疫。在初免后第6、21、35、48和64天对小鼠放血，并进行外周血的流式细胞仪分析。在初免后第70天处死小鼠。收获脾脏并进行流式细胞仪分析。
结果在图7A-7D中示出。图7A显示外周血白细胞(PBL)中抗原(OVA)特异性CD8+T细胞的百分比，且图7B显示PBL中载体(B8R)特异性CD8+T细胞的百分比。图7C显示活细胞中抗原(OVA)特异性CD8+T细胞的百分比。图7D显示活细胞中载体(B8R)特异性CD8+T细胞的百分比。数据显示为平均值±SEM。
结果显示，B8和OVA特异性CD8 T细胞在第一次免疫后第7天达到最大值，并在第41天第二次免疫后进一步扩增(图7A和B)。在第41天的时间点，与rMVA相比，对于B8和OVA两者，rMVA-4-1BBL在抗原特异性T细胞反应方面都具有明显优势。有趣的是，联合注射阻断4-1BBL抗体显示，rMVA诱导的T细胞反应完全不依赖于4-1BBL，但可在rMVA-4-1BBL传递过多的4-1BBL信号时增强(图7A和B)。与这些结果一致，rMVA-4-1BBL初免/加强免疫还使得第一次免疫后70天脾脏中的OVA和B8特异性T细胞反应得到改善(图7C和D)。
实施例9：静脉注射编码TAA和4-1BBL的MVA病毒的抗肿瘤作用增强
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受i.v.(静脉内)PBS或5×107TCID50MVA-OVA或5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL。定期测量肿瘤生长。如图8中所示，与MVA或对照(PBS)相比，编码4-1BBL的MVA病毒的静脉内施用使得肿瘤体积减小，这是肿瘤生长延迟延长的结果。
实施例10：肿瘤内注射编码4-1BBL或CD40L的MVA病毒的抗肿瘤作用增强
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)、第12天和第15天(灰色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝4-5/组)分组并接受肿瘤内(i.t.)PBS或5×107TCID50的MVA-OVA(图中的“rMVA”)、MVA-OVA-CD40L(图中的“rMVA-CD40L”)或MVA-OVA-4-1BBL(图中的“rMVA-4-1BBL”)。定期测量肿瘤生长。如图9A-9D中所示，通过肿瘤内注射编码TAA和4-1BBL或CD40L的MVA病毒实现了增强的抗肿瘤作用。更具体地说，如图9D中所示，在编码4-1BBL的MVA病毒下观察到显著更大的肿瘤生长减少。虽然本发明不受任何特定机制或作用方式束缚，但对于在4-1BBL与CD40L之间观察到的差异的一个假设是4-1BBL旨在活化NK细胞和T细胞，而CD40L旨在活化DC。B16黑色素瘤肿瘤更多地被T细胞浸润(Mosely等人(2016)CancerImmunol.Res.5(1)：29-41)；因此，在这种情况下，编码4-1BBL的MVA比编码CD40L的MVA更有效。
无论4-1BBL和CD40L对肿瘤生长或直径产生影响的确切机制或途径如何，图9中的数据表明，肿瘤内注射编码4-1BBL的MVA使得肿瘤生长控制延长，且在一些情况下甚至完全排斥肿瘤。
实施例11：肿瘤内注射用TAA和CD40L编码的MVA病毒对已确立的结肠癌的抗肿瘤 作用增强
在肿瘤接种后第14天(黑色虚线)、第19天和第22天(黑色虚线)，将携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受肿瘤内(i.t.)PBS或5×107TCID50 MVA-AH1A5-p15E-TRP2(图中标记为“rMVA”)或MVA-AH1A5-p15E-TRP2-CD40L(图中标记为“rMVA-CD40L”)。定期测量肿瘤生长。非抗原性、已建立的MC38结肠癌的结果如图10中所示。
这些载体编码由以下组成的一串肿瘤相关表位：一个黑色素瘤相关TRP2衍生表位(SVYDFFVWL，H2-Kb)和两个鼠类白血病病毒gp70衍生的CD8+T细胞表位p15E(KSPWFTTL，H2-Kb)和修饰的AH1、AH1A5(SPSYAYHQF、H2-Ld)，这些结果表明，在MC38结肠癌模型中肿瘤内注射MVA-CD40L可以显著延缓肿瘤生长。
实施例12：免疫检查点阻断和肿瘤抗原特异性抗体与MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施 用协同作用
B16.OVA黑色素瘤细胞(5×105个)被皮下注射到C57BL/6小鼠中。当肿瘤直径达到约5mm时，将小鼠分组(n＝5/组)并在指示时(钩号)腹膜内(i.p.)接受200μg IgG2a、抗TRP-1或抗PD-1。在肿瘤接种后第13天(黑色虚线)、第18天和第21天(灰色虚线)用PBS或5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫。定期测量肿瘤生长。结果在图11中示出。当肿瘤相关抗原(TAA)Trp1特异性抗体(抗Trp1)与MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施用组合时，与单独的抗PD-1相比，肿瘤体积的减小增加(图11，中间行)。当免疫检查点分子抗体PD-1与MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内施用组合时，与单独的抗PD-1相比，肿瘤体积的减小增加(图11，底行)。
这些实验表明，抗PD-1和抗TRP-1抗体作为单一药剂增强了对肿瘤生长的控制，而任一抗体与MVA-OVA-4-1BBL的组合提高了MVA-OVA-4-1BBL发挥的治疗效果。此处，肿瘤内MVA 4-1BBL与检查点阻断或TAA靶向抗体的组合疗法比任何单一疗法具有更大的治疗活性。此数据还表明，可能诱导ADCC的肿瘤特异性抗体可与表达4-1BBL的MVA的肿瘤内注射组合以产生协同效应。
实施例13：与激动性抗CD137抗体治疗相比，肿瘤内MVA-OVA-4-1BBL注射的优越抗 肿瘤作用
在肿瘤接种后第7天、第12天和第15天(黑色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并肿瘤内注射PBS、5×107TCID50 MVA-OVA-4-1BBL或10μg抗4-1BB(3H3，BioXcell)。定期测量肿瘤生长。
图12A显示与激动性抗4-1BBL抗体(3H3)相比，MVA-OVA-4-1BBL的优越抗肿瘤作用。图12B显示用MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内免疫仅在血液中诱导OVA特异性T细胞反应，而激动性抗4-1BBL抗体不在血液中诱导任何OVA特异性T细胞。
因此，这些数据表明肿瘤内MVA-OVA-4-1BBL治疗在肿瘤特异性T细胞反应以及肿瘤生长控制方面都比激动性抗CD137抗体更有效。
实施例14：在CT26肿瘤模型中静脉内注射编码CD40L编码的内源性逆转录病毒 (ERV)抗原Gp70的MVA的抗肿瘤作用增强
在将肿瘤引入小鼠后第12天(黑色虚线)，将携带CT26肿瘤的Balb/c小鼠(n＝5/组)分组并接受静脉内(i.v.)PBS或5×107TCID50 MVA-BN、MVA-Gp70或MVA-Gp70-CD40L。定期测量肿瘤生长。如图13A和13B中所示，与MVA或对照(PBS)相比，静脉内施用编码内源性逆转录病毒抗原Gp70的MVA病毒使得肿瘤体积减小。当CD40L另外由MVA-Gp70-CD40L编码时，抗肿瘤作用进一步提高。
图13C显示静脉注射MVA-Gp70或MVA-Gp70-CD40L后血液中Gp70特异性CD8 T细胞的诱导。
因此，在这些实验中，构建了编码模型ERV的MVA，所述模型ERV是鼠类蛋白gp70(鼠类白血病病毒的包膜蛋白)(“MVA-gp70”)。还产生了进一步包括共刺激分子CD40L的MVA(“MVA-gp70-CD40L”)。使用CT26.wt结肠癌模型测试了这些新构建体的抗肿瘤潜力。已显示CT26.wt细胞表达高水平的gp70(参见例如Scrimieri(2013)Oncoimmunol 2：e26889)。产生携带CT26.wt肿瘤的小鼠，并且当肿瘤为至少5mm×5mm时，如上所指示地进行静脉内免疫。单独用MVA进行免疫诱导肿瘤生长的轻度延迟。相反，用MVA-gp70进行免疫导致3/5个肿瘤的完全排斥反应(图13A和B)。用MVA-Gp70-CD40L进行免疫获得了更惊人的结果，其导致了4/5个肿瘤的排斥反应(图13A和B)。
为了确定这些抗肿瘤反应是否与免疫后gp70特异性T细胞的诱导相关，使用H-2Kd限制性gp70表位AH1进行血液再刺激。这些结果(图13C)显示在MVA-Gp70和MVA-Gp70-CD40L治疗的小鼠中gp70特异性CD8 T细胞反应的强烈诱导(图13C)。
实施例15：在B16.F10肿瘤模型中静脉内注射编码CD40L编码的内源性逆转录病毒 抗原Gp70的MVA的抗肿瘤作用增强
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)，当肿瘤测量为大约5×5mm时，将携带B16.F10肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受静脉内(i.v.)PBS或5×107TCID50的MVA-BN、MVA-Gp70或MVA-Gp70-CD40L。定期测量肿瘤生长。如图14A中所示，与MVA或对照(PBS)相比，静脉内施用编码内源性逆转录病毒抗原Gp70和CD40L的MVA病毒使得肿瘤体积减小。
图14B显示静脉注射MVA-Gp70或MVA-Gp70-CD40L后血液中Gp70特异性CD8 T细胞的诱导。
因此，在这些实验中，用MVA-Gp70和MVA-Gp70-CD40L治疗的功效在另一个独立的肿瘤模型中得到证实。B16.F10是一种源自C57BL/6的黑色素瘤细胞系，并且表达高水平的Gp70(Scrimieri(2013)Oncoimmunol 2：e26889)。单独用MVA(“MVA-BN”)治疗导致B16.F10肿瘤的一些肿瘤生长延迟，与非佐剂MVA-Gp70的效果相当(图14A)。然而，MVA-Gp70-CD40L比单独的MVA骨架对照产生更强的抗肿瘤作用(图14A)。其它实验表明，接受编码Gp70抗原的MVA的两组均表现出对H-2Kb限制性gp70表位p15e特异的CD8 T细胞反应，但当CD40L也由MVA编码时，未观察到外周T细胞反应显著增加(图14B)。
实施例16：静脉注射编码gp70和4-1BBL的MVA病毒的抗肿瘤作用增强[预测性实施 例]
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并静脉内接受PBS或5×107TCID50MVA-OVA或MVA-gp70-4-1BBL。定期测量肿瘤生长。由于人内源性逆转录病毒(ERV)蛋白的小鼠同系物既不在正常小鼠组织中高表达，也不主要在小鼠肿瘤组织中表达，因此无法在小鼠模型中有效研究人ERV的功效。Gp70是一种已被充分研究的小鼠ERV蛋白(参见例如Bronte等人(2003)J Immunol.171(12)：6396-6405；Bashratyan等人(2017)Eur.J.Immunol.47：575–584；和Nilsson等人(1999)Virus Genes18：115-120)。因此，在小鼠中研究gp70特异性癌症疫苗很可能对ERV特异性癌症疫苗在人类中的功效具有很强的预测价值。
实施例17：肿瘤内注射编码gp70和4-1BBL或CD40L的MVA病毒的抗肿瘤作用增强 [预测性实施例]
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)、第12天和第15天(灰色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝4-5/组)分组并接受肿瘤内(i.t.)PBS或5×107TCID50的MVA-OVA、MVA-OVA-CD40L或MVA-OVA-4-1BBL。定期测量肿瘤生长。
实施例18：与rMVA-HERV-K-4-1BBL一起施用通过受感染肿瘤细胞的直接抗原呈递 来影响细胞因子产生[预测性实施例]
在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10细胞以MOI 10用MVA-HERV-K、MVA-HERV-K-CD40L、MVA-HERV-K-4-1BBL或MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L感染并放置过夜。第二天，在37℃5％CO2下，收获感染的肿瘤细胞并且当指示时在DC存在下以1:1比率共培养4小时。HERV-K特异性CD8+T细胞从HERV-K免疫小鼠中磁性纯化，并以1:5的比例添加到共培养物中。细胞在37℃5％CO2下培养48小时。接着收集培养上清液用于通过Luminex进行细胞因子浓度分析。细胞因子水平量度包括(A)IL-6、(B)GM-CSF、(C)IL-2和(D)IFNγ。数据表示为平均值±SEM。
实施例19：与rMVA-HERV-K-4-1BBL一起施用通过受感染肿瘤细胞的直接抗原呈递 将抗原特异性CD8+T细胞导向至活化的效应T细胞[预测性实施例]
在重组Flt3L存在下培养来自C57BL/6小鼠的骨髓细胞14天后产生树突状细胞(DC)。B16.F10细胞以MOI 10用MVA-HERV-K、MVA-HERV-K-CD40L、MVA-HERV-K-4-1BBL或MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L感染并放置过夜。第二天，在37℃5％CO2下，收获感染的肿瘤细胞并且当指示时在DC存在下以1:1比率共培养4小时。同时，HERV-K特异性CD8+T细胞从HERV-K免疫小鼠中磁性纯化，并以1:5的比例添加到共培养物中。细胞在37℃5％CO2下培养48小时。然后对细胞染色并通过流式细胞仪进行分析。对(A)OT-I CD8+T细胞上T-bet的GMFI和(B)OT-I CD8+T细胞的CD44+颗粒酶B+IFNγ+TNFα+百分比进行细胞因子分析。数据显示为平均值±SEM。
实施例20：感染CD40L或4-1BBL编码的rMVA-HERV-K会在肿瘤细胞系和巨噬细胞中 诱导肿瘤细胞死亡[预测性实施例]
肿瘤细胞系B16.OVA(A和B)、MC38(C)和B16.F10(D)以指定MOI感染20小时。接着，通过流式细胞仪分析细胞的活力。来自(A)的样品中的血清HMGB1通过ELISA进行量化。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)以指定MOI感染20小时。接着通过流式细胞仪分析细胞的活力。数据呈现为平均值±SEM。
实施例21：编码4-1BBL的重组MVA的肿瘤内施用使得肿瘤中的Treg细胞减少和T细 胞耗竭减少[预测性实施例]
在肿瘤接种后第7天(黑色虚线)，将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并接受肿瘤内(i.t.)PBS或5×107TCID50的MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL。五天后，处死小鼠，收获脾脏和肿瘤并染色，以用荧光染料偶联抗体评估Treg浸润和T细胞耗竭。(A)CD45+肿瘤浸润白细胞中CD4+FoxP3+T细胞的百分比；PD-1(B)和Lag-3(C)对肿瘤浸润CD8 T细胞的几何平均荧光强度。数据呈现为平均值±SEM。
实施例22：免疫检查点阻断和肿瘤抗原特异性抗体与rMVA gp-70-4-1BBL的肿瘤 内施用协同作用[预测性实施例]
将携带B16.OVA肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝5/组)分组并在指示时(钩号)接受200μgIgG2a、抗TRP-1或抗PD-1。在肿瘤接种后第13天(黑色虚线)、第18天和第21天(灰色虚线)用PBS或5×107TCID50 MVA-gp70-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内免疫。定期测量肿瘤生长。
实施例23：4-1BBL佐剂化可以增加细胞因子/趋化因子MVA-BN骨架对IT免疫的反 应
为了评估重组MVA在肿瘤微环境(TME)内诱导炎症的潜力，在来自B16.OVA肿瘤的组织中分析了细胞因子和趋化因子。首先，将5×105个B16.OVA细胞皮下(s.c.)植入至C57BL/6小鼠体内。在第10天，用PBS或2×108TCID50 MVA-BN、MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL对小鼠进行肿瘤内(i.t.)免疫(n＝5至6只小鼠/组)。
注射后六小时，测量细胞因子和趋化因子的表达(图15)。用PBS处理的组织中的细胞因子/趋化因子表达代表了将针头插入肿瘤和盐水剪切压力所诱导的基础炎症特征。包括IL-6、IFN-α、IL-15和TNF-α在内的细胞因子以及例如CXCL1、CCL2和MIP2等趋化因子被上调(图15)。也检测到IL-25(也称为IL-17E)，其由NF-κβ活化诱导并刺激人体产生IL-8(Lee等人(2001)J.Biol.Chem.276：1660-64)。有趣的是，与注射MVA-BN的肿瘤或注射MVA-OVA的肿瘤病变相比，注射MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤表现出例如IL-6、IFN-α或IL-15/IL15Rα等促炎细胞因子的显著增加。
实施例24：MVA-OVA-4-1BBL增加了对肿瘤内(i.t.)免疫的细胞因子/趋化因子促 炎反应
如实施例23中所述地治疗小鼠和肿瘤。引人注目的是，包括IFN-γ和GM-CSF在内的几种促炎细胞因子仅在用MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内免疫后产生(图16)。通过使用MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL而不是单独使用MVA-BN或PBS进行肿瘤内(i.t.)免疫，增强了包括IL-18、CCL5、CCL3和IL-22在内的其它促炎细胞因子的产生。
总之，此数据表明，肿瘤内(i.t.)MVA免疫可诱导肿瘤微环境(TME)中的炎性细胞因子/趋化因子转变，从而增强炎症反应。与MVA或MVA-OVA相比，观察到用MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内免疫的效果增加。以这种方式，添加4-1BBL可以说“辅助”了重组MVA。
实施例25：肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL后TME和引流LN的定量和定性T细胞分析
