CN105940102B - 抗cd30嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

于一方面，本发明关于经基因改造的T细胞，其具有一嵌合抗原受体，以用于治疗一个体内的CD30+癌症的过继性细胞疗法中。更具体的，本发明关于一种具有可对CD30+癌细胞表现毒性但对CD30+非癌细胞不具毒性的一特定嵌合抗原受体的T细胞。进一步地，本发明关于一种特定嵌合抗原受体以及可编码出该受体的核酸分子与具有相同核酸分子的载体与细胞。最后，本发明关于该嵌合抗原受体的用途，以用于改善具有相同受体的淋巴细胞的持久性与放大作用，以及特定胜肽的用途，用以改善经基因改造并表现出相同胜肽的淋巴细胞的持久性与放大作用。

Description

抗CD30嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明第一方面关于经过基因改造的T细胞，其具有一嵌合抗原受体(CAR)，用于对需要治疗CD30+癌症的个体所进行的过继性细胞疗法。更具体的，本发明关于一种经过基因工程的T细胞，其中含有并表现出一种特定嵌合抗原受体，其对于CD30+癌细胞具有毒性，但对于CD30+则不具有毒性。另一方面，本发明关于一种特定嵌合抗原受体以及编码相同的细胞核酸分子，以及相同编码的载体及细胞。最后，本发明关于利用一嵌合抗原受体改良具有相同编码的淋巴细胞的持久性与放大作用，以及利用特定胜肽以改良经基因改造并表现出相同特征的淋巴细胞的持久性与增殖作用。
背景技术
过继性T细胞转移已于恶性肿瘤疗程中展现出显著功效，并可对患有包括白血并在内各种疾病之患者发挥治疗效果。通常而言，自患者身上所衍生出的T细胞经体外工程以表现为一重组T细胞(T细胞受体，TCR)，或者称为嵌合抗原受体(CAR)。该嵌合抗原受体一般为衍生自一抗体的一细胞外抗原结合域以及衍生自一传递讯号的T细胞受体胞内结构域的一细胞内T细胞活化域所组成。与生理学上的T细胞受体不同，嵌合抗原受体由一单一多胜肽链所组成，其可通过细胞外部分与细胞内的传递讯号部分所提供的一T细胞活化机构与抗原结合。故，因为衍生自结合域的该抗体缘故，经嵌合抗原受体所修正的T细胞可无视主要组织相容复合体(MHC)的表现与否独立辨识其目标，该目标通常为一细胞表面抗原，且其效果不因肿瘤细胞变体中因抗原较低或缺乏抗原而常见的肿瘤免疫脱逃机制所干扰。
嵌合抗原受体近年来已受到广泛的研究所重视，嵌合抗原受体T细胞的溶细胞能力为过继细胞疗法的焦点所在。近期的癌症治疗临床试验强调以经嵌合抗原受体重新导向的T细胞进行过继性疗法的潜力。举例而言，神经母细胞瘤患者经由针对GD2神经节糖苷(Ganglioside)的嵌合抗原受体T细胞进行治疗后，虽然T细胞仅维持一简短期间，仍展现出令人激励的抗肿瘤效果。近一步研究证实，经过嵌合抗原受体工程的T细胞，在受慢性与急性淋巴性白血病所苦的患者体内可有效激发抗肿瘤反应。嵌合抗原受体T细胞疗法与其他抗体作为媒介的免疫疗法策略不同，例如利用免疫毒素者，目前利用经改造工程的细胞，而非使用单一分子。
近年来，业界对于嵌合抗原受体的最佳化设计已投入诸多心力，可参照如Bridgeman J.S.,et al.所著内容(Curr Gene Ther 2010,10,77-90)。然而，目前仍有许多挑战，更具体的，关于更有效的抗肿瘤反应与延长T细胞存活周期以使该经工程改造的T细胞于体内具有更长持久性的必要性。另外，于临床实施中维持T细胞持久性以及活性所需要的共激讯号仍需要加以辨识。所以仍须进一步努力，以达成适用于包括过继性免疫疗法在内的各种疗法的最理想嵌合抗原受体。
于1999年，Hombach A.,et al.的著作(Immunotherapy,1999,22(6),473-480)描述一嵌合T细胞受体，其具体用于与CD30抗原相关联的何杰金氏淋巴癌(Hodgkin’sLymphoma)中。于此已确认，该嵌合受体的特定交联会诱发非限制性主要组织相容复合体的细胞毒性，其作用于CD30+目标细胞，但不会作用于CD30-细胞。由于CD30不仅会通过肿瘤细胞表现，也会借助正常活化的B细胞表现，故以往并未利用CD30作为目标。此假设受Savoldoet al.的报告(Blood,2007,110(7),2620-2630)所支持，其表示嵌合抗原受体T细胞表现出良性B细胞类的类淋巴细胞株(LCL cell lines)的细胞溶解增加。此处所使用的嵌合抗原受体为一“第一代”嵌合抗原受体，其中不具有细胞内CD28结构域(CD28domain)。
Hombach A.et al.的著作(Gene Therapy,2010,17,1206-1213)描述细胞外嵌合抗原受体部分中对IgG1Fc间隔域(spacer domain)的改造作用，以避免由具有Fc受体的细胞所引起的非目标活性化以及意外引发的先天性免疫反应。
Kofler的著作(2011,Mol.Ther.19,760-767)叙述一嵌合抗原受体分子具有一CD28胞内结构域，其与一CD3zeta胞内结构域以及由一抗体所衍生对CEA的scFv胞外域所结合。其中并描述，将CD28嵌合抗原受体胞内域中的lck结合部分去除，可于调节性T细胞(Treg cells)存在的情况下改善经重新导向的抗肿瘤活性，且不会损害干扰素伽玛(interferon gamma)的分泌、增殖与细胞溶解。据推测具有经改造CD28胞内结构域的该嵌合抗原受体可加快对于患有各种可大量受调节性T细胞所渗入的癌症患者体内实施过继性T细胞疗法。
另外，Hombach et al.对于利用具嵌合抗原受体重新导向的T细胞过继性疗法提供简要说明(Current Molecular Medicine,2013,13(1),1-10)，其中，嵌合抗原受体效果经表示具有共激活性，以及可改善并延长经重新导向的抗肿瘤T细胞反应。除此之外，此种过继性疗法的不利反应经描述包括“细胞因子风暴”以及“T细胞抑制”。