为了更好地了解肿瘤内(i.t.)注射MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL后炎症诱导的细胞过程，进行肿瘤内(i.t.)注射后不同时间点的先天性和适应性免疫浸润的深入分析。向携带B16.OVA肿瘤的小鼠肿瘤内(i.t.)注射PBS或2×108TCID50MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL。在初免后1、3和7天处死小鼠。切除肿瘤和肿瘤引流淋巴结(TdLN)并用胶原酶和DNA酶处理，并通过流式细胞仪分析单细胞。分析免疫细胞群以确定它们的大小、增殖行为和功能状态。
结果显示，在肿瘤内(i.t.)免疫后7天，向B16.OVA肿瘤注射MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL诱导CD45+白细胞浸润到肿瘤中(图17，顶行，左侧直方图)。有趣的是，在i.t.(肿瘤内)免疫后3天，已经观察到TdLN中CD45+白细胞数量的增加(图17，顶行，右侧直方图)，尤其是在注射表达4-1BBL的MVA后。这种差异在肿瘤内(i.t.)免疫后七天在TdLN中进一步扩大，表明MVA免疫介导的抗肿瘤作用在免疫后第3天就在TdLN中开始。
基于疫苗接种的抗肿瘤疗法的一个方面是肿瘤特异性CD8+和CD4+T细胞的扩增和恢复活力以及它们在肿瘤中的富集。免疫一周后肿瘤中的CD4+T细胞和CD8+T细胞均增加(图17，分别为第二和第三行，左侧直方图)。CD4+T细胞截至第7天在肿瘤中增加以及在第3天开始在TdLN中增加，并在用MVA-OVA-4-1BBL进行i.t.免疫后第7天达到峰值。截至第7天，CD8+T细胞在很大程度上促成了肿瘤中CD45+细胞的增加。与在肿瘤(第7天)和dLN(第3天和第7天)中注射MVA-OVA相比，注射MVA-OVA-4-1BBL进一步扩大了CD8+T细胞群。
OVA特异性CD8+T细胞的定量显示在肿瘤内(i.t.)免疫后7天在肿瘤微环境内增加，特别是在用MVA-OVA-4-1BBL治疗的组中(图17，左下)。引人注目的是，TdLN中OVA特异性CD8+T细胞的扩增在免疫后第3天达到峰值，在MVA-OVA-4-1BBL治疗组中更高(图17，右下)。总之，这些数据表明，用MVA-OVA，尤其是MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内免疫会在肿瘤引流淋巴结治疗后3天开始增强适应性免疫反应的产生，使得截至第7天，肿瘤微环境中的抗原特异性CD8+T细胞显著增加。
实施例26：通过肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL诱导抗原特异性CD8+T细胞
肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL诱导的肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的OVA特异性CD8+T细胞发挥了高增殖能力。与PBS相比，MVA-OVA治疗后TdLN中表达Ki67(细胞增殖指标)的OVA特异性CD8+T细胞的百分比更高，并且在用MVA-OVA-4-1BBL免疫的小鼠中进一步增加(图18A)。此外，肿瘤中的OVA特异性CD8 T细胞在用MVA-OVA以及MVA-OVA-4-1BBL免疫后第7天下调耗竭标志物PD-1，表明功能恢复(图18B)。
Treg细胞(也称为“调节性T细胞”)是抗肿瘤免疫反应的有效抑制剂(参见例如Tanaka等人(2017)Cell Res.27：109-118)。肿瘤内注射MVA-OVA增加了肿瘤中的OVA特异性Teff/Treg比率(即“Teff”细胞或“效应T细胞”与Treg细胞的比率)，并在用MVA-OVA-4-1BBL治疗后第7天观察到进一步增加(图18C)。因此，用MVA-OVA且尤其用MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内治疗降低了肿瘤内Treg的频率，有利于CD8+T效应细胞，这有利于抗肿瘤免疫反应。
实施例27：肿瘤内注射MVA-OVA-4-1BBL后TME和引流LN的定量和定性NK细胞分析
用MVA-OVA进行i.t.免疫后的NK细胞定量显示在肿瘤内免疫后第1天肿瘤中NK细胞的减少(图19，顶行，左侧直方图)。当使用MVA-OVA-4-1BBL时，这些变化更加明显。同时，在用MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL进行免疫后3天和7天，肿瘤引流淋巴结(TdLN)中的NK细胞增加(图19，顶行，右侧直方图)，尽管MVA-OVA-4-1BBL诱导TdLN中NK细胞的最高增加。
CD69是早期NK细胞活化的标志物。病毒载体MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL均导致肿瘤和引流淋巴结(TdLN；图19，第二行)中活化标志物CD69的立即上调。此外，i.t.免疫导致在肿瘤和TdLN中的不同时间点在NK细胞中诱导颗粒酶B，这表明细胞毒性NK细胞功能增强(图19，第三行)。
最后，分析了NK细胞通过Ki67表达的增殖能力。在第3天，NK细胞上的Ki67表达在用MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL肿瘤内治疗的小鼠的肿瘤和TdLN中显著增加(图19，最后一行)。
这些结果表明，与MVA-OVA相比，4-1BBL辅助的MVA-OVA(即，MVA-OVA-4-1BBL)进一步增加了肿瘤内注射后NK细胞上CD69、颗粒酶B和Ki67表面标志物的表达。这些实验还揭示了引流淋巴结(TdLN)在肿瘤内免疫疗法后增强抗肿瘤T细胞和NK细胞反应中的重要作用。
虽然本发明不受任何特定操作机制的约束，但第3天TdLN中T细胞的扩增和第7天肿瘤中T细胞的延迟浸润(参见图17)说明了这样一种情况：肿瘤特异性T细胞在TdLN中启动和扩增，且随后迁移到肿瘤以杀死肿瘤细胞。病毒载体的肿瘤内注射也可能导致直接在TdLN中活化NK细胞，从而诱导进一步的DC活化。
实施例28：CD8 T细胞在肿瘤内MVA癌症疗法中的作用
肿瘤和TdLN中T细胞反应的分析(例如，在图17中)显示肿瘤内(i.t.)治疗后肿瘤特异性T细胞在两个部位的扩增。进行实验以检查T细胞对MVA-OVA-4-1BBL介导的抗肿瘤作用的贡献。在这些实验中，C57BL/6小鼠被注射B16.OVA黑色素瘤细胞(5×105个细胞)，并在几次治疗之一后监测肿瘤生长。治疗包括在存在或不存在100μgCD8-T细胞耗竭抗体(“αCD8”，克隆2.43)或同种型对照抗体的情况下肿瘤内(i.t.)注射PBS或MVA-OVA-4-1BBL。当肿瘤直径达到5mm时，进行MVA-OVA-4-1BBL注射(i.t.)，并在一周内重复两次。在第一次注射MVA-OVA-4-BBL前一天，向小鼠i.p.注射抗CD8或IgG2b抗体，并在接下来的两周内重复此治疗四次。图20中呈现的数据表明，CD8 T细胞对于有效的MVA肿瘤疗法至关重要。总之，这些数据表明MVA诱导的肿瘤和TdLN中肿瘤特异性CD8 T细胞的活化和扩增是控制肿瘤生长的重要事件。
实施例29：MVA-OVA和MVA-OVA-4-1BBL介导的抗肿瘤作用的Batf3+DC依赖性
为了阐明有助于MVA-OVA-4-1BBL诱导的抗肿瘤免疫反应的潜在细胞和分子实体，我们研究了各种免疫细胞参与者的作用。树突状细胞(DC)能够有效地为适应性免疫系统的细胞采样和呈递抗原和共刺激信号，被认为是抗肿瘤免疫的关键因素。多种DC亚型与活化针对肿瘤的有效免疫反应有关，包括CD8α+DC(也称为“cDC1”)。此DC亚群具有在免疫反应过程中交叉呈递抗原的独特能力，并且CD8α+DC是响应感染(Hochrein等人(2001)J.Immunol.166：5448-55；Martínez-López等人(2014)Eur.J.Immunol.45：119-29)和癌症(Broz等人(2014)Cancer Cell 26：638-52)的IL-12的主要生产者。CD8α+DC也通过交叉呈递肿瘤相关抗原而有效诱导抗肿瘤CD8+T细胞(Sánchez-Paulete等人，(2015)CancerDiscovery 6：71-79；Salmon等人(2016)Immunity 44：924-38)。CD8α+DC发育关键依赖于转录因子Batf3(Hildner等人(2008)Science 322：1097-1100)。
为了评估此DC亚群对肿瘤内MVA癌症疗法的重要性，我们使用了野生型和Batf3缺陷型(Batf3-/-)携带B16.OVA肿瘤的小鼠。图21A显示B16.OVA肿瘤在不存在交叉呈递DC(Batf3-/-)的情况下生长得更快，这表明此抗原呈递细胞(APC)亚群在诱导肿瘤定向免疫反应中的重要作用。与先前的实验一致，在野生型小鼠中，MVA-OVA的肿瘤内注射导致肿瘤生长延迟，并且在一种情况下导致肿瘤完全清除。当向小鼠注射MVA-OVA-4-1BBL后，这种效果得到了改善；用MVA-OVA-4-1BBL治疗的5只小鼠中有3只排斥了肿瘤(图21A)。有趣的是，在没有交叉呈递DC(Batf3-/-)的情况下，与WT组相比，肿瘤内MVA免疫疗法完全没有受损(图21A)。然而，Batf3-DC似乎参与了4-1BBL诱导的抗肿瘤反应(图21A，底部)。
第一次免疫后11天外周血中CD8+T淋巴细胞群的流式细胞仪分析(图21B)显示，与野生型对应物相比，在MVA-OVA-4-1BBL免疫的Batf3-/-肿瘤携带者中，OVA特异性CD8+T细胞频率仅轻微降低。虽然本发明不受限或依赖于任何特定操作机制，但这些数据表明，Batf3依赖性DC对于用MVA进行的肿瘤内癌症疗法的作用多余。
实施例30：NK细胞在MVA-OVA-4-1BBL肿瘤内施用中的作用
已知NK细胞表达4-1BB，且4-1BB在NK细胞上的连接已被证明会导致这些细胞的增殖和细胞毒性增加(Muntasell等人(2017)Curr.Opin.Immunol.45：73-81)。在早期的实验中(参见图19)，我们发现MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内注射强烈上调了NK细胞上的活化标志物CD69以及细胞毒性标志物颗粒酶B，并伴随着增强的增殖。
为了探索NK细胞在4-1BBL诱导的抗肿瘤免疫反应中的作用，我们使用了IL15Rα-/-小鼠。IL-15受体α亚基(IL-15Rα)介导IL-15的高亲和力结合，IL-15是一种多效性细胞因子，已被证明对NK细胞的发育至关重要(Lodolce等人(1998)Immunity 9：669-76)。产生了野生型和IL15Rα缺陷型(IL15Rα-/-)携带B16.OVA肿瘤的小鼠并用MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL进行肿瘤内免疫。无论是否存在IL-15Rα，用MVA-OVA治疗的小鼠均显示出类似的治疗功效(图22A)。有趣的是，在使用MVA-OVA-4-1BBL时在野生型小鼠(其中5只小鼠中有3只排斥肿瘤)中观察到的益处在用MVA-OVA-4-1BBL治疗的IL15Rα缺陷型携带肿瘤的小鼠(其中5只小鼠中有1只排斥肿瘤；参见图22A)中完全消失。这些结果也反映在肿瘤接种后小鼠的存活率中(图22B)。
已知IL15Rα的缺乏不仅影响NK细胞的发育，而且减弱T细胞稳态和LN迁移，并选择性地减少小鼠中的CD8记忆T细胞(Lodolce等人(1998)Immunity 9：669-76)。因此，我们还研究了T细胞对这些治疗的反应。与我们之前的数据一致，我们观察到在野生型动物中进行MVA-OVA肿瘤内(i.t.)免疫后OVA特异性CD8 T细胞的诱导，这在MVA-OVA-4-1BBL的情况下进一步增加(图22C)。然而，IL15Rα-/-小鼠中的OVA特异性T细胞反应与野生型小鼠中发现的反应类似。
虽然本发明不受任何特定机制或操作模式束缚，但这些发现表明，IL15Rα-/-携带肿瘤的小鼠可增强肿瘤特异性T细胞反应，且因此支持4-1BBL增强的NK细胞活化和功能有助于肿瘤内MVA-OVA-4-1BBL治疗的疗效的观点。
实施例31：响应MVA-OVA-4-1BBL肿瘤内免疫的NK细胞依赖性细胞因子/趋化因子 谱
为了鉴定由NK细胞上的4-1BBL–4-1BB相互作用选择性诱导的细胞因子，对来自携带B16.OVA肿瘤的野生型小鼠或用PBS或5×107TCID50 MVA-OVA或MVA-OVA-4-1BBL肿瘤内治疗的IL15Rα-/-小鼠的肿瘤组织中的细胞因子和趋化因子进行了分析。
先前的实验表明，在肿瘤内注射重组MVA后六小时，大量细胞因子和趋化因子增加(图15和16)。在这些实验中，与注射MVA-OVA相比，注射MVA-OVA-4-1BBL的肿瘤展现促炎细胞因子或趋化因子(例如已知由NK细胞在4-1BBL刺激后产生的IFN-γ、CCL3和CCL5)的显著增加(图23)。这种4-1BBL诱导的增加在IL15Rα-/-小鼠中被完全消除，表明rMVA-OVA-4-1BBL的肿瘤内注射在注射后6小时在肿瘤微环境中诱导一种发源于NK细胞的独特细胞因子和趋化因子谱。
实施例32：与MVA-gp70-4-1BBL相比，用MVA-gp70-CD40L进行肿瘤内免疫的抗肿瘤 功效
Gp70是在许多同基因肿瘤模型(B16.F10、CT26、MC38、4T1、EL4等人)中表达的肿瘤自身抗原，所有肿瘤模型都在基质和免疫细胞组成方面代表不同的肿瘤微环境(TME)。此处，我们测试了编码肿瘤抗原gp70的MVA外加CD40L或4-1BBL在携带B16.F10肿瘤的小鼠的肿瘤内免疫中的效力。
B16.F10黑色素瘤细胞被皮下注射到C57BL/6小鼠中。当肿瘤大小达到约50mm3时，用PBS、MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-4-1BBL或MVA-CD40L对小鼠进行肿瘤内免疫；结果如图24中所示。
用MVA-gp70免疫诱导瞬时且温和的肿瘤生长控制。当病毒表达CD40L时，这种抗肿瘤作用可能会增强。然而，MVA-gp70-4-1BBL的肿瘤内免疫产生最强的治疗效果，导致治疗的5只动物中有2只完全清除肿瘤(图24A)。
引人注目的是，在用MVA-gp70-4-1BBL治疗后肿瘤治愈的小鼠在肿瘤所在的部位表现出色素沉着丧失(图24B)。这种色素脱失是自身免疫病况白癜风的表现，并且是自身反应性T细胞破坏黑素细胞的结果。这种对黑素细胞的破坏表明重组MVA对免疫系统的活化不限于MVA编码的TAA(此处为gp70)。相反，这种针对其它抗原的免疫系统的扩大活化(一种称为表位扩散的现象)导致更广泛的免疫反应，可能提供更好的治疗结果。
为了评估免疫诱导的抗原特异性T细胞反应，在第一次免疫后11天抽取血液并分析抗原特异性T细胞的存在。用MVA-gp70和MVA-gp70-CD40L以及用MVA-CD40L和MVA-4-1BBL进行免疫会诱导可测量的p15E特异性T细胞反应，范围在1-2％之间(图24C)。重要的是，在接受MVA-gp70-4-1BBL的小鼠中，这种反应急剧增加(>5倍)。这种对p15E肽再刺激的抗原特异性T细胞反应与不同治疗组的疗效相关。
实施例33：MVA-gp70-4-1BBL-CD40L肿瘤内免疫的抗肿瘤功效
产生了表达肿瘤抗原gp70以及4-1BBL和CD40L的重组MVA，并在B16黑色素瘤模型中进行了肿瘤内测试。B16.F10黑色素瘤细胞被皮下注射到C57BL/6小鼠中。当肿瘤达到约50mm3时，用PBS、MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-gp70-4-1BBL-CD40L或不表达gp70的对应MVA构建体对小鼠进行肿瘤内免疫。
用MVA-gp70免疫诱导瞬时和显著的肿瘤生长控制(图25A)。当病毒表达CD40L或4-1BBL时，这种抗肿瘤作用可能会增强。然而，用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L进行肿瘤内免疫导致最强的治疗效果--5只治疗动物中有4只完全清除肿瘤(图25A)。引人注目的是，用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L治疗的四只治愈小鼠中有三只表现出肿瘤曾经存在的位置的色素沉着丧失，这表明自身免疫病况白癜风，如上文实施例32中所述。
此外，在第一次免疫后11天，在血液中测量了gp70特异性T细胞反应。用MVA-gp70和MVA-gp70-CD40L以及用MVA-CD40L和MVA-4-1BBL进行免疫会诱导可测量的肿瘤特异性T细胞反应，范围在1-2％之间；这种反应在接受MVA-gp70-4-1BBL的小鼠中显著增加(>5倍)(图25B)。
综上所述，在B16.F10黑色素瘤模型中，当MVA-gp70辅以CD40L或4-1BBL时，可以增强抗肿瘤功效，但当4-1BBL和CD40L在MVA-gp70-4-1BBL-CD40L中一起表达时，观察到更强的效果。
实施例34：CT26.WT肿瘤中使用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L的肿瘤内免疫疗法
然后使用CT26结肠癌模型测试构建体，所述模型被描述为富含T细胞和骨髓细胞并被认为具有免疫原性(参见例如Mosely等人(2016)Cancer Immunol.Res.5：29-41)。向Balb/c小鼠皮下(s.c.)注射CT26.wt结肠癌细胞。当肿瘤达到约60mm3时，用PBS、MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L、MVA-gp70-4-1BBL-CD40L或MVA-4-1BBL-CD40L对小鼠进行肿瘤内免疫。
用MVA-gp70进行i.t.免疫诱导瞬时和显著的肿瘤生长控制。当MVA表达CD40L时，这种抗肿瘤作用并未增强，但引人注目的是，用MVA-gp70-4-1BBL进行免疫产生最强的治疗效果，使得所有治疗动物中的肿瘤完全清除(图26A)。然而，用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L治疗并没有产生更好的疗效。值得注意的是，仅含有共刺激分子但不含gp70的病毒也会导致显著的肿瘤生长延迟，但无法与MVA-gp70-4-1BBL竞争。这些发现反映在治疗小鼠的总体存活率中(图26B)。
在用MVA-gp70和MVA-gp70-CD40L治疗的动物的血液中很容易检测到针对H2-LdCD8+T细胞表位AH-1的Gp70特异性T细胞反应(图26C)。这种反应在接受MVA-gp70-4-1BBL的小鼠中显著增加(>10倍)，这与图26A和26B中所示的疗效相关。用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L治疗也增强了血液中的AH-1特异性T细胞反应(图26C)。
实施例35：对携带B16.F10肿瘤的小鼠IT注射MVA-gp70-4-1BBL-CD40L后肿瘤微环 境和肿瘤引流LN的综合分析
上面提供的数据显示，用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L对携带B16.F10肿瘤的小鼠进行肿瘤内治疗导致80％的治疗小鼠出现肿瘤排斥(见图26)。为了研究此肿瘤模型中的肿瘤微环境(TME)和TdLN，携带B16.F10肿瘤的小鼠肿瘤内(i.t.)接受PBS或5×107TCID50的MVA-gp70、MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L或MVA-gp70-4-1BBL-CD40L。在初免后3天处死小鼠。第3天是根据OVA系统中的先前实验选择的，所述实验显示了在所述时间点免疫系统的先天和适应性成分的变化(参见图17)。切除肿瘤和TdLN并用胶原酶/DNA酶消化，以便使用流式细胞仪分析单细胞。评估了免疫细胞群的丰度以及其增殖行为和功能状态。
肿瘤内注射4-1BBL和CD40L辅助的MVA在第3天的时间点没有赋予肿瘤中CD8 T细胞或p15E特异性T细胞数量方面的优势，如通过五聚体染色所确定。然而，在TdLN中，MVA-gp70和MVA-gp70-CD40L产生了CD8 T细胞的扩增，而添加4-1BBL产生了更大的效果(图27，右上)。添加4-1BBL所产生的增加对于TdLN中的p15E特异性CD8 T细胞更为明显，其中用MVA-gp70-4-1BBL或MVA-gp70-4-1BBL-CD40L进行i.t.免疫增加了肿瘤特异性CD8 T细胞(图27，右中)。p15E特异性CD8 T细胞的数量也与那些细胞的增殖状态相关；例如，将4-1BBL连同gp70和任选的CD40L添加到MVA中在TdLN中诱导了最多数量的Ki67+gp70-p15E CD8 T细胞(图27，右下)。
这些数据表明，用MVA-gp70进行肿瘤内(i.t.)免疫增强了在肿瘤和肿瘤引流淋巴结治疗后第3天产生的适应性免疫反应的产生，而辅以4-1BBL或4-1BBL加CD40L特异性增加了TdLN中的p15E特异性CD8 T细胞反应。
实施例36：在肿瘤内注射MVA后在肿瘤和TdLN中的NK细胞诱导
MVA-OVA的肿瘤内(i.t.)注射分别在第1天和第3天产生NK细胞的活化和扩增(图19)。然后，我们在注射不同的MVA构建体后第3天检查了NK细胞浸润、活化和扩增。用重组MVA进行i.t.免疫后对NK细胞的定量显示浸润肿瘤(图28，左上)和TdLN(图28，右上)的NK细胞增加。当MVA编码4-1BBL(例如MVA-gp70-4-1BBL和MVA-gp70-4-1BBL-CD40L)时，浸润增加。MVA-gp70的肿瘤内(i.t.)注射诱导肿瘤(参见图28，左中)和TdLN(图28，右中)中NK细胞(Ki67+)的增殖，并辅以4-1BBL或4-1BBL和CD40L在TdLN中增强了这种效果。
颗粒酶B是NK细胞的细胞毒性的标志物(参见例如Ida等人.(2005)Mod.Rheumatol.15：315-22)。在肿瘤内注射重组MVA后，在肿瘤和TdLN中诱导了颗粒酶B+NK细胞(图28，左下)。同样，将4-1BBL或4-1BBL-CD40L添加到重组MVA中轻度增加了TdLN中细胞毒性NK细胞的数量(图28，右下)。
总之，这些数据突出了MVA编码的4-1BBL-CD40L在肿瘤内(i.t.)免疫疗法后在NK细胞和TAA特异性T细胞的扩增和功能中的重要作用。因此，用编码gp70和4-1BBL或gp70、4-1BBL和CD40L的重组MVA进行肿瘤内治疗可增强T细胞对内源性逆转录病毒自身抗原(如gp70)的反应。
实施例37：携带CT26.WT肿瘤的小鼠中使用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L的静脉内免疫 疗法
上文论述的实验表明，编码肿瘤抗原gp70的新型MVA构建体与共刺激分子4-1BBL和CD40L一起在肿瘤内施加时非常有效(图25和26)。另外，Lauterbach等人((2013)Front.Immunol.4：251)发现MVA编码的CD40L在静脉内施用时增强先天性和适应性免疫反应。此处，我们询问了用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L进行静脉内(i.v.)免疫是否也可以提供肿瘤生长控制。
将CT26.WT结肠癌细胞皮下注射到Balb/c小鼠中。当肿瘤达到约60mm3时，用PBS或MVA-Gp70、MVA-Gp70-4-1BBL、MVA-Gp70-CD40L、MVA-gp70-4-1BBL-CD40L和MVA-4-1BBL-CD40L(其缺乏gp70)对小鼠进行静脉内免疫。用MVA-gp70进行i.v.免疫使得2/5只动物的肿瘤被清除(图29A)。用含有4-1BBL或CD40L的表达gp70的病毒治疗的小鼠表现出显著改善的抗肿瘤反应，分别使3/5和4/5只小鼠治愈。重要的是，用MVA-gp70-4-1BBL-CD40L进行i.v.治疗使得所有治疗小鼠中的肿瘤生长控制延长，其中3/5只小鼠排斥肿瘤(图29A)。值得注意的是，仅含共刺激分子但不含gp70的重组MVA也会导致显著的肿瘤生长延迟，但不会导致与在MVA-gp70-4-1BBL、MVA-gp70-CD40L或MVA-gp70-4-1BBL-CD40L的情况下所观察相同的肿瘤排斥反应(图29A)。这些发现反映在治疗小鼠的总体存活率中(图29B)。
通过对PBL的肽再刺激分析血液中肿瘤定向的CD8 T细胞反应揭示了所有MVA治疗组中AH1特异性CD8 T细胞的显著诱导，由此在CD40L存在下(即MVA-gp70-CD40L和MVA-gp70-4-1BBL-CD40L)这可能进一步增加(图29C)。
实施例38：包括HERV-K抗原的重组MVA
设计了一种基于MVA的载体(“MVA-mBN489”，也称为“MVA-HERV-Prame-FOLR1-4-1-BBL-CD40L”)，其包括TAA，所述TAA为人内源性逆转录病毒K超家族蛋白质(HERV-K)，特别是ERV-K-env和ERV-K-gag。MVA还被设计以编码人类FOLR1和PRAME，并表达h4-1BBL和hCD40L。
一种类似的基于MVA的载体称为“MVA-HERV-Prame-FOLR1-4-1-BBL”，被设计成表达TAA ERV-K-env和ERV-K-gag以及人类FOLR1和PRAME，并表达h4-1BBL。具体地，载体“MVA-BN-4IT”(“MVA-mBN494”或“MVA-HERV-FOLR1-PRAME-h4-1-BBL”)在图30A中示意性地示出。编码包膜(env)和组特异性抗原(gag)蛋白的HERV-K基因通常在健康人体组织中处于休眠状态，但在许多肿瘤中被活化。FOLR1和PRAME是在乳腺癌和卵巢癌细胞中特异性上调的基因。共刺激分子4-1-BBL的额外表达旨在增强针对TAA的免疫反应。
另一种基于MVA的载体称为“MVA-HERV-Prame-FOLR-CD40L”，被设计成表达TAAERV-K-env和ERV-K-gag以及人类FOLR1和PRAME，并表达hCD40L。这些构建体中的每一个都可用于本发明的方法中。
示例性序列是本领域中已知的并且也在所提供的序列表中列出。任何序列都可以用于本发明的组合物和方法中，只要它为相关MVA提供必要的功能。
对于上述ERV-K env和gag序列，由至少10个代表性序列产生氨基酸共有序列，且潜在的免疫抑制域因突变而失活并部分替换为免疫显性T细胞表位HERV-K-mel，如下所示。合适的序列列于SEQ ID NO:5(ERV-K-gag合成蛋白共有序列)；SEQ ID NO:6(ERV-K-gag合成核苷酸序列)；SEQ ID NO:7(ERV-K-env/MEL合成蛋白序列)；和SEQ ID NO:8(ERV-K-env/MEL核苷酸序列)中。
Figure BDA0003693522260000951
修饰的ERVK-env共有氨基酸序列(上文)：
潜在的免疫抑制域因突变而失活。引入的突变用免疫显性T细胞表位HERVK-mel取代了大部分免疫抑制域。
对于这些MVA中的一些，hFOLR1和PRAME被设计成作为融合蛋白产生。FOLR1(叶酸受体α)属于叶酸受体家族。它对叶酸和其衍生物具有高亲和力，并作为膜蛋白在细胞表面上分泌或表达。跨膜蛋白通过GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚锚定在质膜上，所述锚很可能通过蛋白质C端区域中的丝氨酸(Ser)残基附着在内质网(ER)中。为了避免用GPI锚对FOLR1进行修饰和在ER中完全加工hFOLR1-hPRAME融合蛋白，删除了从aa 234到257的C端区域(包括Ser残基)。
PRAME(黑色素瘤优先表达抗原)是一种转录调节蛋白。它最初被描述为人类黑色素瘤中的抗原，可触发自体细胞毒性T细胞介导的免疫反应，并在多种实体和血液癌症中表达。PRAME通过与视黄酸受体结合来抑制视黄酸信号传导，且从而可能为癌细胞提供生长优势。PRAME的功能需要核定位，因此PRAME中的潜在核定位信号(NLS)通过hFOLR1-hPRAME融合蛋白中的靶向突变进行修饰。
因此，对于hFOLR1-hPRAME融合蛋白的氨基酸序列，FOLR1通过删除C端GPI锚信号进行修饰，而在PRAME中，两个潜在的核定位信号因氨基酸取代而失活。在这种融合蛋白中，hFOLR1的N末端信号序列应导致ER靶向和融合蛋白的不完全加工，以作为避免PRAME核定位的额外保障。
人FOLR1和人PRAME的蛋白质序列分别基于NCBI RefSeq NP_000793.1和NP_001278644.1。除上述修饰外，融合蛋白的核苷酸序还列针对人类密码子使用进行了优化，且去除了多核苷酸伸长段、重复元件和负顺式作用元件，且核苷酸序列在SEQ ID NO:10(“hFOLR1Δ_hPRAMEΔ融合”核苷酸序列)中列出，而融合蛋白序列在SEQ ID NO:9中列出。
Figure BDA0003693522260000961
Figure BDA0003693522260000971
hFOLR1-hPRAME融合蛋白的序列(上文)：
hFOLR1-hPRAME融合蛋白(修饰的人FOLR1(N末端部分)和PRAME(C端部分)的融合物)的氨基酸序列。FOLR1通过删除C端GPI锚信号(删除线字母)进行了修饰。在PRAME(带下划线的字母)中，最初的甲硫氨酸被删除，且两个潜在的核定位信号因氨基酸取代(粗体，带下划线的字母)而灭活。
此MVA中使用的膜结合人4-1BBL的蛋白质序列显示与NCBI RefSeq NP_003802.1具有100％同一性，且使用的膜结合人CD40L的蛋白质序列显示与NCBI RefSeq NP_000065.1具有100％同一性。对于4-1BBL和CD40L，核苷酸序列均针对人类密码子使用进行了优化，并且去除了多核苷酸伸长段、重复元件和负顺式作用元件。
来自NCBI RefSeq NP_000065.1的hCD40L氨基酸序列在SEQ ID NO:1中列出，而hCD40L的核苷酸序列在SEQ ID NO:2中所示。来自NCBI RefSeq NP_003802.1的h4-1BBL氨基酸序列在SEQ ID NO:3中列出，而h4-1BBL的核苷酸序列在SEQ ID NO:4中列出。
每个编码区都处于不同启动子的控制下，除了ERV-K-gag和h4-1BBL均处于Pr1328启动子的控制下。Pr1328启动子(长度为100bp)是痘苗病毒启动子PrB2R的精确同源物。它驱动强烈的即刻早期表达以及较低水平的晚期表达。在重组MVA-mBN489中，Pr13.5长启动子驱动ERVK-env/MEL的表达。此启动子破坏了014L/13.5L之间124bp的基因间区域，驱动天然MVA13.5L基因的表达，并表现出由两个早期启动子核心序列引起的非常强的早期表达(参见Wennier等人(2013)PLoS One 8(8)：e73511)。此处用于驱动hCD40L表达的MVA1-40k启动子最初是在1986年从痘苗病毒Wyeth Hind III H区中分离出来的161bp片段。它破坏了094L/095R基因间区域内158bp的痘苗病毒Wyeth和MVA基因组，驱动晚期基因转录因子VLTF-4。此处用于驱动hFOLR1-hPRAME融合蛋白表达的启动子PrH5m是痘苗病毒H5基因启动子的修饰形式。它由强大的早期和晚期元件组成，使得在重组MVA感染的早期和晚期内都表达(参见Wyatt等人(1996)Vaccine 14：1451-58)。
基于MVA-mBN494(见上文)，还设计了另一个载体以包含ERVK-env/MEL中的修饰。所得载体被称为“MVA-mBN502”并且在图31C中示意性地示出。除了修饰的ERVK-env/MEL，MVA-mBN502还编码ERVK-gag、hFOLR1-hPRAME融合蛋白以及h4-1BBL
天然地，HERVK-env由一个在翻译后被裂解的信号肽、一个表面(SU)和一个跨膜单元(TM)组成。通过细胞蛋白酶实现裂解成两个结构域。RSKR裂解基序对于将全长90kDa蛋白质裂解成SU(约60kDa)和TM(约40kDa)结构域是必需并且足够的。如上文针对MVA-mBN494的制备所述，产生了源自至少十个代表性序列的env氨基酸共有序列，并且TM中潜在的免疫抑制域因突变而失活。引入的突变用免疫显性T细胞表位HERV-K-mel取代了大部分免疫抑制域。这种转基因(用于MVA-mBN494)被称为ERVK-env/MEL(图31A)。
与MVA-mBN494相比，ERVK-env/MEL中的TM结构域在MVA-mBN502中缺失。此ERVK-env/MEL变体被命名为“ERVK-env/MEL_03”，且由整个SU结构域组成，除了缺失RSKR弗林蛋白酶裂解位点。MEL肽插入在C端，然后是TM结构域的6个氨基酸(不包括具有强疏水性的融合肽序列)。另外，通过添加源自人PDGF(血小板源性生长因子)受体的膜锚，这种修饰的ERVK-env/MEL靶向质膜。此膜锚通过柔性的含甘氨酸接头连接到SU结构域(图31B)。所得ERVK-env/MEL变体，即ERVK-env/MEL_03包含于MVA-mBN502中(图31C)。变体的合适序列在SEQ ID NO:11(ERV-K-env/MEL_03合成蛋白质序列)和SEQ ID NO:12(ERV-K-env/MEL_03核苷酸序列)中列出。
实施例39：MVA-HERV-FOLR1-PRAME-h4-1-BBL(MVA-BN-4IT)的生物活性
研究了用MVA-BN-4IT(即，MVA-HERV-FOLR1-PRAME-h4-1-BBL；也参见上面的实施例38)感染是否会导致HLA分子将疫苗衍生的肿瘤抗原呈递于人类细胞上。为此，对抗原呈递细胞上的HLA-ABC肽复合物进行免疫沉淀，并分析哪些HLA结合的肽可以通过质谱进行鉴定。
首先，人类单核细胞系THP-1分化成巨噬细胞(Daigneault等人PLoS One，2010)，其发挥抗原呈递能力，因为抗原可以负载到HLA I类(Nyambura L.等人J.Immunol 2016)。事实上，THP-1细胞表达HLA-A*0201+，它是美国和欧洲最常见的单倍型之一(大约30％的人口)。除HLA-A*02:01:01G外，据报道THP-1细胞表达HLA-B*15和HLA-C*03(Battle R.等人，Int.J.of Cancer)。此处，将8×105/ml THP-1细胞在200ng/ml PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)存在下培养3天，然后更换培养基并在不存在PMA的情况下再培养细胞2天。在第5天，细胞用InfU(感染单位)为4的MVA-BN-4IT感染12小时。如图30B中所示，在用MVA-BN-4IT(图30B中的“mBN494”)感染THP-1细胞后，HERVK-env/MEL、HERVK-gag和融合蛋白FOLR1-PRAME表达。相反，抗原不在未感染的THP-1细胞(图30B中的“ctr”)中内源性表达。
接下来，进行了“ProPresent”HLA-ABC配体分析(ProImmune)。在MVA-BN-4IT感染的细胞中，鉴定出四种肿瘤抗原衍生肽：HERV-K env肽ILTEVLKGV、HERV-K gag肽YLSFIKILL以及PRAME肽ALQSLLQHL和SLLQHLIGL。两种鉴定的PRAME肽在很大程度上是重叠的，并且很可能共享一个共同的核心表位。预计这两种肽都与HLA-A*02:01非常强烈地结合，由此ALQSLLQHL具有与HLA-B*15几乎相似的结合等级。值得注意的是，PRAME肽SLLQHLIGL已被描述为人类免疫原性HLA-A*0201呈递的细胞毒性T淋巴细胞表位(Kessler JH.等人，J ExpMed.，2001)。总之，数据表明由MVA-BN-4IT表达的抗原可以加载到感染细胞的HLA中。
此外，已测试MVA-BN-4IT以与其受体4-1-BB结合的功能形式表达4-1-BBL的能力。为此，使用了商业试剂盒(“4-1BB Bioassay”，Promega)。所述分析由表达h4-1-BB的基因工程化Jurkat T细胞系和由可响应4-1-BB配体刺激的响应元件(RE)驱动的荧光素酶报告基因组成。当h4-1-BB被h4-1-BBL刺激时，RE会活化细胞内的细胞荧光素酶产生。在细胞裂解和添加“Bio-Glo”试剂(Promega)后，使用光度计测量发光并量化。简而言之，将HeLa细胞铺板(1×106)并各自用图30C中所示的基于MVA的构建体感染(TCID50＝2)，培养过夜(37℃，5％CO2)，且接着与Jurkat-h4-1-BB细胞共培养(HeLa:Jurkat的比率＝4:1)6小时。将与Fc交联的带His标签的h4-1BBL用作参考(阳性对照)，并将与1μg/ml交联的h4-1BBl一起培养的Jurkat-h4-1BB细胞的荧光素酶表达设置为1(图30C，虚线)。MVA-BN(即不编码h4-1-BBL)用作主干对照。如图30C中所示，用基于MVA的表达h4-1-BBL的载体感染的HeLa细胞诱导的荧光素酶产生(通过共培养的Jurkat-h4-1-BB细胞)比参考高6倍以上。值得注意的是，由MVA-BN-4IT介导的荧光素酶产生甚至高于由其它两种表达h4-1-BBL的MVA载体介导的荧光素酶产生。因此，MVA-mBN494表达有效结合至其4-1BB受体的功能性h4-1-BBL。
实施例40：用编码brachyury抗原的MVA进行肿瘤内免疫
高度减毒、非复制的痘苗病毒MVA-BN-Brachyury被设计为由四种人类转基因组成，以引发对多种癌症的特异性和强大的免疫反应。所述载体共表达brachyury人TAA和三种人共刺激分子：B7.1(也称为CD80)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1，也称为CD54)和白细胞功能相关抗原-3(LFA-3，也称为CD58)。三种共刺激分子(或共刺激分子三联体，TRICOMTM)被包括在内，以最大限度地提高对brachyury人TAA的免疫反应。
Brachyury是T-box家族中的转录因子，并且是EMT的驱动因子，EMT是与癌症进展相关的过程。与正常组织相比，它在癌细胞中过表达，并且与癌细胞对几种治疗方式的耐受性和转移潜力有关。已知表达brachyury的癌症包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脊索瘤、前列腺癌、结肠直肠癌和胰腺癌。