表现出嵌合抗原受体T细胞于过继性疗法中除了有益效果外，一具有不利的副作用，目前已知会阻碍上述各种疗效的理想发展。如引证文件所述，嵌合抗原受体的发展催生出第二代及第三代嵌合抗原受体，其具有一或二共激讯号域，且亦试图克服相同的问题。然而，以嵌合抗原受体为基础的过继性疗法仍存在另一项问题，亦即经改造工程表现出嵌合抗原受体的T细胞并无法区分恶性癌细胞(肿瘤细胞)与健康细胞(非肿瘤细胞)。故，针对癌症的嵌合抗原受体T细胞疗法所存在的主要问题，为要将对于健康组织造成的副作用减至最小。由于抗肿瘤效果必须长期存在嵌合抗原受体T细胞，所以目前亟欲改善嵌合抗原受体T细胞的持久性、存活度与增殖性。
发明内容
于一方面，本发明关于一种T细胞，其具有一嵌合抗原受体，以用于过继性细胞疗法以治疗体内患有CD30+癌症的个体，包括CD30+白血病或CD30+淋巴癌，借以使嵌合抗原受体自N端(N-terminus)至C端(C-terminus)具有下列结构域：
一抗CD30单链抗体域，更具体的，SEQ ID No.2的HRS3-scFv或其一同源物，其可特定结合于与SEQ ID No.2具有至少70％辨识度的CD30；
一间隔域(spacer domain)；
一穿膜域(transmembrane domain)；以及
一细胞浆讯号传递域(cytoplasmatic signalling domain)；
其特征在于该具有嵌合抗原受体的T细胞对于CD30+癌细胞具有毒性，更具体的，对于CD30+白血病细胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但对于该个体体内的CD30+非肿瘤(健康)细胞则不具有毒性。
更具体的，本发明关于一种T细胞，其表现出嵌合抗原受体，该抗原受体为SEQ.IDNo.3的一多胜肽，受Seq.ID.No.4的一核酸或一其同源物所编码。
进一步方面，本发明关于利用本发明所揭露该具有嵌合抗原受体的T细胞以治疗患有CD30+癌症而需要治疗的个体。更具体的，该CD30+癌症为何杰金氏淋巴癌(Hodgkin’sLymphoma)、间变性大细胞淋巴癌(anaplastic large cell lymphoma)、急性淋巴性白血病(acute lymphocytic leukaemia)、皮肤淋巴癌(cutaneous lymphoma)、蕈样霉菌病(mycosis fungoides)、塞札里淋巴癌(Sézary lymphoma)、淋巴增生性疾病(lymphoproliferative diseases)、全身性肥大细胞增生症(systemic mastocytosis)、畸胎癌(teratocarcinoma)、干细胞衍生性恶性肿瘤(stem cell derived malignancies)、癌干细胞(cancer stem cells)与其他癌症中的任一者。
再者，本发明关于SEQ ID No.3或的一种多胜肽一其同源物，其具有与SEQ IDNo.3达至少90％的辨识度，借此，该多胜肽或其一同源物于T细胞中表现为一嵌合抗原受体时，可对于CD30+癌细胞具有毒性作用，但对于CD30+非癌细胞则不具有毒性。
此外，本发明关于一核酸分子，其可编码出本发明所述的多胜肽，本发明亦关于一载体，其具有该核酸序列如Seq.ID.No.4。再者，本发明提供一种细胞、细胞株或具有该核酸序列或该载体的宿主细胞，亦提供一套件或系统，其含有该载体或一细胞、细胞株或具有该载体或该核酸序列或具有该核酸分子的一宿主细胞。
最后，本发明关于利用本发明所揭露的嵌合抗原受体已改善任何经基因工程改造的免疫细胞的持久性与放大作用，该免疫细胞尤指表现该嵌合抗原受体的淋巴细胞。此外，本发明关于使用HRS3scFv胜肽或可编码出相同胜肽的核酸，当该胜肽融合于任何受基因工程改造林巴细胞所特定表现的一嵌合抗原受体时，用以改善任何可表现该胜肽的基因工程改造淋巴细胞的持久性及放大作用的用途。
附图说明
图1是带有Seq.ID.No.3的嵌合抗原受体#1138的模组化组成，其由一Seq.ID.No.4核酸所编码。
图2是经工程改造的人类T细胞，其表现出该嵌合抗原受体#1138，人类周边T细胞经由一健康捐赠者的血液中分离出来，并借助载体#1138的转导进行逆转录病毒工程，于12小时后，细胞以双色流式细胞分选仪(FACS)，根据SOP_tumorgenetics_FACS利用PE标记的多株山羊人类IgG Fc抗体(PE-labelled polyclonal goat anti-human IgG Fcantibody)以及FITC标记鼠科抗人类CD3单株抗体UCHT1进行检测#1138嵌合抗原受体的表现。
图3是工程改造的T细胞消除CD30+淋巴瘤细胞以及降少CD34+CD30+造血干细胞(hematopoetic stem cells)。具有嵌合抗原受体#1138的T细胞，具嵌合抗原受体#1138的T细胞、于shame转导后不具有嵌合抗原受体的T细胞(T-cells#1138negative)以及未经修改的T细胞(w/o)与同种异体的CD34+造血干细胞进行共同培养，以受诱发表现CD30，以及与CFSE标记Myla CD30+细胞共同培养24小时。细胞经抗CD34PE单株抗体(mAb)AC136(20μl)染色，加入计数标准(counting standard)(5μl/test)以及7AAD(5μl/test)，并将细胞以流式细胞分选仪将计数设定于1000events的标准微珠进行分析。进行三重复检测，并测定目标细胞的总数量。
图4是分别为具有与非具有#1138嵌合抗原受体的细胞，与同种异体的CD34+造血干细胞进行共同培养。细胞经抗CD34PE单株抗体(mAb)AC136(20μl)染色，加入计数标准(counting standard)(5μl/test)以及7AAD(5μl/test)，并将细胞以流式细胞分选仪将计数设定于1000events的标准微珠进行分析。各目标族群中的死亡细胞(7-AAD+)数量经测定并利用下列公式显示为总目标细胞中的死亡细胞百分比：死亡细胞百分比＝(7-AAD+目标细胞数量/总目标细胞数量)*100，完成三重复检测。