进行了体外和临床研究以证明编码brachyury的MVA的安全性和潜在疗效；参见例如Hamilton等人(2013)Oncotarget 4：1777-90(“Immunological targeting of tumorcells undergoing an epithelial-mesenchymal transition via a recombinantbrachyury-yeast vaccine”)；Heery等人(2015a)J.Immunother.Cancer 3：132(“Phase I，dose escalation，clinical trial of MVA-brachyury-TRICOM vaccine demonstratingsafety and brachyury-specific T cell responses”)；Heery等人(2015b)CancerImmunol.Res.3：1248-56(“Phase I trial of a yeast-based therapeutic cancervaccine(GI-6301)targeting the transcription factor brachyury”))
进行了符合GLP的重复剂量毒性研究，以评估MVA-BN-Brachyury(MVA-mBN240B)在NHP(食蟹猴)中的任何潜在毒性，以支持在1期临床开发中使用静脉内途径。毒性研究包括评估MVA-BN-Brachyury在NHP中的空间和时间分布的生物分布部分。
MVA-BN-Brachyury用于III期试验，其中癌症患者接受MVA的肿瘤内注射治疗，任选地与另一种治疗，例如放射和/或检查点抑制剂相结合。
显然，可以改变或修改本文所述的方法或组合物的精确细节而不背离所述发明的精神。我们要求所有落入以下权利要求书的范围和精神内的此类修改和变化。
序列表
如37C.F.R.1.822中所定义，随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用标准字母缩写显示核苷酸碱基，且使用单字母代码或三字母代码显示氨基酸。仅显示每个核酸序列的一个股，但互补股应理解为包括在对显示股的任何引用中。
序列表中的序列：
SEQ ID NO:1：来自NCBI RefSeq NP_000065.1的hCD40L氨基酸序列。(261个氨基酸)
SEQ ID NO:2：来自NCBI RefSeq NP_000065.1的hCD40L(792个核苷酸)
SEQ ID NO:3：来自NCBI RefSeq NP_003802.1的h4-1BBL(254个氨基酸)
SEQ ID NO:4：来自NCBI RefSeq NP_003802.1的h4-1BBL
SEQ ID NO:5：ERV-K-gag(666个氨基酸)合成共有序列
SEQ ID NO:6：ERV-K-gag；nt序列
SEQ ID NO:7：ERV-K-env/MEL(699个氨基酸)合成序列
SEQ ID NO:8：ERV-K-env/MEL nt序列
SEQ ID NO:9：hFOLR1Δ_hPRAMEΔ融合物(741个氨基酸)
SEQ ID NO:10：hFOLR1Δ_hPRAMEΔ融合物(741个氨基酸)nt序列
SEQ ID NO:11：ERV-K-env/MEL_03(517个氨基酸)合成序列
SEQ ID NO:12：ERV-K-env/MEL_03nt序列
SEQ ID NO:1
来自NCBI RefSeq NP_000065.1的hCD40L。(261个氨基酸)
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
SEQ ID NO:2
来自NCBI RefSeq NP_000065.1的hCD40L。(792个核苷酸)
nt序列：
atgatcgagacatacaaccagacaagccctagaagcgccgccacaggactgcctatcagcatgaagatcttcatgtacctgctgaccgtgttcctgatcacccagatgatcggcagcgccctgtttgccgtgtacctgcacagacggctggacaagatcgaggacgagagaaacctgcacgaggacttcgtgttcatgaagaccatccagcggtgcaacaccggcgagagaagtctgagcctgctgaactgcgaggaaatcaagagccagttcgagggcttcgtgaaggacatcatgctgaacaaagaggaaacgaagaaagagaactccttcgagatgcagaagggcgaccagaatcctcagatcgccgctcacgtgatcagcgaggccagcagcaagacaacaagcgtgctgcagtgggccgagaagggctactacaccatgagcaacaacctggtcaccctggagaacggcaagcagctgacagtgaagcggcagggcctgtactacatctacgcccaagtgaccttctgcagcaacagagaggccagctctcaggctcctttcatcgccagcctgtgcctgaagtctcctggcagattcgagcggattctgctgagagccgccaacacacacagcagcgccaaaccttgtggccagcagtctattcacctcggcggagtgtttgagctgcagcctggcgcaagcgtgttcgtgaatgtgacagaccctagccaggtgtcccacggcaccggctttacatctttcggactgctgaagctgtgatgatag
SEQ ID NO：3
来自NCBI RefSeq NP_003802.1的h4-1BBL。(254个氨基酸)
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
SEQ ID NO:4
来自NCBI RefSeq NP_003802.1的h4-1BBL。
nt序列：
atggaatacgccagcgacgcctctctggaccctgaagctccttggcctccagctcctagagccagggcttgtagagtgctgccttgggctcttgtggctggacttctgcttctgttgctcctggctgctgcctgcgcagtgtttcttgcttgtccatgggctgtgtcaggagccagagcatctcctggatctgccgcttctcccagactgagagagggacctgaactgagccctgatgatcctgctggactgctcgacctgagacagggcatgtttgcccagctggtggcccagaatgtgctgctgattgatggccctctgagctggtacagcgatcctggacttgctggcgttagcctgactggaggcctgagctacaaggaggacaccaaagaactggtggtggccaaggctggcgtgtactacgtgttctttcagctggaactgcggagagtggtggcaggcgaaggatctggatccgtgtctctggcactgcatctgcagcctctgagatctgctgctggtgcagctgccctggctctgacagttgatctgcctcctgcctccagcgaagccagaaacagcgcctttggcttccaaggcagactgctgcacctgtctgctggccagagactgggagtgcacctccacacagaagcaagagcaagacacgcctggcagcttacacaaggcgctacagtgctgggcctgttcagagtgacacctgagattccagctggcttgccatctcctcgcagcgagtaatga
SEQ ID NO:5
ERV-K-env/MEL(699个氨基酸)
MNPSEMQRKAPPRRRRHRNRAPLTHKMNKMVTSEEQMKLPSTKKAEPPTWAQLKKLTQLATKYLENTKVTQTPESMLLAALMIVSMVVSLPMPAGAAAANYTYWAYVPFPPMIRAVTWMDNPIEVYVNDSVWVPGPIDDRCPAKPEEEGMMINISIGYRYPPICLGRAPGCLMPAVQNWLVEVPTVSPISRFTYHMVSGMSLRPRVNYLQDFSYQRSLKFRPKGKPCPKEIPKESKNTEVLVWEECVANSAVILQNNEFGTIIDWAPRGQFYHNCSGQTQSCPSAQVSPAVDSDLTESLDKHKHKKLQSFYPWEWGEKGISTPRPKIISPVSGPEHPELWRLTVASHHIRIWSGNQTLETRDRKPFYTVDLNSSLTVPLQSCVKPPYMLVVGNIVIKPDSQTITCENCRLLTCIDSTFNWQHRILLVRAREGVWIPVSMDRPWEASPSVHILTEVLKGVLNRSKRFIFTLIAVIMGLIAVTATAAVAGVALHSSVQSVNFVNDWQKNSTRLWNSQSSIDQKMLAVISCAVQTVIWMGDRLMSLEHRFQLQCDWNTSDFCITPQIYNESEHHWDMVRRHLQGREDNLTLDISKLKEQIFEASKAHLNLVPGTEAIAGVADGLANLNPVTWVKTIGSTTIINLILILVCLFCLLLVCRCTQQLRRDSDHRERAMMTMAVLSKRKGGNVGKSKRDQIVTVSV
SEQ ID NO:6
ERV-K-env/MEL
nt序列
atgaaccctagcgagatgcagagaaaggctccacctagacggagaagacacagaaacagggctcctctgacacacaagatgaacaagatggtcaccagcgaggaacagatgaaactgcccagcaccaagaaggccgagcctccaacatgggctcagctgaagaaactgacccagctggccaccaagtacctggagaacaccaaagtgacccagacacctgagagcatgctgctggcagctctgatgatcgtgtccatggtggtgtccctgcctatgcctgctggtgctgccgctgccaactacacatactgggcctacgtgccctttcctcctatgatcagagccgtgacctggatggacaaccctattgaggtgtacgtgaacgacagcgtgtgggtgccaggacctatcgacgatagatgtcctgccaaacctgaggaagagggcatgatgatcaacatcagcatcggctaccggtatcctccaatctgcctgggcagagcacctggctgtcttatgccagctgtgcagaattggctggtggaagtgcctaccgtgtctcccatcagccggttcacctaccacatggtgtccggcatgagcctcagacctagagtgaactacttgcaggacttcagctatcagcggagcctgaagttcagacccaagggaaagccctgtcctaaagagattcccaaagagtccaagaacaccgaggtgctcgtgtgggaagagtgcgtggccaattctgccgtgatcctgcagaacaacgagttcggcaccatcattgactgggctcctagaggccagttctaccacaattgcagcggacagacacagagctgtcctagcgcacaagtgtcaccagccgtggatagcgatctgaccgagagcctggacaagcacaaacacaagaaacttcagagcttctatccctgggagtggggagagaagggcatctctacaccaaggcctaagatcattagccctgtgtctggaccagaacatcccgaactttggagactgacagtggccagccaccacatcagaatctggagcggcaatcagaccctggaaacacgggacagaaagcccttctacaccgtcgatctgaacagcagcctgaccgtgcctctccagagctgtgtgaagcctccttacatgctggtcgtgggcaacattgtgatcaagcccgactcccagaccatcacatgcgagaactgcagactgctgacctgcatcgacagcaccttcaactggcagcaccggatcctgctcgtgcgagctagagaaggcgtgtggatccctgtctctatggacaggccttgggaagccagccctagcgtgcacattctgacagaggtgctgaagggcgtgctcaacagatccaagcggttcatcttcaccctgatcgccgtcatcatgggcctgattgctgtgacagccacagctgctgttgctggcgtggccctgcatagctctgtgcagagcgtgaacttcgtgaacgattggcagaagaacagcacacggctgtggaacagccagagcagcatcgaccagaagatgctggccgtgatctcctgtgccgtgcagacagttatctggatgggcgacagactgatgagcctggaacaccggttccagctgcagtgcgactggaataccagcgacttctgcatcacacctcagatctacaacgagagcgagcaccactgggatatggtccgaaggcatctgcagggcagagaggacaacctgacactggacatcagcaagctgaaagagcagatcttcgaggccagcaaggctcacctgaatctggtgcctggaaccgaagctattgctggagttgcagatggcctggccaatctgaatcctgtgacctgggtcaagaccatcggcagcaccacaatcatcaacctgatcctgatcctcgtgtgcctgttttgcctgctgcttgtgtgcagatgcacccagcagctgagaagagacagcgaccatagagaaagagccatgatgaccatggccgtcctgagcaagagaaagggaggcaacgtgggcaagagcaagcgggatcagatcgtgaccgtgtccgtttgataa
SEQ ID NO:7
ERV-K-gag(666个氨基酸)
MGQTKSKIKSKYASYLSFIKILLKRGGVKVSTKNLIKLFQIIEQFCPWFPEQGTLDLKDWKRIGKELKQAGRKGNIIPLTVWNDWAIIKAALEPFQTEEDSVSVSDAPGSCIIDCNENTRKKSQKETESLHCEYVAEPVMAQSTQNVDYNQLQEVIYPETLKLEGKGPELVGPSESKPRGTSPLPAGQVPVTLQPQKQVKENKTQPPVAYQYWPPAELQYRPPPESQYGYPGMPPAPQGRAPYPQPPTRRLNPTAPPSRQGSELHEIIDKSRKEGDTEAWQFPVTLEPMPPGEGAQEGEPPTVEARYKSFSIKMLKDMKEGVKQYGPNSPYMRTLLDSIAHGHRLIPYDWEILAKSSLSPSQFLQFKTWWIDGVQEQVRRNRAANPPVNIDADQLLGIGQNWSTISQQALMQNEAIEQVRAICLRAWEKIQDPGSTCPSFNTVRQGSKEPYPDFVARLQDVAQKSIADEKARKVIVELMAYENANPECQSAIKPLKGKVPAGSDVISEYVKACDGIGGAMHKAMLMAQAITGVVLGGQVRTFGGKCYNCGQIGHLKKNCPVLNKQNITIQATTTGREPPDLCPRCKKGKHWASQCRSKFDKNGQPLSGNEQRGQPQAPQQTGAFPIQPFVPQGFQGQQPPLSQVFQGISQLPQYNNCPPPQAAVQQ
SEQ ID NO:8
ERV-K-gag
nt序列
atgggacagaccaagagtaagatcaagtctaagtacgccagctacctcagcttcatcaagatcctgctgaagagaggaggcgtgaaagtgtccaccaagaacctgatcaagctgttccagatcatcgagcagttctgtccctggtttcctgagcagggcaccctggatctgaaggactggaagcggatcggcaaagagctgaagcaggctggcagaaagggcaacatcatccctctgaccgtgtggaacgactgggccatcatcaaagcagctctggaacccttccagaccgaagaggatagcgtgtccgtgtctgatgctcctggcagctgcatcatcgactgcaacgagaacacccggaagaagtcccagaaagagacagagagcctgcactgcgagtacgtggccgaacctgtgatggctcagagcacccagaacgtggactacaaccagctccaagaagtgatctatcccgaaacactgaagctggaaggcaagggacctgaactcgtgggtccttctgagtctaagcccagaggcacatctcctctgcctgcaggacaggtgccagtgacactgcagcctcagaaacaagtgaaagagaacaagacccagcctcctgtggcctaccagtattggcctccagccgagctgcagtacagacctcctccagagagccagtacggctaccctggaatgcctcctgctcctcaaggcagagctccttatcctcagcctcctaccagacggctgaaccctacagctcctcctagcagacagggctctgagctgcacgagatcattgacaagagccggaaagagggcgacaccgaggcttggcagtttcccgttacactggaacccatgcctccaggcgaaggcgctcaagaaggcgaacctcctacagtggaagccaggtacaagagcttcagcatcaagatgctgaaggacatgaaggaaggcgtcaagcagtacggacctaacagcccatacatgcggaccctgctggattctattgcccacggccaccggctgatcccttacgattgggagatcctggctaagtcctctctgagccctagccagttcctgcagttcaagacctggtggatcgacggcgtgcaagaacaagtgagacggaacagagctgccaatcctcctgtgaacatcgacgccgaccagctcctcggaatcggccagaattggagcaccatctctcagcaggctctgatgcagaacgaggccattgaacaagtcagagccatctgcctgagagcttgggagaagattcaggacccaggcagcacatgtcccagcttcaataccgttcggcagggcagcaaagagccctatcctgactttgtggctagactgcaggatgtggcccagaagtctattgccgacgagaaggctcggaaagtgatcgtggaactgatggcctacgagaacgctaatccagagtgccagagcgccatcaagcccttgaagggcaaagtgcctgccggatccgatgtgatcagcgagtatgtgaaggcctgcgacggaatcggaggtgccatgcacaaagccatgctgatggcacaggccatcactggcgttgtgctcggaggacaagttcggacctttggaggcaagtgctacaactgtggccagatcggacacctgaagaagaactgccctgtgctgaacaagcagaacatcaccatccaggccaccaccaccggcagagaacctccagatctgtgccctagatgcaagaagggcaagcactgggccagccagtgcagaagcaagttcgacaagaacggccagcctctgagcggcaacgaacaaagaggacagcctcaggctcctcagcagactggcgcatttccaatccagcccttcgtgcctcaaggcttccagggacaacagcctccactgtctcaggtgttccagggcattagccagctccctcagtacaacaactgccctccacctcaggctgctgtgcagcagtgatga