图5是拟人化SCID小鼠周边血液中具有抗CD30嵌合抗原受体T细胞#1138的情况下所留存的CD30+T细胞及B细胞。SCID小鼠受移植有人类造血系统，以使其周边血液中具有B细胞与T细胞。于第0日时，来自同一捐赠者并受#1138嵌合抗原受体工程改造的人类T细胞，借助静脉注射进行转移输入。于利用抗CD30嵌合抗原受体T细胞#1138治疗前第5日以及治疗50日后，以流式细胞仪纪录周边血液中的CD30+CD4+T细胞(A)以及CD30+CD19+B细胞(B)。
图6是具有抗CD30嵌合抗原受体#1138的T细胞于试管培养中的理想累积情况，周边血液淋巴细胞以各嵌合抗原受体进行移植。于转导后，细胞在Xvivo15培养基中辅以10％FCS及IL-2(500U/ml)进行培养。培养基每周更换一次，并每三日添加一次IL-2。于开始培养后，将CD3+T细胞经利用FITC共轭抗小鼠及PE共轭抗人类IgG1Fc抗体于指定时间内进行纪录其嵌合抗原受体表现。
图7中的图7a显示实验设计流程图，图7b显示由本发明抗CD30嵌合抗原受体T细胞导致自体B细胞的目标细胞的胞溶情况。
具体实施方式
发明人的目标提供经基因改造以具有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，借以使T细胞对于个体内的CD30+癌细胞可产生毒性活化，而对CD30+非癌细胞则不具有毒性。亦即，于一方面，本发明关于具有一嵌合抗原受体的T细胞，用于过继性细胞疗法中以治疗个体所患的CD30+癌症，尤指CD30+淋巴癌或CD30+白血病，借此，该嵌合抗原受体自其N端(N-terminus)至C端(C-terminus)至少具有下列结构域：一抗CD30单链抗体域，更具体的，SEQ ID No.2的HRS3-scFv或其一同源物，其可特定结合于与SEQ ID No.2具有至少70％辨识度的CD30；选择性一间隔域(spacer domain)；一穿膜域(transmembrane domain)；以及一细胞浆讯号传递域(cytoplasmatic signalling domain)；其特征在于该具有嵌合抗原受体的T细胞对于CD30+癌细胞具有毒性，更具体的，对于CD30+白血病细胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但对于该个体体内的CD30+非肿瘤(健康)细胞则不具有毒性。
于此连结关系中，“CD30+癌细胞”一词指表现出CD30分子的恶性细胞或瘤细胞。
再者，“CD30+非肿瘤细胞”一词指表现出CD30分子的良性(健康)细胞，例如活化的T细胞、B细胞或干细胞。
除非特别定义，否则“非肿瘤细胞”与“肿瘤细胞”等词可分别与“非癌细胞”与“癌细胞”等词交互使用。
于此所述，“包含”或“含有”以及“具有”或“拥有”表示“有…成分”或“由…组成”的实施例。
于此所述，“同源物”一词指分子，可为DNA或多胜肽，其具有一既定量的序列相似度，至少达70％，例如至少达其80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的核酸序列或胺基酸序列。同源指两序列的辨识规模，同源序列具有相同或相似特性，更具体的，具有相同或相似的序列辨识度。举例而言，Seq.ID.No.2的HRS3scFv序列，其对于CD30分子具有与HRS3scFv分子相同或相似的结合特定性。再者，同源物包括核酸分子，其可编码出相同胜肽，但可能因基因码的简并性(degeneracy)而使序列有所变化。再者，辨识度指具有相同胺基酸或核酸分子排列于序列中的顺序，亦即，就至少90％辨识度的情况下，有90％以上的核酸或胺基酸分子分别位于相同位置上。除非另外特别定义，否则“同源”与“同辨识度”于此可交互使用。于一实施例中，所述同源物为SEQ ID No.2的HRS3scFv胜肽的同源物，其特定结合于由SEQ ID No.2的胜肽所辨认的相同抗原决定位(epitope)。
另外，“经基因工程改造”一词指细胞借助基因工程加以控制，亦即细胞具有并非原本出现在该等细胞内的异种序列。典型地，异种序列通过一载体系统导入，或通过其他手段将核酸分子导入包含脂质体在内的细胞中。异种核酸分子可经融合至该等细胞的基因组中，或可表现于染色体外，例如以质体的型态表现。此用词亦包含将经基因工程改造并分离的嵌合抗原受体多胜肽导入细胞中的实施例。
一般而言，嵌合抗原受体为融合蛋白，由细胞外抗体类的辨识域融合于细胞内T细胞讯号传递蛋白质所组成。典型地，具有抗原辨识域的胞外域包含一讯号胜肽以及一抗原辨识单元。根据本发明，该胞外域含有一抗CD30单链结构域，较佳者，该单链结构域为选自SEQ.ID.No.2的HRS3scFv或其同源物的单链结构域，其特定结合于具有与SEQ ID No.2达至少70％辨识度的CD30。再者，该单链结构域可衍生自其他抗CD30抗体如HRS4或Ki-4。该等抗体对于CD30具有与HRS3相同的结合特定性，亦即结合至CD30的相同抗原决定位(epitope)。
该胞外域可借助一间隔域与该穿膜域相互间隔，该选择性具有的间隔域将抗原结合域与穿膜域连结，较佳者，该穿膜域具有足够弹性使该抗原结合域朝向不同方向以利抗原辨识。
该穿膜域一般为跨越细胞膜的一疏水性阿法螺旋(hydrophobic alpha helix)，亦可利用其他穿膜域。最后，该胞内结构域代表嵌合抗原受体细胞浆(cytoplasmic)部分中的讯号传递域。
于此可认定具有如前所述嵌合抗原受体的T细胞，亦即具有自N端至C端具有下列要素的嵌合抗原受体：一抗CD30单链抗体域，其可选择性为一间隔域、一穿膜域、一细胞浆域，可区别于CD30+癌细胞以及CD30+非癌细胞之间以表现毒素活动。故，本发明所揭露的T细胞克服了细胞毒化作用会同时影响CD30+癌细胞与CD30+非癌细胞技术的问题，如相关技术中所述。
于本发明一实施例中，该嵌合抗原受体具有一开端序列(leader sequence)，位于N端至抗CD30单链抗体域。
另外，于一实施例中，该抗CD30单链抗体域为一HRS3scFv胜肽，更具体的，其属于SEQ.ID.No.2。于此可认定，变异域(scFv)的一抗CD30单链抗体片段，更具体的属于HRS3，可表现出理想的活性，亦即对于CD30+癌细胞产生毒性，但对CD30+非癌细胞则无毒性。
于另一实施例中，该嵌合抗原受体分子的间隔域为SEQ.ID.No.5的一IgG1铰链CH2CH3域或其同源物，其具有至少达70％的可辨识度，间隔域为SEQ.ID.No.5的突变IgG1铰链CH2CH3域。
于某些实施例中，该间隔域与穿膜域之间可设有一连结体(linker)。举例而言，于Seq.ID.No.3的嵌合抗原受体中，一4胺基酸连结体设置于间隔域与穿膜域之间。
再者，另一实施例关于一具有嵌合抗原受体的T细胞，其中该穿膜域衍生自CD28分子，例如该CD28分子的穿膜域缺少SEQ.ID.No.6的lck域(lck domain)。
讯号传递域或胞内结构域或细胞内结构域等可于此交互替换，其含有一CD3zeta或FcEpsilon受体(IgE受体)珈玛链讯号传递链或一共激域。举例而言，该细胞内结构域为SEQ.ID.No.7的一CD3zeta讯号传递域或其同源物，其具有至少70％之同源性。于另一实施例中，该细胞内结构域为SEQ.ID.No.8的Fc epsilon受体加码讯号传递域(Fc epsilonreceptor gamma signalling domain)或其一同源物，其具有至少70％的辨识度。该讯号传递域分别负责T细胞的细胞毒性作用活化或T细胞的干扰素伽玛(interferon-gamma)分泌。
该嵌合抗原受体分子可为一所谓的“第二代”嵌合抗原受体分子。第二代嵌合抗原受体分子具有经改良的讯号传递域，其额外具有一第二讯号传递域，例如衍生自CD28、CD134(OX40)或CD137(4-1BB)。“第三代”嵌合抗原受体分子具有一经结合的共激讯号传递域，例如CD28与CD137或CD134结合。
一篇关于嵌合抗原受体分子的概论由Gilham D.E.et所提供(MolecularMedicine,2012,18(7),377-384)。
于本发明一较佳实施例中，该T细胞为一具有一嵌合抗原受体的T细胞，其中该嵌合抗原受体为SEQ.ID.No.3的一多胜肽。该嵌合抗原受体于此亦指#1138。
该抗CD30嵌合抗原受体#1138细表现于T细胞表面，并构成于变异区域(scFv)抗体抗HRS3CD30单链片段的胞外部分以及经修改的人类IgG1CH2CH3结构域，并于scFv及穿膜域之间具有一间隔。该IgG1结构域的修改作业包括点突变，以将野生型(wild-type)胺基酸序列PELLGGP X13MISRT(Seq.ID.No.9)转换为PPVA-GP X13MIART(Seq.ID.No.10)，其可减少嵌合抗原受体Fc结构域意外结合其他细胞如原生免疫细胞的Fc受体，此情形可能意外影响其活化作用以及嵌合抗原受体T细胞的活化作用。嵌合抗原受体#1138的穿膜与近细胞内膜部分衍生自人类CD28，并融合于人类CD3zeta的细胞内部分。该CD28序列突变于P560>A560、P563>A563、P564>A564(Kofler et al.,Mol.Ther.19,760-767(2011))。因此，lck激化酶的CD28结合部位受该序列所破坏，lck讯号传递途径与后续受嵌合抗原受体所影响的IL-2分泌受到阻止。前临床模型指出，可于此等条件之下降低调节性T细胞(Treg cells)影响嵌合抗原受体T细胞效应功能的抑制作用
如范例中所示，T细胞(CD4+或D8+T细胞)于CD30+细胞上的运作不同，CD30+癌细胞经杀死，而CD30+非癌细胞则与具有#1138嵌合抗原受体的T细胞继续留存。
如一范例，表现该#1138嵌合抗原受体的T细胞对于健康的人类CD30+CD34+造血干细胞并不具有毒性，而CD30+淋巴瘤细胞则会被消灭。
再者，如范例中所示，本发明具有1138嵌合抗原受体的T细胞于鼠类模式中对健康的人类B细胞与T细胞不会表现出毒素活性，对于自体移植的健康细胞并无显著的自我免疫活动，亦无不利副作用发生。此外，对于病原体的淋巴细胞免疫反应并未有所变化，仍可对于受测病原体发挥细胞免疫保护作用。
于另一方面，本发明关于本发明中具有一嵌合抗原受体的T细胞于试应性细胞疗法以对一个体进行CD30+癌症治疗的用途。举例而言，该CD30+癌症可为何杰金氏淋巴癌(Hodgkin’s Lymphoma)、间变性大细胞淋巴癌(anaplastic large cell lymphoma)、急性淋巴性白血病(acute lymphocytic leukaemia)、皮肤淋巴癌(cutaneous lymphoma)、蕈样霉菌病(mycosis fungoides)、淋巴增生性疾病(lymphoproliferative diseases)、全身性肥大细胞增生症(systemic mastocytosis)、畸胎癌(teratocarcinoma)、干细胞衍生性恶性肿瘤(stem cell derived malignancies)、癌干细胞(cancer stem cells)与其他癌症。
亦即，本发明所揭露具有嵌合抗原受体的T细胞可令人讶异地在不伤害个体内非癌症CD30+细胞的情形下治疗个体的CD30+癌症。与先前对于各种具不同抗原结合域的嵌合抗原受体观测结果相反，该抗CD30抗体域可消灭恶性CD30+细胞并且不影响良性CD30+细胞。
于另一方面，本发明关于SEQ.ID.No.3的多胜肽，其于此代表#1138所指的嵌合抗原受体多胜肽，或其一同源物，其可达至少90％的辨识度，借此，该多胜肽或其同源物于T细胞中表现为一嵌合抗原受体，其可于CD30+癌细胞上表现毒性作用，而对于CD30+非癌细胞则不具有毒性。举例而言，该SEQ.ID.No.3的多胜肽由Seq.ID.No.4的核酸序列所编码。
该多胜肽的组成包括抗CD30抗体的HRS3-scFv单链结构域；一间隔域，其为突变的IgG1铰链CH2CH3结构域；一穿膜域，其衍生自CD28，更具体的，由一CD28衍生的穿膜域，其缺少lck结构域；以及CD3zeta的胞内结构域。
另外，本发明提供核酸分子，包括用以编码出本发明多胜肽的核酸序列。再者，亦提供载体，其包含本发明所述用以编码该多胜肽的核酸序列。精通技艺者可了解适用的载体系统及载体，更具体的，为可达成真核细胞的转染与转导，更具体的，该真核细胞为T细胞。
再者，本发明提供一细胞、细胞株或具有本发明所揭露该载体或本发明所揭露一核酸分子的宿主细胞。较佳者，该细胞、细胞株或宿主细胞为一T细胞，例如一CD4+T细胞或一CD8+T细胞。