SEQ ID NO:9
hFOLR1Δ_hPRAMEΔ融合物(741个氨基酸)
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVELAGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKAVLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTTKAKVDGLSTEAEQPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVAAKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLEVTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFLRGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASATLQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYEDIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN
SEQ ID NO:10
hFOLR1Δ_hPRAMEΔ融合物(741个氨基酸)
nt序列
tggcccagagaatgaccacacaactgctgctgctcctggtgtgggttgccgttgttggagaggcccagaccagaattgcctgggccagaaccgagctgctgaacgtgtgcatgaacgccaagcatcacaaagagaagcctggacctgaagacaagctgcatgaacagtgtcggccttggagaaagaatgcttgctgtagcaccaacaccagccaagaggcccacaaggacgtgtcctacctgtaccggttcaactggaaccactgcggagaaatggctcctgcctgcaagagacacttcatccaggatacctgcctgtacgagtgctctcccaatctcggaccttggatccagcaagtggaccagagctggcggaaagaacgggtgctgaatgtgcccttgtgcaaagaggattgcgagcagtggtgggaagattgccggaccagctacacatgtaagagcaactggcacaaaggctggaactggaccagcggcttcaacaagtgtgccgtgggagctgcctgccagcctttccacttctacttcccaacacctaccgtgctgtgcaacgaaatctggacccacagctacaaggtgtccaactacagcagaggcagcggcaggtgtatccagatgtggttcgatcccgctcagggcaatcccaatgaggaagtggctagattctacgctgctgccatggaaagaagaaggctctggggcagcatccagagccggtacattagcatgagcgtgtggacaagccctagacggctggttgaactggctggacagagcctgctcaaggatgaggccctggccattgctgctctggagctgctgcctagagagctgttccctcctctgttcatggctgccttcgacggcagacacagccagacactgaaagccatggtgcaggcctggcctttcacctgtctgcctctgggagtgctgatgaagggccagcatctgcacctggaaaccttcaaggccgtgctggacggcctggatgttctcctggctcaagaggtgaggcctcggcgttggaaactgcaggttctggatctgcggaagaactctcaccaggatttctggaccgtttggtccggcaacagagccagcctgtacagctttcctgaacctgaggctgcccagcccatgaccacaaaggccaaagtggatggcctgagcacagaggccgagcagcctttcattcccgtcgaagtgctggtggacctgttcctgaaagaaggagcctgcgatgagctgttcagctacctgattgagaaggtggcagccaagaagaacgtgctgcggctgtgctgcaagaagctgaagatctttgccatgcctatgcaggatatcaagatgatcctgaagatggtgcagctggacagcatcgaggacctggaagtgacctgtacctggaagctgcccacactggccaagttcagcccttacctgggacagatgattaacctgcggaggctgctgctgtctcacatccacgccagctcctacatcagccctgagaaagaggaacagtatatcgcccagttcacaagccagtttctgagcctgcagtgtctgcaggccctgtacgtggacagcctgttctttctgagaggcaggctggatcagctgctgcggcacgtgatgaaccctctggaaaccctgagcatcaccaactgtagactgagcgagggcgacgtgatgcacctgtctcagagcccatctgtgtctcagctgagcgtgctgtctctgtctggcgtgatgctgaccgatgtgagccctgaacctctgcaggcactgctggaaagagcctccgctactctgcaggacctggtgttcgatgagtgcggcatcaccgatgaccagctgcttgctctgctgccaagcctgagccactgtagccagctgacaaccctgtccttctacggcaacagcatctccatctctgccctgcagtctctcctgcagcatctgatcggcctgtccaatctgacccacgtgctgtaccctgtgccactggaaagctacgaggacatccacggaaccctgcacctcgagagactggcctatctgcatgctcggctgagagaactgctgtgcgaactgggcagacccagcatggtttggctgagcgccaatccatgtcctcactgtggcgaccggaccttctacgaccctgagcctatcctgtgtccttgcttcatgcccaactaatag
SEQ ID NO:11
ERV-K-env/MEL_03(517个氨基酸)
MNPSEMQRKAPPRRRRHRNRAPLTHKMNKMVTSEEQMKLPSTKKAEPPTWAQLKKLTQLATKYLENTKVTQTPESMLLAALMIVSMVVSLPMPAGAAAANYTYWAYVPFPPMIRAVTWMDNPIEVYVNDSVWVPGPIDDRCPAKPEEEGMMINISIGYRYPPICLGRAPGCLMPAVQNWLVEVPTVSPISRFTYHMVSGMSLRPRVNYLQDFSYQRSLKFRPKGKPCPKEIPKESKNTEVLVWEECVANSAVILQNNEFGTIIDWAPRGQFYHNCSGQTQSCPSAQVSPAVDSDLTESLDKHKHKKLQSFYPWEWGEKGISTPRPKIISPVSGPEHPELWRLTVASHHIRIWSGNQTLETRDRKPFYTVDLNSSLTVPLQSCVKPPYMLVVGNIVIKPDSQTITCENCRLLTCIDSTFNWQHRILLVRAREGVWIPVSMDRPWEASPSVHILTEVLKGVLNMLAVISCAVAGVALHGSAGSAAGSGEFVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR
SEQ ID NO:12
ERV-K-env/MEL_03
nt序列
atgaaccctagcgagatgcagagaaaggctccacctagacggagaagacacagaaacagggctcctctgacacacaagatgaacaagatggtcaccagcgaggaacagatgaaactgcccagcaccaagaaggccgagcctccaacatgggctcagctgaagaaactgacccagctggccaccaagtacctggagaacaccaaagtgacccagacacctgagagcatgctgctggcagctctgatgatcgtgtccatggtggtgtccctgcctatgcctgctggtgctgccgctgccaactacacatactgggcctacgtgccctttcctcctatgatcagagccgtgacctggatggacaaccctattgaggtgtacgtgaacgacagcgtgtgggtgccaggacctatcgacgatagatgtcctgccaaacctgaggaagagggcatgatgatcaacatcagcatcggctaccggtatcctccaatctgcctgggcagagcacctggctgtcttatgccagctgtgcagaattggctggtggaagtgcctaccgtgtctcccatcagccggttcacctaccacatggtgtccggcatgagcctcagacctagagtgaactacttgcaggacttcagctatcagcggagcctgaagttcagacccaagggaaagccctgtcctaaagagattcccaaagagtccaagaacaccgaggtgctcgtgtgggaagagtgcgtggccaattctgccgtgatcctgcagaacaacgagttcggcaccatcattgactgggctcctagaggccagttctaccacaattgcagcggacagacacagagctgtcctagcgcacaagtgtcaccagccgtggatagcgatctgaccgagagcctggacaagcacaaacacaagaaacttcagagcttctatccctgggagtggggagagaagggcatctctacaccaaggcctaagatcattagccctgtgtctggaccagaacatcccgaactttggagactgacagtggccagccaccacatcagaatctggagcggcaatcagaccctggaaacacgggacagaaagcccttctacaccgtcgatctgaacagcagcctgaccgtgcctctccagagctgtgtgaagcctccttacatgctggtcgtgggcaacattgtgatcaagcccgactcccagaccatcacatgcgagaactgcagactgctgacctgcatcgacagcaccttcaactggcagcaccggatcctgctcgtgcgagctagagaaggcgtgtggatccctgtctctatggacaggccttgggaagccagccctagcgtgcacattctgacagaggtgctgaagggcgtgctcaacatgctggccgtgatctcctgtgccgtggctggcgtggccctgcatggctctgctggatctgctgctggaagcggcgagttcgtggtcatctctgccattctggctctggtggtgctgaccatcatcagcctgatcatcctgattatgctgtggcagaagaagccccggtgataa
序列表
<110> 巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)
<120> 用于肿瘤内和/或静脉内施用以治疗癌症的重组MVA病毒
<130> BNIT0015PCT
<150> EP 19210369.5
<151> 2019-11-20
<150> EP 20193706.7
<151> 2020-08-31
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 2
<211> 792
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atgatcgaga catacaacca gacaagccct agaagcgccg ccacaggact gcctatcagc 60
atgaagatct tcatgtacct gctgaccgtg ttcctgatca cccagatgat cggcagcgcc 120
ctgtttgccg tgtacctgca cagacggctg gacaagatcg aggacgagag aaacctgcac 180
gaggacttcg tgttcatgaa gaccatccag cggtgcaaca ccggcgagag aagtctgagc 240
ctgctgaact gcgaggaaat caagagccag ttcgagggct tcgtgaagga catcatgctg 300
aacaaagagg aaacgaagaa agagaactcc ttcgagatgc agaagggcga ccagaatcct 360
cagatcgccg ctcacgtgat cagcgaggcc agcagcaaga caacaagcgt gctgcagtgg 420
gccgagaagg gctactacac catgagcaac aacctggtca ccctggagaa cggcaagcag 480
ctgacagtga agcggcaggg cctgtactac atctacgccc aagtgacctt ctgcagcaac 540
agagaggcca gctctcaggc tcctttcatc gccagcctgt gcctgaagtc tcctggcaga 600
ttcgagcgga ttctgctgag agccgccaac acacacagca gcgccaaacc ttgtggccag 660
cagtctattc acctcggcgg agtgtttgag ctgcagcctg gcgcaagcgt gttcgtgaat 720
gtgacagacc ctagccaggt gtcccacggc accggcttta catctttcgg actgctgaag 780
ctgtgatgat ag 792
<210> 3
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 4
<211> 768
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
atggaatacg ccagcgacgc ctctctggac cctgaagctc cttggcctcc agctcctaga 60
gccagggctt gtagagtgct gccttgggct cttgtggctg gacttctgct tctgttgctc 120
ctggctgctg cctgcgcagt gtttcttgct tgtccatggg ctgtgtcagg agccagagca 180
tctcctggat ctgccgcttc tcccagactg agagagggac ctgaactgag ccctgatgat 240
cctgctggac tgctcgacct gagacagggc atgtttgccc agctggtggc ccagaatgtg 300
ctgctgattg atggccctct gagctggtac agcgatcctg gacttgctgg cgttagcctg 360
actggaggcc tgagctacaa ggaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggctggcgtg 420
tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg caggcgaagg atctggatcc 480
gtgtctctgg cactgcatct gcagcctctg agatctgctg ctggtgcagc tgccctggct 540
ctgacagttg atctgcctcc tgcctccagc gaagccagaa acagcgcctt tggcttccaa 600
ggcagactgc tgcacctgtc tgctggccag agactgggag tgcacctcca cacagaagca 660
agagcaagac acgcctggca gcttacacaa ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg 720
acacctgaga ttccagctgg cttgccatct cctcgcagcg agtaatga 768
<210> 5
<211> 666
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成ERV-K-gag序列
<400> 5
Met Gly Gln Thr Lys Ser Lys Ile Lys Ser Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Ser Phe Ile Lys Ile Leu Leu Lys Arg Gly Gly Val Lys Val Ser Thr
20 25 30
Lys Asn Leu Ile Lys Leu Phe Gln Ile Ile Glu Gln Phe Cys Pro Trp
35 40 45
Phe Pro Glu Gln Gly Thr Leu Asp Leu Lys Asp Trp Lys Arg Ile Gly
50 55 60
Lys Glu Leu Lys Gln Ala Gly Arg Lys Gly Asn Ile Ile Pro Leu Thr
65 70 75 80
Val Trp Asn Asp Trp Ala Ile Ile Lys Ala Ala Leu Glu Pro Phe Gln
85 90 95
Thr Glu Glu Asp Ser Val Ser Val Ser Asp Ala Pro Gly Ser Cys Ile
100 105 110
Ile Asp Cys Asn Glu Asn Thr Arg Lys Lys Ser Gln Lys Glu Thr Glu
115 120 125
Ser Leu His Cys Glu Tyr Val Ala Glu Pro Val Met Ala Gln Ser Thr
130 135 140
Gln Asn Val Asp Tyr Asn Gln Leu Gln Glu Val Ile Tyr Pro Glu Thr
145 150 155 160
Leu Lys Leu Glu Gly Lys Gly Pro Glu Leu Val Gly Pro Ser Glu Ser
165 170 175
Lys Pro Arg Gly Thr Ser Pro Leu Pro Ala Gly Gln Val Pro Val Thr
180 185 190
Leu Gln Pro Gln Lys Gln Val Lys Glu Asn Lys Thr Gln Pro Pro Val
195 200 205
Ala Tyr Gln Tyr Trp Pro Pro Ala Glu Leu Gln Tyr Arg Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Ser Gln Tyr Gly Tyr Pro Gly Met Pro Pro Ala Pro Gln Gly Arg
225 230 235 240
Ala Pro Tyr Pro Gln Pro Pro Thr Arg Arg Leu Asn Pro Thr Ala Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Gln Gly Ser Glu Leu His Glu Ile Ile Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Lys Glu Gly Asp Thr Glu Ala Trp Gln Phe Pro Val Thr Leu Glu Pro
275 280 285
Met Pro Pro Gly Glu Gly Ala Gln Glu Gly Glu Pro Pro Thr Val Glu
290 295 300
Ala Arg Tyr Lys Ser Phe Ser Ile Lys Met Leu Lys Asp Met Lys Glu
305 310 315 320
Gly Val Lys Gln Tyr Gly Pro Asn Ser Pro Tyr Met Arg Thr Leu Leu
325 330 335
Asp Ser Ile Ala His Gly His Arg Leu Ile Pro Tyr Asp Trp Glu Ile
340 345 350
Leu Ala Lys Ser Ser Leu Ser Pro Ser Gln Phe Leu Gln Phe Lys Thr
355 360 365
Trp Trp Ile Asp Gly Val Gln Glu Gln Val Arg Arg Asn Arg Ala Ala
370 375 380
Asn Pro Pro Val Asn Ile Asp Ala Asp Gln Leu Leu Gly Ile Gly Gln
385 390 395 400
Asn Trp Ser Thr Ile Ser Gln Gln Ala Leu Met Gln Asn Glu Ala Ile
405 410 415
Glu Gln Val Arg Ala Ile Cys Leu Arg Ala Trp Glu Lys Ile Gln Asp
420 425 430
Pro Gly Ser Thr Cys Pro Ser Phe Asn Thr Val Arg Gln Gly Ser Lys
435 440 445
Glu Pro Tyr Pro Asp Phe Val Ala Arg Leu Gln Asp Val Ala Gln Lys
450 455 460
Ser Ile Ala Asp Glu Lys Ala Arg Lys Val Ile Val Glu Leu Met Ala
465 470 475 480
Tyr Glu Asn Ala Asn Pro Glu Cys Gln Ser Ala Ile Lys Pro Leu Lys
485 490 495
Gly Lys Val Pro Ala Gly Ser Asp Val Ile Ser Glu Tyr Val Lys Ala
500 505 510
Cys Asp Gly Ile Gly Gly Ala Met His Lys Ala Met Leu Met Ala Gln
515 520 525
Ala Ile Thr Gly Val Val Leu Gly Gly Gln Val Arg Thr Phe Gly Gly
530 535 540
Lys Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ile Gly His Leu Lys Lys Asn Cys Pro
545 550 555 560
Val Leu Asn Lys Gln Asn Ile Thr Ile Gln Ala Thr Thr Thr Gly Arg
565 570 575
Glu Pro Pro Asp Leu Cys Pro Arg Cys Lys Lys Gly Lys His Trp Ala
580 585 590
Ser Gln Cys Arg Ser Lys Phe Asp Lys Asn Gly Gln Pro Leu Ser Gly
595 600 605
Asn Glu Gln Arg Gly Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Thr Gly Ala Phe
610 615 620
Pro Ile Gln Pro Phe Val Pro Gln Gly Phe Gln Gly Gln Gln Pro Pro
625 630 635 640
Leu Ser Gln Val Phe Gln Gly Ile Ser Gln Leu Pro Gln Tyr Asn Asn
645 650 655
Cys Pro Pro Pro Gln Ala Ala Val Gln Gln
660 665
<210> 6
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成ERV-K-gag序列
<400> 6
atgggacaga ccaagagtaa gatcaagtct aagtacgcca gctacctcag cttcatcaag 60
atcctgctga agagaggagg cgtgaaagtg tccaccaaga acctgatcaa gctgttccag 120
atcatcgagc agttctgtcc ctggtttcct gagcagggca ccctggatct gaaggactgg 180
aagcggatcg gcaaagagct gaagcaggct ggcagaaagg gcaacatcat ccctctgacc 240
gtgtggaacg actgggccat catcaaagca gctctggaac ccttccagac cgaagaggat 300
agcgtgtccg tgtctgatgc tcctggcagc tgcatcatcg actgcaacga gaacacccgg 360
aagaagtccc agaaagagac agagagcctg cactgcgagt acgtggccga acctgtgatg 420
gctcagagca cccagaacgt ggactacaac cagctccaag aagtgatcta tcccgaaaca 480
ctgaagctgg aaggcaaggg acctgaactc gtgggtcctt ctgagtctaa gcccagaggc 540
acatctcctc tgcctgcagg acaggtgcca gtgacactgc agcctcagaa acaagtgaaa 600
gagaacaaga cccagcctcc tgtggcctac cagtattggc ctccagccga gctgcagtac 660
agacctcctc cagagagcca gtacggctac cctggaatgc ctcctgctcc tcaaggcaga 720
gctccttatc ctcagcctcc taccagacgg ctgaacccta cagctcctcc tagcagacag 780
ggctctgagc tgcacgagat cattgacaag agccggaaag agggcgacac cgaggcttgg 840
cagtttcccg ttacactgga acccatgcct ccaggcgaag gcgctcaaga aggcgaacct 900
cctacagtgg aagccaggta caagagcttc agcatcaaga tgctgaagga catgaaggaa 960
ggcgtcaagc agtacggacc taacagccca tacatgcgga ccctgctgga ttctattgcc 1020
cacggccacc ggctgatccc ttacgattgg gagatcctgg ctaagtcctc tctgagccct 1080
agccagttcc tgcagttcaa gacctggtgg atcgacggcg tgcaagaaca agtgagacgg 1140
aacagagctg ccaatcctcc tgtgaacatc gacgccgacc agctcctcgg aatcggccag 1200
aattggagca ccatctctca gcaggctctg atgcagaacg aggccattga acaagtcaga 1260
gccatctgcc tgagagcttg ggagaagatt caggacccag gcagcacatg tcccagcttc 1320
aataccgttc ggcagggcag caaagagccc tatcctgact ttgtggctag actgcaggat 1380
gtggcccaga agtctattgc cgacgagaag gctcggaaag tgatcgtgga actgatggcc 1440
tacgagaacg ctaatccaga gtgccagagc gccatcaagc ccttgaaggg caaagtgcct 1500
gccggatccg atgtgatcag cgagtatgtg aaggcctgcg acggaatcgg aggtgccatg 1560
cacaaagcca tgctgatggc acaggccatc actggcgttg tgctcggagg acaagttcgg 1620
acctttggag gcaagtgcta caactgtggc cagatcggac acctgaagaa gaactgccct 1680
gtgctgaaca agcagaacat caccatccag gccaccacca ccggcagaga acctccagat 1740
ctgtgcccta gatgcaagaa gggcaagcac tgggccagcc agtgcagaag caagttcgac 1800
aagaacggcc agcctctgag cggcaacgaa caaagaggac agcctcaggc tcctcagcag 1860
actggcgcat ttccaatcca gcccttcgtg cctcaaggct tccagggaca acagcctcca 1920
ctgtctcagg tgttccaggg cattagccag ctccctcagt acaacaactg ccctccacct 1980
caggctgctg tgcagcagtg atga 2004
<210> 7
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成ERV-K-env/MEL序列
<400> 7
Met Asn Pro Ser Glu Met Gln Arg Lys Ala Pro Pro Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
His Arg Asn Arg Ala Pro Leu Thr His Lys Met Asn Lys Met Val Thr
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Met Lys Leu Pro Ser Thr Lys Lys Ala Glu Pro Pro
35 40 45
Thr Trp Ala Gln Leu Lys Lys Leu Thr Gln Leu Ala Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
Glu Asn Thr Lys Val Thr Gln Thr Pro Glu Ser Met Leu Leu Ala Ala
65 70 75 80
Leu Met Ile Val Ser Met Val Val Ser Leu Pro Met Pro Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Asn Tyr Thr Tyr Trp Ala Tyr Val Pro Phe Pro Pro Met
100 105 110
Ile Arg Ala Val Thr Trp Met Asp Asn Pro Ile Glu Val Tyr Val Asn
115 120 125
Asp Ser Val Trp Val Pro Gly Pro Ile Asp Asp Arg Cys Pro Ala Lys
130 135 140
Pro Glu Glu Glu Gly Met Met Ile Asn Ile Ser Ile Gly Tyr Arg Tyr
145 150 155 160
Pro Pro Ile Cys Leu Gly Arg Ala Pro Gly Cys Leu Met Pro Ala Val
165 170 175
Gln Asn Trp Leu Val Glu Val Pro Thr Val Ser Pro Ile Ser Arg Phe
180 185 190
Thr Tyr His Met Val Ser Gly Met Ser Leu Arg Pro Arg Val Asn Tyr
195 200 205
Leu Gln Asp Phe Ser Tyr Gln Arg Ser Leu Lys Phe Arg Pro Lys Gly
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Lys Glu Ile Pro Lys Glu Ser Lys Asn Thr Glu Val
225 230 235 240
Leu Val Trp Glu Glu Cys Val Ala Asn Ser Ala Val Ile Leu Gln Asn
245 250 255
Asn Glu Phe Gly Thr Ile Ile Asp Trp Ala Pro Arg Gly Gln Phe Tyr
260 265 270
His Asn Cys Ser Gly Gln Thr Gln Ser Cys Pro Ser Ala Gln Val Ser
275 280 285
Pro Ala Val Asp Ser Asp Leu Thr Glu Ser Leu Asp Lys His Lys His
290 295 300
Lys Lys Leu Gln Ser Phe Tyr Pro Trp Glu Trp Gly Glu Lys Gly Ile
305 310 315 320
Ser Thr Pro Arg Pro Lys Ile Ile Ser Pro Val Ser Gly Pro Glu His
325 330 335
Pro Glu Leu Trp Arg Leu Thr Val Ala Ser His His Ile Arg Ile Trp
340 345 350
Ser Gly Asn Gln Thr Leu Glu Thr Arg Asp Arg Lys Pro Phe Tyr Thr
355 360 365
Val Asp Leu Asn Ser Ser Leu Thr Val Pro Leu Gln Ser Cys Val Lys
370 375 380
Pro Pro Tyr Met Leu Val Val Gly Asn Ile Val Ile Lys Pro Asp Ser
385 390 395 400
Gln Thr Ile Thr Cys Glu Asn Cys Arg Leu Leu Thr Cys Ile Asp Ser
405 410 415
Thr Phe Asn Trp Gln His Arg Ile Leu Leu Val Arg Ala Arg Glu Gly
420 425 430
Val Trp Ile Pro Val Ser Met Asp Arg Pro Trp Glu Ala Ser Pro Ser
435 440 445
Val His Ile Leu Thr Glu Val Leu Lys Gly Val Leu Asn Arg Ser Lys
450 455 460
Arg Phe Ile Phe Thr Leu Ile Ala Val Ile Met Gly Leu Ile Ala Val
465 470 475 480
Thr Ala Thr Ala Ala Val Ala Gly Val Ala Leu His Ser Ser Val Gln
485 490 495
Ser Val Asn Phe Val Asn Asp Trp Gln Lys Asn Ser Thr Arg Leu Trp
500 505 510
Asn Ser Gln Ser Ser Ile Asp Gln Lys Met Leu Ala Val Ile Ser Cys
515 520 525
Ala Val Gln Thr Val Ile Trp Met Gly Asp Arg Leu Met Ser Leu Glu
530 535 540
His Arg Phe Gln Leu Gln Cys Asp Trp Asn Thr Ser Asp Phe Cys Ile
545 550 555 560
Thr Pro Gln Ile Tyr Asn Glu Ser Glu His His Trp Asp Met Val Arg
565 570 575
Arg His Leu Gln Gly Arg Glu Asp Asn Leu Thr Leu Asp Ile Ser Lys
580 585 590
Leu Lys Glu Gln Ile Phe Glu Ala Ser Lys Ala His Leu Asn Leu Val