另外，本发明提供一套件或系统，其含有本发明所揭露该载体、本发明所揭露该细胞或宿主细胞，或本发明所揭露该多胜肽或本发明所揭露一核酸分子或其组合，用以制造表现该嵌合抗原受体的T细胞。本发明所揭露该套件或系统可进一步含有其他组成，包含将该载体或核酸分子上的多胜肽导入该等细胞的手段。精通技艺者可了解达成该目的的适用手段。
再者，本发明关于一于此所述的嵌合抗原受体，用以改善可表现该嵌合抗原受体#1138或其同源物的任何经基因工程改造的淋巴细胞的持久性及增殖性。亦即，本发明令人讶异地发现与其他多种嵌合抗原受体不同，本发明所揭露的嵌合抗原受体#1138可对该经基因工程改造的淋巴细胞提供经改良的持久性与放大作用，如范例中所示。所以，可克服现今已知的嵌合抗原受体T细胞所具有的临床相关缺点，亦即个体内经工程改造的T细胞的持久性太短，以及经工程改造的T细胞的数量骤降等问题。
最后，本发明提供一HRS3scFv胜肽，以及其同源物，其于受HRS3的scFv所辨识的抗原决定位(epitope)方面具有相同特质。亦即，例如抗体HRS4及Ki-4结合于相同的抗原决定位。故，HRS4的scFv以及Ki-4的scFv于此发明中相似地具有相同活性。另外，亦提供可编码出所述胜肽的核酸序列。该等胜肽及核酸当该scFv胜肽为一嵌合受体或经融合于由经基因工程改造的淋巴细胞所特定表现出的一嵌合抗原受体的一部分时，适用于改善任何经基因工程改造的淋巴细胞的持久性与放大作用。亦即，举例而言，将HRS3scFv胜肽，例如由Seq.ID.No.1序列所编码的SEQ ID No.2的HRS3scFv胜肽，与一额外具有一不同抗原结合特定性的嵌合抗原受体相互结合，可改善该经工程改造淋巴细胞的持久性与放大作用。
本发明进一步利用不同范例叙述，该等范例用以进一步说明本发明，而非用以限定本发明内容。
范例
制备检测物件
用于#1138嵌合抗原受体的逆转录病毒载体编码，根据SOP-GL-VectProd利用一长臂猿白血病病毒假性外套膜(Galv pseudotyped envelope)所制造。简要而言，载体微粒制作以
Figure BDA0000929973710000111
为媒介的DNA转染后于人类胚胎肾细胞株293T上瞬时制成。载体微利以长臂猿白血病病毒(Galv)假性处理。并无测定到载体滴度(vector titer)。
人类血液淋巴细胞的转导根据标准技术(Cheadle,E.J.,et al.,Chimericantigen receptors for T-cell based therapy.Chapter 36,in:"Antibodyengineering:methods and protocols",2nd Edition,Ed.P.Chames,Meth.Mol.Biol.907,645-666(2012),doi:10.1007/978-1-61779-974-7_36)所完成。简要而言，人类淋巴细胞以经转染二日的293T细胞的二日浮质(supernatant)所转导。该嵌合抗原受体#1138由20-35％的人类T细胞所表现，其于第二日以流式细胞仪(flow cytometry)利用受引导至该抗原嵌合受体细胞外IgG1CH2CH3结构域的一抗体所测得。与抗原嵌合受体#1175的比较，参照Hombach A,et al.所著内容(Gene Ther.2010Oct；17(10):1206-13.doi:10.1038/gt.2010.91.Epub 2010Jun 17)，其以相同程序测得表现于17-30％的人类T细胞上。
于细胞表面表现该嵌合抗原受体#1138的CD4+CD8+T细胞可利用特定节于于嵌合抗原受体HRS3scFv结构域的9G10抗体进行记录。经该#1138嵌合抗原受体工程改造的T细胞会特定结合于表现出CD30的细胞并且变得活性化，该活性化现象表现于包括IFN-γ在内的细胞素借助增殖量以及于CD30+目标细胞内的胞溶作用提升而增加分泌。值得注意的是，当T细胞受嵌合抗原受体#1138所刺激时，仅出现IL-2的背景浓度分泌。然而，当T细胞受其生理性T细胞受体及CD28刺激时，分泌出生理作用量的IL-2。T细胞#1138的活性化作用针对特定抗原，如该嵌合抗原受体的特定性所界定，因为CD30-细胞并不会驱动T细胞的活化。可溶性CD30累积于CD30+淋巴癌患者血清中，其并不会阻碍于以嵌合抗原受体为媒介于10μg/ml浓度中的T细胞活化作用(Hombach A,et al.,Cancer Res.1998Mar 15；58(6):1116-9)。此原因在于该嵌合抗原受体必须借助结合目标抗原的多数相同目标抗原以驱使T细胞活化，借此进行交联，而此作用仅能发生于当CD30于表面受到固定，或经表现在目标细胞表面时，但当CD30蛋白质呈现于溶液中时无法发生。
范例1：经嵌合抗原受体#1138修改的T细胞对于CD30+肿瘤以及健康细胞的作用
将T细胞施以嵌合抗原受体#1138的修改工程
具有#1138嵌合抗原受体的人类周边T细胞的移植，于转导12小时后经由双色流式细胞仪进行评估，图2显示经嵌合抗原受体工程的T细胞点墨分析(dot blot analysis)，表现#1138嵌合抗原受体T细胞的数量为所有T细胞中的16.5％。
具嵌合抗原受体#1138的T细胞以及受控制T细胞的纯化作业
T细胞#1138经培养60小时，并以抗人类IgG-Fc-FITC以及抗anti-CD3-PE抗体标记，前者为结合嵌合抗原受体的抗体，后者可辨识T细胞，再利用FACSAria III细胞分选仪进行分选。Gate经设定为CD3+嵌合抗原受体#1138+以及CD3+嵌合抗原受体#1138-的T细胞。经分选细胞的各分装(aliquot)以FACS进行再分析。CD3+#1138+以及CD3+#1138-T细胞的纯度分别为94.4％及99.6％。
同种异体CD34+造血干细胞的分离作业
CD34+细胞利用密度离心(density centrifugation)以及磁性细胞分选(MACS)GM-CSF自自愿捐赠者周边血液进行分离。细胞以抗CD34PE共轭mAb进行标记，且经分离(fractionated)且未分选(unsorted)细胞的各分装经流式细胞分选仪(FACS)进行分析。经分离的CD34+细胞纯度为94.4％。