595 600 605
Pro Gly Thr Glu Ala Ile Ala Gly Val Ala Asp Gly Leu Ala Asn Leu
610 615 620
Asn Pro Val Thr Trp Val Lys Thr Ile Gly Ser Thr Thr Ile Ile Asn
625 630 635 640
Leu Ile Leu Ile Leu Val Cys Leu Phe Cys Leu Leu Leu Val Cys Arg
645 650 655
Cys Thr Gln Gln Leu Arg Arg Asp Ser Asp His Arg Glu Arg Ala Met
660 665 670
Met Thr Met Ala Val Leu Ser Lys Arg Lys Gly Gly Asn Val Gly Lys
675 680 685
Ser Lys Arg Asp Gln Ile Val Thr Val Ser Val
690 695
<210> 8
<211> 2103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成ERV-K-env/MEL序列
<400> 8
atgaacccta gcgagatgca gagaaaggct ccacctagac ggagaagaca cagaaacagg 60
gctcctctga cacacaagat gaacaagatg gtcaccagcg aggaacagat gaaactgccc 120
agcaccaaga aggccgagcc tccaacatgg gctcagctga agaaactgac ccagctggcc 180
accaagtacc tggagaacac caaagtgacc cagacacctg agagcatgct gctggcagct 240
ctgatgatcg tgtccatggt ggtgtccctg cctatgcctg ctggtgctgc cgctgccaac 300
tacacatact gggcctacgt gccctttcct cctatgatca gagccgtgac ctggatggac 360
aaccctattg aggtgtacgt gaacgacagc gtgtgggtgc caggacctat cgacgataga 420
tgtcctgcca aacctgagga agagggcatg atgatcaaca tcagcatcgg ctaccggtat 480
cctccaatct gcctgggcag agcacctggc tgtcttatgc cagctgtgca gaattggctg 540
gtggaagtgc ctaccgtgtc tcccatcagc cggttcacct accacatggt gtccggcatg 600
agcctcagac ctagagtgaa ctacttgcag gacttcagct atcagcggag cctgaagttc 660
agacccaagg gaaagccctg tcctaaagag attcccaaag agtccaagaa caccgaggtg 720
ctcgtgtggg aagagtgcgt ggccaattct gccgtgatcc tgcagaacaa cgagttcggc 780
accatcattg actgggctcc tagaggccag ttctaccaca attgcagcgg acagacacag 840
agctgtccta gcgcacaagt gtcaccagcc gtggatagcg atctgaccga gagcctggac 900
aagcacaaac acaagaaact tcagagcttc tatccctggg agtggggaga gaagggcatc 960
tctacaccaa ggcctaagat cattagccct gtgtctggac cagaacatcc cgaactttgg 1020
agactgacag tggccagcca ccacatcaga atctggagcg gcaatcagac cctggaaaca 1080
cgggacagaa agcccttcta caccgtcgat ctgaacagca gcctgaccgt gcctctccag 1140
agctgtgtga agcctcctta catgctggtc gtgggcaaca ttgtgatcaa gcccgactcc 1200
cagaccatca catgcgagaa ctgcagactg ctgacctgca tcgacagcac cttcaactgg 1260
cagcaccgga tcctgctcgt gcgagctaga gaaggcgtgt ggatccctgt ctctatggac 1320
aggccttggg aagccagccc tagcgtgcac attctgacag aggtgctgaa gggcgtgctc 1380
aacagatcca agcggttcat cttcaccctg atcgccgtca tcatgggcct gattgctgtg 1440
acagccacag ctgctgttgc tggcgtggcc ctgcatagct ctgtgcagag cgtgaacttc 1500
gtgaacgatt ggcagaagaa cagcacacgg ctgtggaaca gccagagcag catcgaccag 1560
aagatgctgg ccgtgatctc ctgtgccgtg cagacagtta tctggatggg cgacagactg 1620
atgagcctgg aacaccggtt ccagctgcag tgcgactgga ataccagcga cttctgcatc 1680
acacctcaga tctacaacga gagcgagcac cactgggata tggtccgaag gcatctgcag 1740
ggcagagagg acaacctgac actggacatc agcaagctga aagagcagat cttcgaggcc 1800
agcaaggctc acctgaatct ggtgcctgga accgaagcta ttgctggagt tgcagatggc 1860
ctggccaatc tgaatcctgt gacctgggtc aagaccatcg gcagcaccac aatcatcaac 1920
ctgatcctga tcctcgtgtg cctgttttgc ctgctgcttg tgtgcagatg cacccagcag 1980
ctgagaagag acagcgacca tagagaaaga gccatgatga ccatggccgt cctgagcaag 2040
agaaagggag gcaacgtggg caagagcaag cgggatcaga tcgtgaccgt gtccgtttga 2100
taa 2103
<210> 9
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成hFOLR1-hPRAME融合序列
<400> 9
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1 5 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
20 25 30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35 40 45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
50 55 60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85 90 95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100 105 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115 120 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130 135 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145 150 155 160
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165 170 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180 185 190
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195 200 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210 215 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly
225 230 235 240
Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg
245 250 255
Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu
260 265 270
Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu
275 280 285
Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met
290 295 300
Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys
305 310 315 320
Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu
325 330 335
Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln
340 345 350
Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp
355 360 365
Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala
370 375 380
Gln Pro Met Thr Thr Lys Ala Lys Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala
385 390 395 400
Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys
405 410 415
Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Ala
420 425 430
Ala Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe
435 440 445
Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu
450 455 460
Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr
465 470 475 480
Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg
485 490 495
Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys
500 505 510
Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln
515 520 525
Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg
530 535 540
Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser
545 550 555 560
Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln
565 570 575
Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met
580 585 590
Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala
595 600 605
Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp
610 615 620
Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu
625 630 635 640
Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln
645 650 655
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu
660 665 670
Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His
675 680 685
Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys
690 695 700
Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro
705 710 715 720
His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro
725 730 735
Cys Phe Met Pro Asn
740
<210> 10
<211> 2228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成hFOLR1-hPRAME融合核苷酸序列
<400> 10
tggcccagag aatgaccaca caactgctgc tgctcctggt gtgggttgcc gttgttggag 60
aggcccagac cagaattgcc tgggccagaa ccgagctgct gaacgtgtgc atgaacgcca 120
agcatcacaa agagaagcct ggacctgaag acaagctgca tgaacagtgt cggccttgga 180
gaaagaatgc ttgctgtagc accaacacca gccaagaggc ccacaaggac gtgtcctacc 240
tgtaccggtt caactggaac cactgcggag aaatggctcc tgcctgcaag agacacttca 300
tccaggatac ctgcctgtac gagtgctctc ccaatctcgg accttggatc cagcaagtgg 360
accagagctg gcggaaagaa cgggtgctga atgtgccctt gtgcaaagag gattgcgagc 420
agtggtggga agattgccgg accagctaca catgtaagag caactggcac aaaggctgga 480
actggaccag cggcttcaac aagtgtgccg tgggagctgc ctgccagcct ttccacttct 540
acttcccaac acctaccgtg ctgtgcaacg aaatctggac ccacagctac aaggtgtcca 600
actacagcag aggcagcggc aggtgtatcc agatgtggtt cgatcccgct cagggcaatc 660
ccaatgagga agtggctaga ttctacgctg ctgccatgga aagaagaagg ctctggggca 720
gcatccagag ccggtacatt agcatgagcg tgtggacaag ccctagacgg ctggttgaac 780
tggctggaca gagcctgctc aaggatgagg ccctggccat tgctgctctg gagctgctgc 840
ctagagagct gttccctcct ctgttcatgg ctgccttcga cggcagacac agccagacac 900
tgaaagccat ggtgcaggcc tggcctttca cctgtctgcc tctgggagtg ctgatgaagg 960
gccagcatct gcacctggaa accttcaagg ccgtgctgga cggcctggat gttctcctgg 1020
ctcaagaggt gaggcctcgg cgttggaaac tgcaggttct ggatctgcgg aagaactctc 1080
accaggattt ctggaccgtt tggtccggca acagagccag cctgtacagc tttcctgaac 1140
ctgaggctgc ccagcccatg accacaaagg ccaaagtgga tggcctgagc acagaggccg 1200
agcagccttt cattcccgtc gaagtgctgg tggacctgtt cctgaaagaa ggagcctgcg 1260
atgagctgtt cagctacctg attgagaagg tggcagccaa gaagaacgtg ctgcggctgt 1320
gctgcaagaa gctgaagatc tttgccatgc ctatgcagga tatcaagatg atcctgaaga 1380
tggtgcagct ggacagcatc gaggacctgg aagtgacctg tacctggaag ctgcccacac 1440
tggccaagtt cagcccttac ctgggacaga tgattaacct gcggaggctg ctgctgtctc 1500
acatccacgc cagctcctac atcagccctg agaaagagga acagtatatc gcccagttca 1560
caagccagtt tctgagcctg cagtgtctgc aggccctgta cgtggacagc ctgttctttc 1620
tgagaggcag gctggatcag ctgctgcggc acgtgatgaa ccctctggaa accctgagca 1680
tcaccaactg tagactgagc gagggcgacg tgatgcacct gtctcagagc ccatctgtgt 1740
ctcagctgag cgtgctgtct ctgtctggcg tgatgctgac cgatgtgagc cctgaacctc 1800