Myla细胞的CFSE标记
Myla细胞以1.25μM CFSE标记，并与经分离的CD34+造血干细胞混合。经CD34-PEmAb及CFSE+Myla细胞所辨识的CD34+细胞可经清楚区分，且两者群体可经独立分析其存活率。
具#1138嵌合抗原受体T细胞的重新导向毒素对于CD30+淋巴癌细胞以及CD30+CD34+造血干细胞
CD30+MyLa白血癌细胞与CD30+CD34+健康造血干细胞以及经抗CD30嵌合抗原受体#1138工程的T细胞进行共培养，控制组则以相同的CD30+细胞与来自相同捐赠者及细胞制备方法的不具嵌合抗原受体T细胞(T-cells#1138negative)进行共培养。
目标细胞总数经由流式细胞分选仪(FACS)测定，且利用计数标准进行标准化。CD34+CD30+造血干细胞利用单株抗CD34-PE抗体染色辨识，并缺乏CSFE标记，其与CFSE胞计Myla细胞不同。进行三重复检测，资料总结于图3中。CD34+造血干细胞的数量无论在搭配不具嵌合抗原受体(w/o)T细胞、具嵌合抗原受体T细胞(T-cells#1138)或于转导程序后缺乏嵌合抗原受体T细胞(T-cells#1138negative)的情况下都并未增加。与CD34+CD30+健康细胞，由于期望中的T细胞同种异体反应(T-cells#1138negative)外，再加上嵌合抗原受体T细胞媒介的细胞杀死作用，经CD30+CFSE标计的Myla细胞实质上有所减少。
为测定T细胞嵌合抗原受体#1138对于CD30+健康细胞及肿瘤细胞的毒性，死亡目标细胞的数量利用常用的流式细胞仪进行测定。CD34+CD30+健康细胞借助抗CD34-PE抗体辨识，并自CFSE标计的Myla淋巴癌细胞中进行区分。存活与死亡的目标细胞以7-AAD染色测定，资料总结于图3中。
结论
具有抗CD30嵌合抗原受体#1138的T细胞对于健康CD30+CD34+造血干细胞的毒性以及对于目标CD30+淋巴癌细胞的毒性经过测试并相互比对。来自一健康捐赠者的T细胞经工程改造以表现出#1138嵌合抗原受体，且来自相同转导批次不具嵌合抗原受体的T细胞经由细胞分选纯化。该程序利用以比对嵌合抗原受体所媒介的特定毒性以及受该转导程序本身所诱发的任何非特定毒性。我方对于精纯化T细胞#1138毒性对于CD34+同种异体造血干细胞的反应性进行记录。再者，我方并于同次测试中，借助混合不同标记的目标细胞，同时计录对于CD30+淋巴癌细胞以及对于CD30+CD34+造血干细胞的毒性。该程序可于同次测试中评估直接毒性(direct toxicity)与间接毒性(bystander toxicity)，对于测试组与控制组两者的观测时间皆为24小时。
我方发现经CFSE-labelled标计的CD30+Myla淋巴癌细胞当与T细胞#1138共培养时，较与无#1138的T细胞共培养时有所下降。与此现象相符地，死亡Myla目标细胞的数量与T细胞#1138共培养时呈现实质上增加，相反地，CD34+健康造血干细胞与死亡CD34+细胞的数量皆未减少。值得注意地，虽然在CD34+CD30+细胞的附近区域发生T细胞#1138杀死对于CD30+肿瘤细胞的特定杀害情形，但我方并未观测到对于CD34+造血干细胞的任何直接或间接毒性。且具有嵌合抗原受体#1138的T细胞对于CD30+淋巴癌细胞表现出特定毒性，但并未对健康的CD30+CD34+造血干细胞表现毒性。
范例2：经嵌合抗原受体#1138工程改造的T细胞于鼠类模式中对于人类B细胞及T细胞未出现毒素作用
剂量选择
人类CD34+造血干细胞由脐带血中分离。新生Rag2-/-common gamma chain-/-小鼠受移植3x105的CD34+造血干细胞，以移植人类造血系统。每只成功移植的小鼠动物再个别以单一静脉注射的方式受移植2.5x106的T细胞。
动物维持
物种：鼠类
品系/族群：Rag2-/-cγ-/-
物种选择：缺乏T细胞与B细胞的小鼠样本用以移植人类造血系统；重建的造血系统可近乎仿造人类条件。
动物辨识
表1
Figure BDA0000929973710000141
表1：A-E＝繁殖组；m＝雄性、w＝雌性；1-6小鼠编号
人类造血系统移植
Rag2-/-cγ-/-小鼠受来自脐带血并经分离的人类CD34+造血干细胞(SOP-RepopCD34,Appendix 6)并于5周后以流式细胞仪纪录周边血液中的人类CD45+及CD4+CD45+T细胞，经监测成功建立成熟的人类淋巴细胞。
实验组别
该等动物根据研究计划分为三组测试组别，如下列所示各组。
表2
Group 1: (#1138<sup>+</sup>9G10)
E-m2左及右 CD3<sup>+</sup>细胞#1138
C-m3(左) CD3<sup>+</sup>细胞#1138
E-m6(左) CD3<sup>+</sup>细胞#1138
Group 2: (#1138)
E-m4(无) CD3<sup>+</sup>细胞#1138
E-m5(右) CD3<sup>+</sup>细胞#1138
E-w1(无) CD3<sup>+</sup>细胞#1138
Group 3: (#1175)
B-w1(无) CD3<sup>+</sup>细胞#1175
CD3<sup>+</sup>细胞#1175
CD3<sup>+</sup>细胞#1175
利用人类造血系统的动物过继性细胞疗法：利用尾部静脉注射将具有#1138嵌合抗原受体的CD3+T细胞注入经建立有自体移植人类造血系统的Rag2-/-cγ-/-小鼠；控制组：移植具有#1175嵌合抗原受体的CD3+T细胞。
移植人类造血细胞于Rag2-/-cγ-/-小鼠
人类CD34+造血干细胞移植以及后续于小鼠周边血液中人类造血系统建立成果，于移植5周后以流式细胞仪纪录人类CD4+及CD45+细胞加以评估。移植于12/21小鼠中的人类造血系统由人类CD4+CD45T细胞表现于周边血液中。假性移植(Mock-engrafted)与未接受移植的Rag2-/-cγ-/-小鼠并未具有此等细胞。A、B、C、D及E等窝小鼠各移植有相同捐赠者的CD34+脐带血细胞。仅成功移植的小鼠用于过继性治疗中。