tgcaggcact gctggaaaga gcctccgcta ctctgcagga cctggtgttc gatgagtgcg 1860
gcatcaccga tgaccagctg cttgctctgc tgccaagcct gagccactgt agccagctga 1920
caaccctgtc cttctacggc aacagcatct ccatctctgc cctgcagtct ctcctgcagc 1980
atctgatcgg cctgtccaat ctgacccacg tgctgtaccc tgtgccactg gaaagctacg 2040
aggacatcca cggaaccctg cacctcgaga gactggccta tctgcatgct cggctgagag 2100
aactgctgtg cgaactgggc agacccagca tggtttggct gagcgccaat ccatgtcctc 2160
actgtggcga ccggaccttc tacgaccctg agcctatcct gtgtccttgc ttcatgccca 2220
actaatag 2228
<210> 11
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 合成ERV-K-env/MEL_03序列
<400> 11
Met Asn Pro Ser Glu Met Gln Arg Lys Ala Pro Pro Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
His Arg Asn Arg Ala Pro Leu Thr His Lys Met Asn Lys Met Val Thr
20 25 30
Ser Glu Glu Gln Met Lys Leu Pro Ser Thr Lys Lys Ala Glu Pro Pro
35 40 45
Thr Trp Ala Gln Leu Lys Lys Leu Thr Gln Leu Ala Thr Lys Tyr Leu
50 55 60
Glu Asn Thr Lys Val Thr Gln Thr Pro Glu Ser Met Leu Leu Ala Ala
65 70 75 80
Leu Met Ile Val Ser Met Val Val Ser Leu Pro Met Pro Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Asn Tyr Thr Tyr Trp Ala Tyr Val Pro Phe Pro Pro Met
100 105 110
Ile Arg Ala Val Thr Trp Met Asp Asn Pro Ile Glu Val Tyr Val Asn
115 120 125
Asp Ser Val Trp Val Pro Gly Pro Ile Asp Asp Arg Cys Pro Ala Lys
130 135 140
Pro Glu Glu Glu Gly Met Met Ile Asn Ile Ser Ile Gly Tyr Arg Tyr
145 150 155 160
Pro Pro Ile Cys Leu Gly Arg Ala Pro Gly Cys Leu Met Pro Ala Val
165 170 175
Gln Asn Trp Leu Val Glu Val Pro Thr Val Ser Pro Ile Ser Arg Phe
180 185 190
Thr Tyr His Met Val Ser Gly Met Ser Leu Arg Pro Arg Val Asn Tyr
195 200 205
Leu Gln Asp Phe Ser Tyr Gln Arg Ser Leu Lys Phe Arg Pro Lys Gly
210 215 220
Lys Pro Cys Pro Lys Glu Ile Pro Lys Glu Ser Lys Asn Thr Glu Val
225 230 235 240
Leu Val Trp Glu Glu Cys Val Ala Asn Ser Ala Val Ile Leu Gln Asn
245 250 255
Asn Glu Phe Gly Thr Ile Ile Asp Trp Ala Pro Arg Gly Gln Phe Tyr
260 265 270
His Asn Cys Ser Gly Gln Thr Gln Ser Cys Pro Ser Ala Gln Val Ser
275 280 285
Pro Ala Val Asp Ser Asp Leu Thr Glu Ser Leu Asp Lys His Lys His
290 295 300
Lys Lys Leu Gln Ser Phe Tyr Pro Trp Glu Trp Gly Glu Lys Gly Ile
305 310 315 320
Ser Thr Pro Arg Pro Lys Ile Ile Ser Pro Val Ser Gly Pro Glu His
325 330 335
Pro Glu Leu Trp Arg Leu Thr Val Ala Ser His His Ile Arg Ile Trp
340 345 350
Ser Gly Asn Gln Thr Leu Glu Thr Arg Asp Arg Lys Pro Phe Tyr Thr
355 360 365
Val Asp Leu Asn Ser Ser Leu Thr Val Pro Leu Gln Ser Cys Val Lys
370 375 380
Pro Pro Tyr Met Leu Val Val Gly Asn Ile Val Ile Lys Pro Asp Ser
385 390 395 400
Gln Thr Ile Thr Cys Glu Asn Cys Arg Leu Leu Thr Cys Ile Asp Ser
405 410 415
Thr Phe Asn Trp Gln His Arg Ile Leu Leu Val Arg Ala Arg Glu Gly
420 425 430
Val Trp Ile Pro Val Ser Met Asp Arg Pro Trp Glu Ala Ser Pro Ser
435 440 445
Val His Ile Leu Thr Glu Val Leu Lys Gly Val Leu Asn Met Leu Ala
450 455 460
Val Ile Ser Cys Ala Val Ala Gly Val Ala Leu His Gly Ser Ala Gly
465 470 475 480
Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala
485 490 495
Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp
500 505 510
Gln Lys Lys Pro Arg
515
<210> 12
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> ERV-K-env/MEL_03核苷酸序列
<400> 12
atgaacccta gcgagatgca gagaaaggct ccacctagac ggagaagaca cagaaacagg 60
gctcctctga cacacaagat gaacaagatg gtcaccagcg aggaacagat gaaactgccc 120
agcaccaaga aggccgagcc tccaacatgg gctcagctga agaaactgac ccagctggcc 180
accaagtacc tggagaacac caaagtgacc cagacacctg agagcatgct gctggcagct 240
ctgatgatcg tgtccatggt ggtgtccctg cctatgcctg ctggtgctgc cgctgccaac 300
tacacatact gggcctacgt gccctttcct cctatgatca gagccgtgac ctggatggac 360
aaccctattg aggtgtacgt gaacgacagc gtgtgggtgc caggacctat cgacgataga 420
tgtcctgcca aacctgagga agagggcatg atgatcaaca tcagcatcgg ctaccggtat 480
cctccaatct gcctgggcag agcacctggc tgtcttatgc cagctgtgca gaattggctg 540
gtggaagtgc ctaccgtgtc tcccatcagc cggttcacct accacatggt gtccggcatg 600
agcctcagac ctagagtgaa ctacttgcag gacttcagct atcagcggag cctgaagttc 660
agacccaagg gaaagccctg tcctaaagag attcccaaag agtccaagaa caccgaggtg 720
ctcgtgtggg aagagtgcgt ggccaattct gccgtgatcc tgcagaacaa cgagttcggc 780
accatcattg actgggctcc tagaggccag ttctaccaca attgcagcgg acagacacag 840
agctgtccta gcgcacaagt gtcaccagcc gtggatagcg atctgaccga gagcctggac 900
aagcacaaac acaagaaact tcagagcttc tatccctggg agtggggaga gaagggcatc 960
tctacaccaa ggcctaagat cattagccct gtgtctggac cagaacatcc cgaactttgg 1020
agactgacag tggccagcca ccacatcaga atctggagcg gcaatcagac cctggaaaca 1080
cgggacagaa agcccttcta caccgtcgat ctgaacagca gcctgaccgt gcctctccag 1140
agctgtgtga agcctcctta catgctggtc gtgggcaaca ttgtgatcaa gcccgactcc 1200
cagaccatca catgcgagaa ctgcagactg ctgacctgca tcgacagcac cttcaactgg 1260
cagcaccgga tcctgctcgt gcgagctaga gaaggcgtgt ggatccctgt ctctatggac 1320
aggccttggg aagccagccc tagcgtgcac attctgacag aggtgctgaa gggcgtgctc 1380
aacatgctgg ccgtgatctc ctgtgccgtg gctggcgtgg ccctgcatgg ctctgctgga 1440
tctgctgctg gaagcggcga gttcgtggtc atctctgcca ttctggctct ggtggtgctg 1500
accatcatca gcctgatcat cctgattatg ctgtggcaga agaagccccg gtgataa 1557

Claims (25)

1.一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向所述受试者肿瘤内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非肿瘤内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，所述重组MVA的所述肿瘤内施用使所述受试者增强所述癌性肿瘤中的炎症反应、增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
2.一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向所述受试者静脉内施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与非静脉内注射包括编码TAA和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒相比，所述重组MVA的所述静脉内施用增强自然杀手(NK)细胞反应并增强对所述TAA特异的CD8 T细胞反应。
3.一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA和4-1BBL抗原相比，所述重组MVA的所述施用使所述受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
4.一种在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向所述受试者肿瘤内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸和编码4-1BBL抗原的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内注射包括编码异源肿瘤相关抗原和4-1BBL抗原的第一和第二核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，所述重组MVA的所述肿瘤内施用在所述肿瘤中产生增强的炎症反应。
5.一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括编码内源性逆转录病毒(ERV)蛋白的第一核酸和编码4-1BBL的第二核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA和4-1BBL抗原相比，所述重组MVA的所述施用使所述受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
6.一种减小患有癌性肿瘤的受试者的肿瘤大小和/或增加所述受试者的存活率的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸、编码4-1BBL的第二核酸和编码CD40L的第三核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与单独施用重组MVA、4-1BBL抗原和CD40L抗原相比，所述重组MVA的所述施用使所述受试者增加肿瘤减小和/或增加总体存活率。
7.一种在受试者的癌性肿瘤中诱导增强的炎症反应的方法，所述方法包括向所述受试者肿瘤内施用包括编码第一异源肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸、编码4-1BBL抗原的第二核酸和编码CD40L抗原的第三核酸的重组修饰的安卡拉痘苗(MVA)，其中与通过非肿瘤内注射包括编码异源肿瘤相关抗原的第一核酸、编码4-1BBL抗原的第二核酸和编码CD40L抗原的第三核酸的重组MVA病毒产生的炎症反应相比，所述重组MVA的所述肿瘤内施用在所述肿瘤中产生增强的炎症反应。
8.一种重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包括：
(a)编码肿瘤相关抗原(TAA)的第一核酸；
(b)编码4-1BB配体(4-1BBL)的第二核酸；和
(c)至少一种另外的编码TAA的核酸。
9.根据权利要求8所述的重组MVA，其进一步包括：
(d)编码CD40配体(CD40L)的核酸。
10.根据权利要求8或9所述的重组MVA，其包括两个、三个、四个、五个、六个或更多个各自编码不同TAA的核酸。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的重组MVA，其中所述TAA选自由以下组成的组：内源性逆转录病毒(ERV)蛋白、内源性逆转录病毒(ERV)肽、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1细胞表面相关(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸相关蛋白1(TRP2)、Brachyury、p15、AH1A5、叶酸受体α(FOLR1)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)和MEL；以及其组合。
12.根据权利要求11所述的重组MVA，其中所述ERV蛋白来自人内源性逆转录病毒K(HERV-K)家族，优选地选自HERV-K包膜(HERV-K-env)蛋白和HERV-K gag蛋白。
13.根据权利要求12所述的重组MVA，其中所述ERV肽来自人内源性逆转录病毒K(HERV-K)家族，优选地选自HERV-K包膜蛋白的假基因(HERV-K-env/MEL)。
14.一种重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，其包括：
(i)编码HERV-K-env/MEL的核酸；
(ii)编码HERV-K gag的核酸；
(iii)编码优选表达为融合蛋白的FOLR1和PRAME的核酸；和
(iv)编码4-1BBL的核酸。
15.根据权利要求14所述的重组MVA，其进一步包括：
(v)编码CD40L的核酸。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的重组MVA，其中所述重组MVA源自MVA-BN。
17.一种药物制剂或组合物，其包含根据权利要求8至16中任一项所述的重组MVA。
18.根据权利要求17所述的药物制剂或组合物，其适于肿瘤内和/或静脉内施用，优选肿瘤内施用。
19.根据权利要求8至16中任一项所述的重组MVA，其用作药剂或疫苗。
20.根据权利要求8至16中任一项所述的重组MVA，其用于治疗癌症，优选黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌或卵巢癌。
21.根据权利要求8至16中任一项所述的重组MVA，其用于使受试者，优选人类增强癌性肿瘤的炎症反应、减小癌性肿瘤的大小、延缓或阻止癌性肿瘤的生长和/或增加总体存活率。
22.根据权利要求19至21中任一项所述使用的重组MVA，其中所述重组MVA是肿瘤内和/或静脉内施用的，优选肿瘤内施用的。
23.根据权利要求19至22中任一项所述使用的重组MVA，其中所述重组MVA与TAA特异性抗体组合使用。
24.根据权利要求19至22中任一项所述使用的重组MVA，其中所述重组MVA与免疫检查点分子拮抗剂或激动剂组合使用。
25.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述重组MVA是根据权利要求8至16中任一项所述的重组MVA。
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