经工程改造的人类T细胞所表现的嵌合抗原受体#1138
人类CD3+T细胞(与CD34+细胞来自同一捐赠者)经体外工程以表现CD30特定性的嵌合抗原受体#1138，或作为控制组CEA特定性的嵌合抗原受体#1175。嵌合抗原受体#1175具有CEA特定性的scFv BW431/26，而非嵌合抗原受体#1138的针对CD30特定性scFv HRS3且作为研究中的控制组。人类CD3+T细胞嵌合抗原受体借助流式细胞仪侦测嵌合抗原受体的细胞外人类IgG“间隔”域以及人类CD3的方式进行记录。
经嵌合抗原受体工程改造的T细胞以静脉注射自体移植的造血系统经转移至对应的小鼠(每只小鼠给予2.5x 106个具有嵌合抗原受体T细胞)。
具#1138嵌合抗原受体的T细胞体内毒性
1.周边血液计数与体重
测试组于观测期间都未观测到明显异常状况，淋巴细胞百分比(约70％)、单核白血球(monocyte)(约10％)以及颗粒性白血球(granulocyte)(约20-25％)于周测试组周边血液的细胞区室(cellular compartment)中与未接受T细胞或接受控制组嵌合抗原受体#1175的控制组动物并无差异。
具有或不具抗CD30T细胞#1138或控制组的抗CEA T细胞#1175小鼠周边血液中的CD30+T细胞及B细胞数量，于接受T细胞疗法5日前以及接受T细胞疗法第7、24、22、29、36、43及50日后，以流式细胞仪进行记录。
具有T细胞#1138条件的CD30+CD4+T细胞以及CD30+CD19+B细胞数量，于过继性细胞疗法后7周观测期间与接受T细胞疗法5日前的细胞数量并无差异。CD30+CD4+T细胞的数量与接受CEA特定性T细胞#1175的控制组细胞数量相同。
各小鼠的体重于每周进行测定，我方于观测期间并未记录到各小鼠体重产生任何实质变化。再者，受实验的各组别间亦无记录到任何变化。
2.嵌合抗原受体#1138的试管中刺激未具有毒性
我方尝试对于抗CD30嵌合抗原T细胞#1138施以经放射线照射的9G10融合瘤(hybridoma)细胞，其可产生抗独特性抗体(anti-idiotypic antibody)9G10，此抗体特定指向嵌合抗原受体#1138的HRS3scFv结构域。抗体9G10表现于产生细胞的抗体细胞表面，且借助嵌合抗原受体交联强烈活化经工程改造的T细胞#1138。于此等测试条件中，受治疗小鼠的周边血液中的CD30+CD4+T细胞或CD30+CD19+B细胞数量并未产生变化(图5。)
3.LCMV感染作为测试病原体后的免疫反应无变化
为探究具有T细胞#1138时，淋巴细胞对于病原体的免疫反应是否有所变化，故于T细胞#1138过继性疗法7日后，使移植于Rag2-/-cγ-/-小鼠的人类免疫系统感染淋巴球性脉络丛脑膜炎(lympho-choriomeningitis)病毒(LCMV)。
此次试验基于在免疫健全个体内的全身性LCMV感染受特定的CD8+及CD4+T细胞活化所控制的事实，其可于感染部位产生发炎浸润并短暂表现出高浓度的CD30。未移植T细胞及B细胞免疫系统的Rag2-/-cγ-/-小鼠无法产生抗LCMV的T细胞反应。经移植有人类免疫系统的拟人化Rag2-/-cγ-/-小鼠受质疑其是否可于感染LCMV后产生发炎浸润。
我方借助对脚板局部施以病毒，使免疫系统对抗LCMV，此为典型的感染试验，可由感染部位在数日内的肿胀现象表现出抗病毒免疫反应。
我方于此纪录脚板感染部位的肿胀进行记录，亦即一般所知免疫健全野生型小鼠如balb/c小鼠所会产生的现象。受此感染路径施作的实验用小鼠都未发生体重下降的情形。资料显示局部LCMV感染于经重建的Rag2-/-cγ-/-小鼠受到抗CD30嵌合抗原受体T细胞#1138治疗后受到局部控制，于研究中无任何小鼠死亡。
然而，经观察约有30％的体重下降情形(于第10日至第27日平均自18g下降至12g)。接受9G10抗体细胞以刺激受到抗CD30T细胞#1138所控制LCMV感染的小鼠，体重较无大幅变化。相较之下，拟人化Rag2-/-cγ-/-小鼠于抗CEA的T细胞#1175治疗后并未表现出体重变化。
资料显示，具有抗CD30T细胞#1138的拟人化小鼠可对所有经由脚板肿胀表现出的LCMV感染建立细胞免疫反应。然而，在受到抗CD30T细胞#1138治疗的小鼠中，对于LCMV感染的反应可能与适当的细胞因子(cytokine)释放并发症相关，因为急性T细胞#1138活性化导致了食物摄取量降低与体重减轻。此与接受抗CEA#1175嵌合抗原受体T细胞的控制组小鼠相反，其于该等小鼠体内并无目标存在，故并未活性化。
4.血清病理
各实验组别小鼠的血清GOT(天冬氨酸氨基转移酶)经纪录，另外于各组中有一只小鼠受全身性感染LCMV。血清GOT及GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)利用Institut fürKlinische Chemie,Uniklinik
Figure BDA0000929973710000171
依据其标准作业程序进行测定。于T细胞疗法后长达57日的观测期内，并未观测到血清GOT含量产生显著变化。
结论
T细胞#1138对于健康的自体移植CD30+淋巴细胞毒性，经于完整重建有人类造血系统的Rag2-/-cγ-/-小鼠体内受到测试。来自三名捐赠者的T细胞受抗CD30嵌合抗原受体#1138的工程改造，而控制组则受抗CEA嵌合抗原受体#1175所改造，并经测试对于自体移植健康CD30+淋巴细胞的自体免疫反应，尤其对于CD30+CD19+B细胞以及CD30+CD4+T细胞的消灭作用。测试组与实验组两者各总观察时间皆为60日。
受治疗小鼠皆未产生疾病征兆，CD30+CD19+B细胞及CD30+CD4+T细胞于周边血液中的发生率皆未变化。缺乏自体免疫毒性征兆的现象，借助对经工程改造的T细胞#1138施以结合于嵌合抗原受体结合域以诱发嵌合抗原受体讯号传递以及T细胞活性化的抗独特性抗体9G10来加以刺激。周边血液中的CD30+CD19+B细胞及CD30+CD4+T细胞的发生率皆未观测到有所变化。
经抗CD30T细胞#1138治疗的拟人化小鼠体内，淋巴细胞对于病原体的反应，并未产生如转移T细胞#1138的7日后感染淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)所表现出的变化。然而，受治疗的小鼠发生约30％的体重下降(第10日与第27日相比)。由于移植有T细胞#1175的小鼠并未于LCMV感染后产生体重下降，我方定论具有T细胞#1138的小鼠体内抗LCMV免疫反应产生了适当的细胞因子释放并发症，其源自对于CD30+目标细胞的急性活化而导致食物摄取量减少。感染过程中无任何小鼠死亡。
于本试验条件下，T细胞#1138过继性疗法保留了B细胞及T细胞于周边血液中的数量，并对于一受测病原体产生了细胞免疫保护。
范例3：经#1138嵌合抗原受体修改的T细胞特定延伸
以嵌合抗原受体#1138及#946进行T细胞工程
具有#1138以及作为比对的#946的人类周边T细胞移植(参照Hombach A,et.Al.,Gene Ther.2010Oct；17(10):1206-13.doi:10.1038/gt.2010.91.Epub 2010Jun 17)具有CEA特定性scFv结合域CEA，受双色流细胞分选仪(FACS)于转导12小时后进行评估。
具有嵌合抗原受体#1138及#946的T细胞监测作业
其后，转导细胞培养经于Xvivo15培养液辅以10％FCS及IL-2(500U/ml)，每周更换一次培养液，每3日添加一次IL-2。于不同时间点移出一份细胞样本，且CD3+T细胞经利用FITC共轭抗鼠类及PE共轭抗人类IgG1Fc抗体分析其嵌合抗原受体表现，资料总结于图6中。
结论
具#1138嵌合抗原受体T细胞的数量于进一步培养达300小时后，较#946嵌合抗原受体T细胞数量实质上增加，并增加超过所有具#1138嵌合抗原受体T细胞的90％，相较之下，具#946嵌合抗原受体的T细胞增加50％。
范例4：B细胞的特定胞溶现象
如图7A所示，B细胞根据标准程序自PBMC分离。另外，T细胞自PBMC分离病移植有嵌合抗原受体#1138，经CFSE标记并分为CAR+及CAR－群体。自体移植B细胞根据标准程序以sCD40L/IL-4活化96小时，以PKH26标记并以流式细胞仪的细胞分选功能分选为CD30+及CD30-群体。经标技的T细胞以B细胞共培养(2.5x104/well)24小时，取回后以7-AAD染色并以流式细胞仪分析。控制组部分，代表恶性T细胞的Myla细胞的目标细胞溶解，以XTT进行存活力试验加以测定。如图7B所示，CD19+B细胞并无受CAR+或CAR-T细胞导制的显著胞溶现象，反之当CD30+Myla细胞与#1138嵌合抗原受体共培养时产生了实质上的胞溶。再者，相较于不具嵌合抗原受体的T细胞，CD19+B细胞的CD30+及CD30-细胞两者由具有嵌合抗原受体#1138的T细胞所导致的胞溶现象并无实质差异。
Figure IDA0001053029580000021
Figure IDA0001053029580000031
Figure IDA0001053029580000041
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Figure IDA0001053029580000061
Figure IDA0001053029580000071
Figure IDA0001053029580000091
Figure IDA0001053029580000101

Claims (9)

1.一种具有嵌合抗原受体的T细胞，用于过继性细胞疗法中，以治疗一个体体内的CD30+癌症，所述CD30+癌症为CD30+白血病或CD30+淋巴癌，其特征在于：所述嵌合抗原受体为SEQ. ID. No. 3所示的多肽，其对于所述CD30+白血病细胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但对于上述个体体内的CD30+非癌细胞则不具有毒性。
2.如前述权利要求1所述的T细胞，用于过继性细胞疗法中，以治疗一个体内的CD30+癌症，其中该CD30+癌症为何杰金氏淋巴癌（Hodgkin’s Lymphoma）、间变性大细胞淋巴癌（anaplastic large cell lymphoma）、急性淋巴性白血病（acute lymphocyticleukaemia）、皮肤淋巴癌（cutaneous lymphoma）、蕈样霉菌病（mycosis fungoides）其中任一者。
3.如前述权利要求1所述的T细胞，用于过继性细胞疗法中，以治疗一个体内的CD30+癌症，其中该CD30+癌症为B细胞淋巴癌或T细胞淋巴癌，所述B细胞淋巴癌为何杰金氏淋巴癌（Hodgkin’s Lymphoma）或非何杰金氏B细胞淋巴癌（non-Hodgkin’s B-cell Lymphoma），所述的T细胞淋巴癌为蕈样霉菌病（mycosis fungoides）或塞札里淋巴癌（Sézarylymphoma）。
4.一种氨基酸序列SEQ. ID. No. 3所示的多肽，所述多肽表现为一T细胞的嵌合抗原受体，对于CD30+癌症表现出毒性作用，并且对CD30+非癌细胞不具有毒性作用。
5.一种核酸分子，其编码权利要求4所述多肽的碱基序列，其中，所述碱基序列为Seq.ID. No. 4。
6.一种载体，其具有如权利要求5所述的核酸分子。
7.一种细胞、细胞系或宿主细胞，其包含如权利要求6所述的载体或如权利要求5所述的核酸分子。
8.一种试剂盒，其包含如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的细胞、细胞系或宿主细胞、如权利要求5所述的核酸分子以及/或如权利要求4所述的多肽，用于制备嵌合抗原受体的T细胞。
9.一种如权利要求1中所述的嵌合抗原受体用于改善表达所述嵌合抗原受体的基因工程T淋巴细胞体外增殖的用途。
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